Artykuł metodologiczny

Wizualizacja cytoszkieletów aktyny i mikrotubul w synapsie immunologicznej komórek B przy użyciu mikroskopii wyczerpywania się emisji stymulowanej (STED)

13.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57028

⸱

9 kwietnia 2018

 ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of British Columbia

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy protokół użycia mikroskopii STED do jednoczesnego obrazowania struktur aktynowych, mikrotubul i białek wiążących mikrotubule plus end w komórkach B, które rozprzestrzeniły się na szkiełkach nakrywkowych pokrytych przeciwciałami przeciwko receptorowi komórek B, modelowi początkowej fazy tworzenia synaps immunologicznych.

Streszczenie

Komórki B, które wiążą się z antygenami związanymi z błoną (np. na powierzchni komórki prezentującej antygen) tworzą synapsę immunologiczną, wyspecjalizowaną strukturę komórkową, która optymalizuje sygnalizację receptora komórek B (BCR) i akwizycję antygenu za pośrednictwem BCR. Zarówno przebudowa cytoszkieletu aktynowego, jak i reorientacja sieci mikrotubul w kierunku miejsca kontaktu z antygenem są niezbędne do tworzenia synaps immunologicznych. Przebudowie cytoszkieletu aktynowego w gęsty obwodowy pierścień F-aktyny towarzyszy polaryzacja centrum organizującego mikrotubule w kierunku synapsy immunologicznej. Białka wiążące plus-koniec mikrotubul, a także korowe białka wychwytujące plus-koniec pośredniczą w fizycznych interakcjach między aktyną a cytoszkieletami mikrotubul, co pozwala na ich reorganizację w skoordynowany sposób. Wyjaśnienie mechanizmów, które kontrolują tę reorganizację cytoszkieletu, a także zrozumienie, w jaki sposób te struktury cytoszkieletu kształtują tworzenie synaps immunologicznych i sygnalizację BCR, może dostarczyć nowych informacji na temat aktywacji komórek B. Zostało to pomocne dzięki opracowaniu metod mikroskopii superrozdzielczej, które ujawniają nowe szczegóły organizacji sieci cytoszkieletowej. Opisujemy tutaj metodę wykorzystania mikroskopii wymuszonej defibuli emisji (STED) do jednoczesnego obrazowania struktur aktynowych, mikrotubul i transfekowanych białek wiążących plus-koniec mikrotubul znakowanych GFP w komórkach B. Aby modelować wczesne zdarzenia w tworzeniu synaps immunologicznych, pozwalamy limfocytom B rozprzestrzeniać się na szkiełkach nakrywkowych pokrytych przeciwciałami anty-immunoglobulinowymi (anty-Ig), które inicjują sygnalizację BCR i przebudowę cytoszkieletu. Zapewniamy protokoły krok po kroku dotyczące ekspresji białek fuzyjnych GFP w komórkach chłoniaka B A20, rozprzestrzeniania się komórek indukowanego anty-Ig oraz późniejszej fiksacji komórek, barwienia immunologicznego, akwizycji obrazu i dekonwolucji obrazu. Obrazy o wysokiej rozdzielczości uzyskane za pomocą tych procedur pozwalają na jednoczesną wizualizację struktur aktynowych, mikrotubul i białek wiążących plus-koniec mikrotubul, które mogą łączyć te dwie sieci cytoszkieletu.

Wprowadzenie

Gdy limfocyty B wiążą się ze spolaryzowanymi układami antygenów (np. wyświetlanymi na powierzchni komórek prezentujących antygen (APC)), wynikowa sygnalizacja receptora komórek B (BCR) napędza tworzenie klasycznej struktury synapsy immunologicznej, która została po raz pierwszy opisana w limfocytach T1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. Początkowo mikroklastry BCR związane z antygenem tworzą się na obrzeżach miejsca kontaktu limfocytów B z APC. Te mikroklastry następnie przemieszczają się w kierunku środka miejsca kontaktu z antygenem, gdzie łączą się w centralny supramolekularny klaster aktywacji (cSMAC), który tworzy rdzeń synapsy immunologicznej. Tworzenie synaps immunologicznych optymalizuje sygnalizację BCR i ułatwia ekstrakcję antygenu za pośrednictwem BCR z błony APC14. To akwizycje antygenu, po którym następuje internalizacja antygenu za pośrednictwem BCR, a następnie przetwarzanie antygenu, umożliwia komórkom B prezentowanie kompleksów peptyd: MHC II limfocytom T i wywoływanie limfocytów T help14. Ponieważ tworzenie synaps immunologicznych sprzyja aktywacji limfocytów B, wyjaśnienie mechanizmów, które ustanawiają ten funkcjonalny wzorzec organizacji receptorów, może dostarczyć nowych informacji na temat inicjowania i regulowania humoralnej odpowiedzi immunologicznej.

Reorganizacja cytoszkieletów aktyny i mikrotubul jest niezbędna do tworzenia synaps immunologicznych. Zlokalizowana sygnalizacja BCR stymulowana przez przestrzennie spolaryzowany układ antygenów indukuje szybką i dramatyczną przebudowę cytoszkieletu aktynowego 1,15. Tworzenie się dendrytycznych struktur aktynowych na obrzeżach komórki B wywiera siły popychające na błonę plazmatyczną i sprzyja rozprzestrzenianiu się komórek B. Dzięki temu komórka B może skanować większy obszar powierzchni zawierającej antygen i zwiększa liczbę BCR, które wiążą antygen i aktywują szlaki sygnałowe BCR. W tym samym czasie MTOC i sieć mikrotubul są przeorientowane w kierunku miejsca kontaktu z antygenem. Gdy MTOC zbliża się do miejsca kontaktu z antygenem, mikrotubule emanujące z MTOC rozciągają się wzdłuż wewnętrznej powierzchni błony plazmatycznej na granicy między komórką B a powierzchnią zawierającą antygen16,17. Te zestawione ze sobą mikrotubule błonowe mogą następnie działać jako ścieżki dla ruchu dośrodkowego za pośrednictwem dyneiny mikroklastrów BCR związanych z antygenem18, prowadząc do powstania cSMAC.

