Badanie syntezy RNA z wykorzystaniem znakowania 5-bromourydyną i immunoprecypitacji

Podsumowanie

Ta metoda może być użyta do pomiaru syntezy RNA. 5-bromourydyna jest dodawana do komórek i włączana do syntetyzowanego RNA. Syntezę RNA mierzy się przez ekstrakcję RNA bezpośrednio po znakowaniu, a następnie immunoprecypitację znakowanego RNA ukierunkowaną na 5-bromourydynę i analizę za pomocą odwrotnej transkrypcji i ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy.

Streszczenie

Gdy poziomy RNA w stanie ustalonym są porównywane między dwoma warunkami, nie jest możliwe rozróżnienie, czy zmiany są spowodowane zmianami w produkcji czy degradacją RNA. Protokół ten opisuje metodę pomiaru produkcji RNA, wykorzystującą znakowanie 5-bromourydyny RNA, a następnie immunoprecypitację, co umożliwia badanie RNA zsyntetyzowanego w krótkim czasie (np. 1 godzina). Przewaga znakowania 5-bromourydyną i immunoprecypitacji w porównaniu ze stosowaniem toksycznych inhibitorów transkrypcji, takich jak α-amantyna i aktynomycyna D, polega na tym, że nie ma wpływu na żywotność komórek lub jest on bardzo niski podczas krótkotrwałego stosowania. Ponieważ jednak immunoprecypitacja 5-bromourydyny wychwytuje tylko RNA wytworzony w krótkim czasie znakowania, powolne wytwarzanie, jak również szybko degradowane RNA może być trudne do zmierzenia tą metodą. RNA znakowane 5-bromourydyną wychwycone przez immunoprecypitację 5-bromourydyny można analizować za pomocą odwrotnej transkrypcji, ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy i sekwencjonowania nowej generacji. Można badać wszystkie typy RNA, a metoda nie ogranicza się do pomiaru mRNA, jak pokazano w tym przykładzie.

Wprowadzenie

5-bromouridine (BrU) immunoprecypitacja (IP) pozwala na badanie produkcji RNA w komórkach bez lub z bardzo ograniczonym wpływem na fizjologię komórki podczas krótkiego okresu znakowania1^,2. Metoda opiera się na włączeniu syntetycznej pochodnej urydyny BrU do nowo zsyntetyzowanego RNA, a następnie IP znakowanego RNA przy użyciu przeciwciał anty-BrU (Rysunek 1).

Od dziesięcioleci wiadomo, że synteza białek może być regulowana transkrypcyjnie, a istnienie czynników transkrypcyjnych zostało postawione hipotezę ponad 50 lat temu³. Obecnie wiadomo, że wiele chorób jest spowodowanych rozregulowaniem transkrypcji i stabilności RNA (rysunek uzupełniający S1 w referencji⁴), a możliwość pomiaru zmian w produkcji RNA ma ogromne znaczenie w zrozumieniu rozwoju choroby.

Z drugiej strony, narzędzia do regulacji produkcji RNA dają nowe możliwości leczenia chorób spowodowanych zbyt małą lub zbyt dużą ekspresją białka, lub akumulacją białek, jak np. w chorobie Parkinsona (PD). Dominującym białkiem gromadzącym się w postaci nierozpuszczalnych agregatów w PD jest α-synukleina, a poziom α-synukleiny jest bezpośrednio związany z chorobą, ponieważ namnażanie się genu α-synukleiny powoduje rodzinną PD⁵. Ponadto α-synukleina agreguje się w sposób zależny od stężenia. Obniżenie poziomu mRNA α-synukleiny jest zatem interesującą strategią terapeutyczną, którą udało się osiągnąć przy użyciu interferencji RNA w celu zmniejszenia utraty komórek neuronalnych w modelach gryzoni PD^6,7.

