Artykuł metodologiczny

Fotokonwersja jednokomórkowa u żyjących nienaruszonych danio pręgowanych

DOI:

10.3791/57024

⸱

19 marca 2018

 , 
1Department of Biological Sciences, University of Notre Dame, 2Center for Stem Cells and Regenerative Medicine, University of Notre Dame

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół, który pokazuje, jak fotokonwersja komórek jest osiągana poprzez ekspozycję na promieniowanie UV na określone obszary wyrażające białko fluorescencyjne, Eos, u żywych zwierząt.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tkanka zwierzęca i roślinna składa się z odrębnych populacji komórek. Komórki te oddziałują na siebie z czasem, aby zbudować i utrzymać tkankę i mogą powodować choroby, gdy są zakłócone. Naukowcy opracowali sprytne techniki badania cech i naturalnej dynamiki tych komórek w nienaruszonej tkance poprzez ekspresję białek fluorescencyjnych w podzbiorach komórek. Czasami jednak eksperymenty wymagają bardziej wyselekcjonowanej wizualizacji komórek w tkance, czasami w sposób jednokomórkowy lub populacyjny komórek. Aby to osiągnąć i zobrazować pojedyncze komórki w populacji komórek, naukowcy wykorzystali fotokonwersję białek fluorescencyjnych w pojedynczych komórkach. Aby zademonstrować tę technikę, pokazujemy tutaj, jak skierować światło UV do interesującej nas komórki wyrażającej Eos w nienaruszonym, żywym daniu pręgowanym. Następnie obrazujemy te fotokonwertowane komórki Eos+ 24 godziny później, aby określić, jak zmieniły się w tkance. Opisujemy dwie techniki: fotokonwersję pojedynczej komórki i fotokonwersje populacji komórek. Techniki te mogą być wykorzystywane do wizualizacji interakcji komórka-komórka, losu i różnicowania komórek oraz migracji komórek, co czyni ją techniką mającą zastosowanie w wielu kwestiach biologicznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wiele odrębnych komórek współdziała ze sobą, budując i utrzymując złożone tkanki zwierzęce i roślinne. Komórki te są często interkalowane i trudne do odróżnienia od sąsiadów na poziomie pojedynczej komórki bez mikroskopii o wysokiej rozdzielczości, która wymaga utrwalenia tkanki. Jednak, aby zrozumieć, w jaki sposób te tkanki powstają, są utrzymywane i stają się chore, konieczne było zbadanie, w jaki sposób pojedyncze komórki w tkance oddziałują na siebie w czasie. W idealnej sytuacji eksperymenty te wymagają znakowania pojedynczych komórek w tkance w sposób nieinwazyjny, bez konieczności utrwalania. Naukowcy opracowali wiele technik, aby wykonać to zadanie1,2,3,4.

Odkrycie i implementacja białka zielonej fluorescencji meduzy (GFP) było jednym z ekscytujących podejść, które pozwoliło na znakowanie odrębnych komórek w środowisku tkankowym1. Korzystając z promotorów specyficznych dla komórki, możliwe jest genetyczne wybranie podzbioru komórek, które są oznaczone jako 1. Alternatywnie, indukowana przez wirusa ekspresja GFP może być wykorzystana do wybranej przez użytkownika ekspresji GFP3,4. Chociaż jest to całkiem użyteczne, ekspresja GFP za pośrednictwem genetyki nie pozwala na ekspresję wybraną przez użytkownika w podzbiorze komórek w tkance; a ekspresja wirusa GFP, choć korzystna, może być inwazyjna. Wraz z pojawieniem się pochodnych GFP i sprytnych technik, takich jak Brainbow, do rzadszej ekspresji odrębnych białek fluorescencyjnych w tkankach, możliwa stała się wizualizacja pojedynczych komórek i interakcji między nimi w złożonej tkance2,5. Jednak te podejścia oznaczają komórki w sposób losowy. Jeśli pożądany eksperyment wymaga wizualizacji pojedynczej komórki lub populacji komórek, która jest zdefiniowana przez eksperymentatora, są one zatem ograniczone. Przy takich eksperymentach korzystne byłoby posiadanie genetycznie wyrażonego białka fluorescencyjnego, którym można manipulować w celu odróżnienia, w sposób jednokomórkowy, od innych komórek fluorescencyjnych i niefluorescencyjnych.

