Artykuł metodologiczny

Skojarzone leczenie trichostatyną A i witaminą C poprawia skuteczność klonowania myszy poprzez transfer jądra komórki somatycznej

DOI:

10.3791/57036

⸱

26 kwietnia 2018

 ,  ,  ,  , 
1Division of Biological Science, Graduate School of Biology-Oriented Science and Technology, Kindai University, 2Faculty of Biology-Oriented Science and Technology, Kindai University, 3Wellcome Trust/Cancer Research UK Gurdon Institute and Department of Zoology, University of Cambridge, 4Laboratory of Reproductive Biology, Graduate School of Agriculture, Kyoto University, 5Institute of Advanced Technology, Kindai University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy znacznie ulepszoną metodę klonowania myszy przy użyciu trichostatyny A, witaminy C i dejonizowanej albuminy surowicy bydlęcej. Pokazujemy uproszczony, powtarzalny protokół, który wspiera efektywny rozwój sklonowanych zarodków. W związku z tym ta metoda może stać się standardową procedurą klonowania myszy.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transfer jądra komórki somatycznej (SCNT) daje unikalną możliwość bezpośredniego wyprodukowania sklonowanego zwierzęcia z komórki dawcy i wymaga użycia umiejętnych technik. Ponadto wydajność klonowania pozostaje niska od czasu udanej produkcji klonowanych zwierząt, zwłaszcza myszy. Podjęto wiele prób poprawy wydajności klonowania, a trichostatyna A (TSA), inhibitor deacetylazy histonowej, jest szeroko stosowana w celu zwiększenia wydajności klonowania. W tym miejscu przedstawiamy znacznie ulepszoną metodę klonowania u myszy. Ta metoda transferu jądra komórki somatycznej polega na wykorzystaniu hemaglutynującego wirusa otoczki japońskiej (HVJ-E), który umożliwia łatwą manipulację. Co więcej, leczenie przy użyciu dwóch małych cząsteczek, TSA i witaminy C (VC), z dejonizowaną albuminą surowicy bydlęcej (dBSA), jest wysoce skuteczne w rozwoju embrionalnym. Takie podejście nie wymaga ani dodatkowej iniekcji, ani manipulacji genetycznej, a zatem stanowi prostą, odpowiednią metodę do praktycznego zastosowania. Metoda ta może stać się technicznie wykonalnym podejściem dla naukowców do produkcji genetycznie zmodyfikowanych zwierząt z hodowanych komórek. Co więcej, może to być użyteczny sposób na ratowanie zagrożonych zwierząt poprzez klonowanie.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Technologia SCNT umożliwia produkcję klonowanych zwierząt przy użyciu tylko jednej komórki somatycznej lub jądra, które mają być przeniesione do wyłuszczonego oocytu. Jednym z celów techniki SCNT jest wyprowadzenie linii embrionalnych komórek macierzystych z transferem jądrowym (NT-ESC) ze sklonowanych zarodków. W 1998 roku Wakayama i in. poinformowali, że po raz pierwszy udało im się sklonować mysz o imieniu Cumulina1. Od tego czasu klonowanie myszy było szeroko badane i uzyskano wiele ważnych informacji na temat przeprogramowania jądra somatycznego. Z drugiej strony, technice tej towarzyszą liczne etapy mikromanipulacji, które są dość trudne do opanowania, wymagające intensywnego treningu trwającego ponad 3 miesiące2.

Produkcja klonowanych myszy za pomocą SCNT ewoluowała od oryginalnej metody Honolulu1, metody elektrooporowej3, do metody fuzji komórek za pomocą hemaglutynującego wirusa Japonii (HVJ)4. Jednak bezpośrednie wstrzyknięcie jądra komórkowego przez błonę cytobłonową ma tendencję do szkodliwego wpływu na przeżycie oocytów. Elektrooporowość ma niską wydajność, ponieważ każda błona komórkowa ma inną twardość, co utrudnia określenie optymalnego stanu. Obchodzenie się z HVJ jest pracochłonne, ponieważ wymaga specjalnego sprzętu dla bezpieczeństwa badaczy i zwierząt laboratoryjnych. Ostatnio, do fuzji cytoplazmy komórki dawcy i oocytu, zastosowano HVJ-E5. HVJ-E ma zdolność łączenia błon tylko bez zdolności proliferacyjnych lub zakaźnych wirusów. Genomowe RNA HVJ są całkowicie inaktywowane w HVJ-E. Zastosowanie HVJ-E ułatwia zatem obsługę fuzji komórek podczas SCNT.

Kilka raportów wykazało, że leczenie zarodków SCNT TSA, inhibitorem deacetylazy histonowej, znacznie poprawia wydajność produkcji żywych szczeniąt z mniej niż 1% do 6,5%6,7. Leczenie TSA przyspiesza przeprogramowanie poprzez modyfikację znaczników histonowych w zarodkach SCNT8. Ostatnio wykazano, że wstrzykiwanie określonych mRNA, podrodziny demetylazy lizyny histonowej 4 (KDM4), które usuwają trimetylację histonu H3 lizyny 9 (H3K9) w zarodkach SCNT, zwłaszcza w regionach opornych na przeprogramowanie, zwiększa rozwój sklonowanych zarodków myszy9. Tymczasem VC, który służy również jako modyfikator histonów, zmniejszył trimetylację H3K910. Ponadto VC wspomaga rozwój embrionalny u świń SCNT10. Doniesiono, że wstrzyknięcie dBSA do zarodków SCNT prowadzi do poprawy rozwoju embrionalnego11.

