W tym artykule opisany jest ekonomiczny, zoptymalizowany i prosty protokół, który wykorzystuje metodę niebieskiego barwnika Evansa do oceny wynaczynienia osocza w organach myszy FVBN, które mogą być przystosowane do użycia w innych szczepach, gatunkach i innych narządach lub tkankach.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Zoptymalizowany protokół Evans Blue do oceny przecieku naczyniowego u myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wyciek naczyniowy, czyli wynaczynienie osocza, ma wiele przyczyn i może być poważną konsekwencją lub objawem reakcji zapalnej. Badanie to może ostatecznie doprowadzić do nowej wiedzy na temat przyczyn lub nowych sposobów hamowania lub leczenia wynaczynienia osocza. Ważne jest, aby naukowcy dysponowali odpowiednimi narzędziami, w tym najlepszymi dostępnymi metodami, do badania wynaczynienia osocza. W tym artykule opisujemy protokół, wykorzystujący metodę niebieskiego barwnika Evansa, do oceny wynaczynienia osocza w narządach myszy FVBN. Protokół ten jest celowo prosty, w jak największym stopniu, ale zapewnia wysoką jakość danych. Niebieski barwnik Evans został wybrany przede wszystkim dlatego, że jest łatwy w użyciu dla przeciętnego laboratorium. Wykorzystaliśmy ten protokół, aby dostarczyć dowodów i poprzeć hipotezę, że enzym neprylizyna może chronić naczynia krwionośne przed wynaczynieniem osocza. Jednak protokół ten może być eksperymentalnie stosowany i łatwo dostosowany do stosowania u innych szczepów myszy lub u innych gatunków, w wielu różnych narządach lub tkankach, do badań, które mogą obejmować inne czynniki, które są ważne w zrozumieniu, zapobieganiu lub leczeniu wynaczynienia osocza. Protokół ten został znacznie zoptymalizowany i zmodyfikowany w stosunku do istniejących protokołów i łączy w sobie niezawodność, łatwość użycia, oszczędność oraz ogólną dostępność materiałów i sprzętu, dzięki czemu protokół ten jest lepszy dla przeciętnego laboratorium do ilościowego określania wynaczynienia osocza z narządów.
Wprowadzenie
Przeciek naczyniowy w narządach odnosi się do wynaczynienia, czyli wycieku osocza krwi przez szczeliny powstałe w śródbłonku żyłek naczyń włosowatych w narządach. To wynaczynienie osocza lub zwiększona przepuszczalność naczyń, która może wynikać z pewnego rodzaju reakcji zapalnej, może mieć poważne konsekwencje. Dlatego ważne jest, aby to zjawisko, jego przyczyny, modulatory i konsekwencje były badane i rozumiane, a także, aby badacze mieli dobre narzędzia i protokoły, za pomocą których mogą je badać. Luki śródbłonka mogą być wytwarzane przez szereg bodźców, ale zwykle są wytwarzane przez działanie neuroprzekaźników peptydowych i/lub tachykinin na śródbłonek. Jednym z....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie obowiązujące międzynarodowe, krajowe i/lub instytucjonalne wytyczne dotyczące opieki i użytkowania zwierząt (myszy) były przestrzegane w eksperymentach opisanych w tym manuskrypcie.
Ta metoda wykorzystuje dorosłe myszy FVBN w wieku 16 - 20 tygodni, które okazały się optymalne dla celów tego badania. Dzień 1 obejmuje kroki od 1 do 5, a Dzień 2 obejmuje kroki od 6 do 7 (Rysunek 1).