Ważne jest, aby móc mierzyć zmiany w produkcji RNA spowodowane chorobą lub interwencjami terapeutycznymi. Najnowocześniejsze metody pomiaru poziomów RNA w stanie stacjonarnym, takie jak odwrotna transkrypcja, a następnie ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy (RT-qPCR), nie są w stanie odróżnić zmian spowodowanych regulacją transkrypcji lub zmienioną stabilnością RNA. Szeroko stosowaną metodą badania szybkości rozpadu RNA jest blokowanie maszynerii transkrypcyjnej za pomocą związków takich jak α-amanityna lub aktynomycyna D, a następnie pomiary rozpadających się RNA. Istnieją jednak pewne problemy związane z ogólnym zablokowaniem transkrypcji w komórkach, takie jak indukcja apoptozy^8,9. Oprócz efektów cytotoksycznych, inhibitory transkrypcji stwarzają również kilka problemów technicznych, takich jak powolny wychwyt komórkowy α-amantyny i brak swoistości aktynomycyny D (przegląd w reference¹⁰).

Aby uniknąć ogólnego zablokowania transkrypcji, użyto analogów nukleotydów, takich jak 5-etynylourydyna (5-EU), 4-tiourydyna (4-TU) i BrU. Są one łatwo wchłaniane przez komórki ssaków i włączane do nowo zsyntetyzowanego RNA, umożliwiając znakowanie impulsowe RNA w określonym czasie. BrU jest mniej toksyczny niż 5-EU i 4-TU, co czyni go preferowanym analogiem z wyboru^11,12.

BrU-IP może być używany do badania zarówno szybkości syntezy RNA, jak i stabilności, a tym samym do rozróżniania podstawowych przyczyn zmian w całkowitym RNA. W tym artykule skupimy się na pomiarze syntezy RNA i odniesiemy się do reference², aby uzyskać szczegółowe informacje na temat badania stabilności RNA. Aby zbadać syntezę RNA, komórki są krótko znakowane BrU, np. przez 1 godzinę, a następnie BrU-IP¹ (Rysunek 1C). Umożliwia to pomiary RNA zsyntetyzowanego w krótkim czasie znakowania, a obserwowane zmiany pozwolą lepiej oszacować regulacje w syntezie RNA niż pomiar zmian całkowitego RNA za pomocą RT-qPCR. Należy jednak wspomnieć, że nawet jeśli czas znakowania wynosi np. tylko 1 godzinę, degradacja może mieć wpływ na obserwowane poziomy RNA.

RNA z eksperymentów BrU-IP nadaje się do dalszej analizy zarówno za pomocą RT-qPCR¹, jak i sekwencjonowania nowej generacji2^,13. Inne standardowe metody wykrywania RNA, takie jak test ochrony przed rybonukleazą lub rybonukleazą, mogą być również stosowane w przypadku niektórych RNA.

Protokół

UWAGA: Wykonuj wszystkie kroki w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej, i przechowuj na lodzie lub w lodówce (z wyjątkiem buforu elucyjnego zawierającego SDS). Protokół podzielony jest na 5 sekcji: Przygotowanie próbek RNA; przygotowanie koralików do IP; wiązanie RNA znakowanego BrU z kulkami; elucja i oczyszczanie związanego RNA znakowanego BrU za pomocą 3-etapowej ekstrakcji fenol-fenol/chloroform-chloroform; analiza RNA (w tym przykładzie z wykorzystaniem RT-qPCR)

1. Przygotowanie próbek RNA

1. Policz HEK293T komórek za pomocą automatycznego licznika komórek i zasiej 3 500 000 komórek na 10 cm szalce Petriego w 10 ml pożywki wzrostowej (zmodyfikowana pożywka Eagle's Medium firmy Dulbecco uzupełniona 10% płodową surowicą cielęcą i 50 μg/ml penicyliny/streptomycyny), aby uzyskać łącznie >40 μg RNA po ekstrakcji 48 godzin później. Utrzymuj komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
2. 48 godzin po wysiewie odessać 8 ml pożywki wzrostowej i pozostawić 2 ml, aby uniknąć wysuszenia komórek. Dodać 2 mM BrU i dowolną obróbkę do 8 ml aspirowanej pożywki wzrostowej i usunąć pozostałe 2 ml z komórek przed ponownym nałożeniem pożywki zawierającej 8 ml BrU. Należy unikać stosowania świeżych pożywek po nałożeniu BrU na komórki, ponieważ może to wywołać zmiany w ekspresji genów.
3. Inkubować komórki przez 1 godzinę z BrU i leczeniem. Umyj komórki w 5 ml buforze Hanka i trypsynizuj komórki za pomocą 2 ml 0,05% trypsyny. Dodaj 8 ml pożywki wzrostowej, aby zatrzymać reakcję, przenieś komórki do probówki o pojemności 15 ml i wiruj komórki przez 2 minuty przy 1,000 x g.
4. Usunąć supernatant i wyekstrahować całkowity RNA z osadu komórkowego za pomocą zestawu do izolacji RNA (patrz Tabela materiałów) lub innej preferowanej metody, a następnie wymyć w H₂O, wolnym od RNaz. Przechowywać RNA w temperaturze -80 °C, aż będzie gotowy do kontynuowania.