Wcześniej odkryliśmy, że połączenie małych molekuł, a mianowicie TSA i VC, wraz z dBSA, znacznie przyspieszyło rozwój zarodków SCNT12. W tym miejscu szczegółowo opisana została wcześniej opisana metoda SCNT dla myszy, która reprezentuje wysoce wydajne i proste procedury klonowania12. Opisujemy również sposób obchodzenia się z HVJ-E. Mogą one pomóc wielu naukowcom w dziedzinie biologii rozwoju i rozrodu w zachowaniu zasobów genetycznych lub produkcji genetycznie modyfikowanych zwierząt za pomocą tej metody SCNT.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury na zwierzętach są zgodne z wytycznymi Uniwersytetu Kindai dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych.

1. Przygotowanie pożywek hodowlanych

  1. Przygotować zmodyfikowaną pożywkę KSOM (mKSOM) do hodowli zarodków, składającą się z 95 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 0,35 mM KH2PO4, 0,2 mMMgSO4 · 7H2O, 1,71 mM CaCl2 · 2H2O, 0,2 mM D(+)-glukoza, 0,2 mM pirogronian sodu, 1,0 mM L-glutamina, 1,0 g/L poliwinylopirolidon (PVP), 25,07 mM NaHCO3, 10 mM DL-mleczanu sodu, 0,05 g/l penicyliny i 0,05 g/l streptomycyny w sterylnej wodzie.
  2. Przygotować pożywkę CZB (HCZB) buforowaną przez Hepes do manipulacji zarodkami, składającą się z 81,5 mM NaCl, 4,8 mM KCl, 1,7 mM CaCl2 · 2H2O, 1,18 mMMgSO4 · 7H2O, 1,18 mM KH2PO4, 0,11 mM EDTA · 2Na, 36,1 mM DL-mleczanu sodu, 5,55 mM D(+)-glukozy, 0,025 g/ml penicyliny, 0,035 g/l streptomycyny, 0,014 mM czerwieni fenolowej, 1,0 g/l alkoholu poliwinylowego, 5,0 mMNaHCO3 i 20,0 mM soli sodowej Hepes w sterylnej wodzie.
  3. Przygotuj pożywkę aktywacyjną do aktywacji oocytów: pożywkę mKSOM uzupełnioną 50 nM TSA, 2 mM EGTA, 5 μg/ml cytochalazyny B (CB) i 5 mM SrCl2.

2. Przygotowanie dejonizowanej albuminy surowicy bydlęcej (dBSA)

  1. Rozpuścić 1,2 g albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w 10 ml sterylnej wody o temperaturze pokojowej (stężenie końcowe 12%).
  2. Dodać około 0,12 g zmieszanych kulek żywicy jonowymiennej do wyżej przygotowanych 12% BSA w sterylnej wodzie o temperaturze pokojowej, delikatnie mieszając.
  3. Gdy kulki zmienią kolor z niebiesko-zielonego na złoty, odzyskaj roztwór supernatantu za pomocą pipety. Następnie zastąp koraliki świeżymi (Rysunek 1).
    UWAGA: Wymiana koralików jest zwykle wykonywana tylko raz. Prawdopodobnie wymaga kilku wymian, aby zakończyć dejonizację. Tylko orientacyjnie, jeśli kolor koralików pozostaje niezmieniony od niebiesko-zielonego do złotego, oznacza to, że wymiana jonowa jest zakończona.
  4. Odzyskaj roztwór po upewnieniu się, że nie ma zmiany koloru w kulkach.
    UWAGA: Jeśli odzyskany roztwór stanie się mętny, odwiruj go, aby zapobiec zatkaniu filtra (175 x g, 5 min).
  5. Uzupełnij odzyskany roztwór 250 μl 10,5% NaHCO3,
    UWAGA: Ten proces jest przeznaczony dla roztworu dBSA w celu zneutralizowania warunków pH. Jednak NaHCO3 może być zbędny.
  6. Wysterylizuj supernatant za pomocą filtra 0,45 μm i przechowuj w temperaturze -20 °C jako roztwór podstawowy dBSA.

3. Kolekcja oocytów

UWAGA: Wszystkie myszy były utrzymywane w klimatyzowanych pomieszczeniach z kontrolowanym światłem.

  1. Każdą samicę myszy B6D2F1 (w wieku 8 - 10 tygodni) należy poddać superowulacji przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 7,5 j.m. gonadotropiny surowicy ciężarnej klaczy (PMSG) i 7,5 j.m. ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej (hCG) 48 godzin po wstrzyknięciu PMSG.
  2. Wykonać eutanazję przez zwichnięcie szyjki macicy 14 - 16 godzin po wstrzyknięciu hCG. Naciąć brzuch, aby uzyskać dostęp do układu rozrodczego, stosując standardowe techniki preparacji13. Krótko uszczypnij skórę i wykonaj nożyczkami małe boczne nacięcie na linii środkowej. Przytrzymaj skórę mocno powyżej i poniżej nacięcia i pociągnij skórę w kierunku głowy i ogona. Przetnij otrzewną nożyczkami, odepchnij cewki jelita i potwierdź obecność dwóch rogów macicy, jajowodów i jajników.
  3. Usuń jajowody małymi prostymi nożyczkami i pęsetą, umieść na arkuszu bibuły filtracyjnej, aby zetrzeć krew z powierzchni. Ustaw jajowody w oleju mineralnym. Następnie należy przeciąć bańkę jajowodu za pomocą igieł rozwarstwiających i przenieść kompleksy wzgórek-oocyty pochodzące z bańki jajowodu do 200 μl kropli pożywki HCZB z 0,1% hialuronidazą. Inkubować przez 5 minut na płycie rozgrzewającej.
    Uwaga: Ekspozycja dłuższa niż 10 minut na pożywkę HCZB z 0,1% hialuronidazą byłaby szkodliwa dla oocytów.
  4. Upewnij się, że komórki wzgórka są uwalniane z kompleksów wzgórek-oocyt pod mikroskopem stereoskopowym, przenieś oocyty drugiego etapu metafazy mejotycznej (MII) z niektórymi pozostałymi komórkami wzgórka na pożywkę mKSOM zawierającą 0,3% dBSA. Następnie przemyj oocyty w stadium MII czterokrotnie, pipetując w górę iw dół (za pomocą pipety o średnicy wewnętrznej <100 μm) w pożywce mKSOM zawierającej 0,3% dBSA w celu odłączenia pozostałych komórek wzgórka.
    UWAGA: Użycie małej pipety ułatwia odklejanie się komórek wzgórka.
  5. Inkubować oocyty w stadium Mll w pożywce mKSOM zawierającej 0,3% dBSA w temperaturze 37 °C w inkubatorze 5% CO2 aż do enukleacji.
    UWAGA: Zalecana jest mała pipeta o średnicy nieco większej niż średnica oocytu.