Aby osiągnąć ten cel i zobrazować biologię pojedynczych komórek w złożonej żywej tkance, społeczność naukowa wykorzystuje fotokonwersję pojedynczych komórek różnych białek fluorescencyjnych6,7,8. Korzystając z genetycznie kontrolowanej ekspresji białka fotokonwertowalnego (tj. eos, kaede itp.), które przechodzi ze stanu zielonej do czerwonej fluorescencji pod wpływem światła UV (488 nm), możemy odróżnić pojedynczą komórkę od jej fluorescencyjnie znakowanych sąsiadów6,7,8. Podejście to wykorzystuje aparaturę dołączoną do naszego mikroskopu konfokalnego, która może skierować światło ze stosu laserowego do obszaru zainteresowania ograniczonego dyfrakcją. Dzięki tej technice możemy oznaczać pojedyncze komórki lub większe populacje w sposób zdefiniowany przez użytkownika9,10,11. Technika ta jest minimalnie inwazyjna w porównaniu z iniekcjami wirusa GFP z pojedynczych komórek. Jako dowód słuszności koncepcji pokazujemy, że możemy fotokonwertować pojedyncze komórki w zwoju obwodowego układu nerwowego i fotokonwertować większe populacje, takie jak komórki znajdujące się po brzusznej stronie rdzenia kręgowego9,10,11,12. Następnie możemy wizualizować te fotokonwertowane populacje komórek 24 godziny później, aby uzyskać wgląd w ich ruch i różnicowanie podczas rozwoju.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie badania na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Notre Dame.

1. Przygotowanie okazu danio pręgowanego

  1. Umieść jednego dorosłego samca i jedną dorosłą samicę Tg (białko konwertowalne) w komorze krycia zgodnie ze standardowymi procedurami13. W tym manuskrypcie użyj Tg(sox10:eos) fish9 ze względu na dostęp, ale inne linie transgeniczne z białkiem fotokonwertowalnym mogą być równie dobrze stosowane. Ustaw więcej niż jedną komorę na wypadek, gdyby ryby nie leżały. Pozostaw rybę na noc w komorze
    2. .
  2. Następnego ranka zbierz jajka na 100-milimetrowe szalki Petriego. Pozwól jajom dojrzeć do 24 godzin po zapłodnieniu (hpf) przed badaniem przesiewowym.
  3. Jeśli zwierzęta powyżej były heterozygotami pod względem transgenu, przebadaj 24 szalki hpf pod kątem zarodków Tg(sox10:eos)+ za pomocą źródła światła 488 nm i zestawów filtrów GFP pod mikroskopem preparacyjnym. Wyizoluj zarodki Tg(sox10:eos)+ i pozwól im dojrzeć do 48 hpf.
  4. Dekorionuj zarodki ręcznie za pomocą igły lub pęsety.
  5. Przygotować i podgrzać w kuchence mikrofalowej 5 ml 0,8% roztworu agarozy o niskiej temperaturze topnienia.
    1. Gdy agaroza ostygnie w dotyku, umieść 3-4 znieczulone ryby Tg (sox10: eos) + 48 hpf na środku 10 mm szklanej płytki Petriego.
    2. Dodać tyle agarozy, aby pokryć powierzchnię szkiełka nakrywkowego, około 1 ml. Użyj igły sondy, aby ułożyć ryby na bokach. Pozwól agarozie zastygnąć, aby zapewnić dosiadanie zwierząt. Może być konieczne ciągłe przestawianie danio pręgowanego, aż agar zastygnie14. Krzepnięcie trwa około 2 minut.
  6. Po zestaleniu się agarozy przez 2 minuty, powoli dodawać pożywkę zarodkową zawierającą 0,02% ester kwasu aminobenzoesowego (trikainę) do naczynia, aż dolna powierzchnia agaru i szalki zostanie zanurzona. Powinno to być około 3 ml.

