Artykuł metodologiczny

Poklatkowe, bezznacznikowe, ilościowe badanie obrazowania fazowego uśpionych i aktywnych ludzkich komórek nowotworowych

DOI:

10.3791/57035

⸱

16 lutego 2018

 ,  , 
1Vascular Biology Program, Boston Children's Hospital, 2Department of Surgery, Harvard Medical School and Boston Children's Hospital

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uśpione i aktywne fenotypy komórek nowotworowych zostały scharakteryzowane za pomocą ilościowego obrazowania fazowego. Testy proliferacji, migracji i morfologii komórek zostały zintegrowane i przeanalizowane w jednej prostej metodzie.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nabycie fenotypu angiogennego jest niezbędnym elementem ucieczki z uśpienia guza. Chociaż opracowano kilka klasycznych testów in vitro (np. proliferacja, migracja i inne) oraz modeli in vivo w celu zbadania i scharakteryzowania angiogennych i nieangiogennych fenotypów komórek, metody te są czasochłonne i pracochłonne i często wymagają drogich odczynników i instrumentów, a także znacznej wiedzy specjalistycznej. W niedawnym badaniu zastosowaliśmy nowatorską technikę ilościowego obrazowania fazowego (QPI) do przeprowadzenia poklatkowych i wolnych od znakowania charakterystyk angiogennych i nieangiogennych komórek ludzkiego kostniakomięsaka KHOS. Panel parametrów komórkowych, w tym morfologia komórki, proliferacja i ruchliwość, został ilościowo zmierzony i przeanalizowany za pomocą QPI. To nowatorskie i ilościowe podejście daje możliwość ciągłego i nieinwazyjnego badania odpowiednich procesów komórkowych, zachowań i cech komórek nowotworowych i innych typów komórek w prosty i zintegrowany sposób. Ten raport opisuje nasz protokół eksperymentalny, w tym przygotowanie komórek, akwizycję QPI i analizę danych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jednym z najwcześniejszych punktów kontrolnych w rozwoju i progresji guza litego jest nabycie fenotypu angiogennego, cechy charakterystycznej raka. Ten postęp obejmuje różnorodne procesy biochemiczne i molekularne1,2,3. Wyzwaniem technicznym w badaniu tego kluczowego etapu progresji guza jest brak narzędzi do ciągłego i ilościowego charakteryzowania i różnicowania między angiogennymi i nieangiogennymi fenotypami żywych komórek rakowych w bezstronny sposób. Tradycyjne testy stosowane do badania zachowań komórkowych komórek angiogennych i nieangiogennych zwykle wymagają drogich odczynników i instrumentów, na przykład testów proliferacji/migracji komórek4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14 lub uzupełniające oceny in vivo4,5,6,8,15,16, a także wymagają znacznej wiedzy specjalistycznej i intensywnego czasu oraz pracochłonność.

Ostatnio, ilościowe obrazowanie fazowe (QPI) pojawiło się jako nowatorska technika, która umożliwia poklatkową i bezznacznikową ocenę różnych parametrów morfologii i zachowania komórek17,18,19,20,21,22. W przeciwieństwie do konwencjonalnej mikroskopii optycznej, QPI określa ilościowo zmiany przesunięcia fazowego piksel po pikselu po przejściu światła przez obiekt optyczny i rekonstruuje hologram z przeliczoną grubością i objętością optyczną, umożliwiając w ten sposób bezpośrednią analizę żywych komórek i następujących cech: (1) obrazowanie ilościowe, (2) obrazowanie nieinwazyjne i poklatkowe, (3) obrazowanie bez znaczników oraz (4) jednoczesne obrazowanie wieloparametrowe. Te cechy sprawiają, że QPI jest potężnym narzędziem do oceny i zrozumienia procesów patologicznych na poziomie komórkowym.

W niedawnym badaniu wykorzystaliśmy QPI do ilościowego scharakteryzowania i różnicowania między angiogennymi fenotypami KHOS-A i nieangiogennymi KHOS-N ludzkich komórek kostniakomięsaka w sposób systematyczny i ilościowy, łącząc analizy morfologii, proliferacji i ruchliwości komórek23. Korzystając z oprogramowania do analizy obrazu, porównano ilościowo panel parametrów morfologicznych i behawioralnych komórek między angiogennymi i nieangiogennymi komórkami ludzkiego kostniakomięsaka i zidentyfikowano pięć charakterystycznych różnic między tymi dwoma fenotypami. To nowatorskie podejście zapewnia zintegrowaną i ilościową platformę do oceny różnorodnych biologicznie istotnych cech komórkowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet Bezpieczeństwa Biologicznego Szpitala Dziecięcego w Bostonie.