1. Przygotowanie sprzętu
- Zapewnić odpowiedni zapas sterylnych, jednorazowych strzykawek i igieł, jeśli ketamina/ksylazyna jest stosowana jako środek znieczulający (zgodnie z zaleceniami)....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Na Rysunku 1 przedstawiono schemat procedury, która zapewnia najbardziej wiarygodne i spójne wartości przesączania osocza indukowanego substancją P w organach myszy FVBN. Procedura ta zazwyczaj zajmuje dwa dni pracy, przedzielone co najmniej 48 h czasu oczekiwania. Jest możliwe dalsze rozciągnięcie tego procesu w czasie, pod warunkiem, że będzie on prowadzony w ten sam sposób dla wszystkich porównywanych eksperymentów. Na przykład po wyizolowaniu organów w dn.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Jak omówiono powyżej, badanie wynaczynienia osocza może ostatecznie doprowadzić do nowej wiedzy na temat przyczyn lub nowych sposobów hamowania lub leczenia wynaczynienia osocza. Skuteczne zastosowanie protokołu wynaczynienia osocza (powyżej), przy użyciu niebieskiego barwnika Evansa, zostało zademonstrowane w obecnym manuskrypcie. Chociaż dane potwierdziły hipotezę, że NEP może chronić naczynia krwionośne przed wynaczynieniem osocza, jest to obecnie cel drugorzędny, a głównym celem jest przedstawienie zoptymalizowanego .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy pragną podziękować Andy'emu Poczobuttowi i Dr. Jori Leszczyńskiemu za ich cenną pomoc i zmiany w tym manuskrypcie. Wspierane przez granty otrzymane od Narodowego Instytutu Serca, Płuc i Krwi (NHLBI RO1 HL078929, PPG HL014985 i RO3 HL095439) oraz Departamentu ds. Weteranów (Przegląd Zasług).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| izofluran | Vet One | 200-070 | wziewny środek znieczulający |
| ketamina | Vet One | 200-055 | iniekcyjne strzykawki znieczulające |
| ksylazyna | Lloyd Laboratories | 139-236 | |
| (10,3 i 1 cc) | Becton Dickinson | 309604, 309657, 309659 | |
| igieł (20G1,23G1 i 26G1/2) | Becton Dickinson | 305178, 305193, 305111 | |
| komora indukcyjna izofluranu | VetEquip | 941443 | 1 litrowe |
| obwody oddechowe nosa | VetEquip | RC2 | Kontroler obwodu gryzoni 2 |
| zbiornik tlenu | Airgas | UN 1072 | 100% medyczna |
| poduszka grzewcza | CWE Inc. | TC-1000 | regulator temperatury |
| sonda temperatury doodbytnicy | CWE Inc. | 10-09012 | waga myszy |
| (dla gryzoni) | Ohaus | CS 2000 | |
| narzędzia chirurgiczne-nożyczki | Narzędzia do nauki | 15000-00 | Vannas Nożyczki sprężynowe Ostrze proste 3 mm (naczynia do cięcia) |
| narzędzia chirurgiczne-kleszcze | Narzędzia do nauki pięknej | 11151-10 | Bardzo cienkie kleszcze Graefe (izolowanie naczyń myszy) |
| narzędzia chirurgiczne-hemostatyki | Narzędzia do nauki pięknej | 13009-12 | Hemostatyki komarów Halsteada (wypreparowanie, trzymanie tkanki) |
| narzędzia chirurgiczne -sterowniki do szwów | Narzędzia do nauki | 12502-12 | Sterowniki do szwów Olsen-Hegar (szycie) |
| narzędzia chirurgiczne-kleszcze | Grzywna Narzędzia naukowe | 11627-12 | Kleszcze aligatora Adson-Brown (chwytanie tkanek, szycie, szczur) |
| narzędzia chirurgiczne-nożyczki | Narzędzia do nauki | 14110-15 | Nożyczki Mayo do cięcia twardego 15 cm (chirurgia, preparacja, kości, szczur) |
| narzędzia chirurgiczne-kleszcze | Narzędzia Fine Science | 18025-10 | kleszcze do wiązania szwów (używane do cewnikowania Millar) |
| narzędzia chirurgiczne-nożyczki | Narzędzia do nauki pięknej | 14078-10 | Nożyczki Lexer Baby proste (chirurgia, mysz) |