Reorientacja i polaryzacja MTOC w kierunku synapsy immunologicznej wymaga nienaruszonych cytoszkieletów aktynowych i mikrotubul, a często zależy od interakcji między korową siecią aktynową a mikrotubulami16,17,19,20. Korowe białka wiążące aktynę, takie jak IQGAP1, mogą wychwytywać mikrotubule poprzez interakcję z kompleksami białkowymi, które zdobią plus-końce mikrotubul21. Te dynamiczne kompleksy białek wiążących plus-end obejmują EB1 i CLIP-170, które są zbiorczo określane jako białka śledzące plus-end mikrotubul (+TIP)21,22. +TIP na końcach mikrotubul mogą wiązać się z białkami związanymi z błoną plazmatyczną lub cytoszkieletem aktynowym kory mózgowej. Pozwala to mechanizmom generującym siłę (np. ruchowi dyneiny zakotwiczonej w korze mózgowej wzdłuż mikrotubul) wywierać siły ciągnące na mikrotubule, a tym samym zmieniać położenie MTOC. CLIP-170 może wiązać się z białkiem rusztowania związanym z aktyną IQGAP123, a my wykazaliśmy, że oba te białka są wymagane do indukowanej przez BCR polaryzacji MTOC w kierunku synapsy immunologicznej17. Ta interakcja IQGAP1-CLIP-170 może odgrywać kluczową rolę w koordynowaniu przebudowy cytoszkieletu aktynowego z repozycjonowaniem sieci mikrotubul w synapsie immunologicznej komórek B.

Konwencjonalna mikroskopia fluorescencyjna ujawniła dramatyczną reorganizację cytoszkieletów aktyny i mikrotubul podczas tworzenia synaps immunologicznych komórek B2. Jednak to podejście nie jest w stanie szczegółowo rozdzielić małych struktur komórkowych ze względu na granicę dyfrakcji światła, która zgodnie z prawem Abbego zależy od długości fali światła użytego do oświetlenia próbki i apertury obiektywu24. Ta granica dyfrakcji ogranicza rozdzielczość konwencjonalnych mikroskopów świetlnych do 200-300 nm w kierunku bocznym i 500-700 nm w kierunku osiowym25. W związku z tym mniejsze struktury subkomórkowe, a także drobne szczegóły cytoszkieletów aktyny i mikrotubul, można było zaobserwować tylko za pomocą mikroskopii elektronowej. Obrazowanie cytoszkieletu za pomocą mikroskopii elektronowej jest czasochłonne, wymaga rygorystycznych protokołów utrwalania i przygotowywania próbek, które mogą zmieniać struktury biologiczne, i ogranicza się do wykrywania za pośrednictwem przeciwciał. Zdolność do barwienia immunologicznego i jednoczesnego obrazowania wielu białek lub struktur komórkowych jest istotną zaletą mikroskopii fluorescencyjnej. Co więcej, ekspresja fluorescencyjnych białek fuzyjnych w komórkach umożliwia obrazowanie w czasie rzeczywistym i jest przydatna, gdy nie są dostępne skuteczne przeciwciała do barwienia immunologicznego białka będącego przedmiotem zainteresowania.

Ostatnie osiągnięcia technologiczne w mikroskopii superrozdzielczej pokonały ograniczenia dyfrakcyjne światła i umożliwiły wizualizację struktur komórkowych w nanoskali24. Jedną z takich technik mikroskopii superrozdzielczej jest mikroskopia stymulowanego zubożenia emisji (STED). STED wykorzystuje dwa lasery, z których jeden wzbudza fluorofor, a drugi laser z wzorem w kształcie pączka selektywnie tłumi emisję fluorescencji wokół fluoroforu. Zmniejsza to funkcję rozproszenia punktowego (obszar pozorny) pojedynczej cząstki fluorescencyjnej i zapewnia limit subdyfrakcji obraz fluorescencyjny25,26. Mikroskopia zubożenia w stanie podstawowym wykorzystuje również techniki oparte na fluorescencji do uzyskiwania obrazów o wysokiej rozdzielczości. Jednak czas akwizycji i rekonstrukcji obrazu jest długi, istnieje tylko ograniczona liczba fluoroforów, które można zastosować, a jednoczesne obrazowanie w wysokiej rozdzielczości wielu składników cytoszkieletu jest technicznie trudne, ponieważ utrzymanie struktur aktyny i mikrotubul wymaga różnych procedur fiksacji. Dlatego STED ma wiele zalet w porównaniu z mikroskopią elektronową i innymi podejściami do mikroskopii superrozdzielczej, ponieważ oferuje szybką akwizycję obrazu, ma minimalne wymagania dotyczące przetwarzania końcowego i wykorzystuje te same fluorofory i techniki barwienia, które są używane w konwencjonalnej mikroskopii fluorescencyjnej utrwalonych próbek26.