1. Przygotowanie komórek

  1. Rozmrażanie komórek KHOS-A i -N
    1. Rozgrzej pożywkę hodowlaną, tj. zmodyfikowaną pożywkę Eagle firmy Dulbecco uzupełnioną 10% (obj./obj.) płodowej surowicy cielęcej (FBS) i 1% (obj./obj.) penicyliny/streptomycyny.
    2. Wyjąć kriogeniczne fiolki z komórkami ze zbiornika ciekłego azotu, zanurzyć dno fiolek w ciepłej wodzie w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i delikatnie potrząsnąć fiolkami kriogenicznymi, aby przyspieszyć proces rozmrażania. Nie dopuścić do kontaktu pokrywki fiolek kriogenicznych z wodą, aby uniknąć zanieczyszczenia. Jak tylko komórki zostaną rozmrożone, wysterylizuj fiolkę kriogeniczną, rozpylając 70% roztwór etanolu i wycierając fiolkę.
    3. W kapturze z przepływem laminarnym natychmiast odessać zawiesinę komórek z fiolki kriogenicznej i delikatnie zawiesić w 10 ml ogrzanej pożywki hodowlanej (opisanej w ppkt 1.1.1). Odwirować zawiesiny komórek w ilości około 200 x g przez 5 - 7 minut.
    4. Zawiesić osad komórkowy za pomocą 10 ml ogrzanej pożywki hodowlanej i przenieść do kolby T75. Delikatnie odpipetuj kilka razy, aby równomiernie zawiesić komórki, używając pipety o pojemności 10 ml.
    5. Umieścić kolbę w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% (obj.) CO2 i wilgotną atmosferą. Pozwól komórkom przyczepić się przez co najmniej 12 godzin.
    6. Inkubuj komórki przez około 3 - 7 dni, aż osiągną 80 - 100% zlewania się. Zmieniaj pożywkę co 2-3 dni.
  2. Dzielenie komórek KHOS-A i -N
    1. Wyjąć pożywkę z kolby.
    2. Umyj komórki 5 ml sterylnego PBS (1x) bez wapnia i magnezu, aby usunąć nieprzylegające komórki lub frakcję.
    3. Dodać 1 ml 0,05% roztworu trypsyny-EDTA do kolby i krótko zamieszać kolbę, aby zapewnić równomierne rozproszenie trypsyny-EDTA.
    4. Inkubować kolbę przez 2-3 minuty w inkubatorze o temperaturze 37 °C lub 3-5 minut w temperaturze pokojowej. Sprawdź komórki pod mikroskopem w powiększeniu około 400x, aby upewnić się, że komórki są zaokrąglone i odłączone.
    5. Po odłączeniu komórek dodaj 10 ml pożywki hodowlanej i delikatnie pipetuj pożywkę w górę i w dół kilka razy, aby rozbić agregaty komórek na zawiesinę pojedynczej komórki za pomocą pipety o pojemności 10 ml.
    6. Zliczanie komórek za pomocą licznika komórek. Zawiesinę komórek należy rozsiać do nowych kolb T75 o gęstości 2 × 106 komórek lub w stosunku 1:4.
    7. Pozwól komórkom urosnąć do 80 - 100% konfluencji przed wysiewem do eksperymentu QPI.
  3. Wysiewanie komórek KHOS-A i -N dla QPI
    1. Komórki KHOS-A i -N zasiać na płytkach 6-dołkowych o gęstości 50 000 - 300 000 komórek/basenik z 5 ml pożywki hodowlanej po zliczeniu za pomocą licznika komórek.
      UWAGA: Gęstość wysiewu zależy od szybkości proliferacji komórek i okresu obrazowania, aby uzyskać <100% zbieżność podczas akwizycji obrazowania.
    2. Inkubować komórki przez co najmniej 12 godzin, aby umożliwić przyczepienie.
    3. Zmień podłoże na świeże podłoże przed przeprowadzeniem QPI.