4. Przygotowanie komórek dawcy do transferu jądrowego

  1. Po krokach 3,3 - 3,5 ogołocone oocyty są izolowane z kompleksów wzgórek-oocyty. Przenieść niewielką ilość (około 2 μl) pozostałych komórek wzgórka rozproszonego z kompleksów wzgórek-oocyty w pożywce HCZB z 0,1% hialuronidazą do pożywki HCZB z 6% dBSA za pomocą pipety pod mikroskopem stereoskopowym.
  2. Umieścić wzgórki w pożywce HCZB z 6% dBSA na płycie grzewczej w temperaturze 37 °C, aż będą potrzebne do SCNT.
    UWAGA: Gdy komórki fibroblastów (np. mysie płodowe komórki fibroblastów) są używane jako komórki dawcy, odłącz komórki od naczynia do hodowli tkankowej i odwiruj je do postaci osadu. Zawiesić osad komórek w podłożu HCZB zawierającym 6% dBSA.

5. Wyłuszczenie oocytów

  1. Przygotuj 9% pożywkę PVP, dodając 0,9 g PVP do 10 ml pożywki HCZB, przechowuj w lodówce przez noc (4 °C), a następnie wysterylizuj za pomocą filtra 0,45 μm.
  2. Przygotować roztwory podstawowe CB (stężenie 1 mg/ml), dodając 5 mg CB do 5 ml dimetylosulfotlenku (DMSO). Rozcieńczyć roztwór podstawowy CB pożywką HCZB (końcowe stężenie 5 μg/ml) i użyć jako roztworu enukleacji.
  3. Przemyć oocyty w stadium Mll w 20 μl pożywki HCZB zawierającej 5 μg/ml CB (roztwór enukleacji) poprzez wdychanie i wydychanie przez wysterylizowaną pipetę (średnica wewnętrzna: 150 μm do 200 μm). Powtórz procedurę prania pięć razy. Odczekaj około 10 minut na płycie grzewczej w roztworze enukleacji przed rozpoczęciem procesu enukleacji.
  4. Przygotuj komorę enukleacyjną, jak pokazano na Rysunek 2A. Przenieść oocyty Mll do komory enukleacji poprzez wdychanie i wydychanie za pomocą pipety (średnica wewnętrzna: od 150 μm do 200 μm); umieścić 4 μl roztworu enukleacji i zalać komorę olejem mineralnym.
    UWAGA: Zamiast komory można zastosować pokrywę z szalki Petriego o średnicy 60 mm.
  5. Zidentyfikuj wrzeciona i chromosomy oocytu w stadium MII pod mikroskopem (400X) w temperaturze pokojowej. Zorientuj oocyt w stadium Mll z wyraźnym pierwszym ciałem polarnym, tak aby wrzeciono i chromosom znajdowały się na godzinie 3 lub 9 (Rysunek 2B) za pomocą pipety trzymającej i mikropipety.
    UWAGA: Zastosowany mikroskop posiada soczewki o łącznym powiększeniu 400X. Ponadto soczewka obiektywu N.A wynosi 5X/0.12 i 40X/0.55. Piezoelektryczne sterowanie impulsem pipety umożliwia szybkie wiercenie w osłonie przejrzystej. Ponadto system laserowy (np. XYClone) może być również używany do wiercenia w osłonie przezroczystej w miejsce piezoelektrycznego układu napędowego.
  6. Ustaw intensywność impulsu piezoelektrycznego na 3 - 6 i wywierć do osłony przejrzystej za pomocą pipety do mikromanipulacji (końcówka o płaskim końcu o średnicy wewnętrznej 7 - 8 μm) z napędem impulsu piezoelektrycznego. Po otwarciu otworu w osłonie przejrzystej, całkowicie wyłuszczyć wrzeciona i chromosomy minimalną ilością cytoplazmy (Rysunek 2C).
    UWAGA: Podczas tego procesu oocyty mają tendencję do ścisłego przylegania do dna naczynia lub pipety ze względu na pożywkę bez BSA14. W ciągu 10 minut proces enukleacji musi zostać zakończony, a wyłuszczone oocyty muszą zostać zwrócone do inkubatora. Odpowiednia liczba oocytów, którymi można manipulować w jednej enukleacji, wynosi od 10 do 20. W przypadku większych partii oocytów procedurę enukleacji powtarza się.
  7. Potwierdź brak chromosomów w cytoplazmie w świetle widzialnym (Rysunek 2C, środek), a następnie dokładnie umyj wyłuszczone oocyty w pożywce mKSOM zawierającej 0,3% dBSA bez CB. Wprowadzić naczynie do inkubatora w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO2 aż do fuzji komórek.
    UWAGA: Po enukleacji cytoplazma usunięta z ooplazmy zawiera wrzeciona i chromosomy.