Mikroskopia superrozdzielcza została teraz wykorzystana do wizualizacji struktur aktynowych w synapsie immunologicznej w komórkach NK i limfocytach T26,27,28,29,30,31. Jednak dopiero niedawno doniesiono o obrazowaniu cytoszkieletu mikrotubul w superrozdzielczości, a także o skoordynowanej reorganizacji cytoszkieletów aktyny i mikrotubul podczas tworzenia synaps immunologicznych17. Użyliśmy mikroskopii STED do zobrazowania limfocytów B, którym pozwolono rozprzestrzeniać się na szkiełkach nakrywkowych pokrytych przeciwciałami anty-immunoglobulinowymi (anty-Ig), które stymulują sygnalizację BCR i inicjują reorganizację cytoszkieletu. Po nałożeniu na unieruchomione przeciwciała anty-Ig, limfocyty B ulegają dramatycznemu rozprzestrzenianiu zależnemu od aktyny, które podsumowuje początkowe zdarzenia podczas tworzenia synaps immunologicznych. Co ważne, mikroskopia STED ujawniła drobne szczegóły pierścienia dendrytycznego F-aktyny, który tworzy się na obrzeżach synapsy immunologicznej i wykazała, że MTOC, a także przyłączone do niego mikrotubule, przemieściły się w pobliże miejsca kontaktu z antygenem17. Te mikrotubule rozciągały się na zewnątrz w kierunku obwodowego pierścienia F-aktyny. Co więcej, wielokolorowe obrazowanie STED różnych kombinacji F-aktyny, tubuliny, IQGAP1 i CLIP-170 +TIPS znakowanych GFP wykazało, że plus-końce mikrotubul oznaczone przez CLIP-170-GFP były ściśle związane z obwodową siatką aktyny i IQGAP1, białkiem wychwytującym korę mózgową17.

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół obrazowania cytoszkieletów aktyny i mikrotubul w synapsie immunologicznej za pomocą mikroskopii STED. Metody te zostały zoptymalizowane przy użyciu mysiej linii komórek B A20, która jest szeroko stosowana do badania sygnalizacji BCR i tworzenia synaps immunologicznych17,32,33,34,35,36,37,38,39. Ponieważ komercyjne przeciwciała przeciwko CLIP-170 nie działały dobrze w immunostainingu w poprzednich eksperymentach, szczegółowo opisujemy ekspresję CLIP-170 znakowanego GFP w komórkach A20, wraz z protokołami barwienia do jednoczesnej wizualizacji do trzech składników cytoszkieletu lub białek związanych z cytoszkieletem. Metody wykorzystania mikroskopii STED do obrazowania aktyny w synapsach immunologicznych komórek NK zostały opisane wcześniej40. Tutaj rozszerzamy to na pozyskiwanie wielokolorowych obrazów o wysokiej rozdzielczości zarówno cytoszkieletów aktynowych, jak i mikrotubul w komórkach B.

Kluczowym czynnikiem dla mikroskopii superrozdzielczej jest stosowanie odpowiednich procedur fiksacji w celu utrzymania struktur komórkowych i zapobiegania uszkodzeniom białek fluorescencyjnych. Przedstawione w niniejszym artykule metody utrwalania i barwienia zostały zoptymalizowane w celu zachowania fluorescencji GFP i zapewnienia obrazowania sieci aktyny i mikrotubul w wysokiej rozdzielczości. Podczas ekspresji białek fluorescencyjnych należy zauważyć, że limfocyty B są zwykle trudne do transfekcji. Korzystając z tego protokołu, 20-50% komórek A20 zazwyczaj wyraża transfekowane białko fuzyjne GFP, a w tej populacji poziomy ekspresji białka są zmienne. Niemniej jednak obrazowanie aktyny i mikrotubul w superrozdzielczości przy użyciu opisanych przez nas procedur jest dość solidne i łatwo uzyskuje się obrazy wysokiej jakości. Pomimo ich niewielkich rozmiarów w stosunku do komórek A20, pokazujemy, że procedury te mogą być również wykorzystywane do obrazowania sieci mikrotubul w pierwotnych komórkach B, które zostały na krótko aktywowane lipopolisacharydem (LPS). Wykazaliśmy, że pierwotne limfocyty B aktywowane LPS mogą być transfekowane siRNA ze stosunkowo wysoką wydajnością (tj. taką, że wyczerpanie białka można wykryć za pomocą immunoblottingu), co czyni je dobrą alternatywą dla stosowania linii komórek B w niektórych badaniach17.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Komitet Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Kolumbii Brytyjskiej.

1. Ekspresja białek fuzyjnych GFP w komórkach chłoniaka B A20

  1. Hodowla komórek A20 w kompletnej pożywce RPMI (RPMI-1640 uzupełniona 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS), 50 μM 2-merkaptoetanolu, 2 mM glutaminy, 1 mM pirogronianu, 50 U/ml penicyliny i 50 μg/ml streptomycyny) w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowych z 5% CO2 .
  2. Przygotować odczynnik do transfekcji (patrz Tabela Materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta.
    UWAGA: Ten protokół został zoptymalizowany pod kątem określonych odczynników i protokołu transfekcji opisanego w Tabeli materiałów. Inne odczynniki do transfekcji, które wypróbowaliśmy, nie przyniosły wystarczającej wydajności transfekcji.
  3. Policz komórki za pomocą hemocytometru. Odwirować 2,5 x 106 komórek A20 (na każdą transfekcję) przez 5 minut przy 525 x g. Ponownie zawiesić komórki w 100 μl odczynnika do transfekcji zawierającego 1-2,5 μg plazmidowego DNA. Do kodowania DNA CLIP-170-GFP23, użyj 2,5 μg na transfekcję. Delikatnie wymieszaj.
  4. Przenieś komórki do dołka na 6-dołkowej płytce i dostosuj objętość do 2 ml za pomocą wstępnie podgrzanej pełnej pożywki RPMI. Hodować komórki przez 18 godzin w temperaturze 37 °C, aby umożliwić ekspresję białka.