2. Montaż mikroskopu i obrazowanie przed konwersją

  1. Otwórz oprogramowanie konfokalne i wybierz okna przechwytywania i ustawiania ostrości [Rysunek 1]. W oknie przechwytywania wybierz ustawienie obrazowania konwersji specyficzne dla laboratorium na karcie rozwijanej ustawień przechwytywania [Rysunek 1]. W tym przypadku ustawienie specyficzne dla laboratorium nazywa się "obrazowaniem ryb".
  2. Umieść preparat na lunecie konfokalnej i ustaw ostrość za pomocą pokręteł kursu i precyzyjnej regulacji.
  3. Otwórz okno ostrości i zlokalizuj żądany obszar zainteresowania (np. zwoje korzenia grzbietowego).
  4. Wybierz laser c488 z menu Filter Set (Zestaw filtrów). Ustaw ekspozycję na 300 ms, moc lasera na 5 i intensyfikację na 75 [Rysunek 2].
  5. Zaznacz pole 3D w sekcji typu przechwytywania. W sekcji Przechwytywanie 3D wybierz opcję użyj bieżącej pozycji i sprawdź zakres względem bieżącego. W tej samej sekcji ustaw zakres na 35, liczbę płaszczyzn na 36, a rozmiar kroku na 1. Zakres można zwiększać lub zmniejszać, aby dostosować się do głębokości obszaru obrazowania. Dla rdzenia kręgowego zazwyczaj wystarcza wartość zakresu między 35-40 stosów [Rysunek 5].
  6. Wybierz bieżącą lokalizację [Rysunek 5].
  7. Kliknij przycisk Start u dołu okna przechwytywania, aby uzyskać obraz.

3. Fotokonwersja pojedynczej komórki

  1. Otwórz oprogramowanie konfokalne i wybierz okna przechwytywania i ustawiania ostrości [Rysunek 1]. W oknie przechwytywania wybierz ustawienie obrazowania konwersji specyficzne dla laboratorium na karcie rozwijanej ustawień przechwytywania [Rysunek 1]. W tym przypadku ustawienie specyficzne dla laboratorium nazywa się "Ryba abluje pełny chip".
  2. Wybierz laser c488 i c541 z menu Filter Set (Zestaw filtrów). Jeśli nie używasz tego samego oprogramowania mikroskopu, znajdź menu, aby wybrać różne lasery i wybierz lasery 488 nm i 541 nm. Ustaw ekspozycję na 300 ms, moc lasera na 5 i intensyfikację na 75 [Rysunek 2]. Te ustawienia lasera są wybierane na podstawie wytworzenia wystarczającej ilości sygnału fluorescencyjnego bez powodowania fotowybielania lub toksyczności. Jeśli zostanie uwidoczniona toksyczność lub fotowybielanie, zmniejsz moc lasera lub ekspozycję.
  3. Otwórz okno ostrości i kliknij kartę fotomanipulacji w oknie ostrości. Dostosuj odpowiednio parametry lasera. Zmień moc stosu laserowego na 2, a następnie kliknij przycisk Przejdź. Zmień rozmiar bloku rastrowego na 1 i kliknij przycisk Ustaw. Zmień rozmiar dwukrotnego kliknięcia na 4. Zmień linię lasera na v405 [Rysunek 3].
  4. Otwórz zaawansowane ustawienia przechwytywania w oknie przechwytywania. Wybierz kartę fotomanipulacji i zmień Powtórzenia dwukrotnego kliknięcia na 2. Kliknij OK [Rysunek 4].
  5. Wybierz zakładkę XY w oknie fokusu. Dokładnie sprawdź parametry lasera z kroku 2 w zakładce fotomanipulacji [Rysunek 3, Rysunek 4]. Ustaw ustawienia lasera, aby fotokonwertować interesującą komórkę bez fotokonwersji otaczających komórek.
    1. Jeśli występuje fotokonwersja sąsiednich komórek, zmniejsz moc lasera. Jeśli fotokonwersja komórek nie zachodzi, moc lasera może zostać zwiększona. Optymalnie ustaw moc lasera tak, aby fotokonwertowała tylko obszar zainteresowania, a nie otaczające obszary.
  6. Zaznacz pole timelapse w sekcji typ przechwytywania. Następnie kliknij Start [Rysunek 6A].
  7. Gdy otworzy się okno timelapse na żywo, wybierz narzędzie okrąg na górnym pasku narzędzi [Rysunek 7]
  8. Narysuj okrąg w najbardziej środkowym obszarze komórki. Kliknij prawym przyciskiem myszy narysowany okrąg, wybierz region FRAP i poczekaj 3 sekundy. Wybrany obszar powinien stać się ciemniejszy [Rysunek 8]. Kliknij przycisk Zatrzymaj przechwytywanie.
  9. Jeśli obrazujesz więcej niż jedno zwierzę, wróć do zakładki XY w menu ostrości i wybierz pozycję 2. Następnie powtórz kroki 4.1-4.6.
  10. Aby przekonwertować populację komórek, postępuj zgodnie z protokołem i parametrami lasera dla kroków 4.1-4.4, z wyjątkiem tego, że zamiast rysować okrąg w celu określenia obszaru zainteresowania metodą FRAP, użyj narzędzia linii. Narysuj linię na obszarze zainteresowania i narysuj go metodą FRAP, używając tych samych parametrów, które wymieniono powyżej.