2. Przygotowanie koralików do IP

1. Przygotować kulki w partiach w zależności od liczby próbek, które mają być badane, plus jedna dodatkowa w celu uwzględnienia strat podczas pipetowania i mieszania wirowego. Dokładnie zawiesić kulki magnetyczne anty-mysie IgG przez mieszanie wirowe i wyjąć 20 μl kulek na próbkę w probówce 1,5 ml wolnej od RNaz. Umieść probówkę o pojemności 1,5 ml w stojaku magnetycznym i pozostaw około 20 sekund, aby kulki zebrały się z boku.
2. Usunąć supernatant, wyjąć probówkę ze stojaka magnetycznego i ponownie zawiesić w 400 μl 1x buforze BrU-IP przez pipetowanie. Wirować probówkę bardzo krótko przez 2 sekundy w wirówce stołowej, umieścić ją z powrotem w stojaku magnetycznym i usunąć supernatant. Powtórz krok prania raz.
3. Zablokuj niespecyficzne wiązanie z koralikami za pomocą heparyny. Ponownie zawiesić kulki w 1 ml 1x BrU-IP+ 1 mg/ml buforu heparyny i pozostawić na 30 minut. Umyj koraliki raz, jak w kroku 2.2.
   UWAGA: Heparyna jest ujemnie naładowanym polimerem, który będzie konkurował z RNA o wiązanie. tRNA lub inne nieistotne RNA mogą być również używane, jeśli dalsza aplikacja nie sekwencjonuje.
4. Ponownie zawiesić kulki w 1 ml 1x bufor BrU-IP i dodać 1,25 μg / próbkę przeciwciała anty-α-bromodeoksyurydyny, które również rozpoznaje BrU. Inkubuj koraliki przez 1 godzinę podczas obracania lub przez noc w temperaturze pokojowej.
5. Umyj koraliki trzy razy, jak w kroku 2.2. Ponownie zawiesić kulki w 50 μl / próbkę 1x bufor BrU-IP uzupełniony 1 mM BrU i pozostawić obracając się przez 30 minut, aby obniżyć czułość przeciwciała związanego z kulkami, a tym samym ryzyko niespecyficznego wiązania podczas IP.
6. Umyć kulki trzy razy, jak w kroku 2.2, i ponownie zawiesić w 50 μl/próbkę buforze 1xBrU-IP.

3. Wiązanie znakowanego BrU RNA z koralikami

1. Zmierzyć stężenia RNA w ekstraktach RNA z kroku 1.3 za pomocą spektrofotometrii w ultrafiolecie widzialnym i rozcieńczyć 40 μg RNA z każdej próbki w H₂O wolnym od RNaz do całkowitej objętości 200 μl.
2. Podgrzewać próbki RNA przez 2 minuty w temperaturze 80 °C w celu denaturacji RNA i krótko odwirować w wirówce stołowej. Dodać 200 μL 2x inhibitor BrU-IP+BSA/RNAzy.
3. Dodać 50 μl ponownie zawieszonych i przygotowanych kulek z kroku 2.6 do każdej próbki i pozostawić na 1 godzinę do obrotu. Umyć kulki cztery razy, jak w kroku 2.2.

