Multimodalne hierarchiczne obrazowanie odcinków szeregowych w celu znalezienia określonych celów komórkowych w dużych objętościach

Summary

Ten protokół jest ukierunkowany na konkretne komórki w tkance do obrazowania w rozdzielczości nanoskali za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM). Duża liczba seryjnych odcinków materiału biologicznego zatopionego w żywicy jest najpierw obrazowana w mikroskopie świetlnym w celu identyfikacji celu, a następnie w sposób hierarchiczny w SEM.

Abstract

Celowanie w konkretne komórki w ultrastrukturalnej rozdzielczości w mieszanej populacji komórek lub tkance można osiągnąć poprzez hierarchiczne obrazowanie za pomocą kombinacji światła i mikroskopii elektronowej. Próbki zatopione w żywicy są dzielone na układy składające się z wstęg o setkach ultracienkich odcinków i osadzane na kawałkach płytki krzemowej lub szkiełkach nakrywkowych pokrytych przewodząco. Matryce są obrazowane w niskiej rozdzielczości za pomocą cyfrowego odbiornika, takiego jak aparat w smartfonie lub mikroskop świetlny (LM) w celu szybkiego przeglądu dużego obszaru, lub mikroskopu fluorescencyjnego o szerokim polu widzenia (mikroskopia światła fluorescencyjnego (FLM)) po znakowaniu fluoroforami. Po barwieniu metalami ciężkimi matryce są obrazowane w skaningowym mikroskopie elektronowym (SEM). Wybór celów jest możliwy z rekonstrukcji 3D wygenerowanych przez FLM lub z rekonstrukcji 3D wykonanych ze stosów obrazów SEM w rozdzielczości pośredniej, jeśli nie są dostępne markery fluorescencyjne. W przypadku analizy ultrastrukturalnej wybrane cele są ostatecznie rejestrowane w SEM w wysokiej rozdzielczości (kilka nanometrów pikseli obrazu). Zademonstrowano narzędzie do obsługi wstęgi, które można zamontować w każdym ultramikrotomie. Pomaga w produkcji tablicy i usuwaniu substratu z noża do sekcji. Omówiono platformę programową, która umożliwia automatyczne obrazowanie macierzy w SEM. W porównaniu z innymi metodami generującymi duże ilości danych EM, takimi jak szeregowy blok SEM (SBF-SEM) lub skupiona wiązka jonów SEM (FIB-SEM), podejście to ma dwie główne zalety: (1) Próbka zanurzona w żywicy jest konserwowana, choć w wersji pokrojonej. Można go barwić na różne sposoby i obrazować w różnych rozdzielczościach. (2) Ponieważ skrawki mogą być barwione po wybarwieniu, nie jest konieczne stosowanie próbek silnie barwionych blokami metali ciężkich w celu wprowadzenia kontrastu do obrazowania SEM lub nadania blokom tkanki przewodzenia. To sprawia, że metoda ta ma zastosowanie do szerokiej gamy materiałów i zagadnień biologicznych. Materiały z prefiksami, np. z banków biopsji i laboratoriów patologicznych, mogą być bezpośrednio osadzane i rekonstruowane w 3D.

Introduction

Do rekonstrukcji dużych objętości tkanek w ultrastrukturalnej rozdzielczości użyto wielu różnych podejść do obrazowania opartych na SEM¹: Dostępne są kompleksowe recenzje, np. dla SBF-SEM², FIB-SEM³, oraz Array Tomography (AT)⁴. Podczas gdy w przypadku tej drugiej metody materiał próbki jest zachowywany jako tablica szeregowych przekrojów na podłożu, SBF-SEM i FIB-SEM są metodami destrukcyjnymi, działającymi na bloku próbki i zużywającymi go podczas obrazowania. Ze względu na ładunek żywicy w SEM, są one również zależne od silnie metalizowanych bloków próbki⁵.

Z drugiej strony, identyfikacja pewnych komórek lub struktur będących przedmiotem zainteresowania w próbce tkanki może przynieść korzyści szczególnie dzięki korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej (CLEM)^6,7,8. Użycie FLM do celowania wyklucza zastosowanie dużych ilości metali ciężkich, ponieważ spowodowałoby to wygaszenie sygnału fluorescencji⁹. W przypadku takich tylko nieznacznie zmetalizowanych próbek, AT jest metodą z wyboru, ponieważ matryce mogą być łatwo wybarwione metalem ciężkim po obrazowaniu LM. Co więcej, prawie każdy rodzaj próbki może być użyty do AT, nawet rutynowe próbki ze skrzyni skarbów patologa¹⁰.

Kolejną dużą zaletą AT jest potencjał do hierarchicznego¹¹ lub obrazowania wielorozdzielczego¹²: Nie jest konieczne obrazowanie wszystkiego w wysokiej rozdzielczości, ponieważ cele mogą być wybrane w innym trybie (np. FLM) lub na obrazach SEM o niskiej rozdzielczości. Obrazowanie tylko interesujących obszarów populacji tkanek lub komórek w wysokiej rozdzielczości oszczędza miejsce do przechowywania danych cyfrowych i tworzy mniejsze zestawy danych obrazowych, które są łatwiejsze w obsłudze. W tym przypadku przepływ pracy AT jest demonstrowany przy użyciu dość słabo zmetalizowanej próbki: zamrożonych pod wysokim ciśnieniem korzeni roślin (Arabidopsis thaliana) zatopionych w żywicy hydrofilowej.

Jak tablice są przygotowywane, barwione i obrazowane zarówno w FLM, jak i SEM, oraz jak rejestrowane są stosy obrazów. Zilustrowano również, w jaki sposób rekonstrukcja 3D objętości FLM może być wykorzystana do wyboru określonych komórek do obrazowania w SEM w rozdzielczości nanoskali.

Protocol

UWAGA: Bloki próbek powinny być spolimeryzowane i zawierać trochę ciężkiego metalu. Protokoły utrwalania i osadzania dla dwóch próbek pokazanych w Rysunek 1A-B zostały opisane gdzie indziej¹¹. Krótko mówiąc, próbka pokazana w Rysunek 1A została chemicznie utrwalona, wybarwiona en bloc najpierw 1% OsO₄, a następnie 1% octanem uranylu i zatopiona w żywicy Spurra. Próbka pokazana w Rysunek 1B została zamrożona pod wysokim ciśnieniem, zamrożona podstawiona 0,4% octanem uranylu w acetonie i zatopiona w żywicy Lowicryl HM20. Do kolejnych etapów przygotowań używaj rękawiczek bezpudrowych.

