Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Proliferacja i różnicowanie mysich komórek prekursorowych mieloidu 32D/G-CSF-R

9.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57033

⸱

21 lutego 2018

 ,  ,  , 
1Department of Hemato-Oncology, Institute of Molecular Genetics of the ASCR, 2Childhood Leukaemia Investigation Prague, Department of Paediatric Haematology and Oncology, 2nd Faculty of Medicine, Charles University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj przedstawiono szczegółowe protokoły hodowli mysiego prekursora mieloidu linii komórkowej 32D/G-CSF-R, przeprowadzania infekcji wirusowych oraz przeprowadzania testów proliferacji i różnicowania. Ta linia komórkowa nadaje się do badania rozwoju komórek szpikowych oraz roli genów będących przedmiotem zainteresowania we wzroście komórek szpikowych i różnicowaniu neutrofilów.

Streszczenie

Zrozumienie biologii komórek macierzystych i progenitorowych ma ważne implikacje dla medycyny regeneracyjnej i leczenia patologii hematologicznych. Pomimo najistotniejszych danych, które można uzyskać za pomocą modeli in vivo lub hodowli pierwotnych, niska liczebność hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych znacznie ogranicza pulę odpowiednich technik do ich badania. W związku z tym wykorzystanie linii komórkowych pozwala na wystarczającą produkcję materiału biologicznego do wykonywania badań przesiewowych lub testów, które wymagają dużej liczby komórek. Poniżej przedstawiamy szczegółowy opis, odczyt i interpretację testów proliferacji i różnicowania, które są wykorzystywane do badania procesów związanych z mielopoezą i różnicowaniem neutrofilowym. Eksperymenty te wykorzystują zależną od cytokin mysią linię komórek szpikowych 32D / G-CSF-R, która posiada zdolność do proliferacji w obecności IL-3 i różnicowania się w G-CSF. Zapewniamy zoptymalizowane protokoły obsługi komórek 32D/G-CSF-R i omawiamy główne pułapki i wady, które mogą zagrozić opisanym testom i oczekiwanym wynikom. Dodatkowo artykuł ten zawiera protokoły wytwarzania, miareczkowania i transdukcji komórek 32D/G-CSF-R w lentiwirusach i retrowirusach. Wykazaliśmy, że manipulacja genetyczna tych komórek może być wykorzystana do skutecznego przeprowadzenia badań funkcjonalnych i molekularnych, które mogą uzupełnić wyniki uzyskane z pierwotnymi krwiotwórczymi komórkami macierzystymi i progenitorowymi lub modelami in vivo.

Wprowadzenie

Populacja krwiotwórczych komórek macierzystych i progenitorowych dostarcza organizmowi wiele dojrzałych komórek, w tym komórek z linii szpikowej (neutrofile, eozynofile, bazofile i monocyty). Proces, który napędza produkcję komórek szpikowych z hematopoetycznych komórek macierzystych, jest znany jako mielopoeza, a odpowiednia produkcja dojrzałych komórek szpikowych w odpowiedzi na zmieniające się zapotrzebowanie jest warunkiem prawidłowego radzenia sobie organizmu z warunkami stresowymi, takimi jak infekcje i utrata krwi. Niewystarczająca produkcja dojrzałych komórek szpikowych może prowadzić do niezdolności do eliminacji patogenów, zmniejszonej krzepliwości krwi i innych stanów zagrażających życiu1,2. Ponadto zmiany w rozwoju linii szpikowej mogą być również związane z nowotworami hematologicznymi, takimi jak ostra białaczka szpikowa (AML)3. Zmiany w mielopoezie mogą wystąpić z różnych powodów, takich jak defekty w receptorach powierzchniowych komórek4, zmieniona ekspresja czynników transkrypcyjnych5, upośledzone szlaki sygnałowe6, mutacje powodujące powstawanie/aktywację onkogenów7, lub inaktywacja genów supresorowych nowotworów8.

Opracowano różne metody badania rozwoju szpiku i oceny wpływu określonych zmian genetycznych w tym procesie. Typowe podejścia stosowane do badania mielopoezy obejmują komórki pierwotne i myszy transgeniczne. Chociaż modele te umożliwiają pozyskiwanie danych istotnych z biologicznego punktu widzenia, mają pewne ograniczenia. Użycie komórek pierwotnych wiąże się z ograniczoną liczbą komórek i ograniczonym okresem hodowli, co zawęża możliwości zmiany ekspresji genów i późniejszej analizy biologicznej lub biochemicznej. Myszy transgeniczne są kosztowne i wymagają rozsądnego stopnia uzasadnienia biologicznego. Ponadto praca z modelami in vivo zwiększa stopień złożoności zrozumienia roli genu będącego przedmiotem zainteresowania w danym procesie. W związku z tym potrzebne są alternatywne podejścia do obejścia tych ograniczeń. Linie komórkowe mają niezaprzeczalne zalety: (1) posiadają nieograniczoną zdolność proliferacji, która pozwala na wytworzenie wystarczającej ilości materiału do badań biochemicznych i biologicznych, (2) są podatne na manipulacje genetyczne (knockdown, knockout, nadekspresja), (3) koszt jest stosunkowo niski oraz (4) pozwalają na pewien stopień biologicznego uproszczenia wymagany w niektórych podejściach eksperymentalnych.

