Artykuł metodologiczny

Pobieranie i przetwarzanie tkanki tłuszczowej myszy do analizy RNA

DOI:

10.3791/57026

⸱

31 stycznia 2018

 ,  , 
1Centre de Recherche du Centre Hospitalier, Université de Montréal, 2Department of Biochemistry and Molecular Medicine, Université de Montréal, 3Department of Kinesiology, Université de Montréal, 4Montreal Diabetes Research Center

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tego artykułu jest przedstawienie krok po kroku procedury pobierania różnych białych tkanek tłuszczowych od myszy, przetwarzania próbek tłuszczu i ekstrakcji RNA.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W porównaniu do innych tkanek, biała tkanka tłuszczowa ma znacznie mniejszą zawartość RNA i białka do dalszych zastosowań, takich jak PCR w czasie rzeczywistym i Western Blot, ponieważ zawiera głównie lipidy. Izolacja RNA z próbek tkanki tłuszczowej jest również trudna, ponieważ wymagane są dodatkowe kroki, aby uniknąć tych lipidów. W tym miejscu przedstawiamy procedurę pobierania trzech anatomicznie różnych białych tkanek tłuszczowych od myszy, w celu przetworzenia tych próbek i przeprowadzenia izolacji RNA. Dalej opisujemy syntezę cDNA i eksperymenty z ekspresją genów za pomocą PCR w czasie rzeczywistym. Opisany poniżej protokół pozwala na zmniejszenie zanieczyszczenia sierści i krwi zwierzęcia na poduszeczkach tłuszczowych, a także zanieczyszczenia krzyżowego między różnymi poduszeczkami tłuszczowymi podczas pobierania tkanek. Został również zoptymalizowany w celu zapewnienia odpowiedniej ilości i jakości wyekstrahowanego RNA. Protokół ten może być szeroko stosowany do dowolnego modelu mysiego, w którym próbki tkanki tłuszczowej są wymagane do rutynowych eksperymentów, takich jak PCR w czasie rzeczywistym, ale nie jest przeznaczony do izolacji z hodowli komórek pierwotnych adipocytów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Otyłość to ogólnoświatowa epidemia, która może prowadzić do powikłań, takich jak cukrzyca typu 21. Otyłe i genetycznie modyfikowane modele zwierzęce są często wykorzystywane do badań nad otyłością i związanymi z nią powikłaniami. Tradycyjnie, biała tkanka tłuszczowa jest znana jako komora magazynująca nadmiar energii i składa się głównie z lipidów, podczas gdy brązowa tkanka tłuszczowa przekształca energię w ciepło2,3. Tkanka tłuszczowa jest dynamiczna i rozszerza się i kurczy w zależności od wielu czynników, takich jak przyjmowanie pokarmu i aktywność fizyczna. W związku z tym, aby określić czynniki przyczyniające się do tych zmian, wymagane jest odpowiednie pobieranie i obchodzenie się z tkanką tłuszczową4.

Wśród białych tkanek tłuszczowych ogólnie przyjmuje się, że podskórne i trzewne magazyny tłuszczu mają różne właściwości, takie jak anatomiczna lokalizacja i funkcja2,5. W związku z tym, aby uniknąć sprzecznych wyników lub dużej zmienności, należy zwrócić uwagę na unikanie zanieczyszczenia krzyżowego między tymi różnymi magazynami tłuszczu podczas zbierania poduszek tłuszczowych.

Ponadto, istnieją trzy główne wyzwania związane z izolacją RNA lub białka z białej tkanki tłuszczowej myszy. Po pierwsze, zbieranie poduszeczek tłuszczowych u otyłych myszy nie jest łatwym zadaniem, ponieważ granica oddzielająca różne magazyny białego tłuszczu nie zawsze jest wyraźna, w przeciwieństwie do innych narządów, takich jak nerki i serce6. Po drugie, ze względu na wysoką zawartość lipidów w tkance tłuszczowej, podczas izolacji RNA lub białka, warstwa lipidów unosi się na wierzchu i uniemożliwia bezpośredni dostęp do próbki. Po trzecie, w przeciwieństwie do brązowej tkanki tłuszczowej lub innych tkanek, biała tkanka tłuszczowa ma znacznie niższą zawartość RNA i białka, co jest głównym problemem w przypadku korzystania z młodych myszy, myszy karmionych normalną dietą (N) i myszy, które powinny mieć niską masę tłuszczową (tj. modele KO, leczenie lekami, trening fizyczny itp.)7,8.

Dlatego wybór odpowiedniej metody izolacji RNA z tkanki tłuszczowej jest kluczowy. Alternatywnymi metodami ekstrakcji fenolu/chloroformu są zestawy komercyjne. Zazwyczaj opierają się one na początkowym etapie ekstrakcji fenolu, po którym następuje oczyszczanie RNA na kolumnie9. Jednak zestawy te są zazwyczaj droższe i dają próbki o niższej wydajności, podczas gdy jakość RNA może być zmienna, ale jest mniej czasochłonna. Jednak jedną z największych zalet opisanej tutaj ekstrakcji roztworem fenolu/chloroformem jest możliwość wyizolowania RNA, DNA i białka z jednej próbki10. Ponieważ poduszeczki tłuszczowe myszy są zwykle małe i dają niewielką ilość RNA i białek (szczególnie w szczupłych modelach mysich), protokoły te maksymalizują dane, które można uzyskać z małej próbki.

