Artykuł metodologiczny

Multimodalne hierarchiczne obrazowanie odcinków szeregowych w celu znalezienia określonych celów komórkowych w dużych objętościach

12.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57059

⸱

20 marca 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Cryo Electron Microscopy, Centre for Advanced Materials, Universität Heidelberg, 2Heidelberg Karlsruhe Research Partnership (HEiKA), 3Cryo Electron Microscopy, BioQuant, Universitätsklinikum Heidelberg, 4Institute for Automation and Applied Computer Science, Karlsruhe Institute of Technology (KIT), 5Carl Zeiss Microscopy GmbH, 6Electron Microscopy Core Facility, Universität Heidelberg

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół jest ukierunkowany na konkretne komórki w tkance do obrazowania w rozdzielczości nanoskali za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM). Duża liczba seryjnych odcinków materiału biologicznego zatopionego w żywicy jest najpierw obrazowana w mikroskopie świetlnym w celu identyfikacji celu, a następnie w sposób hierarchiczny w SEM.

Streszczenie

Celowanie w konkretne komórki w ultrastrukturalnej rozdzielczości w mieszanej populacji komórek lub tkance można osiągnąć poprzez hierarchiczne obrazowanie za pomocą kombinacji światła i mikroskopii elektronowej. Próbki zatopione w żywicy są dzielone na układy składające się z wstęg o setkach ultracienkich odcinków i osadzane na kawałkach płytki krzemowej lub szkiełkach nakrywkowych pokrytych przewodząco. Matryce są obrazowane w niskiej rozdzielczości za pomocą cyfrowego odbiornika, takiego jak aparat w smartfonie lub mikroskop świetlny (LM) w celu szybkiego przeglądu dużego obszaru, lub mikroskopu fluorescencyjnego o szerokim polu widzenia (mikroskopia światła fluorescencyjnego (FLM)) po znakowaniu fluoroforami. Po barwieniu metalami ciężkimi matryce są obrazowane w skaningowym mikroskopie elektronowym (SEM). Wybór celów jest możliwy z rekonstrukcji 3D wygenerowanych przez FLM lub z rekonstrukcji 3D wykonanych ze stosów obrazów SEM w rozdzielczości pośredniej, jeśli nie są dostępne markery fluorescencyjne. W przypadku analizy ultrastrukturalnej wybrane cele są ostatecznie rejestrowane w SEM w wysokiej rozdzielczości (kilka nanometrów pikseli obrazu). Zademonstrowano narzędzie do obsługi wstęgi, które można zamontować w każdym ultramikrotomie. Pomaga w produkcji tablicy i usuwaniu substratu z noża do sekcji. Omówiono platformę programową, która umożliwia automatyczne obrazowanie macierzy w SEM. W porównaniu z innymi metodami generującymi duże ilości danych EM, takimi jak szeregowy blok SEM (SBF-SEM) lub skupiona wiązka jonów SEM (FIB-SEM), podejście to ma dwie główne zalety: (1) Próbka zanurzona w żywicy jest konserwowana, choć w wersji pokrojonej. Można go barwić na różne sposoby i obrazować w różnych rozdzielczościach. (2) Ponieważ skrawki mogą być barwione po wybarwieniu, nie jest konieczne stosowanie próbek silnie barwionych blokami metali ciężkich w celu wprowadzenia kontrastu do obrazowania SEM lub nadania blokom tkanki przewodzenia. To sprawia, że metoda ta ma zastosowanie do szerokiej gamy materiałów i zagadnień biologicznych. Materiały z prefiksami, np. z banków biopsji i laboratoriów patologicznych, mogą być bezpośrednio osadzane i rekonstruowane w 3D.

Wprowadzenie

Do rekonstrukcji dużych objętości tkanek w ultrastrukturalnej rozdzielczości użyto wielu różnych podejść do obrazowania opartych na SEM1: Dostępne są kompleksowe recenzje, np. dla SBF-SEM2, FIB-SEM3, oraz Array Tomography (AT)4. Podczas gdy w przypadku tej drugiej metody materiał próbki jest zachowywany jako tablica szeregowych przekrojów na podłożu, SBF-SEM i FIB-SEM są metodami destrukcyjnymi, działającymi na bloku próbki i zużywającymi go podczas obrazowania. Ze względu na ładunek żywicy w SEM, są one również zależne od silnie metalizowanych bloków próbki5.