1. Tworzenie tablic

1. Przycinanie bloku próbki
   UWAGA: Zawsze dobrze dokręcaj podczas wkładania części.
   1. Włóż blok próbki do uchwytu na próbkę ultramikrotomu, umieść uchwyt w bloku przycinania i wsuń go do dolnego stopnia ultramikrotomu.
   2. Odetnij żywicę wokół osadzonej tkanki za pomocą żyletki, pozostawiając tylko niewielką obwódkę żywicy wokół próbki. Przycinaj od góry, aż do osiągnięcia celu.
      UWAGA: Kształt lica bloku może być trapezowy lub prostokątny (z powodzeniem zastosowaliśmy oba kształty). Ważne jest, aby użyć dłuższych boków prostokąta jako krawędzi natarcia i spływu, aby zapewnić, że duży obszar jest pokryty mieszanką kleju stabilizującą wstążki.
   3. Włóż uchwyt na próbkę do ramienia ultramikrotomu i zastąp blok przycinania w dolnym stopniu uchwytem noża. Włóż diamentowy nóż do przycinania (zwykle 45°) do uchwytu noża. Wyrównaj powierzchnię bloku dokładnie równolegle do krawędzi noża przycinającego.
      UWAGA: Aby uzyskać dokładnie równoległe krawędzie natarcia (dolne) i spływające (górne), obróć lub przesuń tylko nóż, aby przyciąć przeciwne strony. W przypadku dużych objętości (ponad kilkaset sekcji) korzystny jest nóż do przycinania pod kątem 90°.
   4. Wygładź wszystkie cztery strony, a następnie obróć uchwyt próbki tak, aby krawędź natarcia i spływu znalazły się teraz w pozycji poziomej.
   5. Ostrożnie pokryj przednią i tylną stronę bloku mieszanką kleju. Użyj maleńkiej szczoteczki utworzonej z kilku włosków przymocowanych do wykałaczki¹³. Wykonaj ten krok szybko, ponieważ rozpuszczalnik tej mieszaniny odparowuje w ciągu kilku sekund. Nie zanieczyszczaj powierzchni bloku tą mieszaniną. Pozostawić powlekany blok próbki do wyschnięcia przez 5-10 minut
      UWAGA: W przypadku większej liczby sekcji (>200) lepszym rozwiązaniem może być pokrycie tylko krawędzi natarcia, ponieważ z czasem na krawędzi spływu może nagromadzić się wybrzuszenie kleju i potencjalnie przeciągnąć sekcje nad krawędź noża.
2. Przygotowanie podłoża
   1. Wytnij kawałki wafli silikonowych do rozmiaru, który zmieści się w łodzi z nożem (około 2 x 2,5^cm2 w przypadku noża Jumbo). W razie potrzeby oznacz kawałki wafla (cyfry lub litery) rysikiem diamentowym przed czyszczeniem lub markerem permanentnym po czyszczeniu. Wyczyść płytkę silikonową ręcznie za pomocą izopropanolu i niestrzępiącej się chusteczki.
      UWAGA: Do obrazowania korelacyjnego należy używać szkiełek nakrywkowych pokrytych tlenkiem indu i cyny (ITO). Należy obchodzić się z nimi bardzo ostrożnie, a dodatkowe czyszczenie nie jest konieczne.
   2. Przymocuj podłoże do jednego końca płyty nośnej za pomocą usuwalnego kleju.
      UWAGA: Alternatywnie krawędzie podłoża można przypiąć równolegle do krawędzi noża za pomocą dwóch pasków taśmy klejącej.
   3. Plazma aktywuje (wyładowanie jarzeniowe) podłoże powietrzem, aby uzyskać hydrofilową powierzchnię. Należy to zrobić w taki sposób, aby kropla wody umieszczona na podłożu rozchodziła się na bardzo cienką warstwę (niski kąt zwilżania, Rysunek 2C, D). Parametry hydrofilizacji zależą od zastosowanego urządzenia plazmowego; Aby zapoznać się z używanymi tutaj parametrami, patrz Tabela materiałów.
      UWAGA: Aktywacja plazmą jest bardzo niestabilna, więc należy ją wykonać bezpośrednio przed użyciem substratu.
   4. Włóż nośnik do zacisku uchwytu podłoża, tak aby zamontowane podłoże znajdowało się bliżej krawędzi noża, aby uzyskać optymalne zwilżenie podłoża w łodzi z nożem.
      UWAGA: Szczegółowy opis uchwytu podłoża, w tym rysunki projektowania wspomaganego komputerowo (CAD), znajduje się w Wacker i wsp. ¹¹
3. Przygotowanie do cięcia
   1. Włóż nóż diamentowy Jumbo do uchwytu noża, ustaw kąt przyłożenia (0° dla noża Jumbo) i napełnij łódkę noża wodą destylowaną. Zbliżyć nóż na odległość 1–2 mm od próbki.
   2. Opuść podłoże do wody za pomocą 1–3 (Rysunek 2A) uchwytu podłoża. Sprawdź, czy linia wodna znajduje się w górnej jednej trzeciej podłoża.
      UWAGA: Sprawdź, czy klej między podłożem a płytą nośną jest dobrze utwardzony, popychając podłoże czystymi kleszkami. Nie powinien się ruszać.
   3. Ponieważ podczas korzystania z płytki krzemowej trudno jest dostrzec prześwit, obniż podłoże, aż poczujesz, że dotyka podłogi. Teraz podnieś podłoże o niewielką ilość. Upewnij się, że ani podłoże, ani nośnik nie dotykają łodzi noża podczas cięcia.
   4. Użyj strzykawki lub pipety, aby wyregulować poziom wody w łodzi. Obserwując przez lornetkę, dodawaj lub usuwaj wodę, aż cały obszar powierzchni wody pokaże jednorodne odbicie górnego oświetlenia świetlnego ultramikrotomu.
   5. Włącz dolne światło ultramikrotomu. Upewnij się, że ramię znajduje się w pozycji środkowej i nie jest w pozycji chowanej za pomocą pokrętła ultramikrotomu. Zbliżyć nóż do próbki, aż odbicie krawędzi noża będzie widoczne na powierzchni bloku.
   6. Użyj opcji regulacji ultramikrotomu, aby wyrównać próbkę do noża. Najpierw obróć nóż, a następnie obróć i przechyl próbkę.
      UWAGA: Jest prawidłowo wyrównany, jeśli jasny pasek, który można zobaczyć w szczelinie między próbką a nożem, pokazuje równoległe krawędzie (proste równoległe linie, a nie w kształcie klina).
   7. Sprawdź nachylenie próbki: Upewnij się, że jasny pasek nie staje się grubszy ani cieńszy podczas przesuwania próbki w górę iw dół. W razie potrzeby użyj regulacji łuku, aby to skorygować. Przesuń nóż bliżej próbki, aż znajdzie się tuż nad powierzchnią bloku (ale jej nie dotyka
   ).
   8. Ustaw grubość przekroju (posuw), prędkość cięcia i okno cięcia w jednostce sterującej.
   9. Rozpocznij dzielenie na sekcje. W razie potrzeby poczekaj, aż zostanie wycięty pierwszy pełny odcinek. Wytnij kilka odcinków, aby upewnić się, że sklejają się ze sobą, tworząc wstążki (w przeciwnym razie klej musi zostać ponownie nałożony). Zacznij od wysokiej wartości posuwu (maksymalnie, 200 nm dla noża Ultra), aż do cięcia pierwszej pełnej sekcji. Następnie ustaw żądaną wartość kanału. Aby zapewnić odpowiednią stabilność taśmy, dobrym punktem wyjścia jest grubość przekroju 100 nm i prędkość cięcia 1 mm/s. Najniższa osiągalna grubość przekroju wynosi około 60 nm, w zależności od jakości próbki.
   10. Przestań dzielić na sekcje. Usuń wszystkie niepotrzebne (częściowo przycięte) sekcje z krawędzi noża i łodzi za pomocą rzęsy/sierści kota. Jeśli wokół unosi się dużo małych zanieczyszczeń, całkowicie usuń wodę za pomocą pipety i napełnij łódź świeżą wodą. Teraz proces jest gotowy na pierwszą produktywną wstążkę.
4. Cięcia
   1. Rozpocznij dzielenie na sekcje. Po wycięciu pewnej liczby sekcji (rzeczywista liczba zależy od wielkości sekcji i podłoża) przerwij proces cięcia i zwolnij wstążkę z krawędzi noża, delikatnie głaszcząc krawędź noża rzęsą¹⁴ lub jeszcze lepiej, bardzo miękkim włosem z sierści kota.
   2. Manipuluj (pchaj/ciągnij) wstążką z rzęsą w kierunku podłoża i przymocuj pierwszą sekcję do podłoża.
      UWAGA: Konieczne jest delikatne dociśnięcie taśmy, aż przyklei się do suchej części podłoża.
   3. Kontynuuj cięcie i mocowanie wstążek do podłoża. Zacznij od jednej strony i stopniowo przechodź na drugą z każdą nową wstążką.
      UWAGA: Unikaj masywnych ruchów wody, aby uniknąć poluzowania już przymocowanych wstążek. To samo dotyczy prądów powietrza. Stosować osłonę oddechową dołączoną do ultramikrotomu. W niesprzyjających warunkach środowiskowych zalecana jest obudowa dla ultramikrotomu¹⁵.
   4. Gdy podłoże jest całkowicie pokryte wstążkami (zwykle możliwe jest 4–5 wstążek), delikatnie wyjmij podłoże z łodzi nożowej za pomocą mikromanipulatora uchwytu podłoża.
      UWAGA: Odpowiednie ruchy to: podnoszenie w pionie (śruba 1) i obracanie/uchylanie (śruba 3) lub kombinacja obu.
   5. Pozostaw matrycę taśmy do wyschnięcia przed przechowywaniem jej w środowisku wolnym od kurzu. Po wyschnięciu należy jak najszybciej usunąć podłoże mocowane klejem z nośnika (tego samego dnia, w przeciwnym razie podłoże może być zbyt trudne do usunięcia lub nawet pęknąć podczas demontażu).