Celem tego artykułu jest szczegółowe opisanie metody zapewniającej odpowiednie pobranie próbek z trzech magazynów białej tkanki tłuszczowej myszy, jak również ilość i jakość izolacji RNA. RNA uzyskane zgodnie z tym protokołem można wykorzystać do wykonywania testów PCR w czasie rzeczywistym. Protokół ten nie jest przeznaczony do izolacji RNA z hodowanych pierwszorzędowych adipocytów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opieka nad myszami stosowanymi w procedurach była zgodna ze standardami opieki i użytkowania zwierząt doświadczalnych ustalonymi przez Kanadyjską Radę Ochrony Zwierząt. Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Uniwersytecką Komisję ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Użytkowania w Centrum Badawczym CHUM.

1. Sekcja zwłok i pobieranie tkanki tłuszczowej od samców myszy

  1. Twórz grupy eksperymentalne zgodnie z celami badania. W tym badaniu próbki pobrano od dwóch grup samców myszy na tle C57Bl / 6 (n = 12-14 / grupa). Upewnij się, że myszy użyte tutaj mają 12-15 tygodni i są utrzymywane w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność z dostępem do normalnej (N) lub wysokotłuszczowej (HF) diety i wody ad libitum przez okres 10 tygodni11.
  2. Poddać mysz eutanazji, umieszczając ją w szczelnie zamkniętej komorze, w której jest narażona na działanie 6% CO2 przez 10 minut.
  3. Wykonaj nakłucie serca, powoli wkładając strzykawkę o pojemności 1 ml zamontowaną za pomocą igły 26G 1/2po po lewej stronie mostka zwierzęcia i powoli pociągając za tłok, aby usunąć większość krwi zwierzęcia. Upewnij się, że strzykawka jest ustawiona równolegle do ciała zwierzęcia. Powoli obracać strzykawkę, jednocześnie ciągnąc tłok, jeśli krew nie dostaje się do strzykawki.
    nuta: Udane punkcje serca (od 0,8 do 1 ml objętości krwi) zmniejszą zanieczyszczenie tkanki tłuszczowej krwią.
  4. Połóż myszy na plecach i przypnij każdą łapę do podkładki za pomocą igieł 22G, jak pokazano na Rysunek 1.
  5. Za pomocą gazy kilkakrotnie przetrzyj skórę myszy alkoholem, zaczynając od szyi aż do narządów płciowych, wykonując ruch jednokierunkowy, ponieważ zapewnia to, że włosy pozostają płaskie i zmniejsza zanieczyszczenie włosów próbkami tkanki tłuszczowej bez usuwania włosów.
  6. Używając czystych, ale nie sterylnych kleszczy i nożyczek chirurgicznych, podnieś centralną skórę w pobliżu narządów płciowych i wykonaj małe nacięcie 0,3 mm.
  7. Włóż nożyczki poziomo do otwartego otworu i oderwij skórę brzucha od ściany brzucha.
    nuta: Odbywa się to poprzez rozwarstwienie w przestrzeni między skórą a ścianą brzucha, a nie przez przecięcie błon znajdujących się w tej przestrzeni.
  8. Za pomocą kleszczy podnieś środkową skórę w pobliżu otwartego otworu i przetnij skórę nad linea alba, aż znajdziesz się w pobliżu klatki piersiowej (~4 cm w zależności od rozmiaru myszy).
    nuta: Unikaj przecinania mięśni brzucha, ponieważ może to narazić trzewną tkankę tłuszczową na działanie powietrza i doprowadzić do wysuszenia poduszek tłuszczowych, co może zmienić integralność tkanki i jej zawartość.
  9. Od środka klatki piersiowej przeciąć skórę w kierunku prawego ramienia na ~2 cm. Z okolic narządów płciowych przeciąć skórę nad prawą tylną kończyną na ~2 cm.
  10. Rozciągnij jeden róg otwartej skóry i przypnij go do opuszki za pomocą igły 22G. Powtórz z drugim rogiem.
    nuta: Tkanka tłuszczowa odsłonięta na skórze to podskórny tłuszcz brzuszny (SCF) (Rysunek 1A).
  11. Zbierz SCF poprzez wypreparowanie i odcięcie go od skóry za pomocą nożyczek chirurgicznych umieszczonych jak najbardziej płasko przy skórze. Po zebraniu umieść SCF na wstępnie zidentyfikowanej folii aluminiowej.
    nuta: Zbieranie lub zanieczyszczanie tkanki tłuszczowej skórą lub włosami zmieni jakość próbki i wydajność RNA z powodu RNaz. Jeśli poświęci się zbyt dużo czasu na pobranie tkanki tłuszczowej, próbka może również wyschnąć, co również może zmienić jakość próbki.
  12. Powtórz kroki od 1.9 do 1.11 po lewej stronie zwierzęcia. Zbierz zarówno lewą, jak i prawą poduszkę tłuszczową w folii aluminiowej i zamroź próbkę w ciekłym azocie.
  13. Aby uzyskać dostęp do trzewnej tkanki tłuszczowej, przetnij mięsień brzucha za pomocą czystych, ale nie sterylnych nożyczek chirurgicznych i kleszczy wzdłuż kresy białej, na ~ 4 cm, w zależności od wielkości myszy, od narządów płciowych do klatki piersiowej. Następnie wykonaj nacięcie w mięśniach brzucha od narządów płciowych w kierunku tyłu myszy na ~2,5 cm, aby mieć dostęp do boku narządów jamy brzusznej.
  14. Tłuszcz wokół narządów rozrodczych to tłuszcz okołogonadalny (PGF) (Rysunek 1B). Ponieważ PGF jest przyczepiony do najądrza, jądra i przewodu pokarmowego, ostrożnie odłącz lewą poduszeczkę tłuszczową od tych struktur i załóż wcześniej zidentyfikowaną folię aluminiową. Powtórz dla prawej strony. Po zebraniu obu PGF próbkę należy zamrozić w ciekłym azocie.
  15. Zaczynając od lewej strony, odsłoń nerki, przesuwając jelito od jamy brzusznej na prawą stronę. Tkanka tłuszczowa otaczająca nerki to tłuszcz okołonerkowy (PRF) (Rysunek 1C). PRF otacza również nadnercza (Ryc. 1D).
  16. Wyizoluj i usuń nadnercza przed pobraniem PRF. Może to być uciążliwe, ponieważ są one nieco bardziej różowe niż tkanka tłuszczowa.
    nuta: Nerki nie powinny być usuwane na tym etapie, ponieważ krew może zanieczyścić tkankę tłuszczową i utrudnić identyfikację nadnerczy w tej poduszce tłuszczowej.
  17. Odizoluj PRF od tylnej ściany mięśniowej, kończąc na przecięciu moczowodu, tętnicy nerkowej i żyły, która oddziela PRF i nerki od reszty ciała. Wyizolować PRF od nerki, przecinając i usuwając torebkę nerkową. PRF pozostaje przymocowany do kapsuły.
  18. Powtórz kroki 1.15 i 1.17 dla prawej strony. Umieść oba PRF w folii aluminiowej i zamroź próbkę w ciekłym azocie.
  19. Powtórz procedurę od kroków od 1.2 do 1.18 dla wszystkich myszy, które mają zostać zebrane.
  20. W tym momencie przystąp do mielenia tkanki tłuszczowej lub przechowuj próbki w zamrażarce o temperaturze -80 °C do późniejszej ekstrakcji. Próbki mogą być stabilnie przechowywane w temperaturze -80 °C przez kilka lat4.