4. Elucja i oczyszczanie RNA za pomocą 3 etapów: ekstrakcja fenol-fenol/chloroform-chloroform

1. Elutować RNA i przeprowadzić ekstrakcję fenolową
   1. Ponownie zawiesić kulki w 200 μl buforu elucyjnym w celu elucji RNA, a następnie szybko dodać 200 μl fenolu o pH 6,6 (UWAGA: Toksyczny, patrz uwaga poniżej kroku 4.1.2) w celu usunięcia wszelkich cząsteczek innych niż RNA z próbki.
   2. Wirowo wymieszać próbkę i wirować przez 3 minuty przy 25 000 x g w wirówce stołowej.
      UWAGA: Fenol jest toksyczny i należy z nim obchodzić się pod wyciągiem w osłonie skóry. Lekko kwaśne pH zapewnia, że ekstrahowane jest tylko RNA, a nie DNA. RNA pozostanie w górnej fazie wodnej ze względu na hydrofilowy charakter ładunków. Hydrofobowe rdzenie białek wiążą fenol i przechodzą do niższej organicznej fazy fenolowej.
2. Przeprowadzić ekstrakcję fenolowo-chloroformową
   1. Odessać jak najwięcej górnej fazy (około 190 μl z 200 μl, w zależności od doświadczenia w obsłudze) i przenieść ją do probówki z 200 μl fenolu/chloroformu, pH 6,6 (UWAGA: Toksyczny, patrz uwaga). Upewnij się, że zasysasz tę samą ilość do wszystkich próbek.
   2. Wirować próbkę i wirować przez 3 minuty w temperaturze 25 000 x g.
      UWAGA: Chloroform jest toksyczny i należy się z nim obchodzić w dygestorium z zachowaniem ochrony skóry. Chloroform jest dodawany w celu usunięcia fenolu, który może wpływać na dalszą analizę RNA poprzez hamowanie odwrotnej transkrypcji¹⁴ i reakcji łańcuchowych polimerazy¹⁵.
3. Przeprowadzić ekstrakcję chloroformem, zasysając górną fazę wody wodnej jak poprzednio (teraz około 180 μl) i przenieść do probówki zawierającej 200 μl chloroformu. Wirować próbkę i wirować przez 3 minuty przy 25 000 x g.
4. Odessać górną fazę wodną jak poprzednio (teraz około 170 μl) i przenieść ją do probówki zawierającej 17 μl (1/10 objętości) 3 M CH₃COONa, pH 6,0. Aby zneutralizować i wytrącić RNA z roztworu wodnego, dodaj 2 μl glikogenu (20 mg/ml), który wytrąca się razem z RNA i sprawia, że osad RNA jest bardziej widoczny.
5. Dodaj 500 μl 96% etanolu, aby zwiększyć wiązanie jonów soli i RNA i wymieszaj, kilkakrotnie odwracając probówkę. Pozostaw probówkę na noc w temperaturze -20 °C lub 15 minut na suchym lodzie.
6. Wirować próbkę w temperaturze 25 000 x g, 4 °C przez 30 minut. Wyrzucić supernatant bez naruszania osadu i umyć osad w 185 μl 75% etanolu w celu usunięcia pozostałości soli. Wirować w temperaturze 25 000 x g, 4 °C przez 5 min.
7. Całkowicie wyrzucić supernatant bez naruszania osadu i pozostawić osad do wyschnięcia na 5-10 minut z otwartą pokrywą. Zawiesić w 10 μl H₂O wolnym od RNaz nałożonym z boku probówki, aby uniknąć naruszenia osadu.

5. Analiza RNA

1. Przygotować cDNA przy użyciu zestawu do odwrotnej transkrypcji cDNA (patrz tabela materiałów) lub innej preferowanej metody przy użyciu próbki 2 μl RNA i 1 μg całkowitego RNA drożdży jako nośnika RNA do reakcji syntezy cDNA (niestosowane, jeśli cDNA jest używane do sekwencjonowania nowej generacji). Użyj 1 μg RNA bez drożdżowego RNA do przygotowania cDNA odpowiedniego wejścia.
2. Rozcieńczyć cDNA w stosunku 1:25 i zmieszać 9 μl rozcieńczonego cDNA z 10 μl qPCR Master mix i 1 μl sondy fluorogenicznej, oba określone w Tabeli Materiałów.
   UWAGA: Rozcieńczenie cDNA zależy od zastosowanego preparatu cDNA i metody qPCR.
3. Uruchom następujący program qPCR (np. w systemie 7500 Fast Real-time PCR lub równoważnym): 2 min w 50 °C, 20 s w 95 °C, 40 cykli po 3 s w 95 °C i 30 s w 60 °C.