Rodzicielska linia komórkowa 32D zależna od IL-3 (interleukiny-3) została założona w 1983 roku przez Greenbergera i współpracowników przez zakażenie komórek szpiku kostnego myszy C3H/HeJ wirusem białaczki mysiej Friend9. W literaturze opisano kilka klonów 32D: cl-239, cl-310 i cl-1011. Wykazano, że komórki 32D cl-3 proliferują w IL-3 i ulegają różnicowaniu neutrofilowemu po leczeniu czynnikiem stymulacji kolonii granulocytów (G-CSF)10. Wręcz przeciwnie, komórki 32D cl-10, choć zależne od IL-3, pierwotnie nie różnicowały się w odpowiedzi na leczenie G-CSF. W 1995 roku grupa dr Ivo Touw dokonała retrowirusowej transdukcji komórek 32D cl-10 z dzikimi i zmutowanymi formami receptora G-CSF (G-CSF-R), w celu zidentyfikowania funkcjonalnie ważnych regionów tego receptora11. Badanie to doprowadziło do wytworzenia komórek 32D/G-CSF-R, które są podobnie zależne od IL-3, ale w ciągu 6 do 10 dni po zastąpieniu IL-3 przez G-CSF, komórki przestają się namnażać i nieodwracalnie różnicują w dojrzałe neutrofile. Właściwości te sprawiają, że komórki 32D cl-3 i 32D/G-CSF-R są uproszczonymi modelami różnicowania mysich neutrofili, które mogą być modulowane przez dwa dobrze zdefiniowane czynniki wzrostu i różnicowania - IL-3 i G-CSF. W ciągu ostatnich dziesięcioleci wiele grup wykorzystało komórki 32D/G-CSF-R do badania roli poszczególnych genów w proliferacji i różnicowaniu komórek szpikowych w hodowli12,13,14,15,16, oraz do badania sygnalizacji G-CSF17,18. Co ważne, wyniki uzyskane przy użyciu tej linii komórkowej korelowały z danymi uzyskanymi z komórek pierwotnych i myszy transgenicznych16,19,20,21. W związku z tym uważamy, że komórki 32D/G-CSF-R, będące szeroko stosowanym i dobrze ugruntowanym modelem, stanowią cenny system do badania różnicowania szpiku, który może być stosowany równolegle z innymi podejściami zajmującymi się tym pytaniem.

Tutaj przedstawione są szczegółowe protokoły opisujące postępowanie z linią komórkową 32D/G-CSF-R, które obejmują ekspansję, różnicowanie oraz ocenę proliferacji i różnicowania tych komórek. Podano szczegółowe informacje na temat modyfikacji genetycznej komórek 32D/G-CSF-R, zarówno metodą transdukcji retrowirusowej, jak i lentiwirusowej, a także protokoły miareczkowania wirusa. Ponadto przedstawiono kilka reprezentatywnych wyników, które pokazują potencjalne zastosowania ogniw 32D/G-CSF-R.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Kroki opisujące rozszerzanie, różnicowanie i transdukcję komórek 32D/G-CSF-R są przedstawione poniżej.