Z drugiej strony, identyfikacja pewnych komórek lub struktur będących przedmiotem zainteresowania w próbce tkanki może przynieść korzyści szczególnie dzięki korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej (CLEM)6,7,8. Użycie FLM do celowania wyklucza zastosowanie dużych ilości metali ciężkich, ponieważ spowodowałoby to wygaszenie sygnału fluorescencji9. W przypadku takich tylko nieznacznie zmetalizowanych próbek, AT jest metodą z wyboru, ponieważ matryce mogą być łatwo wybarwione metalem ciężkim po obrazowaniu LM. Co więcej, prawie każdy rodzaj próbki może być użyty do AT, nawet rutynowe próbki ze skrzyni skarbów patologa10.

Kolejną dużą zaletą AT jest potencjał do hierarchicznego11 lub obrazowania wielorozdzielczego12: Nie jest konieczne obrazowanie wszystkiego w wysokiej rozdzielczości, ponieważ cele mogą być wybrane w innym trybie (np. FLM) lub na obrazach SEM o niskiej rozdzielczości. Obrazowanie tylko interesujących obszarów populacji tkanek lub komórek w wysokiej rozdzielczości oszczędza miejsce do przechowywania danych cyfrowych i tworzy mniejsze zestawy danych obrazowych, które są łatwiejsze w obsłudze. W tym przypadku przepływ pracy AT jest demonstrowany przy użyciu dość słabo zmetalizowanej próbki: zamrożonych pod wysokim ciśnieniem korzeni roślin (Arabidopsis thaliana) zatopionych w żywicy hydrofilowej.

Jak tablice są przygotowywane, barwione i obrazowane zarówno w FLM, jak i SEM, oraz jak rejestrowane są stosy obrazów. Zilustrowano również, w jaki sposób rekonstrukcja 3D objętości FLM może być wykorzystana do wyboru określonych komórek do obrazowania w SEM w rozdzielczości nanoskali.

Protokół

UWAGA: Bloki próbek powinny być spolimeryzowane i zawierać trochę ciężkiego metalu. Protokoły utrwalania i osadzania dla dwóch próbek pokazanych w Rysunek 1A-B zostały opisane gdzie indziej11. Krótko mówiąc, próbka pokazana w Rysunek 1A została chemicznie utrwalona, wybarwiona en bloc najpierw 1% OsO4, a następnie 1% octanem uranylu i zatopiona w żywicy Spurra. Próbka pokazana w Rysunek 1B została zamrożona pod wysokim ciśnieniem, zamrożona podstawiona 0,4% octanem uranylu w acetonie i zatopiona w żywicy Lowicryl HM20. Do kolejnych etapów przygotowań używaj rękawiczek bezpudrowych.