2. Barwienie do obrazowania LM

UWAGA: Możliwe są różne metody barwienia/znakowania, w tym protokoły immunofluorescencji. Tutaj wybiera się bezpośrednią, raczej niespecyficzną plamę, aby obrysować ściany komórkowe.

1. Barwienie jodkiem propidyny
   1. Przykryj dno dużej szklanej szalki Petriego (o średnicy 30 cm) parafilmem i wyłóż krawędź naczynia mokrą chusteczką, aby zbudować wilgotną komorę.
   2. Użyć około 300-500 μl roztworu na szkiełko nakrywkowe. Umieść jedną kroplę na każde szkiełko nakrywkowe na parafilmie i połóż szklankę do góry nogami na kropli, tak aby sekcje stykały się z płynem barwiącym. Przykryj naczynie i owiń je folią aluminiową, aby chronić próbki przed światłem. Inkubować próbki przez 16 godzin w temperaturze 4 °C.
   3. Usuń szkiełko nakrywkowe za pomocą kleszczy i umyj je, przesuwając je w górę i w dół w zlewce o pojemności 100 ml wypełnionej 80 ml wody destylowanej. Powtórz ten krok w innej zlewce ze świeżą wodą. Ostrożnie osusz szkiełko nakrywkowe sprężonym powietrzem.

3. Nagrywanie stosu obrazów w FLM

1. Umieść szkiełko nakrywkowe na stoliku popularnego FLM o szerokim polu.
2. Wybierz odpowiedni zestaw filtrów (Tabela materiałów) dla obserwowanej fluorescencji.
3. Za pomocą odpowiedniej soczewki obiektywowej zrób zdjęcie obiektu w każdej sekcji: staraj się wypełnić pole widzenia i utrzymuj stałą orientację. Do końcówki korzeniowej użyto obiektywu pneumatycznego 40X.
   UWAGA: Jeśli wstążki nie są idealnie proste, obrotowy stolik może pomóc w zmianie orientacji sekcji podczas robienia zdjęć. Jeśli to możliwe, wyśrodkuj obraz na określonym elemencie lub utrzymuj element, taki jak krawędź sekcji, w równej odległości od krawędzi zarejestrowanego obrazu.
4. Jeśli to możliwe, użyj 16 bitów, aby ograniczyć nasycone piksele i utrzymać stały czas ekspozycji.

4. Rejestracja stosu obrazów FLM

1. Zaimportuj serię obrazów do Fiji¹⁶ jako wirtualny stos.
2. Otwórz nowy TrakEM¹⁷ (pusty) z menu plików.
3. Kliknij prawym przyciskiem myszy pole obrazu i zaimportuj stos do TrakEM jako "Jeden plasterek na warstwę".
4. Wyrównaj warstwy (kliknij prawym przyciskiem myszy w polu obrazu), ustaw zakres (od pierwszego obrazu do ostatniego) i wybierz brak jako odniesienie. Dla wszystkich ustawień należy użyć wartości domyślnych i wybrać opcję sztywny jako żądaną transformację.
5. Gdy rejestracja zostanie zakończona i zadowalająca, zapisz wyrównany zestaw danych, klikając prawym przyciskiem myszy i wybierając opcję eksportuj. Utwórz płaski obraz, ustaw zakres od pierwszego do ostatniego obrazu i pozwól oprogramowaniu wyświetlić wynikowy stos. Zapisz stos w formacie tif.

5. Barwienie i montaż do obrazowania SEM

UWAGA: Aby przygotować roztwory do barwienia, zobacz Tabelę materiałów. Roztwory mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez okres do 12 miesięcy, chroniąc je przed światłem i powietrzem.