1. Przygotowanie

  1. Przygotowanie podłoża
    1. Przygotuj 250 ml pożywki hodowlanej: pożywki RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 uzupełnionej 10% inaktywowaną termicznie FBS (płodowa surowica bydlęca) i mysią IL-3 (10 ng / ml).
      1. Alternatywnie użyj domowej roboty IL-3. Aby wyprodukować domowej roboty IL-3, przeprowadź transdukcję komórek HEK293 z wektorem eksprymującym IL-3 i zbierz IL-3 zawierający supernatant22.
        UWAGA: Antybiotyki, takie jak penicylina G (100 j.m./ml), streptomycyna (100 μg/ml) i gentamycyna (40 μg/ml), mogą być stosowane do hodowli komórek na dowolnym etapie protokołu, chyba że określono inaczej.
    2. Przygotuj 50 ml pożywki różnicującej: pożywki RPMI 1640 uzupełnionej 10% FBS i ludzkiego G-CSF (100 ng / ml).
      UWAGA: (Ważne) Nie wszystkie partie surowicy obsługują różnicowanie komórek 32D/G-CSF-R. Przed rozpoczęciem eksperymentu przetestuj różne partie surowicy. Zaleca się przetestowanie co najmniej 4 różnych partii i wybranie optymalnej w oparciu o zdolność komórek 32D/G-CSF-R do różnicowania. Zobacz protokół różnicowania 32D/G-CSF-R poniżej.
    3. Przygotuj 10 ml pożywki zamrażającej: pożywka RPMI 1640 uzupełniona 40% FBS i 10% DMSO (dimetylosulfotlenek).
  2. Produkcja retrowirusa
    1. Zawiesinę jednokomórkową komórek Bosc23 (6 × 106) umieścić na 16-centymetrowej szalce Petriego i hodować w 18 ml DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) zawierającej 10% FBS, aż do momentu, gdy zlewność kultury osiągnie 80 % (24 h).
      UWAGA: Komórki powinny rosnąć w monowarstwie i nie tworzyć grudek w hodowli. Zliczanie komórek można przeprowadzić przy użyciu różnych metod (dotyczy to pozostałych przedstawionych tutaj protokołów). W przypadku małej liczby próbek zaleca się ręczne liczenie pod mikroskopem przy użyciu komory Bürker. W takim przypadku użyj błękitu trypanowego, aby wykluczyć martwe komórki. Wymieszaj komórki 1:1 z 0,4% błękitem trypanowym w PBS. Do zliczania dużej liczby próbek można zastosować automatyczny licznik komórek.
    2. Połącz 40 μg konstruktu retrowirusowego (takiego jak MSCV), 20 μg pCL-Eco (wektor opakowania)23, 80 μl PEI (polietyleniminy) i 2 ml pożywki o obniżonej surowicy (np. Opti-MEM) (bez antybiotyków). Inkubować tę mieszaninę przez 20 minut w temperaturze pokojowej (RT).
    3. Ostrożnie zastąp pożywkę komórkową Bosc23 16 ml DMEM uzupełnionym 2% FBS. Przed użyciem podgrzej podłoże do temperatury 37 °C.
      UWAGA: Nie używaj antybiotyków podczas transfekcji, ponieważ może to zmniejszyć skuteczność transfekcji.
    4. Dodać mieszaninę przygotowaną w ppkt 1.2.2. kroplami i ostrożnie do kultury Bosc23 i inkubować przez 4 godziny w temperaturze 37 °C. Ograniczyć inkubację do mniej niż 6 godzin ze względu na toksyczność PEI.
    5. Po inkubacji zmień pożywkę Bosc23 na 18 ml wstępnie podgrzanego DMEM zawierającego 10% FBS i hoduj komórki przez 48 godzin w temperaturze 37 °C. Umieść naczynia w laboratorium o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2, trzymaj się tutaj od tego kroku i postępuj zgodnie ze standardowymi procedurami bezpieczeństwa.
    6. Zebrać pożywkę Bosc23 (zawierającą ekotropowe cząstki retrowirusowe) za pomocą pipety serologicznej o pojemności 25 ml do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i przechowywać w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: (Ważne) Skuteczność transfekcji powinna osiągnąć 90%, aby wytworzyć wirusa o wysokim mianie.
    7. Dodaj 18 ml wstępnie podgrzanego DMEM 10% FBS do komórek Bosc23 i hoduj przez 24 godziny.
    8. Powtórz krok 1.2.6.
      UWAGA: Supernatanty retrowirusowe z ppkt 1.2.6 i 1.2.8 mogą być łączone po osiągnięciu tej samej temperatury (4 °C) w celu zachowania integralności wirusa.
    9. Aby uniknąć zanieczyszczenia Bosc23 supernatantami wirusowymi, należy wirować zebrany wirus w temperaturze 1500 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Podwielokrotność wirusa, zamrozić błyskawicznie przy użyciu suchego lodu lub ciekłego azotu i przechowywać w temperaturze -80 °C. Należy jednak pamiętać, że świeżo przygotowany wirus jest wyższej jakości pod względem skuteczności infekcji niż mrożone zapasy.
      UWAGA: (Ważne) Unikaj powtarzającego się zamrażania/rozmrażania wirusa, ponieważ prowadzi to do degradacji wirusa.
  3. Produkcja lentiwirusa
    1. Zawiesinę jednokomórkową HEK293T (Ludzka zarodek nerki 293T) (6 × 106) umieścić na 16-centymetrowej szalce Petriego i hodować w 18 ml DMEM zawierającej 10% FBS, aż do momentu, gdy zlewność kultury osiągnie 80 % (24 godziny).
      UWAGA: Komórki powinny rosnąć w monowarstwie i nie tworzyć grudek w hodowli.
    2. Połącz 15 μg konstruktu lentiwirusowego (takiego jak pGhU6), pakując plazmidy pCMVdR8.74 (kodujące dla gag/pol, 12 μg) i pMD2.VSVG (kodujące dla VSV-G, 1,4 μg), 85,2 μl PEI i 2 ml pożywki o obniżonej surowicy (bez antybiotyków). Inkubować tę mieszaninę przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Ostrożnie zastąp HEK293T podłoże 16 ml DMEM uzupełnionym 2% FBS. Przed użyciem podgrzej podłoże do temperatury 37 °C. Nie należy stosować antybiotyków podczas transfekcji, ponieważ może to zmniejszyć skuteczność transfekcji.
