Artykuł metodologiczny

Badanie połączeń monosynaptycznych u Drosophila przy użyciu kanałów sodowych opornych na tetrodotoksynę

9.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57052

⸱

14 lutego 2018

 , 
1Department of Biology, University of Maryland

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł przedstawia metodę testowania połączeń monosynaptycznych między neuronami za pomocą tetrodotoksyny i kanału sodowego opornego na tetrodotoksynę, NaChBac.

Streszczenie

Tutaj zastosowano nową technikę zwaną Tetrotoksyną (TTX) Engineered Resistance for Probing Synapses (TERPS) do testowania połączeń monosynaptycznych między docelowymi neuronami. Metoda opiera się na koekspresji aktywatora transgenicznego z opornym na tetrodotoksyny kanałem sodowym NaChBac w określonym neuronie presynaptycznym. Połączenia z domniemanymi partnerami postsynaptycznymi są określane przez zapisy całych komórek w obecności TTX, który blokuje aktywność elektryczną w neuronach, które nie wyrażają NaChBac. Podejście to można zmodyfikować tak, aby działało z dowolnym aktywatorem lub obrazowaniem wapnia jako reporterem połączeń. TERPS uzupełnia rosnący zestaw narzędzi dostępnych do określania łączności w sieciach. Jednak TERPS jest wyjątkowy, ponieważ niezawodnie raportuje również transmisję masową lub objętościową oraz transmisję rozlaną.

Wprowadzenie

Głównym celem neuronauki jest mapowanie połączeń między neuronami, aby zrozumieć, jak informacje przepływają przez obwody. Dostępnych jest wiele podejść i zasobów do testowania funkcjonalnych połączeń między neuronami w różnych systemach modelowych1,2. Aby wygenerować najdokładniejsze schematy połączeń za pomocą elektrofizjologii, ważne jest, aby ustalić, czy obserwowane połączenia między dwiema komórkami są bezpośrednie i monosynaptyczne, czy pośrednie i polisynaptyczne. Złotym standardem dla dokonania tego rozróżnienia w neuronach ssaków jest pomiar opóźnienia między pojedynczymi potencjałami czynnościowymi w komórkach presynaptycznych a początkiem pobudzających prądów postsynaptycznych (EPSC) w drugim neuronie. Połączenia monosynaptyczne powinny charakteryzować się krótkimi opóźnieniami wynoszącymi kilka milisekund i niską zmiennością3. Podejście to może być skomplikowane w neuronach bezkręgowców, ponieważ synapsy mogą występować w ich dendrytach daleko od somatycznego miejsca zapisu, powodując opóźnienia w wykrywaniu z powodu dużych odległości elektrotonicznych między przewodnictwem postsynaptycznym a elektrodą rejestrującą. Takie opóźnienia mogą wprowadzać niejasności dotyczące wkładu poli- i monosynaptycznego. Dodatkowo, małe zdarzenia synaptyczne mogą zanikać przed dotarciem do miejsca zapisów somatycznych, a napędzanie silniejszej aktywności presynaptycznej prawdopodobnie rekrutuje zdarzenia polisynaptyczne.

Opracowano różne techniki testowania połączeń monosynaptycznych u bezkręgowców. Jedno z podejść wykorzystuje wysokowartościowe roztwory kationów (Hi-Di) zawierające nadmiar Mg++ i Ca++. To rozwiązanie blokuje połączenia polisynaptyczne, zmniejszając prawdopodobieństwo uwolnienia i zwiększając próg potencjału czynnościowego, aby sprzyjać wykrywaniu monosynaptycznych danych wejściowych4,5. Określenie wymaganego dokładnego stosunku Mg++ do Ca++ nie jest jednak trywialne, a wkłady polisynaptyczne mogą utrzymywać się nawet przy umiarkowanej stymulacji6. Alternatywne podejście o nazwie GFP Reconstitution Across Synaptic Partners (GRASP) wykorzystuje bliskość między błonami pre- i postsynaptycznymi znajdującymi się w synapsach, aby wywnioskować połączenie monosynaptyczne 7. W tym przypadku składnik białka zielonej fluorescencji (GFP) ulega ekspresji w jednym neuronie, a komplementarny fragment cząsteczki ulega ekspresji w domniemanym partnerze postsynaptycznym. Obecność fluorescencji wskazuje, że dwa neurony znajdują się wystarczająco blisko, aby umożliwić odtworzenie cząsteczki GFP i sugeruje istnienie synapsy. GRASP może jednak fałszywie informować o synapsach, jeśli dwie komórki mają ściśle przylegające błony, jak w nerwie lub pęczku. Warianty GRASP eliminują takie fałszywie dodatnie wyniki poprzez przywiązanie presynaptycznego fragmentu GFP bezpośrednio do synaptobrewiny, umożliwiając w ten sposób rekonstytucję tylko w aktywnych synapsach8. Podczas gdy GRASP i jego warianty odegrały zasadniczą rolę w określaniu funkcjonalnej łączności w OUN Drosophila, niektóre połączenia mogą nie być widoczne przez GRASP, jeśli odległości między partnerami pre- i postsynaptycznymi są stosunkowo duże. Jest to szczególnie istotne w ocenie transmisji objętościowej związanej z neuromodulacją9 lub GABAergic inhibition10.