Uwaga: Cytrynian ołowiu i octan uranylu zawierają metale ciężkie, które są toksyczne. Nosić rękawice i utylizować odpady zgodnie z instrukcjami władz lokalnych.

1. Przykryj dno dużej szklanej szalki Petriego (o średnicy 30 cm) parafilmem i wyłóż krawędź naczynia mokrą chusteczką, aby zbudować wilgotną komorę.
   UWAGA: Ważne jest, aby kilka granulek NaOH było umieszczonych na szalce Petriego w pobliżu kropli barwiących, aby zapobiec nadmiernemu wytrącaniu się cytrynianu ołowiu.
2. Barwienie octanem uranylu
   1. Odwirować roztwór octanu uranylu o stężeniu 2,680 x g przez kilka sekund w celu osadzenia małych cząstek.
   2. Użyć około 300–500 μl roztworu na szkiełko nakrywkowe. Umieść jedną kroplę na każde szkiełko nakrywkowe na parafilmie i połóż szklankę do góry nogami na kropli, tak aby sekcje stykały się z płynem barwiącym.
   3. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej i przykryć naczynie podczas barwienia.
   4. Usunąć szkiełko nakrywkowe za pomocą kleszczy i umyć, przesuwając je w górę i w dół w zlewce wypełnionej wodą destylowaną (patrz krok 2.1.3).
3. Barwienie cytrynianem ołowiu
   1. Podczas inkubacji octanu uranylu przygotować roztwór cytrynianu ołowiu.
      UWAGA: Cytrynian ołowiu należy zawsze filtrować bezpośrednio przed użyciem w celu usunięcia wszelkich osadów. Odwirować również roztwór cytrynianu ołowiu o stężeniu 2,680 x g przez kilka sekund, jak w kroku 5.2.1.
   2. Użyć około 300–500 μl roztworu na szkiełko nakrywkowe. Umieścić jedną kroplę na każde szkiełko nakrywkowe na parafilmie bezpośrednio przed umyciem szkiełek nakrywkowych po barwieniu octanem uranylu i położyć szklankę do góry nogami na kropli, tak aby skrawki stykały się z płynem barwiącym. Umieścić krople (300–500 μl) na parafilmie bezpośrednio przed umyciem szkiełek nakrywkowych po barwieniu octanem uranylu.
      UWAGA: Aby uniknąć tworzenia się osadów, nie wdychać kropelek cytrynianu ołowiu.
   3. Umyte szkiełko nakrywkowe połóż do góry nogami na kropli (nie ma potrzeby jej suszenia).
   4. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej i przykryć naczynie podczas barwienia.
   5. Usunąć szkiełko nakrywkowe za pomocą kleszczy i umyć je w sposób opisany powyżej w zlewce ze świeżą wodą (krok 5.2.4).
4. Ostrożnie osusz szkiełko nakrywkowe sprężonym powietrzem.
5. Montaż próbek do obrazowania SEM
   1. Zamontuj wafle krzemowe na aluminiowych króćcach za pomocą lepkiej podkładki węglowej.
      UWAGA: Szkiełka nakrywkowe z powłoką IT można montować za pomocą srebrnej farby i taśmy Cu — upewnij się, że powierzchnia przewodząca jest połączona z króćcem — lub za pomocą podkładek węglowych, jak powyżej. W takim przypadku przewodzące połączenie od powierzchni ITO do kkońcówki można wykonać za pomocą kropli srebrnej farby.

6. Obrazowanie hierarchiczne w SEM

UWAGA: W SEM emisji pola wybierz niską energię pierwotną (3 kV lub niższą), prąd wiązki w zakresie od 50 do 800 pA, aby uniknąć ładowania, oraz odpowiednią odległość roboczą dla efektywnego zbierania elektronów wtórnych i/lub wstecznie rozproszonych. Dobór prądu wiązki zależy od właściwości próbki (np. zatapianie żywicy); Dawka elektronów będzie również kompromisem pomiędzy małym prądem (mniej szkodliwym dla próbki) a wysokim prądem, co korzystnie wpływa na szybkość obrazowania, a tym samym skraca całkowity czas akwizycji obrazu. Dedykowane detektory elektronów rozpraszanych wstecznie zapewniają dobry kontrast, są mniej wrażliwe na ładowanie próbki i pokazują mniej artefaktów na powierzchni próbki (fałdy, ślady noża). Kontrast i jasność należy dostosować tak, aby histogram był wyśrodkowany.

1. Obrazowanie SEM
   1. Najpierw zdefiniuj cztery rogi tablicy, chwytając obraz każdego rogu w małym powiększeniu, około 100x. Utwórz obszar zainteresowania (ROI) otaczający całą tablicę. Przypisz protokół obrazowania z następującymi parametrami: Użyj detektora elektronów wtórnych (SE), który pozwala na szybkie obrazowanie przy dużym rozmiarze piksela obrazu (na przykład 1,000 nm) i krótkim czasie przebywania (np. 0,2 μs).
      UWAGA: Aby przezwyciężyć ograniczenia optyczne elektronów przy dużym polu widzenia skanowania (FOV), które mogą powodować zniekształcenia na obrzeżach obrazów, należy użyć dedykowanych trybów małego powiększenia (dostarczanych przez większość producentów SEM) lub użyć średnich, 1 do 2 tys. pól skanowania dla pojedynczych obrazów.
   2. Wygeneruj zestaw sekcji, tworząc ROI przedstawiający tylko tkankę w pierwszej sekcji. Sklonuj go do wszystkich kolejnych sekcji za pomocą narzędzia stempla. W razie potrzeby obróć ROI, aby pomieścić wygięte taśmy.
   3. Nagraj serię obrazów przy użyciu pośredniego rozmiaru piksela (około 50 nm) i czasu przebywania wystarczająco długiego, aby zidentyfikować i rozpoznać strukturę docelową. Użyj pola widzenia dla pojedynczych obrazów w zakresie 6-10 tys. pikseli.
      UWAGA: Oprogramowanie Atlas 5 może automatycznie zbierać mozaiki złożone z sąsiednich obrazów, aby pokryć duże obszary ROI/sekcji w sekcjach szeregowych.
   4. Utwórz zestaw witryn w tym zestawie sekcji, zawierający strukturę docelową dla obrazowania SEM o wyższej rozdzielczości. Spraw, aby zwrot z inwestycji był wystarczająco duży, aby uwzględnić precyzję etapu. Sprawdź i dostosuj pozycje witryn.
      UWAGA: Ważne jest, aby umieścić ROI w taki sposób, aby środek, w którym będzie wykonywany autofokus i autostygmatyzacja, nie znajdował się na "pustym" materiale bez szczegółów strukturalnych, np. wakuoli.
   5. Zdefiniuj ustawienia autofokusa i sprawdź wydajność co najmniej na długości wstęgi (tj. najdłuższej odległości, jaką musi pokonać stolik) przy niewielkim zwrocie z inwestycji w pobliżu miejsca, które zostanie zobrazowane.
   6. Zdefiniuj protokół obrazowania dla akwizycji SEM o wysokiej rozdzielczości. Aby zobaczyć przedziały membranowe, wybierz rozmiar piksela obrazu 3–5 nm. Wybierz czas przebywania w zależności od detektora, aby obraz nie był zbyt zaszumiony.
   7. Przed rozpoczęciem akwizycji zdefiniuj wartości fokusu w co najmniej pierwszej sekcji każdej wstążki przy użyciu opcji sprawdź protokół.
   8. Rozpocznij automatyczne obrazowanie SEM w całej serii docelowych zwrotów z inwestycji.
   9. Eksportuj pozyskane dane jako serie obrazów, najlepiej w formacie tif.