2. Izolowanie pierwotnych komórek B myszy i aktywacja ich za pomocą LPS

  1. Użyj wysterylizowanych narzędzi chirurgicznych, aby usunąć śledzionę z myszy, zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami instytucji.
  2. W kapturze do hodowli tkankowych umieścić sterylne sitko do komórek o średnicy 70 μm w naczyniu do hodowli tkankowej o średnicy 35 mm zawierającym 3 ml sterylnego PBS o temperaturze pokojowej. Za pomocą gumowej części tłoka ze strzykawki o pojemności 5 ml rozdrobnić śledzionę przez sitko do komórek.
  3. Odpipetować jednokomórkową zawiesinę śledziony do sterylnej probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 525 x g przez 5 minut.
  4. Użyj zestawu do izolacji komórek B na bazie kulek magnetycznych (patrz tabela materiałów), aby uzyskać wysoce wzbogaconą populację komórek B.
  5. Ponownie zawiesić limfocyty B na 3 x 106 / ml w kompletnej pożywce RPMI uzupełnionej 2,5 μg / ml LPS plus 5 ng / ml czynnik aktywujący komórki B (BAFF; cytokina przeżycia).
  6. Hodować komórki przez 6 godzin w temperaturze 37 °C.

3. Powlekanie szkiełek nakrywkowych przeciwciałami anty-Ig

  1. Przygotować roztwór przeciwciała do pokrycia szkiełek nakrywkowych. Rozcieńczyć roztwór podstawowy kozich przeciwciał Ig przeciwko mysim przeciwciałom w sterylnym PBS o temperaturze pokojowej, aby uzyskać roztwór o stężeniu 12,5 μg/ml; Na każde szkiełko nakrywkowe potrzeba 400 μl roztworu przeciwciał.
    UWAGA: Użyj koziego anty-mysiego IgG dla komórek A20; użyj koziego anty-mysiego IgM dla pierwotnych komórek B. Przeciwciała kozie IgG nie wiążą się dobrze z mysimi receptorami Fc. Jednak, aby uniknąć potencjalnego wiązania się z receptorem Fc, można użyć fragmentów F(ab) lub F(ab')2 przeciwciał anty-mysich IgG lub anty-mysich IgM.
  2. Zanurz #1.5 18-milimetrowe okrągłe szklane szkiełko nakrywkowe w 100% metanolu i pozostaw do całkowitego wyschnięcia (~10 min).
  3. Za pomocą kleszczy umieścić wysuszone szkiełko nakrywkowe na 12-dołkowej płytce do hodowli tkankowej i odpipetować 400 μl roztworu przeciwciała o stężeniu 12,5 μg/ml (łącznie 5 μg; 2 μg/cm2) na szkiełko nakrywkowe, tak aby utworzyło pęcherzyk w środku szkiełka nakrywkowego i rozprzestrzeniło się na krawędzie.
  4. Należy uważać, aby przykryć całe szkiełko nakrywkowe, ale nie należy pozwolić, aby roztwór przeciwciała wysunął się poza krawędź szklanego szkiełka nakrywkowego i trafił na plastikową hodowlę tkankową. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
  5. Umyć szkiełka nakrywkowe, pipetując 1 ml sterylnego PBS do studzienki, a następnie odsysając roztwór. Powtórz jeszcze dwa razy, aby usunąć niezwiązane przeciwciała.
  6. Dodać 1 ml sterylnego PBS do studzienki zawierającej szkiełko nakrywkowe pokryte przeciwciałami, aż komórki będą gotowe do dodania.
    UWAGA: Szkiełka nakrywkowe można przechowywać w temperaturze pokojowej, pokryte PBS, do użycia tego samego dnia.

4. Rozprzestrzenianie się komórek B na szkiełkach nakrywkowych pokrytych anty-Ig

  1. Przygotować modyfikowaną sól fizjologiczną buforowaną przez HEPES (mHBS): 25 mM HEPES, pH 7,2, 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM Na2HPO4, 0,5 mMMgSO4, 1 mg/ml dekstrozy, 2 mM glutamina, 1 mM pirogronian sodu i 50 μM 2-merkaptoetanol). Przefiltrować, wysterylizować ten roztwór i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  2. W dniu eksperymentu przygotuj 50 ml mHBS z 2% FBS (mHBS-FBS), dodając 1 ml inaktywowanego termicznie FBS do 50 ml mHBS. Przed użyciem podgrzej mHBS-FBS do temperatury 37 °C.
  3. Odwirować transfekowane komórki A20 lub pierwszorzędowe komórki B, które były hodowane z BAFF plus LPS w temperaturze 525 x g przez 5 minut.
  4. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml mHBS-FBS, policzyć komórki za pomocą hemocytometru i rozcieńczyć komórki do 2 x 105 komórek/ml w mHBS-FBS.
  5. Za pomocą kleszczy przenieś szkiełko nakrywkowe z płytki do hodowli tkankowej na kawałek filmu parafinowego.
  6. Dodaj 250 μl komórek B (5 x 104 komórki) do każdego szkiełka nakrywkowego.
  7. Inkubować szkiełka nakrywkowe w temperaturze 37 °C przez 15 minut w ciemności, aby umożliwić licytom B rozprzestrzenienie się na powierzchni pokrytej anty-IgG.