Tutaj zademonstrowano komplementarną i nowatorską technikę testowania bezpośrednich połączeń monosynaptycznych w OUN Drosophila. Ta metoda, zwana Tetrodotoxin Engineered Resistance for Probing Synapses (TERPS), działa poprzez koekspresję kanału sodowego opornego na tetrodotoksynę (TTX), NaChBac, i aktywatora optogenetycznego w komórce presynaptycznej podczas nagrywania od domniemanych partnerów postsynaptycznych 9. W obecności TTX cała aktywność za pośrednictwem potencjału czynnościowego jest tłumiona w komórkach innych niż te, w których dochodzi do ekspresji NaChBac. Kanał NaChBac selektywnie przywraca pobudliwość w docelowej komórce presynaptycznej (komórkach presynaptycznych), umożliwiając transmisję synaptyczną wywołaną światłem. Metoda ta pozwala na silną aktywację neuronów presynaptycznych, tak że połączenia mogą być rozwiązywane postsynaptycznie przez zapis somatyczny, jednocześnie zmniejszając prawdopodobieństwo rekrutacji obwodów polisynaptycznych. Co ważne, technika ta pozwala na badanie transmisji objętościowej i ujawnia rozprzestrzenianie się nadajnika uwalnianego z pojedynczego neuronu w całym obwodzie. Ponadto TERPS może ujawnić chemiczną naturę połączenia za pomocą konwencjonalnej farmakologii. TERPS nadaje się do stosowania w każdym systemie modelowym, który umożliwia transgeniczną ekspresję kanałów sodowych niewrażliwych na TTX.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotuj muchy i zidentyfikuj linie promotora GAL4

  1. Wybierz linię promotora GAL4 i skrzyżuj ją z muchami przenoszącymi zarówno transgen UAS-NaChBac, jak i transgen optogenetyczny w celu aktywacji.
    UWAGA: UAS-CsChrimson11 został wybrany ze względu na jego wysoką przewodność i łatwość, z jaką aktywuje potencjały czynnościowe za pośrednictwem NaChBac. Zarówno UAS-NaChBac, jak i UAS-CsChrimson są dostępne w repozytorium Bloomington Stocks.
  2. Przygotować retinal all-trans jako roztwór podstawowy w etanolu (35 mM) i przechowywać roztwór w zamrażarce w temperaturze -20 °C.
  3. Wymieszaj 28 μl tego bulionu z około 5 ml uwodnionego pokarmu w płatkach ziemniaczanych i dodaj tę mieszaninę do górnej części fiolki z konwencjonalnym podłożem Drosophila.
  4. Wychowuj dorosłe muchy wykazujące ekspresję csChrimson na pokarmie zawierającym 0,2 mM all-trans-retinal przez 1-3 dni11.

2. Przygotuj zapas TTX

  1. Sporządzić roztwór podstawowy 1 mM TTX w wodzie destylowanej lub dejonizowanej. Przechowuj ten roztwór w lodówce laboratoryjnej przez kilka miesięcy. Zapoznaj się z polityką instytucji dotyczącą przechowywania TTX, ponieważ wiele instytucji klasyfikuje TTX jako substancję niebezpieczną lub kontrolowaną.