1. Tworzenie tablic

  1. Przycinanie bloku próbki
    UWAGA: Zawsze dobrze dokręcaj podczas wkładania części.
    1. Włóż blok próbki do uchwytu na próbkę ultramikrotomu, umieść uchwyt w bloku przycinania i wsuń go do dolnego stopnia ultramikrotomu.
    2. Odetnij żywicę wokół osadzonej tkanki za pomocą żyletki, pozostawiając tylko niewielką obwódkę żywicy wokół próbki. Przycinaj od góry, aż do osiągnięcia celu.
      UWAGA: Kształt lica bloku może być trapezowy lub prostokątny (z powodzeniem zastosowaliśmy oba kształty). Ważne jest, aby użyć dłuższych boków prostokąta jako krawędzi natarcia i spływu, aby zapewnić, że duży obszar jest pokryty mieszanką kleju stabilizującą wstążki.
    3. Włóż uchwyt na próbkę do ramienia ultramikrotomu i zastąp blok przycinania w dolnym stopniu uchwytem noża. Włóż diamentowy nóż do przycinania (zwykle 45°) do uchwytu noża. Wyrównaj powierzchnię bloku dokładnie równolegle do krawędzi noża przycinającego.
      UWAGA: Aby uzyskać dokładnie równoległe krawędzie natarcia (dolne) i spływające (górne), obróć lub przesuń tylko nóż, aby przyciąć przeciwne strony. W przypadku dużych objętości (ponad kilkaset sekcji) korzystny jest nóż do przycinania pod kątem 90°.
    4. Wygładź wszystkie cztery strony, a następnie obróć uchwyt próbki tak, aby krawędź natarcia i spływu znalazły się teraz w pozycji poziomej.
    5. Ostrożnie pokryj przednią i tylną stronę bloku mieszanką kleju. Użyj maleńkiej szczoteczki utworzonej z kilku włosków przymocowanych do wykałaczki13. Wykonaj ten krok szybko, ponieważ rozpuszczalnik tej mieszaniny odparowuje w ciągu kilku sekund. Nie zanieczyszczaj powierzchni bloku tą mieszaniną. Pozostawić powlekany blok próbki do wyschnięcia przez 5-10 minut
      UWAGA: W przypadku większej liczby sekcji (>200) lepszym rozwiązaniem może być pokrycie tylko krawędzi natarcia, ponieważ z czasem na krawędzi spływu może nagromadzić się wybrzuszenie kleju i potencjalnie przeciągnąć sekcje nad krawędź noża.
  2. Przygotowanie podłoża
    1. Wytnij kawałki wafli silikonowych do rozmiaru, który zmieści się w łodzi z nożem (około 2 x 2,5cm2 w przypadku noża Jumbo). W razie potrzeby oznacz kawałki wafla (cyfry lub litery) rysikiem diamentowym przed czyszczeniem lub markerem permanentnym po czyszczeniu. Wyczyść płytkę silikonową ręcznie za pomocą izopropanolu i niestrzępiącej się chusteczki.
      UWAGA: Do obrazowania korelacyjnego należy używać szkiełek nakrywkowych pokrytych tlenkiem indu i cyny (ITO). Należy obchodzić się z nimi bardzo ostrożnie, a dodatkowe czyszczenie nie jest konieczne.
    2. Przymocuj podłoże do jednego końca płyty nośnej za pomocą usuwalnego kleju.
      UWAGA: Alternatywnie krawędzie podłoża można przypiąć równolegle do krawędzi noża za pomocą dwóch pasków taśmy klejącej.
    3. Plazma aktywuje (wyładowanie jarzeniowe) podłoże powietrzem, aby uzyskać hydrofilową powierzchnię. Należy to zrobić w taki sposób, aby kropla wody umieszczona na podłożu rozchodziła się na bardzo cienką warstwę (niski kąt zwilżania, Rysunek 2C, D). Parametry hydrofilizacji zależą od zastosowanego urządzenia plazmowego; Aby zapoznać się z używanymi tutaj parametrami, patrz Tabela materiałów.
      UWAGA: Aktywacja plazmą jest bardzo niestabilna, więc należy ją wykonać bezpośrednio przed użyciem substratu.
    4. Włóż nośnik do zacisku uchwytu podłoża, tak aby zamontowane podłoże znajdowało się bliżej krawędzi noża, aby uzyskać optymalne zwilżenie podłoża w łodzi z nożem.
      UWAGA: Szczegółowy opis uchwytu podłoża, w tym rysunki projektowania wspomaganego komputerowo (CAD), znajduje się w Wacker i wsp. 11
  3. Przygotowanie do cięcia
    1. Włóż nóż diamentowy Jumbo do uchwytu noża, ustaw kąt przyłożenia (0° dla noża Jumbo) i napełnij łódkę noża wodą destylowaną. Zbliżyć nóż na odległość 1–2 mm od próbki.
    2. Opuść podłoże do wody za pomocą 1–3 (Rysunek 2A) uchwytu podłoża. Sprawdź, czy linia wodna znajduje się w górnej jednej trzeciej podłoża.
      UWAGA: Sprawdź, czy klej między podłożem a płytą nośną jest dobrze utwardzony, popychając podłoże czystymi kleszkami. Nie powinien się ruszać.
    3. Ponieważ podczas korzystania z płytki krzemowej trudno jest dostrzec prześwit, obniż podłoże, aż poczujesz, że dotyka podłogi. Teraz podnieś podłoże o niewielką ilość. Upewnij się, że ani podłoże, ani nośnik nie dotykają łodzi noża podczas cięcia.
