Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Metody in vitro i in vivo w celu określenia przepuszczalności komórek nabłonka jelitowego

26K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57032

⸱

19 października 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Jiangsu Key Laboratory of Neuropsychiatric Diseases and Cambridge-Suda (CAM-SU) Genome Resource Center, Soochow University, 2Department of Oncology, The First Affiliated Hospital of Soochow University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Dwie metody są tutaj przedstawione do określenia funkcji bariery jelitowej. Miernik nabłonka (wolt/om) służy do pomiarów transnabłonkowej rezystancji elektrycznej nabłonka hodowanego bezpośrednio w studzienkach do hodowli tkankowych. U myszy metodę zgłębnika FITC-dekstranu stosuje się do określenia przepuszczalności jelit in vivo.

Streszczenie

Bariera jelitowa chroni przed chorobotwórczymi mikroorganizmami i toksynami mikrobiologicznymi. Jego funkcja jest regulowana przez przepuszczalność połączeń ścisłych i integralność komórek nabłonka, a zaburzenie funkcji bariery jelitowej przyczynia się do postępu choroby przewodu pokarmowego i ogólnoustrojowej. Opisano tutaj dwie proste metody pomiaru przepuszczalności nabłonka jelitowego. In vitro komórki Caco-2BBe są siane w studzienkach do hodowli tkankowych jako monowarstwa, a transepiteliczny opór elektryczny (TER) można mierzyć za pomocą nabłonkomierza (woltomierz/om). Metoda ta przekonuje przyjazną dla użytkownika obsługą i powtarzalnością. In vivo myszy są poddawane zgłębnikowaniu distranem izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC)-dektranu, a stężenia FITC-dekstranu mierzy się w próbkach surowicy pobranych od myszy w celu określenia przepuszczalności nabłonka. Zgłębnik doustny zapewnia dokładną dawkę i dlatego jest preferowaną metodą pomiaru przepuszczalności jelit in vivo. Podsumowując, te dwie metody mogą mierzyć przepuszczalność nabłonka jelitowego in vitro i in vivo, a tym samym być wykorzystywane do badania związku między chorobami a funkcją bariery.

Wprowadzenie

Komórki nabłonka jelitowego są nie tylko odpowiedzialne za wchłanianie składników odżywczych, ale także stanowią ważną barierę do obrony przed patogennymi mikroorganizmami i toksynami mikrobiologicznymi. Ta funkcja bariery jelitowej jest regulowana przez przepuszczalność połączeń ścisłych i integralność komórek nabłonka1,2,3, a dysfunkcja funkcji bariery nabłonkowej jest związana z nieswoistym zapaleniem jelit (IBD). Okołozłączowy pierścień aktomiozyny (PAMR) leży w komórce, która ściśle przylega do połączeń ścisłych. Skurcz PAMR, który jest regulowany przez lekki łańcuch miozyny (MLC), ma kluczowe znaczenie dla regulacji przepuszczalności połączeń ścisłych4,5,6,7,8,9,10. Czynnik martwicy nowotworu (TNF) ma kluczowe znaczenie dla utraty bariery jelitowej poprzez zwiększenie ekspresji nabłonkowej kinazy MLC (MLCK) jelita i indukowanie internalizacji okludyny11,12,13.

Jony takie jak Na+ i Cl- mogą przenikać przez przestrzeń parakomórkową zarówno przez pory jak i drogę przecieku14. W "nieszczelnym" nabłonku zmiany w TER odzwierciedlają przede wszystkim zmienioną przepuszczalność połączeń ścisłych. Pomiar TER jest powszechnie stosowanym podejściem elektrofizjologicznym do ilościowego określania przepuszczalności złączy ścisłych, głównie do Na+ i Cl-, w oparciu o impedancję monowarstw ogniw. Do pomiarów TER zgłoszono różne typy komórek, w tym komórki nabłonka jelitowego, komórki nabłonka płuc i komórki śródbłonka naczyń krwionośnych. Zaletą tej metody jest to, że pomiary TER są nieinwazyjne i mogą być wykorzystywane do monitorowania żywych komórek w czasie rzeczywistym. Ponadto technika pomiaru TER jest przydatna w badaniach toksyczności leków15.