    4. Mieszaninę przygotowaną w ppkt 1.3.2 należy ostrożnie wrzucić do hodowli komórek HEK293T i inkubować przez 4 godziny w temperaturze 37 °C. Ograniczyć czas inkubacji do 6 godzin, aby zapobiec toksyczności PEI.
    5. Zmień pożywkę na 18 ml wstępnie podgrzanego DMEM 10% FBS i hoduj komórki przez 48 godzin w temperaturze 37 °C. Umieść naczynia w laboratorium o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2, trzymaj się tego miejsca od tego kroku i postępuj zgodnie ze standardowymi procedurami bezpieczeństwa.
    6. Zebrać HEK293T pożywkę (zawierającą amfotropowe cząstki lentiwirusowe) za pomocą pipety serologicznej o pojemności 25 ml do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i przechowywać w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: (Ważne) Skuteczność transfekcji powinna osiągnąć 90%, aby wytworzyć wirusa o wysokim mianie.
    7. Ostrożnie dodaj 18 ml wstępnie podgrzanego DMEM 10% FBS do HEK293T komórek. Uprawiać przez 24 h w temperaturze 37 °C.
    8. Powtórz krok 1.3.6.
      UWAGA: Supernatanty lentiwirusowe z ppkt 1.3.6 i 1.3.8 mogą być łączone po osiągnięciu tej samej temperatury (4 °C) w celu zachowania integralności wirusa.
    9. Aby uniknąć zanieczyszczenia supernatantu wirusa komórkami HEK293T, należy wirować zebrany wirus w temperaturze 1500 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Podwielokrotność wirusa należy zamrozić błyskawicznie przy użyciu suchego lodu lub ciekłego azotu i przechowywać w temperaturze -80 °C. Należy jednak zauważyć, że świeżo przygotowany wirus jest wyższej jakości pod względem skuteczności infekcji niż mrożone zapasy.
      UWAGA: (Ważne) Unikaj powtarzającego się zamrażania/rozmrażania wirusa, ponieważ prowadzi to do degradacji wirusa.
  4. Miareczkowanie wirusa zawierającego reporter GFP
    1. Zasiew 1 × 105 komórek NIH / 3T3 w 300 μL DMEM 10% FBS na dołek do płytki 24-dołkowej. 7 dołków zostanie użytych do mianowania jednego wirusa.
    2. Rozmrozić wirusa w temperaturze 37 °C i dodać 1, 5, 10, 50, 100 i 500 μl wirusa do kultur NIH/3T3. Nie należy dobrze dodawać żadnego wirusa do kontroli negatywnej. Hodować komórki w obecności wirusa przez 48 godzin w temperaturze 37 °C.
    3. Zbierz komórki NIH / 3T3 za pomocą 30 μl trypsyny / EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy) (0,25% trypsyny, 0,01% EDTA w PBS) i umieść komórki w 250 μl PBS w probówce FACS (sortowanie komórek aktywowanych fluorescencją).
    4. Określ częstość komórek GFP+ za pomocą cytometrii przepływowej w każdej próbce24. Wyklucz martwe komórki przez dodanie barwnika żywotności, takiego jak Hoechst 33258.
    5. Oblicz całkowitą liczbę komórek GFP+ (na podstawie liczby posianych komórek i procentu komórek GFP+) i wykreśl je w stosunku do objętości wirusa użytego do infekcji.
      UWAGA: (Ważne) Skuteczność infekcji osiąga plateau, gdy stosuje się duże dawki wirusa. Dlatego ważne jest, aby oszacować miano na podstawie stężeń wirusa, przy których występuje skuteczność infekcji w zakresie liniowym (przykład pokazany w tabeli 1). Liczba komórek GFP+ wskazuje liczbę funkcjonalnych cząstek wirusa (TU - jednostek transformujących) w danej objętości wirusa. Przelicz liczbę TU na ml.
  5. Miareczkowanie wirusa zawierającego reporter puromycyny
    1. Zasiew 5 × 104 komórek NIH / 3T3 w 3 ml DMEM 10% FBS na studzienkę w płytce 6-dołkowej; zastosuj 6 dołków do miana jednego wirusa. Hodowla przez noc w temperaturze 37 °C.
    2. Następnego dnia rozcieńczyć wirusa, jak wskazano w Tabeli 2. Aby rozcieńczyć wirusa, użyj wstępnie podgrzanego DMEM 10% FBS. Nie wirować.
    3. Usunąć pożywkę hodowlaną z komórek NIH/3T3 i dodać 1 ml rozcieńczonego wirusa.
    4. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
    5. Delikatnie zastąpić pożywkę zawierającą wirusa 2 ml wstępnie podgrzanego DMEM 10% FBS i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
    6. Delikatnie zastąp pożywkę NIH/3T3 2 ml wstępnie podgrzanego DMEM 10% FBS zawierającego puromycynę (2 μg/ml).
    7. Hodowlę w temperaturze 37 °C i ostrożne odświeżanie pożywki puromycyną co 3 dni lub gdy podłoże zmieni kolor na żółty.
    8. Po 10-12 dniach od zakażenia odessać pożywkę z każdej studzienki i delikatnie przemyć PBS.
    9. Zabarwić 1 ml roztworu fioletu krystalicznego (0,5% fioletu krystalicznego w 20% etanolu idH2O), 2 minuty w temperaturze pokojowej i dwukrotnie dokładnie przemyć PBS.
    10. Policz niebieskie kolonie obecne w każdym dołku pod mikroskopem (powiększenie X4). W studzience kontroli ujemnej nie należy obserwować żadnych kolonii.
    11. Obliczyć całkowitą liczbę TU/ml, biorąc pod uwagę współczynnik rozcieńczenia.