6. Fuzja komórki dawcy i wyłuszczonego oocytu

  1. Przygotowanie HVJ-E
    1. Dodać 260 μl lodowatego roztworu zawiesiny HVJ-E do liofilizowanego HVJ-E (z zestawu, patrz tabela materiałów) i pipetować w górę iw dół, aż do całkowitego zawieszenia.
      UWAGA: Odpowiednia ilość liofilizowanego HVJ-E jest przygotowana w butelce, a w zestawie znajduje się 260 μL roztworu zawiesiny HVJ-E.
    2. Przygotować 5 μl podwielokrotności roztworu HVJ-E, a następnie przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu fuzji komórek.
      Uwaga: Ostrożnie traktuj HVJ-E na lodzie, ponieważ jest wrażliwy na temperaturę. Po zakończeniu eksperymentu należy odpowiednio autoklawować materiały i pojemniki HVJ-E, aby całkowicie dezaktywować składniki wirusa.
  2. Fuzja komórek
    1. Bezpośrednio przed użyciem rozcieńczyć 5 μl roztworu HVJ-E w 20 μl buforu do fuzji komórek. Rozcieńczony roztwór HVJ-E umieścić na lodzie do czasu użycia.
      UWAGA: Bufor fuzji komórek znajduje się w zestawie HVJ-E.
    2. Przygotuj komorę fuzji komórek, jak pokazano na Rysunek 3A. Przenieść wyłuszczone oocyty do pożywki HCZB w komorze fuzji komórek za pomocą pipety (średnica wewnętrzna: 150 μm do 200 μm); umieścić 4 μl każdego roztworu (pożywka HCZB zawierająca 6% -BSA dla komórek dawcy, roztwór HVJ-E, pożywka HCZB, 9% PVP w pożywce HCZB) i przykryć komorę około 1 ml oleju mineralnego.
      UWAGA: Odpowiednia liczba wyłuszczonych oocytów, które są przenoszone do komory w celu manipulacji podczas jednej procedury fuzji komórek, wynosi od 5 do 30. W przypadku większych partii oocytów procedurę fuzji komórek powtarza się. Zamiast komory można zastosować 60-milimetrową pokrywę szalki Petriego, jeśli jest dostępna.
    3. Umieścić wyłuszczone oocyty w pożywce HCZB pod mikroskopem w 400-krotnym powiększeniu w temperaturze pokojowej. Odessać komórki dawcy za pomocą pipety do mikromanipulacji (płaska końcówka o średnicy wewnętrznej 6-7 μm) i wydalić komórki do roztworu zawiesinowego HVJ-E.
    4. Następnie odsysaj wzgórki pojedynczo roztworem zawiesiny HVJ-E, aby były równomiernie oddzielone od siebie, umożliwiając seryjną fuzję komórek. Utrzymuj wyłuszczone oocyty w pożywce HCZB za pomocą pipety podtrzymującej. Wywierć osłonę przejrzystą pipetą mikromanipulacyjną z impulsem piezoelektrycznym (intensywność 3 - 6, prędkość 2 - 3).
    5. Po otwarciu otworu w osłonie przejrzystej należy przyłożyć komórkę wzgórka do błony oocytu wraz z roztworem zawiesiny HVJ-E o objętości 5 razy większej niż objętość komórki wzgórka, nie przechodząc przez błonę oocytów.
      UWAGA: Przygotować płaskie końcówki pipet mikromanipulacyjnych o średnicy wewnętrznej 6 - 7 μm do komórek wzgórka. Pipety należy regularnie myć przy użyciu 9% pożywki PVP, aby utrzymać płynne uwalnianie komórek. Kroki 6.2.3 - 6.2.5 muszą zostać zakończone w ciągu 10 minut, w przeciwnym razie wydajność fuzji komórek będzie niższa. Aktywność fuzji membranowej HVJ-E jest inaktywowana przez autoklawowanie, traktowanie detergentem lub 70% etanolem. Po doświadczeniu roztwór HVJ-E należy odpowiednio zutylizować.
    6. Po manipulacji fuzją komórek należy niezwłocznie przenieść oocyty na pożywkę mKSOM zawierającą 0,3% dBSA i przenieść do inkubatora w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO2 przez 1 godzinę.