3. Przygotuj muchy do elektrofizjologii

  1. Zbierz 1-3 dniowe dorosłe muchy, które są hodowane na pożywieniu za pomocą all-trans-retinal.
    UWAGA: Zapoznaj się z Murthy i Turner w 2013 roku, aby uzyskać szczegółowy opis neuronów Drosophila zaciskających plamy12,13.
  2. Umieść muchy w szklanej fiolce scyntylacyjnej. Umieścić fiolkę na lodzie na 1 minutę, aby unieruchomić muchy.
  3. Użyj grubych kleszczy, aby włożyć muchę do specjalnie wykonanej komory nagraniowej. Komora składa się z koła 3 1/2" wyciętego laserowo z akrylu 1/16". Wytnij otwór 3/4" w środku, w którym przymocowana jest niestandardowa folia z 2-częściową żywicą epoksydową. Folia zawiera trójkątną nadzieję, do której wkłada się muchę.
  4. Nałóż wosk lub żywicę epoksydową utwardzalną promieniami UV wokół zwierzęcia, aby mocno zabezpieczyć je w komorze nagrywającej.
  5. Oświetl preparat światłowodem na gęsiej szyi do wizualizacji pod mikroskopem stereoskopowym. Ustaw włókna na gęsiej szyi na ukośne oświetlenie, regulując je tak, aby oświetlały muchę bezpośrednio z boku.
  6. Dostosuj poziom światła do najniższego możliwego ustawienia, które nadal umożliwia wyraźną wizualizację muchy. To natężenie światła będzie się różnić w zależności od eksperymentu.
    UWAGA: Ten protokół można dostosować za pomocą metody eksplantacji mózgu in situ14.
  7. Pobierz zewnętrzną sól fizjologiczną do nagrywania. Sól fizjologiczna zawiera w mM: 103 NaCl, 3 KCl, 5 Kwas N-tris(hydroksymetylo)metylo-2-aminoetanosulfonowy, 8 trehalozy, 10 glukozy, 26 NaHCO3, 1 NaH2PO4, 1,5 CaCl2 i 4 MgCl2 (dostosowane do 270–275 mΩ). Sól fizjologiczna jest bąbelkowana 95% O2/5% CO2 (karbogen) i ma pH dostosowane do 7,315.
  8. Umieść 4-6 kropli zewnątrzkomórkowej soli fizjologicznej na preparacie muchowym. W tym momencie zwiększ poziom światła w mikroskopie preparacyjnym, aby uzyskać lepszą widoczność.
  9. Naostrz drut wolframowy za pomocą elektrolizy. Aby wykonać drut, przygotuj nasycony roztwór KNO3 i przyłóż około 20 V prądu przemiennego, zanurzając końcówkę drutu w roztworze 20 razy na 100 ms każdy, aż końcówka zostanie naostrzona. Użyj zaostrzonego drutu wolframowego, aby usunąć naskórek na głowie muchy, odsłaniając w ten sposób mózg.
  10. Dalej odsłaniaj mózg, usuwając tchawicę i otaczające go ciała tłuszczowe. Jeśli uzyskujesz dostęp do płatów anteny, użyj wygiętego drutu wolframowego lub podobnego narzędzia, aby delikatnie wsunąć anteny pod foliową komorę nagrywającą, aby zwiększyć widoczność. Użyj ostrych kleszczy, aby delikatnie oderwać poszycie glejowe pokrywające obszar zainteresowania, w którym będą wykonywane nagrania.
  11. Przenieść komorę rejestracyjną na stanowisko do elektrofizjologii. Natychmiast rozpocznij perfuzję z zewnętrznym zapisem soli fizjologicznej z bąbelkami karbogenu, aby zachować mózg. Zbiornik z roztworem soli umieszcza się nad stolikiem mikroskopu i jest grawitacyjnie podawany do preparatu. Za pomocą przewodu próżniowego i kolby Erlenmeyera o pojemności 2 l zebrano odpady soli fizjologicznej.