2. Przygotowanie zmielonej białej tkanki tłuszczowej do izolacji RNA

Uwaga: Proszę nosić rękawiczki na każdym etapie, ponieważ skóra zawiera RNazy, które mogą sprzyjać degradacji RNA i jako takie zmieniają jakość próbki i wydajność RNA po izolacji.

  1. Przygotuj i zidentyfikuj trzy wolne od RNaz stożkowe probówki z nakrętką o pojemności 1,5 ml na mysz, po jednej dla każdego rodzaju białej tkanki tłuszczowej, i umieść je na stojaku.
    nuta: Otyłe zwierzęta mogą wymagać dodatkowych rurek, ponieważ mają zwiększoną masę tłuszczową. Jest to szczególnie prawdziwe w przypadku SCF, dla którego uzyskano do 7 probówek na jedną mysz.
  2. Wyczyść ławkę 70% etanolem i połóż czysty i nowy papier ławkowy na powierzchni.
  3. Niezależnie od tego, czy tkanki tłuszczowe zostały świeżo pobrane od myszy, czy też były wcześniej przechowywane w zamrażarce o temperaturze -80 °C, wszystkie próbki należy zebrać w jednym pojemniku wypełnionym ciekłym azotem do czasu rozpoczęcia procedury.
  4. Zamroź moździerz, tłuczek i szpatułkę, umieszczając je w pojemniku z ciekłym azotem. Gdy ciekły azot przestanie "wrzeć", można rozpocząć mielenie tkanki tłuszczowej.
    nuta: Na tym etapie zaprawa, szpatułka, stożkowa rurka i tkanka tłuszczowa muszą pozostać schłodzone podczas całego procesu. Każde ciepło stopi tkankę tłuszczową i utrudni ekstrakcję RNA. Ponadto, jeśli używasz moździerza ceramicznego i tłuczka, można użyć suchego lodu i/lub ciekłego azotu, aby utrzymać go w niskiej temperaturze.
  5. Umieść wszystkie stożkowe probówki z nakrętką 1,5 ml bez RNaz przygotowane w kroku 2.2 na suchym lodzie, aby je schłodzić.
  6. Aby uniknąć odmroźń na dłoniach, użyj kilku warstw brązowego papieru, aby podnieść zaprawę z ciekłego azotu i położyć ją na stole roboczym.
  7. Za pomocą kleszczy pobierz próbkę tkanki tłuszczowej z ciekłego azotu i umieść ją w moździerzu. Szybko odwiń folię aluminiową i upuść próbkę na środek zaprawy.
    nuta: Jeśli próbka tkanki tłuszczowej jest zbyt duża, jak ma to miejsce w przypadku otyłych myszy, rozbij próbki na mniejsze części w folii aluminiowej za pomocą kciuków i sproszkowaj każdą część osobno.
  8. Za pomocą kilku warstw brązowego papieru wyjmij tłuczek z ciekłego azotu i wpasuj go do moździerza. Trzymając tłuczek z brązowymi papierami, użyj młotka, aby raz lub dwa razy uderzyć w górną część tłuczka. Dociśnij tłuczek do moździerza ruchami obrotowymi, aby zmielić próbkę, aż do uzyskania drobnego proszku.
    nuta: Ten krok ma kluczowe znaczenie dla uzyskania odpowiedniej izolacji RNA. Rzeczywiście, obecność większych fragmentów utrudni izolację RNA i zmniejszy wydajność.
  9. Po uzyskaniu drobnego proszku wyjmij tłuczek i podnieś szpatułkę z ciekłego azotu i użyj jej do przeniesienia próbki do odpowiedniej, wstępnie schłodzonej stożkowej probówki o pojemności 1,5 ml.
    nuta: Od czasu do czasu zanurzaj szpatułkę z powrotem w ciekłym azocie, aby zapobiec stopieniu się próbki. Ponadto stożkową rurkę należy zawsze przechowywać w suchym lodzie, aby zapobiec rozmrożeniu próbki. Stożkowa probówka wypełniona zmieloną próbką o pojemności około 2/3 (~1 ml) jest wymagana do uzyskania odpowiedniej wydajności i ilości RNA.
  10. Po napełnieniu do około 1 ml zamknij probówkę i wrzuć ją do drugiego pojemnika wypełnionego ciekłym azotem.
    nuta: Nadmiar próbek można umieścić w oddzielnych, wstępnie schłodzonych probówkach stożkowych o pojemności 1,5 ml wolnych od RNaz i przechowywać w zamrażarce o temperaturze -80 °C do późniejszego wykorzystania.
  11. Wyczyść moździerz, tłuczek i szpatułkę brązowymi papierami, aby uniknąć przeniesienia do następnej próbki tkanki tłuszczowej. Włóż tłuczek i szpatułkę z powrotem do ciekłego azotu, aby się schłodziły. Mimo że brązowy papier nie jest wolny od RNaz, używamy świeżo otwartego opakowania brązowego papieru na każdy dzień izolacji RNA.
  12. Powtórz kroki od 2.4 do 2.11 z następną próbką.
  13. Po przetworzeniu wszystkich próbek rozpocznij izolację RNA lub przechowuj próbki w zamrażarce o temperaturze -80 °C do późniejszego wykorzystania.
    nuta: Aby zapobiec pękaniu probówek, należy zamrozić pojemnik na próbki, całkowicie zanurzając go w pojemniku z ciekłym azotem. Gdy ostygnie, usuń nadmiar azotu z pudełka i pozwól mu unosić się na ciekłym azocie. Posortuj próbki do pudełka i umieść je w zamrażarce o temperaturze -80 °C.