Komórki Caco-2BBe to ludzkie komórki gruczolakoraka jelita grubego nabłonkowego o strukturze i funkcji podobnej do zróżnicowanych komórek nabłonka jelita cienkiego: na przykład, te komórki mają mikrokosmki i enzymy związane z granicą szczoteczki jelita cienkiego. Dlatego hodowane monowarstwy Caco-2BBe są wykorzystywane jako model in vitro do testowania funkcji bariery.

U myszy, jednym ze sposobów badania przepuszczalności parakomórkowej jelit jest pomiar zdolności FITC-dekstranu do przenikania ze światła do krwi. W ten sposób przepuszczalność jelit można ocenić, podając FITC-dekstran bezpośrednio myszom i mierząc fluorescencję we krwi. Poniższy protokół opisuje dwie proste metody oceny przepuszczalności nabłonka jelitowego zarówno in vitro, jak i in vivo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Badanie to zostało zatwierdzone przez Protokół Opieki i Korzystania ze Zwierząt Cambridge-Suda Genomic Resource Center (CAM-SU) Uniwersytetu Soochow.

1. Wysiewanie i hodowla linii Caco-2bbe na porowatych membranach poliwęglanowych

  1. Hodować komórki w kolbie T75 w pożywce (DMEM zawierającej 10% FBS). Kolby należy regularnie dokarmiać, w zależności od gęstości komórek.
    UWAGA: Dla optymalnego wysiewania komórki powinny szybko się dzielić i mieć płaski kształt „smażonego jajka”, co wskazuje, że komórki są w fazie wzrostu.
  2. Gdy komórki osiągną 80% konfluencji, wyjąć kolbę z inkubatora i usunąć pożywkę. Przepłukać resztki pożywki 1-2 mL sterylnego PBS (bez Ca2+). Pipetować 1,5 mL Trypsyny-EDTA do kolby i delikatnie nią wstrząsnąć; następnie umieścić kolbę w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 20 min bez wstrząsania.
  3. Podczas trypsynizacji komórek umieścić inserty zawierające porowate membrany poliwęglanowe (wielkość porów: 0,4 µm; powierzchnia: 0,3 cm2; patrz Tabela Materiałów) w płytkach 24-dołkowych. Dodać 1,0 mL pożywki hodowlanej do komory bazalnej (dolnej przestrzeni membrany).
  4. Pipetować 5 mL pożywki do kolby i energicznie pipetować komórki o ściankę kolby 5-10 razy, aby uzyskać luźne, pojedyncze komórki lub agregaty po 2-3 komórki.
  5. Wysiać 0,16 mL komórek (osiągając stosunek rozcieńczenia 1:8) do komory apikalnej (górnej przestrzeni membrany). Inkubować w 37 °C przez maksymalnie 3 tygodnie.
    1. Dokarmiać komórki trzy razy w tygodniu, ostrożnie aspirując pożywkę z przedziału bazalnego każdego dołka za pomocą pompy próżniowej. Delikatnie wkraplać 1 mL pożywki do komory apikalnej każdego insertu.

2. Użycie miernika nabłonkowego (Volt/Ohm) do pomiaru TER

UWAGA: Po około 3 tygodniach hodowli na membranach poliwęglanowych komórki Caco-2BBe są gotowe do pomiaru TER.