7. Rejestracja stosu obrazów SEM

1. Importuj serie obrazów na Fidżi jako wirtualny stos.
   UWAGA: Będą to duże pliki danych w zakresie kilku GB w zależności od liczby sekcji i wielkości ROI.
2. Przytnij stos obrazów SEM w celu dalszego przetwarzania do obszaru jak najbardziej zbliżonego do interesującej Cię struktury, a następnie dostosuj jasność i kontrast.
3. Otwórz nowy TrakEM¹⁷ (pusty) z menu plików.
4. Kliknij prawym przyciskiem myszy pole obrazu i zaimportuj stos do TrakEM jako "Jeden plasterek na warstwę".
5. Wyrównaj warstwy (kliknij prawym przyciskiem myszy w polu obrazu), wybierz tryb najmniejszych kwadratów, ustaw zakres (od pierwszego obrazu do ostatniego) i wybierz brak jako odniesienie. W ustawieniach użyj wartości domyślnych i wybierz sztywny jako żądaną transformację.
6. Gdy rejestracja zostanie zakończona i zakończona i zadowalająca, zapisz wyrównany zestaw danych, klikając prawym przyciskiem myszy i wybierając opcję eksportuj. Utwórz płaski obraz, ustaw zakres od pierwszego do ostatniego obrazu i pozwól oprogramowaniu wyświetlić wynikowy stos. Zapisz stos w formacie tif.

Results

Opisany tutaj przepływ pracy (Rysunek 1) rozpoczyna się od próbki osadzonej w bloku żywicy. Podczas przygotowywania próbki należy wprowadzić do tkanki trochę metalu ciężkiego, ale nie jest konieczne stosowanie protokołów zoptymalizowanych pod kątem dość silnej metalizacji. Rysunek 1A pokazuje korzeń rośliny (rzeżuchę) barwiony blokowo konwencjonalnie 1% OsO₄ i 1% octanu uranylu, podczas gdy korzeń Arabidopsis w Rysunek 1B jest tylko słabo metalizowany przy użyciu 0,5% octanu uranylu. Ten ostatni typ próbki najlepiej nadaje się do podejść korelacyjnych, ponieważ niektóre metale ciężkie mają tendencję do wygaszania fluorescencji. Za pomocą dedykowanego uchwytu na podłoże (Rysunek 2) można wyprodukować tablice składające się z kilkuset sekcji (Rysunek 1C). Po znakowaniu fluorescencyjnym takie matryce są obrazowane w standardowym szerokopolowym FLM (Rysunek 1D), a następnie barwione roztworami metali ciężkich i obrazowane w SEM w różnych rozdzielczościach (Rysunek 1E-G).

Ważnymi narzędziami do powtarzalnego generowania tablic, szczególnie podczas umieszczania kilku wstęg z noża mikrotomu na podłożu, są uchwyt na podłoże (Rysunek 2A, specjalnie zaprojektowany w laboratorium autorów) oraz diamentowy nóż Jumbo z łódką wystarczająco dużą, aby pomieścić szkiełka mikroskopowe (Rysunek 2B). Płaska meniskus, pozwalająca na dobrą obserwację wstęg, jest niezbędna i można ją osiągnąć poprzez plazmowe czyszczenie podłoża: Mała kropla wody destylowanej nie powinna tworzyć na podłożu struktury przypominającej soczewkę, jak w Rysunek 2C (podłoże niepoddane obróbce), ale cienka warstwa (Rysunek 2D, podłoże aktywowane plazmą). W tych warunkach wstęgi przymocowane do suchej części szkiełka nakrywkowego pokrytego ITO są łatwe do wizualizacji (Rysunek 2E) i mogą być obserwowane i kontrolowane podczas wyjmowania podłoża z wody.

Na przykład, tablice barwione jodkiem propidyny w celu oznaczenia ścian komórkowych roślin zostały zobrazowane za pomocą standardowego FLM o szerokim polu widzenia (Rysunek 3A). Ponieważ odcinki mają grubość tylko 100 nm, nawet nadmierne barwienie, jak pokazano tutaj, powoduje niewielkie rozmycie. Po zarejestrowaniu, dwie komórki całkowicie zamknięte w zrekonstruowanym woluminie zostały wybrane ze stosu obrazów (Rysunek 3B) do obrazowania w wysokiej rozdzielczości w 3D (patrz również Film uzupełniający S1). Po dodatkowym barwieniu octanem uranylu i cytrynianem ołowiu, matryce zostały zobrazowane w SEM. Rysunek 3C przedstawia przegląd, zarejestrowany za pomocą pikseli obrazu 60 nm; Ciemny kwadrat na środku obrazu wskazuje pozycję, w której zostały wykonane funkcje autofokusa, a dodatkowa dawka doprowadziła do lekkiego zanieczyszczenia. Odpowiednie ROI w tych sekcjach szeregowych (wycinki od 51 do 248 z 435 warstw łącznie) zawierających dwie komórki docelowe wybrane w stosie FLM zostały następnie zarejestrowane z obrazem o rozmiarze piksela 5 nm (Rysunek 3D; patrz także Film uzupełniający S2).

Zautomatyzowane hierarchiczne obrazowanie opisanych tutaj macierzy w SEM zostało wykonane za pomocą platformy programowo-sprzętowej ZEISS Atlas 5. Po pierwsze, za pomocą detektora SE stworzono przegląd całej matrycy, z bardzo dużymi (1000 nm) pikselami obrazu i bardzo krótkim czasem przebywania (Rysunek 4A). Zwrot akcji przedstawiający tylko tkankę umieszczono w pierwszej sekcji i rozpropagowano do wszystkich innych sekcji matrycy. Ten zestaw sekcji został następnie zarejestrowany z pikselami obrazu 60 nm przy użyciu dłuższego czasu przebywania ( Rysunek 4B). Na koniec, zestaw miejsc, zawierający dwie komórki docelowe plus jedną "warstwę" otaczających komórek w celu uwzględnienia niedokładności etapu, został skonfigurowany z następującymi parametrami: detektor ESB (Energy Selective Backscatter), piksele obrazu 5 nm, bardzo długi (40 μs) czas przebywania (Rysunek 4C). Powiększenie takiego obrazu pokazuje szczegóły subkomórkowe (Rysunek 4D), takie jak wakuole (V), mitochondria (M), jądro (N) i retikulum endoplazmatyczne (strzałki). Zobacz także film uzupełniający S3, aby powiększyć widok z przeglądu całej tablicy do szczegółów subkomórkowych jednej komórki docelowej.