3. Izolacja RNA z naziemnej tkanki tłuszczowej

Uwaga: Roztwór fenolu jest szkodliwy dla skóry. Załóż fartuch laboratoryjny, rękawice, okulary ochronne i wykonaj zabieg pod kapturem chemicznym. Schemat blokowy krok po kroku jest pokazany w Rysunek 2.

  1. Przygotuj i zidentyfikuj dwa zestawy stożkowych probówek o pojemności 1,5 ml bez RNaz i umieść je w stojaku.
  2. Niezależnie od tego, czy tkanki tłuszczowe zostały świeżo zmielone, czy wstępnie przechowywane w zamrażarce o temperaturze -80 °C, wszystkie próbki należy zebrać w pojemniku wypełnionym ciekłym azotem do czasu rozpoczęcia procedury, która zwykle odbywa się w temperaturze pokojowej.
  3. Za pomocą kleszczy wybierz zmieloną próbkę tkanki tłuszczowej z ciekłego azotu i umieść ją w stojaku na probówki. Probówki powinny zawierać ~1 ml proszku, co odpowiada około 100 mg proszku tkankowego.
  4. Powoli otwórz tubę.
    nuta: Pozostawienie zamkniętej probówki w temperaturze pokojowej lub zbyt szybkie otwarcie pokrywy probówki może prowadzić do utraty próbki lub obrażeń, ponieważ ciśnienie azotu ma tendencję do ucieczki z probówki.
  5. Dodać 500 μl roztworu fenolu do próbki (stosunek 1:2 roztwór fenolu do sproszkowanej tkanki).
  6. Zamknij pokrywę rurki i wiruj z maksymalną prędkością przez około 5 s. Powoli i ostrożnie otwórz rurkę, aby uwolnić ciśnienie azotu (słychać dźwięk powietrza wydobywającego się z rurki).
  7. Powtórz kroki 3.5 i 3.6. Końcowa objętość roztworu fenolu dodanego do próbki wynosi 1 ml.
  8. Powtarzać krok 3.6 aż do całkowitego rozpuszczenia próbki.
    nuta: Ważne jest, aby zwolnić całe ciśnienie z rurki przed kontynuowaniem, aby zapobiec pęknięciu rurki.
  9. Pozostawić próbkę w temperaturze pokojowej, powtarzając kroki od 3.4 do 3.8 dla następnych próbek.
  10. Po przetworzeniu wszystkich próbek należy krótko wirować z maksymalną prędkością i inkubować wszystkie próbki przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  11. Wirować przez 10 minut przy 12 000 x g w temperaturze 4 °C. Doprowadzić probówki z powrotem do temperatury pokojowej.
    nuta: Po odwirowaniu obecne są 3 fazy, jak pokazano na Rysunek 2: tłuszcz (na górze), RNA (w środku) i osad (na dole).
  12. Dla każdej próbki przenieś jak najwięcej RNA (środkowa różowa warstwa) do pierwszego zestawu odpowiednich probówek za pomocą pipety P1000 za pomocą końcówki z filtrem. Zmieniaj końcówki między próbkami.
  13. Aby zapewnić minimalne zanieczyszczenie RNA (warstwa środkowa) lipidem (warstwa górna), przebij górną fazę końcówką blisko boku probówki. Dozuj RNA do nowych stożkowych probówek bez dotykania boków nowej probówki, aby zapobiec przenoszeniu lipidów, które mogą znajdować się na zewnątrz końcówki.
  14. Dodać 200 μl czystego chloroformu do każdej próbki i mieszać przez odwrócenie przez 15 s. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  15. Odwirować przez 15 minut przy 12 000 x g w temperaturze 4 °C i doprowadzić probówki z powrotem do temperatury pokojowej.
    nuta: Po odwirowaniu obecne są 3 fazy: RNA (na górze), interfaza, która zawiera DNA (w środku) i czerwony fenol-chloroform, który zawiera białka (na dole).
  16. Dla każdej próbki przenieść jak najwięcej wodnej przezroczystej fazy zawierającej RNA (faza górna) do drugiego zestawu odpowiednich stożkowych probówek za pomocą pipety P1000 przy użyciu końcówek z filtrem. Zmieniaj końcówki między poszczególnymi próbkami.
    nuta: Interfaza jest delikatna i może zanieczyścić górną fazę, jeśli aspiracja zostanie wykonana zbyt szybko. Alternatywnie należy użyć pipety P200, aby zmniejszyć ryzyko zakłócenia interfazy.
  17. Dodać 500 μl 100% izopropanolu do każdej próbki i mieszać przez odwrócenie przez 15 sekund.
  18. Inkubować 10 minut w temperaturze pokojowej
  19. Odwirować przez 10 minut przy 12 000 x g w temperaturze 4 °C i doprowadzić probówki z powrotem do temperatury pokojowej. Wyrzuć izopropanol, odwracając każdą probówkę.
    nuta: Zwykle można zobaczyć małą białą pastylkę RNA, ale czasami może jej nie być.
  20. Dodaj 1 ml 75% etanolu (przygotowanego ze 100% etanolu i wody wolnej od RNaz) do każdej próbki i krótko zwiruj każdą probówkę z maksymalną prędkością.
  21. Odwirować przez 5 minut przy 7 500 x g w temperaturze 4 °C i doprowadzić probówki z powrotem do temperatury pokojowej.
  22. Wyrzuć 75% etanolu, odwracając każdą tubkę i lekko postukaj w brązowy papier, aby usunąć resztki.
    nuta: W razie potrzeby użyj końcówki z filtrem, aby usunąć alkohol w pobliżu osadu RNA. Zmieniaj końcówkę między próbkami.
  23. Pozostaw pokrywę otwartą i susz granulkę RNA na powietrzu przez około 15-20 minut.
    nuta: Na tym etapie granulki RNA mogą stać się przezroczyste.
  24. Ponieważ rozpuszczanie RNA z osadu jest zależne od wielkości, należy ocenić rozmiar osadu, aby określić objętość wody wolnej od RNazy, która ma być użyta do rozpuszczania RNA. Zapisz objętość (od 10 do 25 μl) dla każdej próbki.
    nuta: Ten krok ma jedynie charakter jakościowy. Jeśli nie widać osadu RNA, dodaj do próbki 10 μl wody wolnej od RNA.
  25. Do każdej próbki dodać 10-25 μl wody wolnej od RNaz (objętość określona z góry w kroku 3.24).
  26. Inkubować próbkę przez 5 minut w bloku grzewczym ustawionym na 60 °C. Krótko zawirować probówki.
  27. Inkubować próbkę przez dodatkowe 5 minut w tym samym bloku grzewczym w temperaturze 60 °C.
  28. Szybko odwiruj wszystkie próbki w mini wirówce i natychmiast umieść je na lodzie.
  29. Określ stężenie i czystość RNA. Wykonaj odwrotną transkrypcję (RT) w celu uzyskania cDNA lub przechowuj próbki w zamrażarce o temperaturze -80 °C do późniejszego wykorzystania.
    nuta: Unikaj wielokrotnych cykli zamrażania/rozmrażania, ponieważ powoduje to degradację próbek RNA.