5. Utrwalanie i barwienie immunologiczne komórek

  1. Przygotować roztwór utrwalający, rozcieńczając 16% roztwór podstawowy paraformaldehydu i 50% roztwór podstawowy aldehydu glutarowego w wodzie destylowanej o temperaturze pokojowej, aby uzyskać końcowe stężenia 3% paraformaldehydu i 0,1% aldehydu glutarowego. Przygotować roztwór utrwalający w dniu, w którym ma być użyty, i wyrzucić jego nadmiar.
    UWAGA: Roztwory podstawowe paraformaldehydu i aldehydu glutarowego powinny być używane wyłącznie w wyciągach chemicznych. Postępuj zgodnie z instrukcjami zawartymi w karcie charakterystyki substancji niebezpiecznej (MSDS).
  2. Przygotować bufor przepuszczalny/blokujący (3% BSA i 0,1% Triton X-100 rozcieńczone w PBS). Przefiltrować, wysterylizować ten roztwór i przechowywać w temperaturze 4 °C. W dniu eksperymentu podgrzej wymaganą ilość do temperatury pokojowej.
  3. Przygotować bufor barwiący (1% BSA i 0,1% saponiny w PBS). Wysterylizuj ten roztwór za pomocą filtra 0,2 μm i przechowuj w temperaturze 4 °C. W dniu eksperymentu podgrzej wymaganą ilość do temperatury pokojowej.
  4. Odmierzyć pipetą 350 μl roztworu utrwalającego na każde szkiełko nakrywkowe, upewniając się, że powierzchnia jest całkowicie pokryta. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut w ciemności.
  5. Usunąć roztwór utrwalający ze szkiełka nakrywkowego, ostrożnie odsysając go od krawędzi szkiełka nakrywkowego za pomocą mikropipety.
    UWAGA: Roztwór utrwalający należy wyrzucić jako niebezpieczne odpady chemiczne.
  6. Szkiełka nakrywkowe przemyć jednorazowo 500 μl buforu przepuszczalnego/blokującego. Odpipetować płyn.
  7. Przepuszczalność i blokowanie komórek poprzez dodanie 250 μl buforu przepuszczalnego/blokującego do każdego szkiełka nakrywkowego i inkubację przez 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
  8. Rozcieńczyć królicze przeciwciało antytubulinowe w stosunku 1:100 w buforze barwiącym.
  9. Odessać bufor przepuszczalny/blokujący ze szkiełek nakrywkowych i dodać 50 μl rozcieńczonego roztworu przeciwciała antytubulinowego do każdego szkiełka nakrywkowego. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut w ciemności.
  10. Przygotuj drugorzędowy roztwór barwienia przeciwciała/aktyny, rozcieńczając zarówno sprzężone z kozią przeciwciałem anty-króliczą IgG Alexa Fluor 532, jak i sprzężoną z Alexa Fluor 568 falloidyną w stosunku 1:100 w buforze barwiącym.
  11. Umyj szkiełka nakrywkowe 3 razy, aby usunąć nadmiar przeciwciał pierwszorzędowych, dodając 500 μl buforu barwiącego, a następnie odsysając go.
  12. Dodać 50 μl drugorzędowego roztworu barwienia przeciwciała/aktyny do każdego szkiełka nakrywkowego i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
  13. Umyj szkiełka nakrywkowe 3 razy, aby usunąć nadmiar przeciwciał drugorzędowych, dodając 500 μl buforu barwiącego, a następnie odsysając go.
  14. Dodać 10 μl odczynnika montażowego do szkiełka mikroskopowego. Zamontuj szkiełko nakrywkowe na szkiełku mikroskopowym stroną z komórką skierowaną w dół.
    UWAGA: Zdecydowanie zaleca się stosowanie środka montażowego "zapobiegającego blaknięciu" (patrz Tabela materiałów) w celu zachowania intensywności fluorescencji białek fuzyjnych GFP. Unikaj stosowania odczynników montażowych zawierających DAPI, które mogą zakłócać obrazowanie fluoroforów podczas korzystania z lasera STED.
  15. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia przez noc w ciemności. Zobrazuj slajdy następnego dnia.
    UWAGA: Zdecydowanie zaleca się obrazowanie szkiełek nakrywkowych, gdy tylko szkiełko nakrywkowe wyschnie, ponieważ fluorescencja GFP będzie się zmniejszać z czasem.

6. Obrazowanie za pomocą mikroskopu STED

UWAGA: Proszę zauważyć, że wszystkie opisane poniżej kroki oprogramowania są specyficzne dla używanego przez nas mikroskopu i oprogramowania (zobacz Tabelę materiałów). Kroki i ustawienia będą musiały zostać dostosowane, jeśli obrazowanie jest wykonywane przy użyciu innego mikroskopu/oprogramowania.