  1. W badaniach nad cytokinami, na jeden dzień przed pomiarem, należy zastąpić pożywkę podstawową pożywką zawierającą 10 ng/mL IFNγ. W dniu eksperymentu pożywkę należy zastąpić roztworem HBSS zawierającym 2,5 lub 7,5 ng/mL TNF.
    UWAGA: Leczenie IFNγ zwiększa ekspresję receptora TNF 2 (TNFR2)16.
  2. Aby skalibrować miernik, należy włożyć elektrodę korekcyjną do portu wejściowego (Input port) i wybrać tryb „Ohm”. Następnie należy regulować śrubę R Adj za pomocą śrubokręta, aż miernik wskaże wartość 1 0 Ω.
  3. Sterylizować elektrody, umieszczając je w 70% etanolu na 15–30 min, a następnie pozostawić do wyschnięcia na powietrzu przez 15 s. Przepłukać elektrodę w pożywce hodowlanej używanej w eksperymencie.
  4. Włącz zasilanie i wybierz tryb „Ohm”. Ostrożnie umieść długie końce mostków elektrod w komorze podstawnej, a krótkie końce w komorze apikalnej. Upewnij się, że dłuższe elektrody dotykają dna naczynia, natomiast krótsze elektrody znajdują się poniżej powierzchni medium, ale powyżej wkładów do hodowli tkankowej. Utrzymuj elektrody w pozycji pionowej.
  5. Zmierz oporność wkładów z próbką oraz wkładów ślepych (tj. wkładki hodowlane bez komórek, ale z HBSS) w 0, 1, 2, 3 i 4 h po traktowaniu cytokinami. Zapisz wartość rezystancji.
  6. Aby zapewnić spójność wyników dla różnych formatów płytek, należy obliczyć iloczyn rezystancji i efektywnej powierzchni membrany:
    Wzór na opór jednostkowy powierzchni: Ω·cm² = Opór (Ω) × Efektywna powierzchnia membrany (cm²).
    W przypadku wkładów 24-dołkowych efektywna powierzchnia membrany wynosi 0,33 cm²2.

3. Mysi model zapalenia jelita grubego indukowanego dekstranem siarczanem sodu (DSS)

  1. Dodać DSS do wody autoklawowanej do uzyskania końcowego stężenia 3,5% (mas/obj).
  2. Podawać 3,5% DSS 8-tygodniowym samcom myszy C57BL/6 przez łącznie 7 dni. Myszom kontrolnym podawać zwykłą wodę pitną bez DSS.
    1. Po 7. dniu zastąpić wodę zawierającą DSS zwykłą wodą pitną.
  3. Codziennie ważyć myszy i oceniać stan kliniczny każdego zwierzęcia. Znormalizować masę ciała każdej myszy do jej początkowej masy ciała. Wyniki punktowe definiuje się zgodnie z ciężkością choroby na podstawie czterech parametrów: wypadania odbytu (0-2), konsystencji stolca (0-2), krwawienia (0-2) oraz aktywności (0-2)5. Zsumować wyniki z tych parametrów, aby uzyskać końcowy wynik kliniczny.
  4. W celu analizy stanu histopatologicznego tkanki okrężnicy, 7 dni po zakończeniu leczenia DSS uśmiercić myszy poprzez wtryśnięcie do jamy otrzewnowej (i.p.) 1,2% (obj/obj) Avertinu (0,6 mL/10 g masy ciała). Aby przygotować roztwór stokowy 10% avertinu, zmieszać 10 g 2,2,2-tribromoetanolu z 10 ml tert-amylu alkoholu. Przechowywać w ciemności w temperaturze 4°C. Przed użyciem rozcieńczyć 10% roztwór stokowy do stężenia 2% w wodzie.
  5. Wyizolować okrężnicę oraz kątnicę, a następnie zmierzyć długość okrężnicy5.
  6. Wyciąć odcinki o długości 0,5 cm z dystalnej części okrężnicy i utrwalić w probówce Falcon o pojemności 15 mL zawierającej 10 mL 10% formaliny przez noc. Przemyć utrwalone tkanki szeregiem stężeń etanolu (75, 95 i 10%) oraz ksylenem. Zalać tkanki parafiną i wyciąć przekroje o grubości 6 mm do barwienia hematoksyliną i eozyną8.