| narzędzia chirurgiczne-kleszcze | Narzędzia do nauki | 11254-20 | Kleszcze Dumont #5 z cienką końcówką (naczynia szczurów, rozwarstwienie) |
| narzędzia chirurgiczne-nożyczki | Narzędzia do nauk ścisłych | 14082-09 | Nożyczki do dyspreparowania 12 mm (chirurgia, mysz szczura) |
| narzędzia chirurgiczne-kleszcze | Narzędzia do nauki | pięknej 11051-10 | 10 cm Kleszcze Graefe (chwytanie tkanek, mysz szczura) |
| narzędzia chirurgiczne-kleszcze | Narzędzia do nauk ścisłych | 11251-35 | Kleszcze Dumont 5/45 (wprowadzacz do naczyń) |
| narzędzia chirurgiczne-zwijacze | Narzędzia do nauki pięknej | 17012-11 | Retraktory Weitlaner 2/3 zęba (chirurgiczne dla szczurów) |
| narzędzia chirurgiczne-kleszcze | Narzędzia do nauki pięknej | 11294-00 | Kleszcze Dumont #4 (szczury do izolacji naczyń, myszy) |
| narzędzia chirurgiczne-kleszcze | Grzywna Narzędzia naukowe | 11297-00 | Kleszcze Dumont #7 (chwytanie tkanek, preparowanie) |
| narzędzia chirurgiczne-nożyczki | Narzędzia do nauki | 14058-11 | twarde nożyczki do tęczówki (preparacja myszy, kości) |
| narzędzia chirurgiczne-kleszcze | Narzędzia do nauk ścisłych | 11009-13 | ząbkowane, zakrzywione kleszcze Semkena (chwytanie tkanek, szczur myszy) |
| narzędzia chirurgiczne-hemostatyki | Narzędzia do nauki pięknej | 13003-10 | Zakrzywione hemostatyki Hartmana (wycięcie, przytrzymanie tkanki) |
| narzędzia chirurgiczne-kleszcze | Narzędzia do nauk ścisłych | 11006-12 | Kleszcze ząbkowane Adson (chwytanie tkanek) |
| maszynki do strzyżenia | Taśma Oster | A5 | |
| Fisherbrand | 159015G | ||
| sztuczna maść łzowa | Akorn Inc | 13985-600-03 | |
| lidokaina | Hospira | 0409-4277-01 | |
| Cewniki poliwinylowe | Tygon | PV-1 | |
| Evans niebieski | Sigma Aldrich | E2129 | |
| Substancja P | Bachem | H-1890 | |
| heparyna | Sagent Pharmaceuticals | 25201-400-10 | 1000 U/ml |
| roztwór soli | Hospira | 0409-7138-09 | 0,9% chlorek sodu |
| fenobarbital | Vortech | 0298-9373-68 | |
| cytrynian sodu | Fisher Scientific | BP327-1 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P4417-50TAB | |
| Chusteczki do bibułowania | Fisher Scientific | 06-666A | |
| formamid | Sigma Aldrich | 47670 | |
| mikrowaga | Denver Instrument | APX-60 | |
| rurki do mikrofug | Fisher Scientific | 07-200-534 | |
| polistyren 96-dołkowa płytka | Becton Dickenson | 351172 | |
| płytka absorbancyjna czytnik | BioTek | Synergy 2 | |
| żele poliakryloamidowe | Bio-Rad | 3450014 | |
| wzorzec masy cząsteczkowej białka | Bio-Rad | 1610374 | |
| Nitroceluloza na nośniku Protran | Amersham (GE) | 10600015 | |
| żel | pudełko Bio-Rad | 1658005 | |
| Tris | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Tween20 | Sigma Aldrich | P-1379 | |
| chlorek sodu | Fisher Naukowe | S271-1 | |
| NEP | R & D Systems | AF1182 | |
| doksycyklina chow | Teklad (HARLAN) | TD.130750 | |
| Myszy typu dzikiego FVB / NJ | Jackson | 001800 | |
| przeciwciało wtórne (koza anty-królik) | ZyMed | 81-6120 | |
| Roztwór ECL-Western Lightening Plus | PerkinElmer | NEL104001EA | |
| film | Pierce | 34091 |
Bibliografia
- Snijdelaar, D. G., Dirksen, R., Slappendel, R., Crul, B. J. Substance P. Eur J Pain. 4 (2), 121-135 (2000).
- Rubinstein, I., Iwamoto, I., Ueki, I. F., Borson, D. B., Nadel, J. A. Recombinant neutral endopeptidase attenuates substance P-induced plasma extravasation in the guinea pig s....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