  1. Włącz mikroskop STED, aktywuj lasery i lampę oświetlenia epifluorescencyjnego, a następnie uruchom oprogramowanie mikroskopu.
  2. Ustaw parametry dla laserów zubożających STED.
    UWAGA: Będzie to zależeć od konkretnego używanego mikroskopu i laserów, w które jest wyposażony. Niektóre zalecane ustawienia to białe światło (WLL) 70%; Laser 592 nm 80%; Laser 660 nm 80%.
  3. Aktywuj ustawienia STED i wyrównaj wiązki laserowe STED za pomocą obiektywu 100X.
  4. Za pomocą okularu ustawić ostrość próbki i wybrać komórkę o umiarkowanym wyrażeniu GFP.
    UWAGA: Niska ekspresja GFP nie będzie widoczna, ponieważ STED zmniejsza intensywność emisji. I odwrotnie, wysoka ekspresja CLIP-170-GFP indukuje spontaniczne tworzenie dużych klastrów, co nie odzwierciedla normalnej morfologii i rozmieszczenia kompleksu białek plus-end mikrotubul. Wybór komórki o umiarkowanej ekspresji GFP jest niezbędny do dokładnego obrazowania struktur cytoszkieletu w miejscu kontaktu z antygenem.
  5. Powiększ wybraną komórkę i wybierz obszar zainteresowania, który ma zostać zobrazowany. Dostosuj ostrość tak, aby płaszczyzna x-y komórki B, która znajduje się najbliżej szkiełka nakrywkowego, była wyostrzona.
    1. Aby to zrobić, stopniowo przesuwaj obiektyw bliżej szkiełka nakrywkowego, tak aby struktury cytoszkieletu komórek B znalazły się w ostrości, a następnie straciły ostrość. Następnie stopniowo przesuwaj obiektyw w przeciwnym kierunku, aż struktury cytoszkieletu komórek B po raz pierwszy powrócą do ostrości.
  6. Zoptymalizuj ustawienia, w tym moc lasera, wiązkę wzbudzenia i zasięg detektora. Zacznij od ustawień zalecanych przez instrukcje producenta. Następnie w razie potrzeby dokonaj korekt, aby zoptymalizować sygnał dla próbek. Zobrazuj wszystkie próbki, które mają być ze sobą porównane, przy tych samych ustawieniach.
  7. W zakładce "pobierz" oprogramowania ustaw akwizycję obrazu na sekwencyjną akwizycję klatek w lewym dolnym panelu "Skanowanie sekwencyjne", zaznaczając opcję "między klatkami".
  8. Ustawianie sekwencji pobierania.
    Uwaga: Najpierw pozyskujemy fluorescencję GFP, aby uniknąć degradacji sygnału GFP.
    W zależności od kombinacji fluoroforów, które są używane jako dodatek do GFP, obrazowanie najpierw sygnału fluorescencji o większej długości fali może przynieść lepsze wyniki. Jednak kolejność, w jakiej fluorofory lub białka fluorescencyjne są poddawane stymulowanemu zubożeniu emisji i obrazowane, powinna być zoptymalizowana w celu uzyskania najsilniejszych sygnałów fluorescencyjnych i najlepszej rozdzielczości.
  9. Wybierz i ustaw moc lasera STED dla każdego fluoroforu w zakładce "Nabycie" w oprogramowaniu i użyj suwaka dla lasera STED 592 nm lub 660 nm, aby dostosować moc lasera. Dostosuj moc lasera zubożającego 592 nm dla GFP i dla Alexa Fluor 532. Dostosuj moc lasera zubożającego 660 nm dla Alexa Fluor 568.
  10. Aby zwiększyć rozdzielczość i zmniejszyć sygnał tła, przejdź do ustawień "Akwizycja" w zakładce "Pobieranie" oprogramowania, zwiększ uśrednianie linii i/lub ramki, wybierając wartość większą niż 1 za pomocą menu rozwijanego dla każdej opcji.
  11. Sygnał fluorescencyjny należy również uzyskać za pomocą bramkowanego czasowo STED, sprawdzając opcję bramkowania dla fluoroforu w zakładce "Acquire" i określając wartości bramkowania czasowego (patrz uwaga poniżej). Zwiększ moc lasera STED, aby zwiększyć rozdzielczość, ale zwiększy to również fotowybielanie fluoroforów.
    UWAGA: Czas bramkowania będzie musiał być zoptymalizowany dla używanego mikroskopu, próbki i fluoroforów. Zalecane jest bramkowanie czasowe od 0,3 do 6 ns. Po utrwaleniu GFP jest szczególnie wrażliwy na dużą moc lasera. Aby zmniejszyć fotowybielanie GFP, należy zastosować bramkowanie czasowe i zmniejszyć moc lasera STED.
  12. Aby przechwycić obrazy 3D STED, użyj suwaka, aby zmienić funkcję rozproszenia punktowego (PSF) na "3D STED".