4. Pomiar przepuszczalności bariery nabłonkowej u myszy z colitis indukowanym DSS

  1. Zmierz przepuszczalność bariery 7 dni po rozpoczęciu podawania DSS.
  2. W dniu analizy poddaj myszy 3-godzinnej głodówce.
  3. Autoklawuj igłę do zgłębnikowania w celu zapewnienia sterylności, następnie podaj myszom drogą zgłębnikową 150 µL 80 mg/mL 4 kDa FITC-dekstranu w sterylnej wodzie; zachowaj niewykorzystany FITC-dekstran do wyznaczenia krzywej wzorcowej po pobraniu surowicy. Zważ myszy w celu obliczenia przepuszczalności.
    UWAGA: Roztwór FITC-dekstranu należy przygotować w wodzie.
  4. Używając nożyczek, odetnij fragment ogona o długości 1 cm i pobierz 10 µL krwi z ogona do probówek do pobierania surowicy. Odwiruj pobraną krew przy 10,0 x g przez 10 min w temperaturze pokojowej.
  5. Rozcieńcz surowicę w wodzie w stosunku 1:4. Aby przygotować krzywą wzorcową, rozcieńcz niewykorzystany FITC-dekstran wodą w stosunkach 1:30, 1:1,00, 1:3,00, 1:10,0, 1:30,00, 1:100,00, 1:30,0, 1:1,0,00 oraz 1:3,00,0. Nanieś 10 µL na studzienkę surowicy oraz próbek z krzywej wzorcowej do płytek 96-dołkowych.
  6. Odczytaj fluorescencję w czytniku płytek przy wzbudzeniu 485 / emisji 528. Oblicz wartości przepuszczalności na podstawie krzywej wzorcowej i pomnóż je przez 4, aby skorygować rozcieńczenie.
  7. Podziel stężenie FITC-dekstranu przez masę ciała w celu normalizacji wartości (pomaga to zniwelować różnice w podaniu FITC-dekstranu w przypadku, gdy myszy są chore i utraciły na wadze).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W hodowli komórki Caco-2BBe rosną jako monowarstwa i powoli różnicują się w dojrzałe enterocyty chłonne posiadające rąbek szczoteczkowy. W niniejszym protokole komórki Caco-2BBe wysiano z wysoką gęstością na membranach poliwęglanowych, a komórki osiągnęły 10% konfluencji jeden dzień po wysianiu. Jednak na tym etapie komórki są nieróżnicowane: aby w pełni zróżnicować komórki, medium jest wymieniane co 2-3 dni przez okres 3 tygodni. Komórki wybarwiono barwnikami do jąder komórkowych oraz F-...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W protokole znajduje się kilka krytycznych kroków. Komórki Caco-2BBe (wyrażające granicę szczoteczki) są zawsze używane do pomiaru TER, wybrane z linii komórkowej Caco-2 do ekspresji białek na granicy szczoteczki. Komórki Caco-2BBe mają fenotyp absorpcyjny kosmków, gdy są w pełni zróżnicowane (po około 3 tygodniach hodowli po konfluencji)17. Konieczne jest unikanie zanieczyszczenia podczas pomiaru i sterylizacja elektrody. Ponieważ procedura jest niesterylna, w większości przypadków pomiary można ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

Dziękujemy dr Jerroldowi R. Turnerowi z Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, za jego hojną pomoc w ukończeniu tego badania. Praca ta jest wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (grant nr 81470804, 31401229 i 81200620), Fundację Nauk Przyrodniczych prowincji Jiangsu (numer grantu BK20180838 i BK20140319), Program Innowacji Badawczych dla Absolwentów Szkół Wyższych w prowincji Jiangsu (numer grantu KYLX16-0116), Zaawansowane Projekty Badawcze Uniwersytetu Soochow (numer grantu SDY2015_06), oraz Crohn's & Colitis Foundation Research Fellowship Award (grant numer 310801).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Igła do zgłębnika 22 GVWR20068-608
4 kDa FITC-dekstranSigma46944
AvertinSigmaT48402
Czarne 96-dołkowe płytki do fluorescencjiFisher14-245-197A
C57/B6Nanjing Instytut Badań Biomedycznych Uniwersytetu
Komórki Caco-2BBeATCCCRL-2102
Siarczan dekstranu soduMP Biomedicals2160110
DMED z wysoką jakością glukozy i pirogronianem soduHyklonSH30243.01B
Miernik nabłonka (wolt/om)Millicell-ERSMERS00002
EtanolSinopharm ChemicalOdczynnik10009218
probówka Falcon (15 ml)Corning
FBSGibco10437-028
Mikroskop fluorescencyjnyOlympusFV1000
FluorometrBiotekSynergy 2
HBSS138 mM NaCl, 0,3 mM Na2HPO4, 0,4 mM MgSO4, 0,5 mM MgCl2, 5,0 mM KCl, 0,3 mM KH2PO4, 15,0 mM HEPES, 1,3 mM CaCl2, 25 mM glukozy 
IFNgPeproTech315-05-20
Modułowe centrum zatapiania tkanekProbówki do pobierania serum LeicaEG1150H
Sarstedt41.1378.005
Kolba T75corning430641
TNFPeproTech315-01A
ParraffinSigmaA6330-1CS
Membrany poliwęglanowe (Transwell)Costar3413
Pompa ciśnieniowaAUTOSCIENCEAP-9925
Mikrotomia rotacyjnaLeicaRM2235
Trypsin-EDTAGibco25200-056
KsylenSinopharm ChemicalOdczynnik10023418
w Nankinie430791