2. Rozbudowa i utrzymanie ogniw 32D/G-CSF-R

  1. Jeśli komórki 32D/G-CSF-R są zamrożone, pobrać podwielokrotność i rozmrozić komórki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 1 minutę i wlać komórki z fiolki bezpośrednio do 10 ml wstępnie podgrzanej pożywki RPMI 1640 uzupełnionej 10% FBS w probówce o pojemności 15 ml. Odwróć probówkę 3 razy i odwiruj komórki do 400 × g. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w pożywce hodowlanej zawierającej IL-3 w stężeniu 0,3 × 106 komórek/ml.
  2. Optymalne stężenie wzrostu komórek wynosi 0,25-0,5 × 106 komórek/ml. Dziel komórki co 2 dni, doprowadzając je do stężenia 0,1-0,2 × 106 komórek/ml.
    UWAGA: (Ważne) Komórki 32D/G-CSF-R mogą częściowo utracić zdolność różnicowania się, jeśli są hodowane do stężeń wyższych niż 1 × 106 komórek/ml. Dlatego bardzo ważne jest, aby na czas podzielić ogniwa 32D/G-CSF-R.
  3. W razie potrzeby zamrozić i przechowywać podwielokrotności komórek przez długi czas w temperaturze -80 °C lub w ciekłym azocie. Odwiruj 3 × 106 komórek, usuń supernatant i ponownie zawieś w 1 ml pożywki do zamrażania. Umieścić probówkę w pojemniku do zamrażania w temperaturze -80 °C. W celu długotrwałego przechowywania należy przestawić komórki na ciekły azot.

3. Transdukcja komórek 32D/G-CSF-R

  1. Umieść komórki 32D/G-CSF-R na płytce 6-dołkowej w stężeniu 0,3 × 106 komórek/ml.
  2. Dodaj odpowiednią ilość wirusa, aby osiągnąć MOI (wielokrotność infekcji) między 10 a 40,
    UWAGA: Wyższy MOI spowoduje zwiększony odsetek komórek GFP+, a także wyższy poziom ekspresji genu będącego przedmiotem zainteresowania. Przykład: Zainfekować 0,3 × 106 komórek o MOI równym 10; 3 × 106 TU będzie musiało zostać dodane do ogniw 32D/G-CSF-R.
  3. Dodać polibren do końcowego stężenia 8 μg/ml i inkubować przez 6 godzin w temperaturze 37 °C. Alternatywnie, przeprowadzić procedurę wirowania: odwirować przy 1200 × g przez 90 minut w temperaturze 30 °C na płytce do hodowli przy użyciu rotora kubełkowego i inkubować przez 3 godziny w temperaturze 37 °C.
  4. Zebrać komórki, przenieść do probówki o pojemności 15 ml i wirować z masą 450 × g przez 5 minut (4 °C).
  5. Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić granulowane komórki w 6 ml pożywki hodowlanej, umieścić w kolbie do hodowli komórek T25 i przeprowadzić hodowlę w temperaturze 37 °C.
  6. 48 godzin później zebrać komórki i wirować je w temperaturze 450 × g przez 5 minut (4 °C). Odrzucić supernatant.
  7. W przypadku reportera GFP: umieścić komórki w 500 μl PBS i posortować komórki GFP+ za pomocą sortera cytometrii przepływowej. W przypadku reportera puromycyny zawierającego wektor: umieścić komórki w pożywce hodowlanej zawierającej 2 μg/ml puromycyny.
  8. Rozwiń komórki zgodnie z potrzebami do dalszej analizy i eksperymentów.
    UWAGA: (Opcjonalnie) Transdukowane komórki można zamrozić w pożywce zamrażającej w pojemniku do zamrażania w temperaturze -80 °C, a następnie przechowywać w ciekłym azocie.

4. Test proliferacji komórek 32D/G-CSF-R

  1. Aby ocenić szybkość proliferacji, umieścić 0,2 × 106 komórek w 1 ml pożywki hodowlanej i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
  2. Następnego dnia policz liczbę komórek i rozcieńcz je z powrotem do stężenia 0,2 × 106 komórek/ml za pomocą pożywki hodowlanej. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C. Prowadzić zapis stężeń komórek i rozcieńczeń zastosowanych do kultur dziennych, korzystając z tabeli 3.
  3. Powtórz krok 4.2 przez tyle dni, ile wymaga ocena proliferacji.
    UWAGA: Długość testów proliferacji będzie zależeć od wpływu genu będącego przedmiotem zainteresowania. W przypadku silnego fenotypu, 8-9 dni może wystarczyć, aby zaobserwować znaczący efekt (patrz Rysunek 3A). Jednak w przypadku łagodnego fenotypu mogą być wymagane dłuższe okresy czasu.
  4. Oceń wzrost komórek, tworząc krzywą proliferacji, jak pokazano w Tabeli 3.