7. Aktywacja zrekonstruowanych oocytów i leczenie trichostatyną A i witaminą C

  1. Przygotowanie TSA
    1. Dozować 5 mM roztwór TSA do 3 μl porcji i przechowywać roztwór w temperaturze -20 °C.
    2. Dodać 2,5 μl 5 mM roztworu podstawowego TSA do 1 ml DMSO (stężenie 12,5 μM).
    3. Rozcieńczyć 8 μl 12,5 μM roztworu podstawowego TSA w 2 ml pożywki aktywacyjnej i pożywki mKSOM (stężenie końcowe 50 nM).
  2. Przygotowanie VC
    1. Dodać 1 mg VC do 1 ml sterylnej wody wolnej od endotoksyn i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    2. Dodać roztwór podstawowy VC do pożywki mKSOM (końcowe stężenie 10 μg/ml).
  3. Aktywacja zrekonstruowanych oocytów
    1. Godzinę po fuzji komórek sprawdź przedwczesną kondensację chromosomów (PCC) w zrekonstruowanych oocytach (Ryc. 3B) za pomocą mikroskopu (400X).
    2. Przenieść zrekonstruowane oocyty do pożywki aktywacyjnej (patrz krok 1.3) zawierającej TSA i inkubować przez 6 godzin w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO2 w powietrzu (Rysunek 3C). Obserwuj tworzenie się pro-jąder w zarodkach SCNT, a następnie zastosuj 2 kolejne godziny leczenia TSA w pożywce mKSOM zawierającej 0,3% dBSA (Ryc. 2C).
  4. Przenieś zarodki poddane działaniu TSA na pożywkę mKSOM uzupełnioną VC i inkubuj przez 7 godzin, jak pokazano na Rysunek 3D.
  5. Po 7 godzinach od poddania działaniu VC przenieść zarodki poddane VC do pożywki mKSOM zawierającej 0,3% dBSA i inkubować przez 4 dni w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO2 w powietrzu.
    UWAGA: Aby wyprodukować sklonowane myszy, przenieś morfologicznie normalne zarodki w stadium 2-komórkowym do jajowodów samic myszy w ciąży (MCH (ICR)) w dniu znalezienia czopa pochwowego (dzień 0,5 ciąży rzekomej) 15. Po 19,5 dnia rejestruje się liczbę miejsc implantacji i noworodków po cesarskim cięciu.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Do produkcji sklonowanych embrionów myszy użyto komórek wzgórka i płodowych komórek fibroblastów. Liczbę zrekonstruowanych oocytów i rozwój do stadium 2-komórkowego po aktywacji oocytów przedstawiono w tabeli 1. We wszystkich warunkach zaobserwowano bardzo wysokie tempo tworzenia się projądra (89 do 100%) i rozwoju do stadium 2-komórkowego (77 do 89%). Część sklonowanych zarodków, które pochodziły z komórek wzgórka i rozwinęły się do stadium 2-komórkowego, przeniesiono do jajowodów samic w rzekomej ciąży. Sześć sklonowanych potomstwa z 72 przeniesionych embrionów zostało wyprodukowanych z trzech ciężarnych samic przez seryjne leczenie TSA i VC (Ryc. 4). Zgłoszono, że około 15% sklonowanych zarodków rozwija się do terminu dzięki postępowaniu zgodnie z tymi procedurami SCNT12. Ponadto transfer sklonowanych dwukomórkowych zarodków w innych instytucjach pozwolił uzyskać od 9 do 15% żywego potomstwa, co stanowi lepszy postęp niż pojedyncze leczenie TSA na sklonowanych zarodkach. Ponadto leczenie TSA i VC istotnie poprawiło efektywność rozwoju embrionalnego in vitro do stadium blastocysty (Tabela 2, P <0,05, test t-Studenta). Te dane rozwojowe in vitro pokazują, że pozytywny wpływ TSA i VC nie jest ograniczony ani przez szczepy myszy, ani przez typy komórek. Wyniki te sugerują, że ta metoda SCNT ułatwia zdolność rozwojową sklonowanych zarodków.

figure-results-1
Rysunek 1: Przygotowanie dBSA.
Przedstawiono procedury przygotowania roztworu dBSA krok po kroku. Zakres wymiany jonowej można ocenić na podstawie zmiany koloru kulek. Lewy górny rysunek pokazuje, że 1,2 g BSA rozpuszcza się w 10 ml sterylnej wody o temperaturze pokojowej. Po rozpuszczeniu BSA dodaje się kulki żywicy jonowymiennej (prawy górny róg). Gdy mieszanina roztworu BSA z kulkami żywicy jonowymiennej zmieni kolor z niebiesko-zielonego na złoty (prawy dolny róg), zastąp kulki świeżymi. Rysunek w lewym dolnym rogu pokazuje, że kolor koralików pozostaje niebiesko-zielony, a wymiana jonowa jest zakończona. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Procedury enukleacji.
(A) Ilustracja komory enukleacji. Wyłuszczenie oocytów przeprowadza się w pożywce HCZB z CB. W przypadku układu jazdy piezoelektrycznej do przygotowania szklanej pipety do enukleacji wykorzystuje się plamkę 9% pożywki PVP. Plamy pokryte są olejem mineralnym. (B) Diagram i mikrofotografia pokazują położenie wrzecion i chromosomów przed enukleacją. Czarne groty strzał: wrzeciona i chromosomy. Czerwone groty strzał: pierwsze ciało polarne. (C) Diagram i mikrofotografia pokazujące udaną enukleację. Czarne groty strzał: wrzeciona i chromosomy. Czerwony grot strzały: pierwsze ciało polarne. Niebieski grot strzały: w osłonie przejrzystej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rycina 3: Procedury fuzji komórek i warunki hodowli zarodków SCNT.
(A) Ilustracja komory fuzji komórek. Fuzja komórek przeprowadzana jest w pożywce HCZB zawierającej 6% dBSA. Plamka 9% pożywki PVP służy do przygotowania szklanej pipety do fuzji komórek. Plamy pokryte są olejem mineralnym. (B) Diagram i mikrofotografia przedwczesnej kondensacji chromosomów powstałej godzinę po fuzji komórek (grot strzałki). (C) Schemat i mikrofotografia struktury projądrowej uformowanej w sześć godzin po aktywacji (czarne groty strzałek). (D) Schemat leczenia zarodków SCNT za pomocą TSA, VC i dBSA. Zielona strzałka reprezentuje leczenie TSA, a następnie inkubację z VC (żółta strzałka) pod pożywką mKSOM zawierającą 0,3% dBSA (niebieska strzałka). Groty strzałek wskazują czas na zmianę medium. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rycina 4: Sklonowane potomstwo pochodzące z komórek wzgórka tuż po cesarskim cięciu po 19,5 dniu ciąży.
W górnym rzędzie znajdują się łożyska. Pokazane tutaj sklonowane potomstwo zostało wygenerowane w jednym eksperymencie transferu jądrowego od trzech przybranych matek. Rozmiar łożyska był od 1,5 do 2 razy większy niż rozmiar łożyska powstałego w wyniku zapłodnienia in vitro. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