4. Oznaczanie stężenia i czystości RNA w tkance tłuszczowej

  1. Niezależnie od tego, czy próbki RNA tkanki tłuszczowej zostały świeżo wyekstrahowane i rozpuszczone, czy też wstępnie przechowywane w zamrażarce o temperaturze -80 °C, należy zebrać wszystkie próbki i pozostawić je do rozmrożenia na lodzie do rozpoczęcia procedury. Należy to zrobić tuż przed rozpoczęciem następnego kroku lub na końcu izolacji, aby uniknąć wielokrotnych cykli zamrażania/rozmrażania.
  2. Przygotuj i zidentyfikuj dwa zestawy stożkowych probówek o pojemności 1,5 ml bez RNaz i umieść je w stojaku na probówki.
  3. Gdy wszystkie próbki RNA zostaną całkowicie rozmrożone, wiruj próbkę przez 1 s i umieść ją z powrotem na lodzie.
  4. Rozcieńczyć RNA 100-krotnie w 1x roztworze TE w pierwszym zestawie stożkowych probówek 1,5 ml wolnych od RNaz za pomocą przefiltrowanych końcówek wolnych od RNaz (wlej 99 μl 1x roztworu TE i 1 μL RNA do probówki).
  5. Powtórzyć te czynności dla każdej próbki.
    nuta: Objętości mogą być różne dla każdego spektrofotometru w zależności od użytej kuwety.
  6. Po przetworzeniu wszystkich próbek należy odwirować każdą rozcieńczoną próbkę.
  7. Postępuj zgodnie z protokołem spektrofotometru, aby skalibrować przyrząd za pomocą ślepej próby (1x TE) przed przetworzeniem rozcieńczonych próbek RNA.
  8. Przenieść rozcieńczone próbki RNA do kuwety kwarcowej i oznaczyć stężenie każdej próbki przy 260 nm.
    nuta: Jeżeli spektrofotometr nie podaje końcowego stężenia RNA, należy użyć tego wzoru do obliczenia: RNA (μg/μL) = OD260 x współczynnik rozcieńczenia x (40 μg RNA/1 000 μL).
  9. Określić czystość RNA każdej próbki, obliczając stosunek OD260/OD280,
    nuta: Stosunek OD260 / OD280 około 2,0 jest ogólnie uważany za czysty dla RNA12. Zdecydowanie zaleca się weryfikację jakości RNA. W tym celu należy umieścić 1 μg RNA na 1% żelu wybielającym z agarozy wykonanym z 1x buforu TBE (89 mM zasady Tris, 89 mM kwasu borowego i 2 mM EDTA, pH 8,0) i 1% roztworu wybielacza13 (Rysunek 3). RNA o bardzo dobrej jakości pokazuje zarówno prążki rRNA 28S, jak i 18S, a pasmo 28S powinno być intensywniejsze niż 18S. Jakość RNA jest akceptowalna, gdy oba prążki rRNA są widoczne z podobną intensywnością. Jakość RNA staje się niewystarczająca w momencie, gdy pasmo 18S jest bardziej intensywne niż pasmo 28S i gdy widoczny jest rozmaz, co wskazuje na degradację RNA.
  10. Dla każdej próbki należy przygotować 10 μl 0,5 μg/μl RNA z podstawki w drugim zestawie stożkowych probówek o pojemności 1,5 ml bez RNaz, używając wody wolnej od RNaz, aby rozcieńczyć próbki w razie potrzeby. Próbki te są używane do RT w celu uzyskania cDNA.
  11. Po przetworzeniu wszystkich próbek rozpocznij RT lub przechowuj próbki w zamrażarce o temperaturze -80 °C do późniejszego wykorzystania.

5. Odwrotna transkrypcja (RT)