4. Uzyskaj zapis całej komórki

  1. Pociągnij pipety z plastrami na dostępnym w handlu ściągaczu do pipet. Zapoznaj się z instrukcją obsługi, aby uzyskać ustawienia, aby uzyskać odpowiednią pipetę o rezystancji końcówki bliskiej 7 mΩ.
  2. Dodać 4 μl wewnętrznego roztworu rejestrującego do pipety z plastrem. Sól wewnętrzna składa się ze 140 asparaginianu potasu, 10 HEPES, 4 MgATP, 0,5 Na3GTP, 1 EGTA i 1 KCl w mM.
  3. Skonfiguruj wzmacniacz z zaciskiem krosowym do nagrywania całej komórki. Wyzeruj przesunięcie wzmacniacza i ustaw wzmacniacz tak, aby dostarczał impulsy testowe. W tym przypadku używany jest wzmacniacz z zaciskiem krosowym AM systems 2,400.
  4. Zastosuj nadciśnienie przez pipetę i zbliż się do celi. Użyj mikromanipulatora, aby skierować pipetę i zetknąć się z celą. Uwolnij nadciśnienie. Ustaw potencjał utrzymywania membrany na -60 mV. Pipeta powinna tworzyć gigaomowe uszczelnienie z błoną komórki, o czym świadczy niski prąd podprądowy sub-pikoampera.
    UWAGA: Jeśli używasz kierowania komórkami GFP, staraj się zminimalizować użycie światła epifluorescencyjnego, aby zapobiec aktywacji ChR2 i potencjalnej depresji synaptycznej. Odczekaj również kilka minut przed zastosowaniem kroku 5.
  5. Ustaw wzmacniacz tak, aby dostarczał impulsy testowe od -50 mV do -60 mV. To ustawienie jest standardem we wzmacniaczach patch-clamp. Impulsy testowe ujawnią duży pojemnościowy stan przejściowy reprezentujący prąd niezbędny do naładowania pipety krosowej. Usuń pojemnościowe stany nieustalone, regulując pokrętła kompensacji pojemności na AM 2400 lub podobnym amplifier.
  6. Zastosuj krótkie impulsy podciśnienia, aby rozerwać błonę komórkową i uzyskać konfigurację całej komórki.
    UWAGA: Konfigurację całej komórki obserwuje się, gdy występuje duży wzrost pojemnościowych stanów przejściowych wskazujących na pojemność neuronu. Prawdopodobnie zaobserwowany zostanie również niewielki wzrost prądu utrzymywania (scenariusz bazowy). Ustaw wzmacniacz w tryb cęgów prądowych i dostosuj potencjał ogniwa do -50 do -60 mV.