4. Obrazowanie po fotokonwersji

  1. Gdy wszystkie punkty zostaną fotokonwertowane. Wybierz specyficzne dla laboratorium standardowe ustawienie stosu obrazów opisane w kroku 3 obrazowania przed kowersją. Znajduje się to na karcie rozwijanej ustawień przechwytywania w oknie przechwytywania [Rysunek 5].
  2. Wybierz laser c488 i ustaw ekspozycję na 300 ms, moc lasera na 5 i zintensyfikuj na 75 [Rysunek 2].
  3. Wybierz laser c541 znajdujący się w tym samym menu, co laser c488. Ustaw ekspozycję na 500 ms, moc lasera na 10 i intensyfikację na 75 [Rysunek 9].
  4. Zaznacz pole 3D w sekcji typu przechwytywania. W sekcji Przechwytywanie 3D wybierz opcję użyj bieżącej pozycji i sprawdź zakres względem bieżącego. W tej samej sekcji ustaw zakres na 35, liczbę płaszczyzn na 36, a rozmiar kroku na 1. Liczba zakresów może się zwiększać lub zmniejszać, aby dostosować się do żądanej głębokości obrazowania [Rysunek 5].
  5. Jeśli na karcie ostrości XY znajduje się wiele punktów, wybierz opcję listy punktów wielopunktowych w oknie przechwytywania. Jeśli nie, wybierz bieżącą lokalizację.
  6. Kliknij przycisk Start u dołu okna przechwytywania, aby uzyskać obraz.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fotokonwersja białek fluorescencyjnych może być użyta do oznaczania odrębnych komórek w tkance6. Aby to zademonstrować, Tg(sox10:eos) fish9 użyto do ekspresji fotokonwertowalnego białka Eos w sekwencjach regulatorowych sox10. Zwierzęta Tg(sox10:eos) w temperaturze 48 hpf zostały najpierw zamontowane, a następnie zobrazowane w celu wykrycia wszelkich niespecyficznych fotokonwersji, które mogły wystąpić. Następnie zw...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W złożonych tkankach różne typy komórek organizują się w określone domeny. Ostatnio zastosowano techniki znakowania pojedynczych komórek w tych dużych strukturach tkankowych 1,2,3. Tutaj pokazujemy dwie techniki, które można podobnie wykorzystać do wizualizacji zarówno interakcji pojedynczych komórek, jak i interakcji populacji komórek w złożonych tkankach. Zaletą techniki fotokonwersji jest kontrola przestrzenna, którą naukowie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Bernardowi Kulemace i członkom laboratorium Smitha za pomocne komentarze i wskazówki dotyczące odczynników, Samowi Connellowi i Brentowi Redfordowi z 3i za odpowiedzi na pytania dotyczące obrazowania oraz Deborah Bang, Karen Heed i Kay Stewart za opiekę nad danio pręgowanym. Prace te były wspierane przez Uniwersytet Notre Dame, rodzinę Elizabeth i Michaela Gallagherów, Fundację Alfreda P. Sloana, Centrum Badań nad Danio Pręgowanym na Uniwersytecie Notre oraz Centrum Komórek Macierzystych i Medycyny Regeneracyjnej na Uniwersytecie Notre Dame. Wszystkie badania na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z IACUC Uniwersytetu Notre Dame pod kierownictwem dr Cody'ego Smitha.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Tg(sox10:eos) danio pręgowany, zwierzętaRyby zostały pozyskane i skrzyżowane z zakładu rybnego na Uniwersytecie Notre Dame
100 X 15 mmszalka Petriego VWR25384-302
PodłożezarodkowePożywka zarodkowa jest wytwarzana co tydzień i dostarczana przez zakład rybny na Uniwersytecie Notre Dame, zawierający 5 litrów wody RO, 30 ml błękitu metylenowego i 200 ml bulionu solnego.
0,8% Niska temperatura topnienia Agarozakropka scientific inc9012-36-6
35 X 10 mm szklana nakrywkowa dolna szalka PetriegoTed Pella Inc.14021-20
preparcyjna igłowa
0,002% ester kwasu 3-aminobenzoesowego (Trikaina)Fluka analitycznyA5040-250G
Fluorescencyjny mikroskop preparacyjny z filtrami GFPZeiss Axiozoom
z laserami do wzbudzania GFP i RFP zestawy filtrów3i z wirującym dyskiem konfokalnym
Źródło światła UV (laser) do fotokonwersji405 nm
Oprogramowanie do slajdów3i
Błękit metylenowyKordon
Sonda Mikroskop konfokalny Laser