Pokazana tutaj tablica (200 sekcji) plus dodatkowa jedna z 250 sekcji zajęła około 8 godzin, jedną noc na zabarwienie dla LM i jeden dzień na nagranie (ręcznie) w FLM. Barwienie końcowe trwa łącznie około 1-2 godzin, w zależności od liczby pojedynczych tablic. W przypadku nagrywania SEM potrzeba kilku godzin na skonfigurowanie przebiegu Atlasa, a automatyczne nagrywanie trwało 3–4 godziny w przypadku zestawu sekcji o średniej rozdzielczości (rozmiar piksela 60 nm) (200 sekcji, 450 x 200^μm2) i około 5 dni w przypadku zwrotu z inwestycji w wysokiej rozdzielczości (rozmiar piksela 5 nm) zawierającego dwie komórki docelowe (200 sekcji, 55 x 30 μm²). Należy zauważyć, że ze względu na niską zawartość metalu w pokazanej tutaj próbce, trzeba było zastosować bardzo niską prędkość skanowania, aby osiągnąć dobrą detekcję sygnału do szumu, co oznaczało (dla obecnie dostępnego detektora) czas przebywania wynoszący 40 μs dla zwrotu z inwestycji o wysokiej rozdzielczości.

W całym procesie pracy jest kilka etapów, które są podatne na pułapki: Idealnie byłoby, gdyby wstążki były mniej więcej proste i ułożone we właściwej kolejności (Rysunek 5A). Jednak często produkowane są wygięte (Rysunek 5B), zakrzywione (Rysunek 5D), a nawet połamane wstążki. Może to wynikać z nieprawidłowego przycinania (krawędzie natarcia i spływu nie są dokładnie równoległe) lub nierównomiernie nałożonego kleju, ale także z asymetrycznej lub nierównomiernie naciekającej próbki. Szczególnie kłopotliwe są próbki zawierające zarówno miękkie, jak i bardzo twarde składniki. Te ostatnie elementy mogą być trudne do przeniknięcia, takie jak ściana komórkowa korzeni roślin pokazana tutaj (Rysunek 5C). W takim przypadku zagięcia (groty strzałek) mogą być łatwo spowodowane przez zmienną kompresję i rozluźnienie podczas cięcia. W przypadku automatycznego obrazowania w SEM zakrzywione wstęgi nie stanowią większego problemu, ponieważ ROI można obracać, aby dostosować się do krzywizny taśmy.

Kolejnym krytycznym krokiem w protokole jest barwienie: Nieodpowiednie mycie może prowadzić do powstawania osadów na sekcji (Rysunek 5E, F), a w najgorszym przypadku pokrywać najbardziej interesujący obszar (kółko na jednej z dwóch komórek docelowych w Rysunek 5F). Również pył (Rysunek 5D, silnie rozpraszające światło cząstki) wprowadzony do łodzi nożowej, np. z brudnym nośnikiem podłoża, może powodować poważne problemy: W FLM pył może być silnie fluorescencyjny (por. niektóre wycinki w filmie uzupełniającym S1) do tego stopnia, że niektóre algorytmy rejestracji nie działają. Funkcja "align" w TrakEM¹⁷ może jednak obsłużyć takie stosy, jak pokazano w filmie uzupełniającym S1.

Rysunek 1: Przepływ pracy dla korelacyjnego obrazowania hierarchicznego. Zaczynając od próbki osadzonej w bloku żywicy (A, próbka silnie metalizowana), próbka jest najpierw przycinana (B, próbka słabo metalizowana), a następnie przy użyciu ultramikrotomu wytwarza się układy składające się z kilku wstęg odcinków seryjnych (C), tutaj umieszczone na szkiełku nakrywkowym pokrytym ITO. Po zabarwieniu barwnikiem fluorescencyjnym, stosy obrazów są rejestrowane w szerokokątnym polu FLM (D). Po dalszym barwieniu solami metali ciężkich, stosy są obrazowane w SEM (E-G) w różnych rozdzielczościach (rozmiarach pikseli obrazu). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Narzędzia do przygotowania tablic. Uchwyt podłoża złożony z mikromanipulatorów z siedmioma osiami ruchu przymocowanymi do standardowego ultramikrotomu (A):, oznaczone okręgami, służą do ruchu pionowego (1) i poziomego (2) oraz do przechylania (3) nośnika podłoża. Duży nóż diamentowy z ponadwymiarową łodzią do przechowywania dużych podłoży (strzałka), tutaj z kawałkiem aktywowanej plazmowo płytki krzemowej zamontowanej na aluminiowym nośniku wielkości szkiełka (B). 20 μl kropli wody destylowanej umieścić na nieobrobionym podłożu z płytki krzemowej (C) lub na podłożu aktywowanym plazmą (D). Cztery wstęgi unoszące się w łodzi z nożem, przymocowane dolnymi końcami do szkiełka nakrywkowego pokrytego ITO. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Korelacja danych LM z danymi SEM. Przeglądy (A, C) i komórki docelowe (B, D) zarejestrowane za pomocą FLM (A, B) i SEM (C, D). (B) to zoom programowy, a oryginalne dane zostały zarejestrowane za pomocą obiektywu 40X na chipie kamery 1,388 x 1,040 pikseli, podczas gdy (C) jest rejestrowane z rozmiarem piksela obrazu 60 nm, a (D) z rozmiarem piksela obrazu 5 nm, ilustrując prawdziwy wzrost rozdzielczości w SEM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Obrazowanie hierarchiczne w SEM przy użyciu ZEISS Atlas 5 AT. Przegląd matrycy zarejestrowanej z pikselami obrazu 1 000 nm za pomocą detektora SE (A). Zestawy przekrojów z ROI umieszczonym na tkance w każdej sekcji i zarejestrowane z pikselami obrazu 60 nm (B). Zestawy witryn z szeregowym ROI umieszczonymi na komórkach docelowych i zarejestrowanymi za pomocą pikseli obrazu 5 nm (C). Podczas powiększania obrazów o wysokiej rozdzielczości (D) widoczne stają się przedziały błony wewnątrzkomórkowej, takie jak wakuole (V), jądro (N), mitochondria (M) i retikulum endoplazmatyczne (strzałki). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Typowe problemy. 1. Wynikające z procesu cięcia: Taśmy umieszczone na szkiełkach nakrywkowych pokrytych ITO są idealnie proste (A), ale nieregularne ściskanie podczas cięcia może powodować wygięcie (B) lub zakrzywione wstążki (D), a nawet fałdy (C). 2. Spowodowane obchodzeniem się z podłożem i wstążkami w wodzie, np. podczas cięcia i barwienia: cząstki rozpraszające światło na podłożu (D), brzeg kropel na przekroju (kółko w E) lub brud rozmazany na tkance z powodu nieodpowiedniego mycia po barwieniu (F). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dodatkowy film S1: Stos obrazów FLM. 435 obrazów wyrównanych w Fiji¹⁶ przy użyciu TrakEM¹⁷ i zapisane jako plik filmowy (.avi). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Supplemental Movie S2: Stos obrazów SEM. 210 obrazów wyrównanych w Fiji¹⁶ przy użyciu TrakEM¹⁷. Oryginalny stos (300 obrazów) tego zestawu danych miał rozmiar 15 GB. Aby zmniejszyć rozmiar stosu z 3,3 GB (po wyrównaniu i przycięciu tylko do dwóch komórek docelowych), został on przeskalowany w x i y o współczynnik 0,2 przy użyciu Fidżi, a następnie zapisany jako .avi filmie. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Film uzupełniający S3: Powiększanie z różnymi poziomami rozdzielczości w SEM. Film stworzony i wyeksportowany z programu Atlas 5 w formacie .mp4. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