5. Przetestuj łączność synaptyczną

  1. Skonfiguruj system akwizycji danych (DAQ), aby wyzwolić sterownik LED w celu generowania impulsów świetlnych. W tym przypadku system DAQ National Instruments jest używany z Matlabem do dostarczania sygnału analogowego do sterownika LED. Intensywność diody LED jest regulowana za pomocą sygnału analogowego do sterownika. Dioda LED to dioda LED o długości fali 620-630 nm.
  2. Umieść czerwoną diodę LED o dużej mocy bezpośrednio pod preparatem. Dostosuj natężenie światła tak, aby 0,238 mW/mm2 docierało do muchy.
  3. Aktywuj neurony presynaptyczne podczas nagrywania z interesującej nas komórki postsynaptycznej. Osiągnij aktywację komórek optogenetycznie, farmakologicznie lub poprzez stymulację nerwów. W tym przypadku stosuje się csChrimson i krótkie impulsy czerwonego światła.
    UWAGA: Połączenia synaptyczne mogą być monitorowane zarówno w cęgach prądowych jako EPSP, jak i w zaciskach napięciowych jako EPSC. Połączenie synaptyczne powinno być widoczne przed zastosowaniem TTX w odpowiedzi na impuls świetlny o długości 40 ms. Jeśli nie zaobserwuje się żadnego połączenia, jest mało prawdopodobne, aby neurony były połączone synaptycznie mono- lub polisynaptycznie. Potencjał trzymania można dostosować, aby odpowiednio podkreślić połączenia pobudzające lub hamujące.
  4. Jeśli zaobserwuje się połączenie w roztworze soli fizjologicznej, dodaj TTX do systemu perfuzyjnego, aby uzyskać końcowe stężenie 1 μM. Użyj pompy recyrkulacyjnej, aby wychwycić i ponownie wykorzystać sól fizjologiczną w celu zachowania TTX. Pompa perystaltyczna pobierze roztwór soli fizjologicznej z kąpieli i zawróci go do zbiornika soli fizjologicznej.
  5. Dostosuj prędkość pompy, aby zapewnić silne stałe podciśnienie, które nie pozwala na wzrost i spadek poziomu soli fizjologicznej w kąpieli.
    UWAGA: Zastosowanie TTX powinno spowodować zaprzestanie aktywności impulsowej w neuronie, który jest monitorowany w całej komórce. Potwierdza to, że do soli fizjologicznej dodano wystarczającą ilość TTX.
  6. Ponownie zastosuj krótkie impulsy czerwonego światła (40 ms na każdy impuls). W tym momencie każde połączenie synaptyczne, które pozostaje, jest prawdopodobnie monosynaptyczne. Dodać farmakologicznych antagonistów do recyrkulacyjnej soli fizjologicznej, aby przetestować chemiczną naturę połączeń synaptycznych, które pozostają w TTX.
    Uwaga: Łącząc optogenetykę i fluorescencyjne celowanie w neurony, może być ważne, aby nie aktywować stale presynaptycznej populacji neuronów podczas próby uzyskania nagrania. Może to prowadzić do depresji synaptycznej i utrudnia dostrzeżenie powiązań. Ponieważ csChrimson ma długie pasmo wzbudzenia, które rozciąga się szeroko w zakresie białka zielonej fluorescencji, czerwony fluorofor może być używany do wizualizacji neuronów, a rodopsyna channel2rhodopsyna (Ch2R) może być używana do pobudzania populacji komórek. Wymaga to określonej genetyki i niestandardowej kostki filtra. Aby wygenerować odpowiednie muchy, stwórz muchy, które wyrażają czerwony fluorofor (RFP lub mCherry) w binarnych systemach ekspresji systemu LexA lub Q. Będą one musiały zostać skrzyżowane z muchami wykazującymi ekspresję promotora Gal4 oraz genów efektorowych UAS-Ch2R i UAS-NaChBac. Optymalna kostka filtrująca do epifluorescencji będzie miała wąski zakres wzbudzenia, aby wzbudzić czerwony fluorofor, ale nie wzbudzić Ch2R. Dodatkowo zestaw filtrów powinien zawierać długoprzepustowy filtr emisyjny, aby zebrać jak najwięcej emitowanego światła. Użyliśmy niestandardowego zestawu filtrów firmy Chroma, który zawierał numery części et580/25x i t600lpxr (z zestawu 49306), ale z filtrem barierowym/emisyjnym et610lp.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Metoda TERPS jest wykorzystywana do rozróżnienia wkładu mono- i polisynaptycznego w połączeniach synaptycznych między neuronami. Podczas gdy słaba stymulacja komórki może służyć do testowania bezpośrednich połączeń, silniejsza aktywność presynaptyczna często aktywuje połączenia polisynaptyczne (Rycina 1A). Mechanizm działania TERPS opiera się na koekspresji kanału sodowego NaChBac, niewrażliwego na TTX, oraz aktywatora optogenetycznego, a następnie testowaniu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Analiza TERPS uzupełnia obecne techniki stosowane do pękania obwodów, umożliwiając wykrywanie synaps między zidentyfikowanymi neuronami. W szczególności podejście to ujawnia połączenia monosynaptyczne poprzez