5. Test różnicowania komórek 32D/G-CSF-R

  1. Przemyć 0,2 × 106 komórek 32D/G-CSF-R dwukrotnie pożywką RPMI bez cytokin.
    UWAGA: Etapy płukania przed dodaniem G-CSF do kultury są ważne, ponieważ obecność resztkowej IL-3 może hamować różnicowanie.
  2. Umieść komórki w 1 ml pożywki różnicującej (zawierającej 100 ng / ml G-CSF) w 24 dołkach / płytce, co daje stężenie komórek 0,2 × 106 komórek / ml (dzień 0). Hodowla przez noc w temperaturze 37 °C.
  3. Policz liczbę komórek/ml, jak wskazano powyżej (krok 1.2.1).
  4. Cytospin 2-5 ×10 4 komórki na szkiełku podstawowym (76 mm X 26 mm) za pomocą wirówki z niezbędnymi adapterami o masie 20 × g.
  5. Odśwież pożywkę różnicującą i płytki w stężeniu 0,2 × 105 komórek/ml na 24 dołkach/płytce (dzień 1). Wyrzuć starą płytkę i następnego dnia przejdź do kroku 5.6 z nową płytką.
  6. W dniach od 2 do 7 powtórz kroki od 5.3 do 5.5. Oceń proliferację komórek w obecności G-CSF zgodnie z opisem w kroku 4.
    UWAGA: (Ważne) Podczas różnicowania proliferacja komórek zwalnia, dlatego po 3 do 4 dniach w obecności G-CSF jest on odpowiedni do hodowli komórek w wyższych stężeniach.
  7. Oceń stan różnicowania komórek 32D/G-CSF-R na podstawie morfologii komórki.
    1. Utrwalić komórki z kroku 5.4 w metanolu przez 5 minut w temperaturze pokojowej i pozostawić szkiełka do wyschnięcia na powietrzu.
      UWAGA: Slajdy od dnia 0 do 7 mogą być przechowywane w RT i naprawiane jednocześnie. Podobnie, mogą być również trzymane w RT przez dłuższy czas po utrwaleniu.
    2. Wybarwić ogniwa za pomocą barwienia May-Grünwald Giemsa zgodnie z protokołem producenta.
    3. Wizualizacja barwionych komórek za pomocą mikroskopu i powiększenia X40.
    4. Określ ilościowo liczbę blastów, pośrednio zróżnicowanych komórek i dojrzałych granulocytów, korzystając z ilustracyjnych zdjęć na Rysunek 1 i opis w Tabeli 4.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Proliferacja i różnicowanie komórek 32D/G-CSF-R

Aby ocenić proliferację komórek 32D/G-CSF-R w warunkach pro-proliferacyjnych i pro-różnicujących, komórki 32D/G-CSF-R hodowano odpowiednio w pożywkach zawierających IL-3 oraz G-CSF. Zaobserwowano, że komórki hodowane w pożywce z dodatkiem IL-3 (10 ng/mL) dzielą się w przybliżeniu co 24 h (Rysunek 2A). Po zastąpieniu IL-3 przez G-CSF (100 ng/mL) proliferac...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wybór modelu eksperymentalnego jest jednym z głównych zagadnień w badaniach. Chociaż uważa się, że pierwotne komórki zwierzęce i ludzkie dostarczają najbardziej istotnych biologicznie danych, modele te mogą wiązać się z problemami etycznymi i często wiążą się z kosztownymi i/lub wyrafinowanymi procedurami izolacji/hodowli. Komórki pierwotne mają ograniczoną liczbę i trudno jest nimi genetycznie manipulować. Ponadto komórki pierwotne reprezentują niejednorodną populację złożoną z różnych typów komórek, co może komplikować...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują Prof. Ruud Delwel i Prof. Ivo Touw za dostarczenie nam linii komórkowej 32D/G-CSF-R, oraz Prof. Danielowi G. Tenenowi za dostarczenie nam linii komórkowej Bosc23. Praca ta była wspierana przez granty Agencji Grantowej Republiki Czeskiej (GACR 15-03796S i GACR 17-02177S) dla MA-J, wsparcie z Instytutu Genetyki Molekularnej Czeskiej Akademii Nauk (RVO 68378050) dla MA-J, stypendium GA UK (projekt nr 341015) z Uniwersytetu Karola w Pradze dla MK oraz stypendium GA UK (projekt nr 1278217) z Uniwersytetu Karola w Pradze dla PD.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
RPMI 1640 proszekśredni Merck, Kenilworth, NJ, USAT 121-10bez NaHCO3, z L-glutaminą
DMEMThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA15028
Opti-MEM I Zredukowana surowica MediumThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA31985-047L-glutamina, fenol Red
Płodowa surowica bydlęca (FBS)PAA Laboratories (GE Healthcare, Chicago, IL, USA)MT35011CVDo różnicowania komórek 32D/G-CSF-R
Surowica bydlęca płodu (FBS)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA10270Używany do hodowli komórek HEK293T, NIH3T3, BOSC23
PenicylinaSigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)P3032
StreptomycynaSigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)S9137Sól siarczanu streptomycyny w proszku
GentamycynaSigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)G1914
mysia IL-3PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA213-13
człowiek G-CSFPeproTech, Rocky Hill, NJ, USA300-23
PolyethyleniminePolyscience, Warrington, PA, USA23966Linear, MW 25,000 (PEI 25000)
PolybreneSigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, Stany Zjednoczone)H9268
TrypsynaVWR Chemicals, Radnor, PA, USA0458
EDTASigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)E5134
Fiolet krystalicznySigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)C0775
Błękit trypanowySigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)T6146
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, Stany Zjednoczone)D2650
May-Grü nwald GiemsaDiaPath, Martinengo, BG, Włochy10802