Bibliografia

  1. Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nature reviews. Immunology. 9, 799-809 (2009).
  2. Odenwald, M. A., Turner, J. R. The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target? Nature reviews. Gastroenterology & hepatology. 14, 9-21 (2017).
  3. Clarke, H., Soler, A. P., Mullin, J. M. Protein kinase C activation leads to dephosphorylation of occludin and tight junction permeability increase in LLC-PK1 epithelial cell sheets. J. Cell Sci. 113 (Pt 18), 3187-3196 (2000).
  4. Clayburgh, D. R., et al. A differentiation-dependent splice variant of myosin light chain kinase, MLCK1, regulates epithelial tight junction permeability. J.Biol. Chem. 279, 55506-55513 (2004).
  5. Su, L., et al. TNFR2 activates MLCK-dependent tight junction dysregulation to cause apoptosis-mediated barrier loss and experimental colitis. Gastroenterology. 145, 407-415 (2013).
  6. Su, L., et al. Targeted epithelial tight junction dysfunction causes immune activation and contributes to development of experimental colitis. Gastroenterology. 136, 551-563 (2009).
  7. Zha, J. M., et al. Characterization of isoform expression and subcellular distribution of MYPT1 in intestinal epithelial cells. Gene. 588, 1-6 (2016).
  8. He, W. Q., et al. Altered contractile phenotypes of intestinal smooth muscle in mice deficient in myosin phosphatase target subunit 1. Gastroenterology. 144, e1451-e1455 (2013).
  9. He, W. Q., et al. Myosin light chain kinase is central to smooth muscle contraction and required for gastrointestinal motility in mice. Gastroenterology. 135, 610-620 (2008).
  10. Li, H. S., et al. Myosin regulatory light chain phosphorylation is associated with leiomyosarcoma development. Biomed. Pharmacother. 92, 810-818 (2017).
  11. Clayburgh, D. R., et al. Epithelial myosin light chain kinase-dependent barrier dysfunction mediates T cell activation-induced diarrhea in vivo. J. Clin. Invest. 115, 2702-2715 (2005).
  12. Wang, F., et al. Interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha synergize to induce intestinal epithelial barrier dysfunction by up-regulating myosin light chain kinase expression. Am. J. Pathol. 166, 409-419 (2005).
  13. Ye, D., Ma, T. Y. Cellular and molecular mechanisms that mediate basal and tumour necrosis factor-alpha-induced regulation of myosin light chain kinase gene activity. J. Cell Mol. Med. 12, 1331-1346 (2008).
  14. Turner, J. R., Buschmann, M. M., Romero-Calvo, I., Sailer, A., Shen, L. The role of molecular remodeling in differential regulation of tight junction 300 permeability. Semin. Cell Dev. Biol. 36, 204-212 (2014).
  15. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. J. Lab. Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
  16. Wang, F., et al. IFN-gamma-induced TNFR2 expression is required for TNF-dependent intestinal epithelial barrier dysfunction. Gastroenterology. 131, 1153-1163 (2006).
  17. Peterson, M. D., Mooseker, M. S. Characterization of the enterocyte-like brush border cytoskeleton of the C2BBe clones of the human intestinal cell line Caco-2. J. Cell Sci. 102 (Pt 3), 581-600 (1992).
  18. Wang, L., et al. Methods to determine intestinal permeability and bacterial translocation during liver disease. J. Immunol. Methods. 421, 44-53 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Przepuszczalność nabłonka jelitowegooporność elektryczna nabłonkakomórki Caco-2BBetest z FITC-dekstranemmetoda zgłębnika doustnegozapalenie jelita grubego indukowane DSSpomiar TERmonowarstwa hodowli komórkowejdetekcja fluorescencyjnaanaliza histopatologiczna
Metody in vitro i in vivo w celu określenia przepuszczalności komórek nabłonka jelitowego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.