grupaTyp komórki dawcySzczep myszyLiczba użytych oocytówLiczba zrośniętych oocytówLiczba oocytów wykazujących przedwczesną kondensację chromosomówLiczba oocytów wykazujących tworzenie przedjądrzy (%)Liczba oocytów utworzonych przez przedjądrza, które się rozwinęły
do zarodków 2-komórkowych (%)
TSA, VCCumulusC57BL/6× DBA/2Rozdział 84Rozdział 82Rozdział 8281 (99)72 (89)
NieleczonychCumulusC57BL/6× DBA/2Rozdział 84Rozdział 82Rozdział 8282 (100)68 (83)
TSA, VCfibroblasty płodoweMCH(ICR)×MCH(ICR)Rozdział 202171 Rozdział 171Rozdział 169151 (89)124 (82)
Nieleczonychfibroblasty płodoweMCH(ICR)×MCH(ICR)Z numerem 201171 Rozdział 171Rozdział 147142 (97)109 (77)

Tabela 1: Wpływ leczenia TSA i VC na rozwój in vitro sklonowanych embrionów myszy do stadium 2-komórkowego.

Rozdział
Grupatyp komórki dawcySzczep myszyLiczba użytych zarodków dwukomórkowychLiczba zarodków dwukomórkowych rozwiniętych do każdego stadium (%)
4-komorowaMorula powiedział:blastocysta
TSA, VCCumulusC57BL/6× DBA/2152 Rozdział 152152 (100)149 (98)135 (89) a
NieleczonychCumulusC57BL/6× DBA/2Rozdział 8347 (57)41 (49)32 (39) b
TSA, VCfibroblasty płodoweMCH(ICR)×MCH(ICR)124110 (89)101 (81)88 (71) c
Nieleczonychfibroblasty płodoweMCH(ICR)×MCH(ICR)Rozdział 10954 (50)45 (41)art. 29 ust. 27 lit. d
a-b, c-d Różne indeksy górne w tych samych komórkach dawcy reprezentują znaczące różnice (P < 0,05)

Tabela 2: Wpływ leczenia TSA i VC na rozwój in vitro sklonowanych embrionów myszy do stadium blastocysty.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podsumowując, wyniki te sugerują, że przedstawiona metoda SCNT może zmniejszyć trudności techniczne i zwiększyć skuteczność SCNT bez konieczności modyfikacji genetycznych i suplementacji mRNA (Tabela 1, Tabela 2) oraz zapewnić stabilną produkcję sklonowanych zarodków. Metoda ta pozwala nam zrekonstruować więcej zarodków SCNT niż metody konwencjonalne ze względu na lepszą przeżywalność i uproszczony protokół. W tym protokole jednym z krytycznych kroków jest fuzja komórek. Aby pomyślnie wyprodukować sklonowane myszy, konieczne jest upewnienie się, że odpowiednia ilość HVJ-E opisana w protokole jest utrzymywana podczas procesu fuzji komórek, a oocyty muszą zostać zwrócone do inkubatora w ciągu 10 minut podczas kroków 6.2.3 - 6.2.5. Ponieważ w pipecie manipulacyjnej można jednocześnie odessać od 20 do 30 komórek dawcy razem z HVJ-E, liczba oocytów uzyskanych w wyniku jednej operacji jest większa niż w przypadku istniejącej metody. Finalnie w ciągu 10 minut jesteśmy w stanie wyprodukować około 20 do 30 zrekonstruowanych oocytów. Nawet podczas pracy z dużą partią oocytów (100 lub więcej) procedura fuzji komórek powinna zająć godzinę lub mniej, powtarzając kroki 6.2.3 - 6.2.5. Przedstawione tutaj metody i techniki mogą służyć jako skuteczne protokoły z uproszczonymi wymaganiami technicznymi.

Obecnie mechanizmy molekularne leżące u podstaw rozwoju zarodków SCNT są nadal niejasne. Ta ulepszona metoda SCNT przyczynia się również do badania takich mechanizmów przeprogramowywania, ponieważ metoda ta może wyprodukować wiele sklonowanych embrionów w jednym eksperymencie. Ta metoda wykorzystuje komórki somatyczne z nienaruszonymi błonami komórkowymi do fuzji komórek. W związku z tym możliwe jest zastosowanie tego podejścia do innych komórek, takich jak komórki końca ogona16, komórki Sertoliego17 i embrionalne komórki macierzyste (ES)18. Gdy konwencjonalne metody SCNT są stosowane do wstrzykiwania stosunkowo dużych komórek, takich jak komórki końca ogona, bezpośrednio do cytoplazmy oocytów, uzyskanie żywych zarodków staje się jeszcze bardziej wymagające technicznie. Ponadto stosunkowo twarde komórki, takie jak komórki Sertoliego, są trudne do rozbicia przez pipetowanie do wstrzykiwań. Biorąc pod uwagę te różne typy komórek, metoda fuzji komórek z wykorzystaniem HVJ-E jest prosta i skuteczna. Chociaż wartość i bezpieczeństwo HVJ-E zostały przekonująco wykazane19,20, ważne może być ponowne rozważenie wykonalności wykorzystania HVJ-E do produkcji klonowanych zwierząt do celów rolniczych lub biomedycznych.