  13. Ręczne pozyskiwanie wielu obrazów w celu zapewnienia odtwarzalności. Zdekonwolucjonizuj obrazy (patrz Rysunek 1) za pomocą pakietu oprogramowania do dekonwolucji41 (patrz Tabela materiałów).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W przypadku limfocytów B rozprzestrzeniających się na unieruchomionym przeciwciałach anty-Ig, mikroskopia STED stosowana w połączeniu z oprogramowaniem do dekonwolucji zapewnia obrazy struktur cytoszkieletu o wyższej rozdzielczości niż mikroskopia konfokalna. Jest to widoczne na Rysunku 1, gdzie sieć F-aktyny została zwizualizowana zgodnie z opisanym powyżej protokołem. Porównanie obrazów konfokalnych i obrazów superrozdzielczych STED tej samej próbki pokazuj...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Szczegółowe obrazy struktur cytoszkieletu można uzyskać za pomocą mikroskopii superrozdzielczej STED, która teoretycznie może osiągnąć rozdzielczość 50 nm, w porównaniu z konwencjonalną mikroskopią konfokalną, dla której rozdzielczość ograniczona dyfrakcją wynosi ~200 nm24. Zdolność do rozpoznawania drobniejszych struktur jest dodatkowo zwiększona dzięki zastosowaniu oprogramowania do dekonwolucji do obliczenia najbardziej prawdopodobnej pozycji oryginalnego źródła światła na podstawie obserwowane...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Instytutowi Nauk Przyrodniczych UBC (LSI) za wsparcie i utrzymanie mikroskopu SED. Ta praca została sfinansowana z grantu #68865 z Kanadyjskiego Instytutu Badań nad Zdrowiem (dla MRG). Dziękujemy dr Kozo Kaibuchi (Nagoya University, Nagoya, Japonia) za plazmid CLIP-170-GFP.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Cell culture
A20 mysie komórki chłoniaka BATCCTIB-208Mysi chłoniak z komórek B pochodzenia Balb/c, który na swojej powierzchni wykazuje ekspresję BCR zawierającego IgG
RPMI-1640Thermo Fisher Scientific  R0883
Płodowa surowica bydlęcaThermo Fisher Scientific12483020Inaktywacja ciepła w temperaturze 56 oC przez 30 min
2-merkaptoetanolMillipore SigmaM3148
GlutaminaMillipore SigmaG5763
Pirogronian soduMillipore SigmaP5280
Penicylina-StreptomycynaThermo Fisher Scientific15140122Liquid, 10 000 jednostek
Dodatkowe materiały do pierwotnych limfocytów B
70-&mikro; m Sitko do komórekCorning352350
Magnetyczny zestaw do izolacji komórek B na bazie kulekStemcell Technologies19854EasySep Zestaw do izolacji komórek B myszy
Lipopolisacharyd (LPS)Millipore SigmaL4391LPS z E. coli 0111:B4
Czynnik aktywujący komórki B (BAFF)R& D Systems2106-BF-010
NazwaFirmaNumer katalogowyUwagi
>Transfekcja
Kodowanie plazmidu CLIP-170-GFPPrezent od dr Kozo Kaibuchi (Nagoya Univ., Nagoya, Japonia); opisane w Fukata et al. Cell 109:873-885, 2002
Zalecane odczynniki i sprzęt do transfekcji
Amaxa Zestaw do Nucleofection VLonzaVCA-1003Postępuj zgodnie ze wskazówkami producenta dotyczącymi mieszania odczynników do transfekcji z DNA
Amaxa Nucleofector model 2bLonzaAAB-1001Program L-013 używany
Płytki 6-dołkowe Falcon, poddane działaniu TC, sterylneCorning353046
NazwaCompanyNumer katalogowyUwagi
Coating szkiełka nakrywkowe
18-mm średnica okrągłe #1,5 szkła nakrywkoweThomas Scientific1217N81Podobny produkt: Marienfield-Superior Katalog #117580
KleszczeFisher Scientific1381242Ekstra drobne kleszczyki do odłamków
Falcon 12-dołkowa sterylna płytka do hodowli tkanek polistyrenowychFalcon353043
100% metanolFisher ScientificA412-4
Sterylna sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) bez wapnia i magnezuThermo Fisher Scientific10010049
Kozie przeciwciało anty-mysie IgGJackson ImmunoResearch115-005-008Dla komórek A20
Kozie przeciwciało anty-mysie IgMJackson ImmunoResearch115-005-020Dla pierwotnych mysich limfocytów B
< silny>Nazwa< / silny>FirmaNumer katalogowyKomentarze
>Barwienie
Paraformaldehyd (16% roztwór podstawowy)Mikroskopia elektronowaSciences 15710Rozcieńczyć PBS do stężenia roboczego
Aldehyd glutarowy (50% roztwór podstawowy)Millipore Sigma340855Rozcieńczyć PBS do stężenia roboczego
Triton X-100Fisher ScientificBP151-500
SaponinMillipore SigmaS2149
Albumina surowicy bydlęcej (BSA), frakcja VMillipore Sigma10735094001
Rabbit przeciwciało antytubulinoweAbcamab528661:250 zalecane, ale powinno być zoptymalizowane
Alexa Fluor 532-sprzężona koza anty-królicza IgGThermo Fisher ScientificA11009Zalecane rozcieńczenie 1:100, ale powinno być zoptymalizowane
Falloidyna sprzężona z Alexa Fluor 568Thermo Fisher ScientificA12380:100 zalecane, ale należy je zoptymalizować
Przedłuż diamentowy uchwyt zapobiegający blaknięciuThermo Fisher ScientificP36970bez DAPI
Szkiełka mikroskopowe Fisherbrand Superfrost PlusFisher Scientific12-550-15
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Materiały
ParafilmVWRP1150-2
HEPESMillipore SigmaH3375
NaClFisher ScientificBP358
KClMillipore SigmaP9333
CaCl2Millipore SigmaC1016
Na2HPO4FisherScientific S374-500
MgSO4Fisher ScientificM63
DekstrozaFisher ScientificD16-500
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mikroskopia
Leica SP8 TCS STEDLeica
Huygens oprogramowanie do dekonwolucjiNaukowe obrazowanieZobacz https://svi.nl/HuygensProducts
1 mikroskop Voume