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
  2. Livet, J., Weissman, T. A., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
  3. Goins, W. F., Krisky, D., et al. Herpes simplex virus vectors for gene transfer to the nervous system. J Neurovirol. 3 Suppl 1, S80-S88 (1997).
  4. Boevink, P., Cruz, S., Hawes, C., Harris, N., Oparka, K. J. Virus-mediated delivery of the green fluorescent protein to the endoplasmic reticulum of plant cells. Plant J. 10 (5), 935-941 (1996).
  5. Day, R. N., Davidson, M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chem Soc Rev. 38 (10), 2887-2921 (2009).
  6. Wiedenmann, J., Ivanchenko, S., et al. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (45), 15905-15910 (2004).
  7. Maurel, D., Banala, S., Laroche, T., Johnsson, K. Photoactivatable and Photoconvertible Fluorescent Probes for Protein Labeling. ACS Chem Biol. 5 (5), 507-516 (2010).
  8. Terskikh, A., Fradkov, A., et al. "Fluorescent timer": protein that changes color with time. Science. 290 (5496), 1585-1588 (2000).
  9. McGraw, H. F., Snelson, C. D., Prendergast, A., Suli, A., Raible, D. W. Postembryonic neuronal addition in Zebrafish dorsal root ganglia is regulated by Notch signaling. Neural Dev. 7 (23), (2012).
  10. Smith, C. J., Morris, A. D., Welsh, T. G., Kucenas, S. Contact-Mediated Inhibition Between Oligodendrocyte Progenitor Cells and Motor Exit Point Glia Establishes the Spinal Cord Transition Zone. PLoS biology. 12 (9), e1001961(2014).
  11. Ravanelli, A. M., Appel, B. Motor neurons and oligodendrocytes arise from distinct cell lineages by progenitor recruitment. Genes Dev. 29 (23), 2504-2515 (2015).
  12. Smith, C. J., Johnson, K., Welsh, T. G., Barresi, M. J. F., Kucenas, S. Radial glia inhibit peripheral glial infiltration into the spinal cord at motor exit point transition zones. Glia. , (2016).
  13. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  14. Kirby, B. B., Takada, N., et al. In vivo time-lapse imaging shows dynamic oligodendrocyte progenitor behavior during zebrafish development. Nat Neurosci. 9 (12), 1506-1511 (2006).
  15. Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase. Curr Biol. 8 (24), 1323-1326 (1998).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Bia ko fotokonwertowalnemikroskopia konfokalnaekspozycja na wiat o UVzarodki rybka zebrafishbia ko Eosledzenie los w kom rekanaliza migracji kom rekobrazowanie poklatkowebia ko fluorescencyjne

Powiązane artykuły