  1. Niezależnie od tego, czy próbki RNA tkanki tłuszczowej zostały świeżo rozcieńczone do 0,5 μg/μl, czy też wstępnie przechowywane w zamrażarce o temperaturze -80 °C, należy zebrać wszystkie próbki i odczynniki i pozostawić je do rozmrożenia na lodzie do rozpoczęcia procedury.
  2. Połóż stojak na paski probówki do PCR na lodzie. Gdy wystarczająco ostygnie, przygotuj i zidentyfikuj jeden zestaw pasków probówki do PCR wolnych od RNaz i umieść je na stojaku. Dołącz puste miejsce.
  3. Przygotować reakcję do traktowania RNA przez DNazę: Sporządzić mieszankę wzorcową (dla wymaganej ilości próbki + 1 próbki) następujących (ilości na 1 próbkę): 1 μl 10-krotnego buforu reakcyjnego z MgCl2, 0,5 μl DNazy I (1 U/μl) i 7,5 μl wody wolnej od RNaz za pomocą filtrowanych końcówek. Dozować 9 μl do każdej probówki.
  4. Dodaj 1 μl z 0,5 μg/μl RNA z każdej próbki do odpowiedniej probówki, nałóż nakrętki na każdy pasek i szybko odwiruj wszystkie paski w mini wirówce, aby doprowadzić próbkę na dno probówki. Dodać 1 μl wody wolnej od RNA do ślepej próby.
  5. Inkubować wszystkie paski probówek w termocyklerze lub bloku grzewczym w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Umieścić pasek probówki z powrotem na ruszcie na lodzie.
  6. Dodać 1 μl EDTA (50 mM) do każdej probówki i inkubować wszystkie paski probówki w termocyklerze lub bloku grzewczym w temperaturze 65 °C przez 10 minut. Umieścić pasek probówki z powrotem na ruszcie na lodzie.
  7. Sporządzić mieszaninę wzorcową (dla wymaganej liczby próbek plus 1 próbka) następujących (ilości na 1 próbkę): 1 μl losowych heksamerów (0,2 μg/μl) i 1 μl mieszaniny dNTP (zawiera każdy z czterech deoksynukleotydów w stężeniu 10 mM). Dozować 2 μl mieszanki głównej do każdej probówki za pomocą końcówek z filtrem. Zmieniaj końcówkę między próbkami.
  8. Inkubować wszystkie paski probówek w termocyklerze lub bloku grzewczym w temperaturze 65 °C przez 5 minut. Włożyć pasek probówki z powrotem do stojaka na lodzie.
  9. Sporządzić mieszankę wzorcową (dla wymaganej liczby próbek plus 1 próbka) następujących (ilości na 1 próbkę): 4 μl 5x buforu RT, 1 μl inhibitora RNazy (20 U/μL), 0,25 μl odwrotnej transkryptazy (200 U/μL) i 1,75 μl wody wolnej od nukleaz. Dozować 7 μl do każdej probówki za pomocą przefiltrowanych końcówek. Zmieniaj końcówkę między próbkami.
  10. Wykonaj RT w termocyklerze, ustawiając następujący program: 10 min w 25 °C, 30 min w 50 °C, 5 min w 85 °C. Połóż paski probówek z powrotem na ruszcie na lodzie.
  11. Przygotuj i zidentyfikuj jeden zestaw pasków probówki do PCR bez RNaz i umieść je na stojaku.
  12. Dla każdej próbki należy przygotować żądaną objętość rozcieńczonego cDNA w stosunku 1:5 z materiału wyjściowego w nowych paskach probówki, używając ultraczystej wody. Próbki cDNA rozcieńczone w stosunku 1:5 zostaną użyte do PCR w czasie rzeczywistym.
  13. Po przetworzeniu wszystkich próbek rozpocznij PCR w czasie rzeczywistym lub przechowuj próbki (próbki podstawowe i rozcieńczone) w zamrażarce o temperaturze -20 °C do późniejszego wykorzystania.