Bibliografia

  1. Harwood, N. E., Batista, F. D. The cytoskeleton coordinates the early events of B-cell activation. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (2), a002360(2011).
  2. Batista, F. D., Treanor, B., Harwood, N. E. Visualizing a role for the actin cytoskeleton in the regulation of B-cell activation. Immunol Rev. 237 (1), 191-204 (2010).
  3. Harwood, N. E., Batista, F. D. Early events in B cell activation. Annu Rev Immunol. 28, 185-210 (2010).
  4. Batista, F. D., Harwood, N. E. The who, how and where of antigen presentation to B cells. Nat Rev Immunol. 9 (1), 15-27 (2009).
  5. Kumari, S., et al. T cell antigen receptor activation and actin cytoskeleton remodeling. Biochim Biophys Acta. 1838 (2), 546-556 (2014).
  6. Dustin, M. L. Visualization of Cell-Cell Interaction Contacts: Synapses and Kinapses. Self Nonself. 2 (2), 85-97 (2011).
  7. Dustin, M. L., Chakraborty, A. K., Shaw, A. S. Understanding the Structure and Function of the Immunological Synapse. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (10), a002311(2010).
  8. Dustin, M. L. Modular design of immunological synapses and kinapses. Cold Spring Harb Perspect Biol. 1 (1), a002873(2009).
  9. Dustin, M. L. Visualization of cell-cell interaction contacts-synapses and kinapses. Adv Exp Med Biol. 640, 164-182 (2008).
  10. Dustin, M. L. Hunter to gatherer and back: immunological synapses and kinapses as variations on the theme of amoeboid locomotion. Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 577-596 (2008).
  11. Dustin, M. L. T-cell activation through immunological synapses and kinapses. Immunol Rev. 221, 77-89 (2008).
  12. Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
  13. Monks, C. R., et al. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).
  14. Yuseff, M. I., et al. How B cells capture, process and present antigens: a crucial role for cell polarity. Nat Rev Immunol. 13 (7), 475-486 (2013).
  15. Mattila, P. K., Batista, F. D., Treanor, B. Dynamics of the actin cytoskeleton mediates receptor cross talk: An emerging concept in tuning receptor signaling. J Cell Biol. 212 (3), 267-280 (2016).
  16. Kuhn, J. R., Poenie, M. Dynamic polarization of the microtubule cytoskeleton during CTL-mediated killing. Immunity. 16 (1), 111-121 (2002).
  17. Wang, J. C., et al. The Rap1-cofilin-1 pathway coordinates actin reorganization and MTOC polarization at the B cell immune synapse. J Cell Sci. 130 (6), 1094-1109 (2017).
  18. Schnyder, T., et al. B cell receptor-mediated antigen gathering requires ubiquitin ligase Cbl and adaptors Grb2 and Dok-3 to recruit dynein to the signaling microcluster. Immunity. 34 (6), 905-918 (2011).
  19. Nath, S., et al. Dynein Separately Partners with NDE1 and Dynactin To Orchestrate T Cell Focused Secretion. J Immunol. 197 (6), 2090-2101 (2016).
  20. Combs, J., et al. Recruitment of dynein to the Jurkat immunological synapse. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (40), 14883-14888 (2006).
  21. Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Control of microtubule organization and dynamics: two ends in the limelight. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (12), 711-726 (2015).
  22. Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Microtubule +TIPs at a glance. J Cell Sci. 123 (20), 3415-3419 (2010).
  23. Fukata, M., et al. Rac1 and Cdc42 capture microtubules through IQGAP1 and CLIP-170. Cell. 109 (7), 873-885 (2002).
  24. Wegel, E., et al. Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison. Sci Rep. 6, 27290(2016).
  25. Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. Super-resolution fluorescence microscopy. Annu Rev Biochem. 78, 993-1016 (2009).
  26. Mace, E. M., Orange, J. S. Dual channel STED nanoscopy of lytic granules on actin filaments in natural killer cells. Commun Integr Biol. 5 (2), 184-186 (2012).
  27. Ritter, A. T., et al. Actin depletion initiates events leading to granule secretion at the immunological synapse. Immunity. 42 (5), 864-876 (2015).
  28. Tamarit, B., et al. Membrane microdomains and cytoskeleton organization shape and regulate the IL-7 receptor signalosome in human CD4 T-cells. J Biol Chem. 288 (12), 8691-8701 (2013).
  29. Brown, A. C., et al. Super-resolution imaging of remodeled synaptic actin reveals different synergies between NK cell receptors and integrins. Blood. 120 (18), 3729-3740 (2012).
  30. Dupre, L., et al. T Lymphocyte Migration: An Action Movie Starring the Actin and Associated Actors. Front Immunol. 6, 586(2015).
  31. Rak, G. D., et al. Natural killer cell lytic granule secretion occurs through a pervasive actin network at the immune synapse. PLoS Biol. 9 (9), e1001151(2011).
  32. Lin, K. B., et al. The Rap GTPases regulate the migration, invasiveness and in vivo dissemination of B-cell lymphomas. Oncogene. 29 (4), 608-615 (2010).
  33. Lin, K. B., et al. The rap GTPases regulate B cell morphology, immune-synapse formation, and signaling by particulate B cell receptor ligands. Immunity. 28 (1), 75-87 (2008).
  34. McLeod, S. J., et al. The Rap GTPases regulate integrin-mediated adhesion, cell spreading, actin polymerization, and Pyk2 tyrosine phosphorylation in B lymphocytes. J. Biol. Chem. 279 (13), 12009-12019 (2004).
  35. Christian, S. L., et al. Activation of the Rap GTPases in B lymphocytes modulates B cell antigen receptor-induced activation of Akt but has no effect on MAPK activation. J Biol Chem. 278 (43), 41756-41767 (2003).
  36. Batista, F. D., Iber, D., Neuberger, M. S. B cells acquire antigen from target cells after synapse formation. Nature. 411 (6836), 489-494 (2001).
  37. Treanor, B., et al. Dynamic cortical actin remodeling by ERM proteins controls BCR microcluster organization and integrity. J Exp Med. 208 (5), 1055-1068 (2011).
  38. Mattila, P. K., et al. The actin and tetraspanin networks organize receptor nanoclusters to regulate B cell receptor-mediated signaling. Immunity. 38 (3), 461-474 (2013).
  39. Yuseff, M. -I., et al. Polarized Secretion of Lysosomes at the B Cell Synapse Couples Antigen Extraction to Processing and Presentation. Immunity. 35 (3), 361-374 (2011).
  40. Mace, E. M., Orange, J. S. Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy. J Vis Exp. (85), (2014).
  41. Russ, J. C. The Image Processing Handbook, Sixth Edition. , CRC Press. (2011).
  42. Stinchcombe, J. C., et al. Centrosome polarization delivers secretory granules to the immunological synapse. Nature. 443 (7110), 462-465 (2006).
  43. Vicidomini, G., et al. Sharper low-power STED nanoscopy by time gating. Nat Methods. 8 (7), 571-573 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

cytoszkielet aktynowycytoszkielet mikrotubularnyreorganizacja cytoszkieletutworzenie synapsy immunologicznejbia ka znakowane GFPprotok rozprzestrzeniania kom rekdekonwolucja obrazufluorescencyjne bia ka fuzyjne

Powiązane artykuły