szerokie wyciszenie potencjałów czynnościowych za pomocą TTX, przy jednoczesnym przywróceniu pobudliwości w wybranej populacji neuronów z niewrażliwym na TTX kanałem sodowym NaChBac. Uwalnianie synaptyczne jest wywoływane przez stymulację optogenetyczną, podczas gdy zdarzenia postsynaptyczne są monitorowane za pomoc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Joshui Singerowi, Jonathanowi Schenkowi, a także troskliwym recenzentom za komentarze do manuskryptu. Chcielibyśmy również podziękować Benowi White'owi i Haroldowi Zakonowi za dyskusje na temat tej techniki. Jonathan Schenk dostarczył dane dla Rysunek 3A. Praca ta była wspierana przez Whitehall Foundation Grant i NIH R21 dla QG.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
UAS-csChrimsonBloomington Drosophila Stock Center55135Używany jako aktywator neuronów
UAS-NaChBacBloomington Drosophila Stock Center9466Pobudliwość Resotores w komórkach w TTX
TetrodotoksynaTochris1078zakupu TTX może być potrzebne specjalne pozwolenie, ponieważ jest to substancja kontrolowana,
wszystkie trans-RetinalSigma-Aldrichall trans-RetinalR2500Wymagany kofaktor dla rodopsyny kanałowej
Spawalna stal nierdzewna 321  Arkusz,  0,002"  Gruby,  10"  WideMcMaster Carr3254K7Służy do wykonania niestandardowego uchwytu na muchy. Folia niestandardowa może być wycinana laserowo w pololu.com z dostarczonego pliku PDF
Mikroskop preparacyjnyZeissStemi 2000-CUżywany do preparacji preparatu
WoskAlmoreEectra Waxer 66000Używany podczas preparacji do zabezpieczania muchy w folii
Wosk parafinowyJoann4917217Używany z
woskiem Kleszcze numer 5Narzędzia do nauki pięknej#5COSłuży do rozwarstwiania i usuwania pochwy
Nożyczki precyzyjneFine Science Tools15001-08Służy do usuwania części naskórka podczas sekcji
Drut wolframowyAM Systems797500Używaj z elektrolizą do wytwarzania zaostrzonych igieł do preparacji
Recykulacyjna pompa perystaltycznaPo prostu pompuje (Amazon)PM200Sdo recyrkulacji TTX
Regulator prędkości dla pompa perystaltycznaZitrades (Amazon)N / AKontroler ściemniania PWM do świateł LED lub taśmy, 12 V 8 Amp, regulowana jasność przełącznika światła Kontroler ściemniacza DC12V 8A 96W do taśmy LED Light B
Versa-Mount  Precyzyjny regulator sprężonego powietrzaMcMaster Carr1804T1Do stosowania nadciśnienia podczas łatania
Kapilaryszklane World Precision InstrumentsTW150F-3Do pipet krosowych
Manometr uniwersalnyMcMaster Carr3846K431Manometr do regulatora ciśnienia
Kamera do elektrofizjologiiDage MTI IR-1000Każda kamera pracująca w zakresie podczerwieni (850 nm) będzie działać. Nie chcesz używać czerwonego podświetlenia, ponieważ może to aktywować csChrimson
IR LEDThorlabs M850F2Do ukośnego oświetlenia światłowodowego
do diod IRLED ThorlabsM89L01Łączy się z soczewką obiektywu IR LED
 Olympus 40XLUMPlanFLNMoże być używany na większości mikroskryptów i dobrze sprawdza się do wizualizacji neuronów much.
Amber LEDThorlabsM590L3dDo wizualizacji RFP i mCherry
Blue LEDThorlabsM470L3dDo wizualizacji GFP
Zestaw filtrów GFPChroma49011Do wizualizacji GFP lub stymulacji channel2rhodopsin
Niestandardowy zestaw filtrów mCherryChroma  et580/25x i t600lpxr (z zestawu 49306), ale z optyką barierowo-emisyjną et610lpUżywaj tylko wtedy, gdy chcesz załatać zidentyfikowane neurony za pomocą channel2rhodopsin
Dichroic, aby połączyć bursztynowe i niebieskie diody LEDThorlabsDMLP550RUżywaj tylko plastra pod mCherry i pobudzaj channel2rhodopsynę niebieskim światłem.
Czerwonediody LEDSupplyCree XPE 620 - 630 nmSłuży do napędzania sterownika LED csChrimson
LEDSupply3021-D-E-1000Służy do napędzania diod LED do stymulacji optogenetycznej
ManipulatorSutter InstrumentsMP-225Służy do pozycjonowania pipety podczas nagrań
Wzmacniacz PatchclampA-M SystemsModel 2400Odpowiedni
Filtr BesselWarner Instruments LPF 202AFiltr pomocniczy służący do filtrowania śladu prądu do oscyloskopu podczas patchowania.
System Akwizycji Danych National InstrumentsNI PCIe-6321            781044-01Służy do zapisu danych ze wzmacniacza do komputera
Blok złączy - BNC Terminal BNC-2090ANational Instruments779556-01Służy do podłączenia wzmacniacza do karty DAQ.
Folia stalowa McMaster Carr3254K7Folia stalowa do niestandardowej komory nagraniowej
MagnesyK& J MagneticsD42Do mocowania komory nagraniowej do stojaka na pierścionek
1/16 "Cell Cast Acrylic ClearPololuSłuży do wykonania niestandardowej komory nagraniowej. Akryl można wycinać laserowo w pololu.com z dostarczonego pliku PDF
Do jest równoważny wzmacniacz