Wyniki

Nasze wstępne testy czasu znakowania BrU zostały przeprowadzone w komórkach AsPC-1. Komórki traktowano BrU przez 0, 1, 2 i 4,5 godziny, a następnie przeprowadzono całkowitą ekstrakcję RNA i BrU-IP. GAS5 i GAPDH mierzono w BrU-IP RNA, co wykazało, że znakowanie 1 godziną było wystarczające do osiągnięcia około 9- i 44-krotnej zmiany w porównaniu z tłem (0 h) odpowiednio dla GAPDH i GAS5.

BrU-IP i analiza opisana powyżej zostały w...

Dyskusja

Protokół ten opisuje zastosowanie BrU-IP do oznaczania produkcji RNA poprzez znakowanie nowo wytworzonego RNA przez 1 godzinę BrU, a następnie natychmiastową ekstrakcję RNA i immunoprecypitację RNA znakowanego BrU. Metoda ta została wcześniej opisana w odnośniku¹⁶, a ten artykuł zawiera kilka dodatkowych kroków w celu zwiększenia specyficzności IP i czystości RNA, poprzez wstępną obróbkę kulek o niskich stężeniach BrU, a także etap oczyszczania fenolowo-chloroformowego w celu zwiększenia czystości...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Inhibitor Ribolock Rnazy	ThermoFisher	EO0381
Dynabeads M-280 Owca anty-mysie IgG	Life Technologies	11202D
&alfa;-bromodeoksyurydyna mysie przeciwciało BD	Bioscience	555627
Nanodrop 1000	Thermo Fisher		Spektrofotometria ultrafioletowo-widzialna
Nasycony wodą fenol pH 6,6	ThermoFisher	AM9712
Fenol:Chloroform:IAA 25:24:1 pH 6,6	ThermoFisher	AM9732
Zestaw do izolacji RNA o wysokiej czystości	Roche	11828665001
Zestaw do odwrotnej transkrypcji cDNA o dużej pojemności	ThermoFisher	4368814
Taqman Fast Advanced Master Mix	ThermoFisher	4444557	qPCR Master Mix
Sondy RNA Taqman	ThermoFisher	SNCA: Hs01103383_m1, 18sRNA: Hs03928985_g1, ACTB: Hs01060665_g1, HMBS: Hs00609296, NADH: Hs01072843_m1	Sondy flurogeniczne
7500 Szybki system PCR w czasie rzeczywistym	Biosystems stosowane biosystemy
HEK293T linii komórkowej	ATCC
Zmodyfikowane podłoże orła firmy Dulbecco	Lonza	BE12-604F
Surowica cielęca płodu	Biochrom	S0115
Penicylina/Streptomycyna	Biochrom	A2213
Bufor			5,3 mM KCl, 0,44 mM KH2PO4, 0,2 mM Na2HPO4 i 136,8 mM NaCl pH 6,77, autoklawowane.
DEPC-H2O			0,1% dietilowęglanem traktowany H2O
2xBrU-IP Bufor			40 mM Tris-HCl pH 7,5 i 500 mM NaCl w DEPC H2O
2xBrU-IP+BSA/RNAzy			inhibitor 2xBrU-IP, bufor 2xBrU-IP uzupełniony 1 μ g/μ L BSA i 80 U/ml Ribolock
BrU-IP+ 1 mg/ml heparyny			2xBrU-IP bufor rozcieńczony 1:1 DEPC-H2O i uzupełniony 1mg/ml heparyny
1xBrU-IP			bufor 2xBrU-IP rozcieńczony 1:1 w DEPC-H2O i uzupełniony 0,5 μ g/μ L BSA i 20 U/ml
bufor elucyjny rybolocku			0,1% SDS w H2O wolnym od RNAzy