2. Akwizycja QPI

  1. Zakładanie szkiełek nakrywkowych
    1. Wyczyść szkiełko nakrywkowe, kilkakrotnie spłukując je bieżącą wodą dejonizowaną i wysterylizuj 75% roztworem etanolu przez zanurzenie na 15 minut. Włóż szkiełko nakrywkowe do sterylnego okapu z przepływem laminarnym do wyschnięcia.
    2. Ostrożnie umieścić szkiełko nakrywkowe na płytce 6-dołkowej, aby uniknąć widocznych pęcherzyków. Upewnij się, że spód szkiełka nakrywkowego jest zanurzony w pożywce hodowlanej (minimum 5 ml/studzienkę).
    3. Umieścić płytkę w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 i wilgotna atmosfera) w celu zrównoważenia przez co najmniej 15 minut. Jeśli na szkiełku nakrywkowym utworzy się mgła, użyj sterylnego bawełnianego wacika, aby wytrzeć ją do czysta.
  2. Obrazowanie komórek za pomocą mikroskopu
    1. Otwórz oprogramowanie, aby zainicjować system, w tym autokalibrację czasu ekspozycji, kontrastu wzoru i szumu hologramu. Upewnij się, że wartości są dopuszczalne (pokazane w zielonym lub żółtym zakresie).
    2. Umieść 6-dołkową płytkę na stoliku mikroskopu QPI.
    3. Kliknij "Live Capture" i wybierz "Manual" w "Software focus (Ostrość programowa)". Zgrubnie ustaw ostrość obrazów fazowych komórek, dostosowując odległość roboczą w "Ustawieniach mikroskopu", aby uzyskać kontury komórek na obrazach fazowych. Zmień na "Automatyczny" w "Fokus oprogramowania".
    4. Kliknij "Nowy eksperyment", aby utworzyć nowy eksperyment. Zacznij od wyboru pozycji akwizycji obrazu za pomocą myszy lub strzałek na klawiaturze numerycznej. Kliknij "Zapamiętaj" po każdym wyborze. Zwykle wybiera się od 3 do 5 lokalizacji dla każdej próbki.
    5. Ustaw interwały obrazowania i okres czasu w sekcji "Timelapse".
      UWAGA: Aby wyraźnie śledzić komórki rakowe, odstępy powinny być krótsze niż 5 minut. 48 godzin jest ustawione jako okres czasu dla połączonej analizy QPI.
    6. Rozpocznij eksperyment, klikając "Przechwyć", co spowoduje automatyczne ustawienie ostrości i pobranie obrazów w ustawionych punktach czasowych.