6. PCR w czasie rzeczywistym do ekspresji genów w tkance tłuszczowej

Uwaga: Unikaj wystawiania barwnika fluorescencyjnego na działanie światła. Poniższy protokół opisuje amplifikację genu referencyjnego s1614. Startery i warunki PCR powinny być modyfikowane zgodnie z genem, który nas interesuje.

  1. Niezależnie od tego, czy próbki cDNA zostały świeżo rozcieńczone w stosunku 1:5, czy też wstępnie przechowywane w zamrażarce o temperaturze -20 °C, należy zebrać wszystkie próbki i odczynniki i pozostawić je do rozmrożenia na lodzie do rozpoczęcia procedury.
  2. Umieść stojak na paski probówki do PCR w czasie rzeczywistym na lodzie. Gdy wystarczająco ostygnie, przygotuj i zidentyfikuj jeden zestaw pasków probówki do PCR w czasie rzeczywistym i umieść je na stojaku. Przygotować każdą próbkę i ślepą próbę w dwóch egzemplarzach.
  3. Sporządzić mieszankę wzorcową (dla wymaganej liczby próbek plus 1 próbka) następujących (ilości na 1 próbkę): 1,9 μl wody ultraczystej, 5 μl barwnika fluorescencyjnego (np. zielonego SYBR) i 0,3 μl startera wstępnego oraz 0,3 μl startera odwrotnego. Dozować 7,5 μl do każdej probówki.
  4. Dodaj 2,5 μl cDNA rozcieńczonego w stosunku 1:5 z każdej próbki do odpowiedniej probówki. Dodaj 2,5 μl ultraczystej wody do półfabrykatów. Umieść nakrętki na każdym pasku.
  5. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, aby skonfigurować następujący program do PCR w czasie rzeczywistym: 10 min w 95 °C i 40 cykli po 15 s w 50 °C, 30 s w 60 °C, 30 s w 70 °C. Umieść paski próbek w wirniku maszyny do PCR w czasie rzeczywistym i uruchom program.
    nuta: Warunki pracy termocyklera mogą się różnić w zależności od używanej aparatury i genu będącego przedmiotem zainteresowania. Wyniki ekspresji mRNA przedstawione w Rysunek 3 pokazuje amplifikację mRNA leptyny znormalizowaną przez gen odniesienia Amplifikacja mRNA S1614,15.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po procedurze sekcji zwłok pobrano i zważono trzy białe tkanki tłuszczowe z dwóch grup myszy (myszy karmione dietą N i HF). Zgodnie z oczekiwaniami, myszy na diecie HF miały zwiększoną końcową masę ciała i przyrost masy ciała w porównaniu z rodzeństwem z miotu na diecie N (Tabela 1). Obserwacjom tym towarzyszył ponad 2-krotny wzrost masy ciała PGF, PRF i SCF u otyłych myszy w porównaniu z myszami na diecie N.

Pr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po karmieniu dietą HF stwierdzono, że otyłe myszy mają zwiększoną masę ciała i białej tkanki tłuszczowej w porównaniu z myszami karmionymi dietą N. RNA wyekstrahowane przy użyciu roztworu fenolu otrzymało próbki o dobrej czystości. Leptyna jest adipokiną wytwarzaną głównie przez tkankę tłuszczową i wiadomo, że koreluje dodatnio z masą tłuszczową16. Zgodnie z oczekiwaniami, ekspresja mRNA leptyny wzrosła u otyłych myszy wraz z ich masą tłuszczową.