Zademonstrowano przepływ pracy do celowania w określone komórki w tkance za pomocą multimodalnego hierarchicznego AT: próbka zanurzona w żywicy jest krojona na tablice szeregowych sekcji, które są umieszczane na podłożu przewodzącym za pomocą specjalnie zaprojektowanego uchwytu podłoża. Po znakowaniu fluoroforem i zobrazowaniu w FLM, zrekonstruowana objętość jest wykorzystywana do selekcji komórek docelowych. Po dodatkowym barwieniu metalami ciężkimi w celu wprowadzenia kontrastu, cele te są obrazowane na kilkuset odcinkach w rozdzielczości nanoskali w SEM przy użyciu zautomatyzowanej platformy oprogramowania.

Do produkcji gęsto upakowanych macierzy z kilkoma długimi wstęgami niezbędny jest uchwyt podłoża podobny do opisanego tutaj. Wprawna i cierpliwa osoba może być w stanie przymocować kilka taśm do podłoża silikonowego, częściowo zanurzonego w łodzi z nożem, i odzyskać matrycę, stopniowo obniżając poziom wody, aż wstążki osiądą na podłożu. Jednak z naszego doświadczenia wynika, że istnieje tendencja do pękania, gdy podłoże dotyka jakiejkolwiek części łodzi nożowej (por. uwaga w 1.3.2 w protokole). Ponadto procedura ta jest znacznie trudniejsza w przypadku podłoży pokrytych ITO: (1) ze względu na przezroczystość szkła ITO trudno jest dostrzec krawędź wody, do której należy przymocować końce wstążek; oraz (2) ponieważ powierzchnia pokryta ITO jest znacznie bardziej szorstka niż wysoce wypolerowana płytka krzemowa, wstęgi mają tendencję do pękania podczas podnoszenia, a mniejsze fragmenty składające się z kilku sekcji mogą unosić się na wodzie, niszcząc w ten sposób kolejność sekcji.

Cały przepływ pracy jest również możliwy do zrealizowania bez korelacji z danymi FLM. W takim przypadku może być konieczne zebranie danych w SEM w kilku sesjach. Wstępna rekonstrukcja 3D lub przynajmniej ocena danych o niskiej lub średniej rozdzielczości może być konieczna do zidentyfikowania celów. Ponadto można stosować konwencjonalne barwienia histologiczne dla LM jasnego pola (niewymagające FLM). Oczywiście, inne opcje ^6,7,8 to znakowanie przeciwciał na matrycach, jak już wykazano w początkowym artykule na temat AT¹⁸, lub genetycznie kodowane białka fluorescencyjne (XFP) lub wstępne osadzanie znakowania z zachowaniem fluorescencji podczas przygotowywania próbki.

Ogólnym ograniczeniem omawianej metody jest użycie przekrojów o określonej grubości i wynikające z tego dyskretne próbkowanie objętości 3D: Rozdzielczość w Z może być tylko tak dobra, jak grubość przekrojów, ponieważ SEM zbiera tylko dane z powierzchni przekroju (w zależności od wybranej energii pierwotnej/energii lądowania). Oznacza to, że uzyskana objętość 3D ma woksele anizotropowe, np. 5 x 5 x 100 nm³ jeśli użyte są odcinki 100 nm i rozmiar piksela obrazu 5 nm. W przypadku bardzo małych jednostek w zakresie rozmiarów poniżej 1 μm może to nie wystarczyć do prawdziwego opisu ultrastrukturalnego. Bardziej technicznym ograniczeniem jest dokładność etapu używanego w SEM do automatycznego obrazowania. Z tego powodu konieczne jest wybranie zwrotu z inwestycji większego niż specyfikacja dokładności stolika, aby zagwarantować, że obrazowany jest cały obszar docelowy.

W porównaniu z SBF-SEM i FIB-SEM jako metodami obrazowania blokowego, korelacyjny AT ma ostateczną wadę w postaci wokseli anizotropowych, jak opisano powyżej. Dzięki FIB-SEM można uzyskać woksele izotropowe o wymiarach 5 x 5 x 5 nm³ przy odpowiedniej korekcie dryftu.

Luki w zrekonstruowanej objętości spowodowane utratą sekcji podczas przygotowywania macierzy mogą być również problemem, który nie występuje w przypadku SBF-SEM lub FIB-SEM. Przy dobrej stabilizacji wstążki za pomocą kleju zwykle stanowi to problem tylko w przypadku ostatniego odcinka wstążki: może ona zostać uszkodzona podczas zdejmowania jej z krawędzi noża za pomocą rzęsy. Jednak z naszego doświadczenia wynika, że utrata jednej sekcji na 20–50 sekcji nie ma wpływu na rejestrację obrazu.