3. Analiza danych

  1. Analiza morfologii komórki
    1. Kliknij "Zidentyfikuj komórki". Dostosuj ustawienie liczbowe dla "Progu tła", aby obszary komórek były dobrze oddzielone od szumu tła. Dostosuj numer ustawienia dla "Rozmiar obiektu", aby upewnić się, że każda komórka ma jedno jądro. Utrzymuj spójne parametry dla próbek, które muszą być porównane, ponieważ mogą one mieć wpływ na końcowe pomiary powierzchni i objętości. W razie potrzeby ręcznie zmodyfikuj segmenty komórek za pomocą opcji "Zmiany ręczne".
    2. Użyj funkcji "Analizuj dane" w oprogramowaniu, aby przeanalizować komórki. Rozpocznij nową analizę danych, klikając "Nowa analiza". Przeciągnij wybrane obrazy do zakładki "Ramki źródłowe" i parametrów morfologii komórki, w tym obszaru komórki (μm2), grubości optycznej (μm) i objętości (μm3) dla każdej pojedynczej komórki. Wybierz tryb wykresu punktowego lub histogramu i wyeksportuj dane w postaci tabel lub wykresów.
  2. Analiza proliferacji komórek
    1. Wybierz co najmniej 5 obrazów dla różnych punktów zainteresowania w czasie (np. początkowy, 12 godzin, 24 godziny, 36 godziny i 48 godziny). Rejestruj numery komórek, które są dostarczane przez oprogramowanie.
    2. Aby oszacować czas podwajania, wykreśl numery komórek po znormalizowaniu z liczbami początkowymi i dopasuj je do wykładniczych krzywych wzrostu.
  3. Analiza ruchu komórek
    1. Skorzystaj z funkcji "Śledź komórki" w oprogramowaniu. Kliknij "Nowa analiza", aby rozpocząć nową analizę danych. Przeciągnij serię obrazów dla wybranego okresu czasu (np. 4 godziny po 24 h inkubacji) do zakładki "Klatki źródłowe". Losowo wybierz od 10 do 30 komórek, klikając komórki w trybie wyboru "Dodaj komórki". Wyklucz komórki na krawędziach i te, które znajdują się poza polem widzenia.
    2. Dokładnie sprawdź śledzenie w serii obrazów. W przypadku, gdy system straci śledzenie komórki lub śledzi niewłaściwą komórkę, ręcznie dostosuj komórkę śledzącą, klikając "Identyfikuj", aby zidentyfikować komórki lub klikając "Modyfikuj lokalizację" w trybie "Wybierz", aby zmodyfikować lokalizację komórki.
    3. Wybierz wykres różowy trajektorii komórek w polu "Ruch wykresu" lub wykres dla innych parametrów związanych z ruchem w polu "Cechy wykresu", takich jak prędkość ruchliwości (μm/h), ruchliwość (μm), migracja (μm) i bezpośredniość migracji. Eksportuj dane w postaci tabel lub rysunków.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 1 przedstawia typową charakterystykę morfologii komórki. Obrazy są prezentowane jako hologramy ( Rysunek 1A-B) i obrazy 2D ( Rysunek 1C-D). Grubości ogniw optycznych (obliczane na podstawie współczynnika załamania światła i długości ścieżki optycznej) są określane ilościowo za pomocą profilu liniowego lub pomiaru całej komórki. Wykresy punktowe obszaru i grubości komórek KHOS-A ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym badaniu opisujemy metodę in vitro, nieinwazyjną i bezznacznikową wykorzystującą QPI do ilościowego scharakteryzowania angiogennych i nieangiogennych fenotypów ludzkich komórek kostniakomięsaka. Za pomocą tej zintegrowanej, wysokoprzepustowej metody analizowano jednocześnie wiele parametrów komórkowych, w tym obszar komórki, grubość komórki, objętość komórki, szybkość proliferacji, czas podwojenia, bezpośredniość migracji, prędkość ruchliwości, migrację i ruchliwość.

W porównaniu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują za wsparcie Fundacji Badań nad Rakiem Piersi oraz Fundacji Zaawansowanych Badań Medycznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kolba T75Corning, NY, USA353136
płytki 6-dołkowe Corning, Nowy Jork, Stany Zjednoczone3506
Dulbecco' s zmodyfikowana pożywka Eagle (DMEM)Thermo Fisher Scientific, MA, USA11965092
Surowica bydlęca płodu (FBS) Atlanta Biologicals, GA, USAS11550
Penicylina StreptomycynaThermo Fisher Scientific, MA, USA15140122
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Thermo Fisher Scientific, MA, USA10010023
Beckman Z1 Licznik redlicBeckman Coulter, IN, USAZ1 
HoloMonitor M4Phase Holographic Imaging Phi AB, Lund, SzwecjaMikroskopM4
HololidPhase Holographic Imaging Phi AB, Lund, SzwecjaPHI 8020
HStudioM4Phase Holograficzne obrazowanie Phi AB, Lund, SzwecjaOprogramowanie HStudioM4