Ta metoda składa się z ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Diabetes Canada.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1 mL seringes
1X TE roztwór (10 mM Tris-HCl i 1 mM EDTA• Na2. pH 8,0)
Igły
22 G Igły
75% Etanol
Podgrzewacz blokowy (sucha kąpiel)
ChloroformSigmaC2432-500mL
dATP     Thermo scientificR0141
dCTP   Thermo scientificR0151
dGTP   Thermo scientificR0161
DNaza I (1 U/&mikro; l) Thermo scientificEN0521
dTTP Thermo scientificR0171
Faststart Uniwersalny SYBR zielony Master (Rox)Roche4913922001
Faststart uniwersalny SYBR zielony mistrz (Rox) barwnik fluorescencyjny Roche4913914001
Końcówki
Kleszcze InstrumentariumHB275
Gauze
Hammer
Dieta dla gryzoni o wysokiej zawartości tłuszczuBio-Serv, Frenchtown, NJF3282
Izopropanol Laboratoire MATIH-0101
Leptynowy starter do PCR do przodu (5'-GGGCTTCACCCCATTCTGA-3') 10 uM
Leptynowy starter do odwrotnego PCR (5'-GGCTATCTGCAGCACATTTTG-3') 10 uM
Płynny azot
Maxima Odwrotna transkryptaza (enzym i 5x bufor)Thermo scientificEP0742
Woda nanoczysta (określana jako woda ultraczysta)
Rękawice
Rękawice
Normalna dieta gryzoniHarlan Laboratories, Madison, WIHarlan 2018
Pikuler P1000 Pikuler
P20 Pirowerk
P20 pipetman
P200 pipetman
roztwór fenolu (TRIzol) Ambion Life Technologies15598018
Wstępnie zidentyfikowana folia
Kuweta
Stojak na paski
Stojaki na paski
Losowe heksamery Invitrogen58875
System genowy rotora do PCR w czasie rzeczywistym Corbett researchRG-3000 Rotor-Gene Termocykler
stołowa z chłodzeniem
Inhibitor RNazy RiboLock Thermo scientificEO0381
Probówki eppendorfa 1,5 ml bez RNaz Probówki
nakrętką 1,5 ml bez RNaz Paski
probówek do PCR (0,2 ml) i nakrętki
Woda bez RNaz HycloneSH30538.02
Maszyna RT-PCRQiagenRotor-Gene Corbett 3000
Paski probówki RT-PCR (0,1 ml) i nakrętki
S16 starter do PCR do przodu (5'-ATCTCAAAGGCCCTGGTAGC-3') 10 uM
S16 odwrócony starter PCR (5' ACAAAGGTAAACCCCGATCG-3') 10 uM
SpektrofotometrBiochromUltrospec 3100 pro
Moździerz i tłuczek
Podkładki chirurgiczneDomowa płyta piankowa owinięta w jednorazowy chłonny podkład
Nożyczki chirurgiczne Intrumentarium130.450.11
Termocykler
Termocykler BiometraThermocycler
Mieszalnik
Szpatułka do ważenia
26 Gz filtremdo badań nitrylowychnitrylowealuminiowaspektrofotometru kwarcowegoprobówek do PCRprobówek RT-PCRWirówka z ze stali nierdzewnejwirowy

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Guh, D. P., et al. The incidence of co-morbidities related to obesity and overweight: a systematic review and meta-analysis. BMC. Public Health. 9, 88(2009).
  2. Wronska, A., Kmiec, Z. Structural and biochemical characteristics of various white adipose tissue depots. Acta Physiol (Oxf). 205 (2), 194-208 (2012).
  3. Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiol Rev. 84 (1), 277-359 (2004).
  4. Holland, N. T., Smith, M. T., Eskenazi, B., Bastaki, M. Biological sample collection and processing for molecular epidemiological studies. Mutat Res. 543 (3), 217-234 (2003).
  5. Ibrahim, M. M. Subcutaneous and visceral adipose tissue: structural and functional differences. Obes Rev. 11 (1), 11-18 (2010).
  6. Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. Localization, identification, and excision of murine adipose depots. J Vis Exp. (94), (2014).
  7. Hemmrich, K., Denecke, B., Paul, N. E., Hoffmeister, D., Pallua, N. RNA Isolation from Adipose Tissue: An Optimized Procedure for High RNA Yield and Integrity. Laboratory Medicine. 41 (2), 104-106 (2010).
  8. Cirera, S. Highly efficient method for isolation of total RNA from adipose tissue. BMC Res Notes. 6, 472(2013).
  9. Tan, S. C., Yiap, B. C. DNA, RNA, and protein extraction: the past and the present. J Biomed Biotechnol. 2009, 574398(2009).
  10. Sellin Jeffries, M. K., Kiss, A. J., Smith, A. W., Oris, J. T. A comparison of commercially-available automated and manual extraction kits for the isolation of total RNA from small tissue samples. BMC Biotechnol. 14, 94(2014).
  11. Tan, P., et al. Impact of the prorenin/renin receptor on the development of obesity and associated cardiometabolic risk factors. Obesity (Silver. Spring). 22 (10), 2201-2209 (2014).
  12. Taylor, S., Wakem, M., Dijkman, G., Alsarraj, M., Nguyen, M. A practical approach to RT-qPCR-Publishing data that conform to the MIQE guidelines. Methods. 50 (4), 1-5 (2010).
  13. Aranda, P. S., LaJoie, D. M., Jorcyk, C. L. Bleach gel: a simple agarose gel for analyzing RNA quality. Electrophoresis. 33 (2), 366-369 (2012).
  14. Mercure, C., Prescott, G., Lacombe, M. J., Silversides, D. W., Reudelhuber, T. L. Chronic increases in circulating prorenin are not associated with renal or cardiac pathologies. Hypertension. 53 (6), 1062-1069 (2009).
  15. Dusaulcy, R., et al. Adipose-specific disruption of autotaxin enhances nutritional fattening and reduces plasma lysophosphatidic acid. J. Lipid Res. 52 (6), 1247-1255 (2011).
  16. Nakamura, K., Fuster, J. J., Walsh, K. Adipokines: a link between obesity and cardiovascular disease. J Cardiol. 63 (4), 250-259 (2014).
  17. Taylor, S. C., Mrkusich, E. M. The state of RT-quantitative PCR: firsthand observations of implementation of minimum information for the publication of quantitative real-time PCR experiments (MIQE). J Mol Microbiol Biotechnol. 24 (1), 46-52 (2014).
  18. Hummon, A. B., Lim, S. R., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Isolation and solubilization of proteins after TRIzol extraction of RNA and DNA from patient material following prolonged storage. Biotechniques. 42 (4), 467-470 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

RNA Isolation ProtocolPhenol Chloroform ExtractionSubcutaneous Fat DissectionVisceral Adipose TissueLiquid Nitrogen GrindingReal time PCR AnalysisGene Expression MeasurementAdipose Tissue Processing

Powiązane artykuły