Bibliografia

  1. Bonilla, M. A., et al. Effects of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor on neutropenia in patients with congenital agranulocytosis. N Engl J Med. 320 (24), 1574-1580 (1989).
  2. Bennett, C. L., Djulbegovic, B., Norris, L. B., Armitage, J. O. Colony-stimulating factors for febrile neutropenia during cancer therapy. N Engl J Med. 368 (12), 1131-1139 (2013).
  3. Lowenberg, B., Downing, J. R., Burnett, A. Acute myeloid leukemia. N Engl J Med. 341 (14), 1051-1062 (1999).
  4. Dong, F., et al. Identification of a nonsense mutation in the granulocyte-colony-stimulating factor receptor in severe congenital neutropenia. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (10), 4480-4484 (1994).
  5. Rosenbauer, F., Tenen, D. G. Transcription factors in myeloid development: balancing differentiation with transformation. Nat Rev Immunol. 7 (2), 105-117 (2007).
  6. Kota, J., Caceres, N., Constantinescu, S. N. Aberrant signal transduction pathways in myeloproliferative neoplasms. Leukemia. 22 (10), 1828-1840 (2008).
  7. Kvinlaug, B. T., et al. Common and overlapping oncogenic pathways contribute to the evolution of acute myeloid leukemias. Cancer Res. 71 (12), 4117-4129 (2011).
  8. Krug, U., Ganser, A., Koeffler, H. P. Tumor suppressor genes in normal and malignant hematopoiesis. Oncogene. 21 (21), 3475-3495 (2002).
  9. Greenberger, J. S., Sakakeeny, M. A., Humphries, R. K., Eaves, C. J., Eckner, R. J. Demonstration of permanent factor-dependent multipotential (erythroid/neutrophil/basophil) hematopoietic progenitor cell lines. Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (10), 2931-2935 (1983).
  10. Valtieri, M., et al. Cytokine-dependent granulocytic differentiation. Regulation of proliferative and differentiative responses in a murine progenitor cell line. J Immunol. 138 (11), 3829-3835 (1987).
  11. Dong, F., et al. Mutations in the gene for the granulocyte colony-stimulating-factor receptor in patients with acute myeloid leukemia preceded by severe congenital neutropenia. N Engl J Med. 333 (8), 487-493 (1995).
  12. Jorda, M. A., Lowenberg, B., Delwel, R. The peripheral cannabinoid receptor Cb2, a novel oncoprotein, induces a reversible block in neutrophilic differentiation. Blood. 101 (4), 1336-1343 (2003).
  13. Jorda, M. A., et al. Hematopoietic cells expressing the peripheral cannabinoid receptor migrate in response to the endocannabinoid 2-arachidonoylglycerol. Blood. 99 (8), 2786-2793 (2002).
  14. Abbas, S., et al. Integrated genome-wide genotyping and gene expression profiling reveals BCL11B as a putative oncogene in acute myeloid leukemia with 14q32 aberrations. Haematologica. 99 (5), 848-857 (2014).
  15. Zhuang, D., Qiu, Y., Kogan, S. C., Dong, F. Increased CCAAT enhancer-binding protein epsilon (C/EBPepsilon) expression and premature apoptosis in myeloid cells expressing Gfi-1 N382S mutant associated with severe congenital neutropenia. J Biol Chem. 281 (16), 10745-10751 (2006).
  16. Zjablovskaja, P., et al. EVI2B is a C/EBPalpha target gene required for granulocytic differentiation and functionality of hematopoietic progenitors. Cell Death Differ. 24 (4), 705-716 (2017).
  17. Santini, V., et al. The carboxy-terminal region of the granulocyte colony-stimulating factor receptor transduces a phagocytic signal. Blood. 101 (11), 4615-4622 (2003).
  18. Liu, H., Qiu, Y., Xiao, L., Dong, F. Involvement of protein kinase Cepsilon in the negative regulation of Akt activation stimulated by granulocyte colony-stimulating factor. J Immunol. 176 (4), 2407-2413 (2006).
  19. Kelly, L. M., et al. FLT3 internal tandem duplication mutations associated with human acute myeloid leukemias induce myeloproliferative disease in a murine bone marrow transplant model. Blood. 99 (1), 310-318 (2002).
  20. Pikman, Y., et al. MPLW515L is a novel somatic activating mutation in myelofibrosis with myeloid metaplasia. PLoS Med. 3 (7), e270(2006).
  21. Schwaller, J., et al. Transformation of hematopoietic cell lines to growth-factor independence and induction of a fatal myelo- and lymphoproliferative disease in mice by retrovirally transduced TEL/JAK2 fusion genes. EMBO J. 17 (18), 5321-5333 (1998).
  22. Drobek, A., et al. PSTPIP2, a Protein Associated with Autoinflammatory Disease, Interacts with Inhibitory Enzymes SHIP1 and Csk. J Immunol. 195 (7), 3416-3426 (2015).
  23. Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. J Virol. 70 (8), 5701-5705 (1996).
  24. Alberich-Jorda, M., et al. C/EBPgamma deregulation results in differentiation arrest in acute myeloid leukemia. J Clin Invest. 122 (12), 4490-4504 (2012).
  25. Calabretta, B., Perrotti, D. The biology of CML blast crisis. Blood. 103 (11), 4010-4022 (2004).
  26. Ren, R. Mechanisms of BCR-ABL in the pathogenesis of chronic myelogenous leukaemia. Nat Rev Cancer. 5 (3), 172-183 (2005).
  27. Schuster, C., et al. The effects of Bcr-Abl on C/EBP transcription-factor regulation and neutrophilic differentiation are reversed by the Abl kinase inhibitor imatinib mesylate. Blood. 101 (2), 655-663 (2003).