Bibliografia

  1. Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nat Neurosci. 10, 663-668 (2007).
  2. Yao, Z., Macara, A. M., Lelito, K. R., Minosyan, T. Y., Shafer, O. T. Analysis of functional neuronal connectivity in the Drosophila brain. J Neurophysiol. , 684-696 (2012).
  3. Doyle, M. W., Andresen, M. C. Reliability of monosynaptic sensory transmission in brain stem neurons in vitro. J Neurophysiol. 85, 2213-2223 (2001).
  4. Nicholls, J. G., Purves, D. Monosynaptic chemical and electrical connexions between sensory and motor cells in the central nervous system of the leech. J Physiol-London. 209, 647-667 (1970).
  5. Byrne, J. H., Castellucci, V. F., Kandel, E. R. Contribution of individual mechanoreceptor sensory neurons to defensive gill-withdrawal reflex in Aplysia. J Neurophysiol. 41, 418-431 (1978).
  6. Liao, X., Walters, E. T. The use of elevated divalent cation solutions to isolate monosynaptic components of sensorimotor connections in Aplysia. J Neurosci Meth. 120, 45-54 (2002).
  7. Feinberg, E. H., et al. GFP Reconstitution Across Synaptic Partners (GRASP) Defines Cell Contacts and Synapses in Living Nervous Systems. Neuron. 57, 353-363 (2008).
  8. Macpherson, L. J., et al. Dynamic labelling of neural connections in multiple colours by trans-synaptic fluorescence complementation. Nat Commun. 6, 10024-10029 (2015).
  9. Zhang, X., Gaudry, Q. Functional integration of a serotonergic neuron in the Drosophila antennal lobe. Elife. 5, (2016).
  10. Wilson, R. I. Early olfactory processing in Drosophila: mechanisms and principles. Annu Rev Neurosci. 36, 217-241 (2013).
  11. Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 11, 338-346 (2014).
  12. Murthy, M., Turner, G. C. Whole-cell in vivo patch-clamp recordings in the Drosophila brain. Cold Spring Harb Protoc. , 140-148 (2013).
  13. Murthy, M., Turner, G. C. Dissection of the head cuticle and sheath of living flies for whole-cell patch-clamp recordings in the brain. Cold Spring Harb Protoc. 2013, 134-139 (2013).
  14. Gu, H., O'Dowd, D. K. Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila. J Vis Exp. , (2007).
  15. Wilson, R. I., Turner, G. C., Laurent, G. Transformation of olfactory representations in the Drosophila antennal lobe. Science. 303, 366-370 (2004).
  16. Kazama, H., Wilson, R. I. Homeostatic Matching and Nonlinear Amplification at Identified Central Synapses. Neuron. 58, 401-413 (2008).
  17. Becnel, J., et al. DREADDs in Drosophila: a pharmacogenetic approach for controlling behavior, neuronal signaling, and physiology in the fly. Cell Reports. 4, 1049-1059 (2013).
  18. Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. P Natl Acad Sci USA. 104, 5163-5168 (2007).
  19. Sun, Q. Q., Wang, X., Yang, W. Laserspritzer: A Simple Method for Optogenetic Investigation with Subcellular Resolutions. PLoS One. 9, e101600-e101608 (2014).
  20. Holloway, B. B., et al. Monosynaptic Glutamatergic Activation of Locus Coeruleus and Other Lower Brainstem Noradrenergic Neurons by the C1 Cells in Mice. J Neurosci. 33, 18792-18805 (2013).
  21. Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457, 1142-1145 (2009).
  22. Kloppenburg, P., Ferns, D., Mercer, A. R. Serotonin enhances central olfactory neuron responses to female sex pheromone in the male sphinx moth manduca sexta. J Neurosci. 19, 8172-8181 (1999).
  23. Suster, M. L., Seugnet, L., Bate, M., Sokolowski, M. B. Refining GAL4-driven transgene expression in Drosophila with a GAL80 enhancer-trap. Genesis. 39, 240-245 (2004).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Neurony Drosophilarejestracje z ca ej kom rkiaktywacja optogenetycznaaplikacja tetrodotoksynyantagoni ci farmakologicznianaliza transmisji obj to ciowejtestowanie po cze synaptycznychkonfiguracja stanowiska elektrofizjologicznego

Powiązane artykuły