Z drugiej strony, możliwość post-stainingu zapewnia dobry sygnał i kontrast dla obrazowania SEM, nawet w przypadku słabo zmetalizowanych próbek, takich jak pokazane tutaj zamrożone końcówki korzeni pod wysokim ciśnieniem. W związku z tym nie jest konieczne rezygnowanie z optymalnej ochrony ultrastrukturalnej poprzez liczne etapy chemicznego utrwalania i metalizacji. Również rutynowe próbki z laboratorium patomorfologicznego o średnim stopniu metalizacji dostarczają doskonałych danych¹⁰. Takie wzmocnienie kontrastu po osadzeniu nie jest możliwe w przypadku SBF-SEM i FIB-SEM w ogóle. Ponadto, ponieważ metody te są destrukcyjne, tj. konsumpcja próbki podczas obrazowania, obrazowanie hierarchiczne w różnych rozdzielczościach i miejscach lub wielokrotne obrazowanie w późniejszych momentach jest niemożliwe. Zasadniczo nieograniczone objętości, składające się z dużych pól widzenia (np. do kilku milimetrów dla całych mózgów myszy w konektomice) utworzonych przez zszywanie mozaik, oraz ogromna liczba sekcji mogą być uzyskane przez AT, podczas gdy w FIB-SEM pola widzenia powyżej 100 μm x 100 μm są trudne do osiągnięcia za pomocą rutynowych instrumentów.

Dalsza automatyzacja opisanego przepływu pracy AT byłaby niewątpliwą zaletą, ponieważ wyżej wymienione metody SBF-SEM i FIB-SEM wykonują zarówno sekcje, jak i obrazowanie w tym samym instrumencie w sposób w pełni zautomatyzowany. Istnieje jeden rodzaj automatyzacji sekcji: ATUMtome¹² może generować i zbierać tysiące sekcji, ale użycie taśmy kaptonowej jako podłoża sprawia, że takie tablice są trudne do zobrazowania w FLM. Na stosowanych tutaj szkiełkach nakrywkowych z powłoką ITO powinno być możliwe nawet obrazowanie w super rozdzielczości. Kolejnym, bardzo pożądanym celem automatyzacji byłoby rejestrowanie stosów danych FLM. Z drugiej strony, automatyzacja może być kosztowna i z wyjątkiem uchwytu na podłoże, przedstawiony tutaj przepływ pracy opiera się (pod względem sprzętu) tylko na oprzyrządowaniu zwykle dostępnym w rutynowym laboratorium EM lub głównym obiekcie, co sprawia, że dostęp do niego jest niski.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Oprzyrządowanie
Ultramicrotome	RMC	PT-PC	Alternatywa: Leica UC7
Uchwyt podłoża	RMC	ASH-100	Alternatywa: domowy
odkurzacz plazmowy	Diener	Zepto 40kHz	Alternatywy: Ted Pella Pelco lub inny stacjonarny odkurzacz plazmowy Przykładowe parametry dla Diener Zepto z generatorem 40kHz (0-100W); 0,5 mbar, 5 sccm (powietrze), 10% wydajności
Szerokokątny mikroskop fluorescencyjny	Zeiss	Axio Observer.Z1	Alternatywy: Leica, Nikon, Olympus
Zestaw filtrów fluorescencyjnych	Zeiss	43 HE (Cy3/DsRed)
Soczewka obiektywowa	Zeiss	Zeiss Neofluar 40x	0.75 NA
Przyzwoita stacja robocza zdolna do obsługi danych
FESEM	Zeiss	Ultra 55	Alternatywy: FEI, Jeol, Hitachi, TESCAN
strong>Nazwa	Company	Numer katalogowy	Komentarze
Sectioning
Żyletki	Plano	T585-V
Nóż diamentowy do przycinania 45°	Diatome	DTB45
Nóż diamentowy do przycinania 90°	Diatome	DTB90
Nóż diamentowy Jumbo do cięcia	Diatome	DUJ3530
Wafel silikonowy (kawałki)	Si-Mat	Custom Made	Doping: P / Bor, orientacja: < 100>, grubość: 525 ± 25 &mikro; m, rezystywność: 1-30 Ω-cm http://si-mat.com/silicon-wafers.html
Szkiełka nakrywkowe z powłoką ITO	Balzers	Typ Z	22 &krotnie; 22 &razy; 0,17 mm https://www.opticsbalzers.com/de/produkte/deckglas-fenster/corrslide.html
Nośnik aluminiowy	Custom Made		76 & razy; 26 mm
Kleszczyki waflowe	Ideal-tek	34A.SA
Kciaki kleszcze	Dumont	0103-2E1/2-PO-1	Dumoxel-H 2E 1/2
Rysik diamentowy	Plano	T5448
Rzęsy/bardzo miękka sierść kota	Własna		alternatywa:
Plano Brush	Selfmade
Klej kontaktowy	Pattex Pattex	PCL3C	Kraftkleber Classic (żółtawy)
Fixogum	Marabu	290110001	do mocowania podłoża do nośnika
Taśma klejąca	3M	851	do mocowania podłoża do nośnika
Izopropanol	Bernd Kraft	07029.4000
Xylene	Carl Roth	4436	rozcieńczalnik do mieszanki klejowej
Rotihistol	Carl Roth	6640	alternatywa, rozcieńczalnik na bazie limonenu
Imię i nazwisko	Company	Numer katalogowy	Komentarze
Software
Przetwarzanie obrazu	Open source	Fidżi (http://fiji.sc/#download)
Akwizycja obrazu	Zeiss	Atlas 5 AT (moduł dla Zeiss SEM)	Alternatywa dla automatycznego pozyskiwania obrazów: WaferMapper: https://software.rc.fas.harvard.edu/lichtman/LGN/WaferMapper.html
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
>Staining
Propidiumjodek	Sigma-Aldrich	P4170	Roztwór podstawowy: 1,5 mM w 0,1% azydku sodu
Octan uranyoctanu		E22400
Azotan ołowiu(II)	Merck	107398
Cytrynian trisodu Dihydrat	Merck	106448
1M	Bernd Kraft	01030.3000
Szklana szalka	Petriego Duran	23 755 56
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Uwagi
Montaż
Stubs	Plano	G301F
Klocki węglowe	Plano	G3347
Taśma miedziana	Plano	G3397	dwustronny klej, przewodząca
Farba srebrna	Plano	G3692	Acheson Elektrodag 1415M
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Uwagi
Roztwory/mieszaniny
Mieszanina klejowa do bloków			Klej kontaktowy Pattex / ksylen jako rozcieńczalnik, stosunek 1:3, (Alternatywa dla ksylenu: Rotihistol)
Reynolds cytrynian			50 ml: Rozpuść 1,33 g azotanu ołowiu(II) w 10 ml dH2O. Rozpuść 1,76 g dwuwodnego cytrynianu trisodu w 10 ml mieszanki dH2O. oba i dodać 1 M wodorotlenku sodu, aż roztwór będzie klarowny. Napełnić dH2O do 50 ml.
		barwiący jodku propidyny	Przygotować rozcieńczenie 1:1500 z zapasu w wirze dH2O. w celu odpowiedniego wymieszania.
Wodny octan			Rozpuścić 3 % octanu uranylu w dH2O (dokładnie wymieszać).