  28. Chang, J. S., et al. High levels of the BCR/ABL oncoprotein are required for the MAPK-hnRNP-E2 dependent suppression of C/EBPalpha-driven myeloid differentiation. Blood. 110 (3), 994-1003 (2007).
  29. Velten, L., et al. Human haematopoietic stem cell lineage commitment is a continuous process. Nat Cell Biol. 19 (4), 271-281 (2017).
  30. Jorda, M. A., Rayman, N., Valk, P., De Wee, E., Delwel, R. Identification, characterization, and function of a novel oncogene: the peripheral cannabinoid receptor Cb2. Ann N Y Acad Sci. 996, 10-16 (2003).
  31. Wurm, A. A., et al. Disruption of the C/EBPalpha-miR-182 balance impairs granulocytic differentiation. Nat Commun. 8 (1), 46(2017).
  32. Agliano, A. M., et al. On chromosomal instability: what is the karyotype of your 32D CI3 cell line. Blood. 95 (11), 3636-3637 (2000).
  33. Wang, G. G., et al. Quantitative production of macrophages or neutrophils ex vivo using conditional Hoxb8. Nat Methods. 3 (4), 287-293 (2006).
  34. Houston, I. B., Huang, K. J., Jennings, S. R., DeKoter, R. P. PU.1 immortalizes hematopoietic progenitors in a GM-CSF-dependent manner. Exp Hematol. 35 (3), 374-384 (2007).
  35. Calvo, K. R., Sykes, D. B., Pasillas, M., Kamps, M. P. Hoxa9 immortalizes a granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-dependent promyelocyte capable of biphenotypic differentiation to neutrophils or macrophages, independent of enforced meis expression. Mol Cell Biol. 20 (9), 3274-3285 (2000).
  36. Calvo, K. R., Sykes, D. B., Pasillas, M. P., Kamps, M. P. Nup98-HoxA9 immortalizes myeloid progenitors, enforces expression of Hoxa9, Hoxa7 and Meis1, and alters cytokine-specific responses in a manner similar to that induced by retroviral co-expression of Hoxa9 and Meis1. Oncogene. 21 (27), 4247-4256 (2002).
  37. Fossati-Jimack, L., et al. Phagocytosis is the main CR3-mediated function affected by the lupus-associated variant of CD11b in human myeloid cells. PLoS One. 8 (2), e57082(2013).
  38. Schwable, J., et al. RGS2 is an important target gene of Flt3-ITD mutations in AML and functions in myeloid differentiation and leukemic transformation. Blood. 105 (5), 2107-2114 (2005).
  39. Worch, J., et al. The serine-threonine kinase MNK1 is post-translationally stabilized by PML-RARalpha and regulates differentiation of hematopoietic cells. Oncogene. 23 (57), 9162-9172 (2004).
  40. Rowley, J. D. Letter: A new consistent chromosomal abnormality in chronic myelogenous leukaemia identified by quinacrine fluorescence and Giemsa staining. Nature. 243 (5405), 290-293 (1973).
  41. Stam, K., et al. Evidence of a new chimeric bcr/c-abl mRNA in patients with chronic myelocytic leukemia and the Philadelphia chromosome. N Engl J Med. 313 (23), 1429-1433 (1985).
  42. Holly, S. P., Larson, M. K., Parise, L. V. The unique N-terminus of R-ras is required for Rac activation and precise regulation of cell migration. Mol Biol Cell. 16 (5), 2458-2469 (2005).
  43. Pierce, J. H., et al. Macrophage-colony-stimulating factor (CSF-1) induces proliferation, chemotaxis, and reversible monocytic differentiation in myeloid progenitor cells transfected with the human c-fms/CSF-1 receptor cDNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (15), 5613-5617 (1990).
  44. Pierce, J. H., et al. Signal transduction through the EGF receptor transfected in IL-3-dependent hematopoietic cells. Science. 239 (4840), 628-631 (1988).
  45. Oomen, S. P., et al. Somatostatin modulates G-CSF-induced but not interleukin-3-induced proliferative responses in myeloid 32D cells via activation of somatostatin receptor subtype 2. Hematol J. 2 (5), 322-329 (2001).
  46. Oomen, S. P., et al. Somatostatin is a selective chemoattractant for primitive (CD34(+)) hematopoietic progenitor cells. Exp Hematol. 30 (2), 116-125 (2002).
  47. Nogami, A., et al. FLT3-ITD confers resistance to the PI3K/Akt pathway inhibitors by protecting the mTOR/4EBP1/Mcl-1 pathway through STAT5 activation in acute myeloid leukemia. Oncotarget. 6 (11), 9189-9205 (2015).
  48. Rodel, J. E., Link, D. C. Suppression of apoptosis during cytokine deprivation of 32D cells is not sufficient to induce complete granulocytic differentiation. Blood. 87 (3), 858-864 (1996).
  49. Daley, G. Q., Baltimore, D. Transformation of an interleukin 3-dependent hematopoietic cell line by the chronic myelogenous leukemia-specific P210bcr/abl protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 85 (23), 9312-9316 (1988).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Kom rki 32D G CSF Rtesty proliferacji i r nicowaniar nicowanie neutrofilowetransdukcja lentiwirusowa i retrowirusowalinia kom rkowa zale na od cytokinbadania manipulacji genetycznychanaliza cytometrycznabarwienie metod May Gr nwalda Giemsypod o e RPMI 1640
Proliferacja i różnicowanie mysich komórek prekursorowych mieloidu 32D/G-CSF-R
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.