Co więcej, ostatnio jedna grupa z powodzeniem wyprodukowała sklonowane myszy pochodzące z komórek moczu21. Aby ratować zagrożone gatunki ssaków, odtąd idealne będzie SCNT wykorzystujące komórki pobrane w sposób nieinwazyjny, takie jak komórka moczu. Niedawno inna grupa bezpośrednio wygenerowała sklonowane myszy przy użyciu specyficznych dla antygenu limfocytów T CD4 + 22. Interesujące byłoby zbadanie, czy ta metoda ma również zastosowanie do skutecznego klonowania myszy z takich komórek. Ponadto latrunkulina A została zgłoszona jako lepsza alternatywa dla hamowania polimeryzacji aktyny podczas enukleacji i partenogenetycznej aktywacji oocytów SCNT23. Przyszłe badania mogą ujawnić, czy leczenie latrunkuliną A, zamiast cytochalazyny B, jeszcze bardziej poprawia wytwarzanie sklonowanego potomstwa. Dodatkowo, leczenie TSA zostało z powodzeniem zastosowane u myszy, świń24 i królików25 poprzez zmianę czasu, okresu i stężenia leczenia. Co więcej, VC nie tylko wspomaga rozwój embrionalny u świń SCNT10, ale także poprawia produkcję komórek iPS u ludzi i myszy26. W związku z tym można spekulować, że leczenie TSA i VC może być również stosowane do innych gatunków ssaków i może być konieczne zoptymalizowanie czasu leczenia TSA i VC dla każdego gatunku.

Podsumowując, metoda ta umożliwiłaby generowanie sklonowanych myszy o praktycznym poziomie wydajności za pomocą prostych procedur. Dlatego wyniki tego badania mogą skłonić nas do wykorzystania technologii SCNT do zachowania zasobów genetycznych rzadkich zwierząt oraz do zrozumienia molekularnych mechanizmów przeprogramowania jądra i wczesnego rozwoju embrionalnego.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty JSPS KAKENHI o numerach JP15H06753, JP16H01321, JP16H01222, JP17H05045 dla K.M. Sumitomo Foundation Grant for Basic Science Research Projects (150810 do K.M.). Grant badawczy Uniwersytetu Kindai (15-I-2 dla KM i MA). M.O. dziękuje za podstawowe wsparcie udzielone przez Cancer Research UK (C6946/A24843) i Wellcome Trust (203144/Z/16/Z). Dziękujemy Pani N. Backes-Kamimura i Panu J. Horvatowi za korektę.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
NaClSigma-Aldrich, Co., Lcc.28-2270-5Dla średniego
KClWako Pure Chemical Industries, Ltd.169-03542Dla średnich
KH2PO4Wako Pure Chemical Industries, Ltd.165-04242Dla średniego
MgSO4 · 7H2O Wako Pure Chemical Industries, Ltd.137-00402Dla średniego
CaCl2 · 2H2O Wako Pure Chemical Industries, Ltd.039-00431Dla średniej
D(+)-glukozyWako Pure Chemical Industries, Ltd.041-00595Dla średniego
pirogronianu soduWako Pure Chemical Industries, Ltd.199-03062Dla średniej
L-glutaminySigma-Aldrich, Co., Lcc.G3126Dla średniego
poliwinylopirolidonWako Pure Chemical Industries, Ltd.168-17042Dla średniego
NaHCO3Nacalai tesque, Inc.31213-15Dla średniego
DL-mleczanu soduNacalai tesque, Inc.31605-72Dla średniej
penicylinyMeiji Seika Pharma Co., Ltd.4987222637671 (GTIN-13)Dla średniej
StreptomycynyMeiji Seika Pharma Co., Ltd.4987222665643 (GTIN-13)Dla średniej
sterylnej wody, bez endotoksynWako Pure Chemical Industries, Ltd.196-15645Dla średniego
EDTA i middot; 2NaDojindo Lab.345-01865Dla średniej
czerwieni fenolowejSigma-Aldrich, Co., Lcc.P0290Dla średniej
soli sodowej HEPESSigma-Aldrich, Co., Lcc.H3784Dla średniego
alkoholu poliwinylowegoSigma-Aldrich, Co., Lcc.P8136Dla średniej
albuminy surowicy bydlęcejSigma-Aldrich, Co., Lcc.A3311Dla średniej
żywicy BT AG 501-X8 (D)Bio-Rad Lab., Inc.143-7425Do przygotowania
hialuronidazySigma-Aldrich, Co., Lcc.H3506Do pobierania oocytów i komórek wzgórka
Cytochalazyna BWako Pure Chemical Industries, Ltd.034-17554Do enukleacji i aktywacji oocytów
Mikromanipulator piezoelektrycznyPrime tech, Co., Ltd.PMM-150FUDo mikromanipulacji
Zestaw do fuzji komórek kopertowych HVJ GenomONE-CFIshihara sangyo kaisha, Ltd.CF001Zawierający 0,5 ml roztworu zawiesiny HVJ-E i 10 ml buforu do fuzji komórek do fuzji komórek
SrCl2 · 6H2OWako Pure Chemical Industries, Ltd.193-09442Do aktywacji oocytów
EGTASigma-Aldrich, Co., Lcc.E8145Do aktywacji oocytów
Dimetylosulfotlenek WakoPure Chemical Industries, Ltd.045-24511Do rozpuszczalnika
Trichostatyna ASigma-Aldrich, Co., Lcc.T1952Do inkubacji z zarodkami SCNT
Kwas L-askorbinowySigma-Aldrich, Co., Lcc.A5960Do inkubacji z zarodkami SCNT
Olej mineralnySigma-Aldrich, Co., Lcc.M8410Do podłoża kryjącego
dBSA