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Folkman, J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease. Nature Medicine. 1 (1), 27-31 (1995).
  2. Hanahan, D., Folkman, J. Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis. Cell. 86 (3), 353-364 (1996).
  3. Harper, J., Moses, M. A. Molecular regulation of tumor angiogenesis: mechanisms and therapeutic implications. EXS. (96), 223-268 (2006).
  4. Naumov, G. N., et al. A model of human tumor dormancy: an angiogenic switch from the nonangiogenic phenotype. Journal of the National Cancer Institute. 98 (5), 316-325 (2006).
  5. Fang, J., et al. Matrix metalloproteinase-2 is required for the switch to the angiogenic phenotype in a tumor model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (8), 3884-3889 (2000).
  6. Almog, N., et al. Transcriptional switch of dormant tumors to fast-growing angiogenic phenotype. Cancer Research. 69 (3), 836-844 (2009).
  7. Hu, J., et al. Gene expression signature for angiogenic and nonangiogenic non-small-cell lung cancer. Oncogene. 24 (7), 1212-1219 (2005).
  8. Harper, J., et al. Repression of vascular endothelial growth factor expression by the zinc finger transcription factor ZNF24. Cancer Research. 67 (18), 8736-8741 (2007).
  9. Jia, D., et al. Transcriptional repression of VEGF by ZNF24: mechanistic studies and vascular consequences in vivo. Blood. 121 (4), 707-715 (2013).
  10. Jia, D., Huang, L., Bischoff, J., Moses, M. A. The endogenous zinc finger transcription factor, ZNF24, modulates the angiogenic potential of human microvascular endothelial cells. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 29 (4), 1371-1382 (2015).
  11. Almog, N., et al. Prolonged dormancy of human liposarcoma is associated with impaired tumor angiogenesis. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 20 (7), 947-949 (2006).
  12. Almog, N., et al. Consensus micro RNAs governing the switch of dormant tumors to the fast-growing angiogenic phenotype. PloS One. 7 (8), e44001(2012).
  13. Satchi-Fainaro, R., et al. Prospective identification of glioblastoma cells generating dormant tumors. PloS One. 7 (9), e44395(2012).
  14. Almog, N., et al. Transcriptional changes induced by the tumor dormancy-associated microRNA-190. Transcription. 4 (4), 177-191 (2013).
  15. Gao, D., Nolan, D. J., Mellick, A. S., Bambino, K., McDonnell, K., Mittal, V. Endothelial progenitor cells control the angiogenic switch in mouse lung metastasis. Science. 319 (5860), New York, N.Y. 195-198 (2008).
  16. Folkman, J., Watson, K., Ingber, D., Hanahan, D. Induction of angiogenesis during the transition from hyperplasia to neoplasia. Nature. 339 (6219), 58-61 (1989).
  17. Popescu, G. Quantitative phase imaging of cells and tissues. , McGraw-Hill: New York. (2011).
  18. Lee, K., et al. Quantitative Phase Imaging Techniques for the Study of Cell Pathophysiology: From Principles to Applications. Sensors. 13 (4), 4170-4191 (2013).
  19. Mir, M., Bhaduri, B., Wang, R., Zhu, R., Popescu, G. Quantitative Phase Imaging. Progress in Optics. 57, 133-217 (2012).
  20. Marrison, J., Räty, L., Marriott, P., O'Toole, P. Ptychography--a label free, high-contrast imaging technique for live cells using quantitative phase information. Scientific Reports. 3, 2369(2013).
  21. Falck Miniotis, M., Mukwaya, A., Gjörloff Wingren, A. Digital holographic microscopy for non-invasive monitoring of cell cycle arrest in L929 cells. PloS One. 9 (9), e106546(2014).
  22. Popescu, G., et al. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. AJP: Cell Physiology. 295 (2), C538-C544 (2008).
  23. Guo, P., Huang, J., Moses, M. A. Characterization of dormant and active human cancer cells by quantitative phase imaging. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Advancement of Cytometry. 91 (5), 424-432 (2017).
  24. Mir, M., Bergamaschi, A., Katzenellenbogen, B. S., Popescu, G. Highly sensitive quantitative imaging for monitoring single cancer cell growth kinetics and drug response. PloS One. 9 (2), e89000(2014).
  25. Mir, M., Tangella, K., Popescu, G. Blood testing at the single cell level using quantitative phase and amplitude microscopy. Biomedical Optics Express. 2 (12), 3259-3266 (2011).
  26. Park, Y., et al. Measurement of red blood cell mechanics during morphological changes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (15), 6731-6736 (2010).
  27. Pham, H. V., Bhaduri, B., Tangella, K., Best-Popescu, C., Popescu, G. Real time blood testing using quantitative phase imaging. PloS One. 8 (2), e55676(2013).
  28. Sridharan, S., Macias, V., Tangella, K., Kajdacsy-Balla, A., Popescu, G. Prediction of prostate cancer recurrence using quantitative phase imaging. Scientific Reports. 5, 9976(2015).
  29. Park, H., et al. Measuring cell surface area and deformability of individual human red blood cells over blood storage using quantitative phase imaging. Scientific Reports. 6, 34257(2016).
  30. Bishitz, Y., Gabai, H., Girshovitz, P., Shaked, N. T. Optical-mechanical signatures of cancer cells based on fluctuation profiles measured by interferometry. Journal of Biophotonics. 7 (8), 624-630 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Quantitative Phase ImagingTime lapse ImagingCell Morphology AnalysisProliferation Rate MeasurementMotility Speed TrackingAngiogenic Phenotype CharacterizationNon angiogenic Phenotype CharacterizationHuman Osteosarcoma CellsLabel free ImagingCancer Cell Dormancy

Powiązane artykuły