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wakayama, T., Perry, A. C., Zuccotti, M., Johnson, K. R., Yanagimachi, R. Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei. Nature. 394 (6691), 369-374 (1998).
  2. Kishigami, S., et al. Production of cloned mice by somatic cell nuclear transfer. Nat Protoc. 1 (1), 125-138 (2006).
  3. Ogura, A., Inoue, K., Takano, K., Wakayama, T., Yanagimachi, R. Birth of mice after nuclear transfer by electrofusion using tail tip cells. Mol Reprod Dev. 57 (1), 55-59 (2000).
  4. Ono, Y., Shimozawa, N., Ito, M., Kono, T. Cloned mice from fetal fibroblast cells arrested at metaphase by a serial nuclear transfer. Biol Reprod. 64 (1), 44-50 (2001).
  5. Matoba, S., et al. Embryonic development following somatic cell nuclear transfer impeded by persisting histone methylation. Cell. 159 (4), 884-895 (2014).
  6. Kishigami, S., et al. Significant improvement of mouse cloning technique by treatment with trichostatin A after somatic nuclear transfer. Biochem Biophys Res Commun. 340 (1), 183-189 (2006).
  7. Rybouchkin, A., Kato, Y., Tsunoda, Y. Role of histone acetylation in reprogramming of somatic nuclei following nuclear transfer. Biol Reprod. 74 (6), 1083-1089 (2006).
  8. Bui, H. T., et al. Effect of trichostatin A on chromatin remodeling, histone modifications, DNA replication, and transcriptional activity in cloned mouse embryos. Biol Reprod. 83 (3), 454-463 (2010).
  9. Chen, J., et al. H3K9 methylation is a barrier during somatic cell reprogramming into iPSCs. Nat Genet. 45, 34-42 (2013).
  10. Huang, Y., et al. Vitamin C enhances in vitro and in vivo development of porcine somatic cell nuclear transfer embryos. Biochem Biophys Res Commun. 411 (2), 397-401 (2011).
  11. Isaji, Y., Yoshida, K., Imai, H., Yamada, M. An intracytoplasmic injection of deionized bovine serum albumin immediately after somatic cell nuclear transfer enhances full-term development of cloned mouse embryos. J Reprod Dev. 61 (6), 503-510 (2015).
  12. Miyamoto, K., et al. Reprogramming towards totipotency is greatly facilitated by synergistic effects of small molecules. Biol Open. 6, 415-424 (2017).
  13. Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2014).
  14. Nakagata, N., Okamoto, M., Ueda, O., Suzuki, H. Positive effect of partial zona-pellucida dissection on the in vitro fertilizing capacity of cryopreserved C57BL/6J transgenic mouse spermatozoa of low motility. Biol Reprod. 57 (5), 1050-1055 (1997).
  15. Hogan, B., Costantini, F., Lacy, E. Manipulating the mouse embryo. , Cold Spring Harbor Laboratory. (1986).
  16. Wakayama, T., Yanagimachi, R. Cloning of male mice from adult tail-tip cells. Nat Genet. 22 (2), 127-128 (1999).
  17. Ogura, A., et al. Production of male cloned mice from fresh, cultured, and cryopreserved immature sertoli cells. Biol Reprod. 62 (6), 1579-1584 (2000).
  18. Wakayama, T., Rodriguez, I., Perry, A. C., Yanagimachi, R., Mombaerts, P. Mice cloned from embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (26), 14984-14989 (1999).
  19. Tachibana, M., et al. Mitochondrial gene replacement in primate offspring and embryonic stem cells. Nature. 461 (7262), 367-372 (2009).
  20. Yamada, M., et al. Human oocytes reprogram adult somatic nuclei of a type 1 diabetic to diploid pluripotent stem cells. Nature. 510 (7506), 533-536 (2014).
  21. Mizutani, E., et al. Generation of cloned mice and nuclear transfer embryonic stem cell lines from urine-derived cells. Sci Rep. 6, 1-8 (2016).
  22. Kaminuma, O., et al. Hyper-reactive cloned mice generated by direct nuclear transfer of antigen-specific CD4+ T cells. EMBO Rep. 18 (6), 885-893 (2017).
  23. Terashita, Y., et al. Latrunculin A can improve the birth rate of cloned mice and simplify the nuclear transfer protocol by gently inhibiting actin polymerization. Biol Reprod. 86 (6), 180(2012).
  24. Zhao, J., et al. Histone deacetylase inhibitors improve in vitro and in vivo developmental competence of somatic cell nuclear transfer porcine embryos. Cell Reprogram. 12 (1), 75-83 (2010).
  25. Shi, L. H., et al. Trichostatin A (TSA) improves the development of rabbit-rabbit intraspecies cloned embryos, but not rabbit-human interspecies cloned embryos. Dev Dyn. 237 (3), 640-648 (2008).
  26. Esteban, M. A., et al. Vitamin C enhances the generation of mouse and human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 6 (1), 71-79 (2010).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

leczenie trichostatyner Aleczenie witamin Cpoprawa wydajno ci klonowaniausprawnienie rozwoju embrionalnegotechnika fuzji kom rekprocedura enukleacjiprzygotowanie DBSAzastosowanie HVJ Eanaliza formowania si pronukleus w

Powiązane artykuły