    4. Użyj strzykawki lub pipety, aby wyregulować poziom wody w łodzi. Obserwując przez lornetkę, dodawaj lub usuwaj wodę, aż cały obszar powierzchni wody pokaże jednorodne odbicie górnego oświetlenia świetlnego ultramikrotomu.
    5. Włącz dolne światło ultramikrotomu. Upewnij się, że ramię znajduje się w pozycji środkowej i nie jest w pozycji chowanej za pomocą pokrętła ultramikrotomu. Zbliżyć nóż do próbki, aż odbicie krawędzi noża będzie widoczne na powierzchni bloku.
    6. Użyj opcji regulacji ultramikrotomu, aby wyrównać próbkę do noża. Najpierw obróć nóż, a następnie obróć i przechyl próbkę.
      UWAGA: Jest prawidłowo wyrównany, jeśli jasny pasek, który można zobaczyć w szczelinie między próbką a nożem, pokazuje równoległe krawędzie (proste równoległe linie, a nie w kształcie klina).
    7. Sprawdź nachylenie próbki: Upewnij się, że jasny pasek nie staje się grubszy ani cieńszy podczas przesuwania próbki w górę iw dół. W razie potrzeby użyj regulacji łuku, aby to skorygować. Przesuń nóż bliżej próbki, aż znajdzie się tuż nad powierzchnią bloku (ale jej nie dotyka
      8. ).
    8. Ustaw grubość przekroju (posuw), prędkość cięcia i okno cięcia w jednostce sterującej.
    9. Rozpocznij dzielenie na sekcje. W razie potrzeby poczekaj, aż zostanie wycięty pierwszy pełny odcinek. Wytnij kilka odcinków, aby upewnić się, że sklejają się ze sobą, tworząc wstążki (w przeciwnym razie klej musi zostać ponownie nałożony). Zacznij od wysokiej wartości posuwu (maksymalnie, 200 nm dla noża Ultra), aż do cięcia pierwszej pełnej sekcji. Następnie ustaw żądaną wartość kanału. Aby zapewnić odpowiednią stabilność taśmy, dobrym punktem wyjścia jest grubość przekroju 100 nm i prędkość cięcia 1 mm/s. Najniższa osiągalna grubość przekroju wynosi około 60 nm, w zależności od jakości próbki.
    10. Przestań dzielić na sekcje. Usuń wszystkie niepotrzebne (częściowo przycięte) sekcje z krawędzi noża i łodzi za pomocą rzęsy/sierści kota. Jeśli wokół unosi się dużo małych zanieczyszczeń, całkowicie usuń wodę za pomocą pipety i napełnij łódź świeżą wodą. Teraz proces jest gotowy na pierwszą produktywną wstążkę.
  4. Cięcia
    1. Rozpocznij dzielenie na sekcje. Po wycięciu pewnej liczby sekcji (rzeczywista liczba zależy od wielkości sekcji i podłoża) przerwij proces cięcia i zwolnij wstążkę z krawędzi noża, delikatnie głaszcząc krawędź noża rzęsą14 lub jeszcze lepiej, bardzo miękkim włosem z sierści kota.
    2. Manipuluj (pchaj/ciągnij) wstążką z rzęsą w kierunku podłoża i przymocuj pierwszą sekcję do podłoża.
      UWAGA: Konieczne jest delikatne dociśnięcie taśmy, aż przyklei się do suchej części podłoża.
    3. Kontynuuj cięcie i mocowanie wstążek do podłoża. Zacznij od jednej strony i stopniowo przechodź na drugą z każdą nową wstążką.
      UWAGA: Unikaj masywnych ruchów wody, aby uniknąć poluzowania już przymocowanych wstążek. To samo dotyczy prądów powietrza. Stosować osłonę oddechową dołączoną do ultramikrotomu. W niesprzyjających warunkach środowiskowych zalecana jest obudowa dla ultramikrotomu15.
    4. Gdy podłoże jest całkowicie pokryte wstążkami (zwykle możliwe jest 4–5 wstążek), delikatnie wyjmij podłoże z łodzi nożowej za pomocą mikromanipulatora uchwytu podłoża.
      UWAGA: Odpowiednie ruchy to: podnoszenie w pionie (śruba 1) i obracanie/uchylanie (śruba 3) lub kombinacja obu.
    5. Pozostaw matrycę taśmy do wyschnięcia przed przechowywaniem jej w środowisku wolnym od kurzu. Po wyschnięciu należy jak najszybciej usunąć podłoże mocowane klejem z nośnika (tego samego dnia, w przeciwnym razie podłoże może być zbyt trudne do usunięcia lub nawet pęknąć podczas demontażu).

2. Barwienie do obrazowania LM

UWAGA: Możliwe są różne metody barwienia/znakowania, w tym protokoły immunofluorescencji. Tutaj wybiera się bezpośrednią, raczej niespecyficzną plamę, aby obrysować ściany komórkowe.

  1. Barwienie jodkiem propidyny
    1. Przykryj dno dużej szklanej szalki Petriego (o średnicy 30 cm) parafilmem i wyłóż krawędź naczynia mokrą chusteczką, aby zbudować wilgotną komorę.
    2. Użyć około 300-500 μl roztworu na szkiełko nakrywkowe. Umieść jedną kroplę na każde szkiełko nakrywkowe na parafilmie i połóż szklankę do góry nogami na kropli, tak aby sekcje stykały się z płynem barwiącym. Przykryj naczynie i owiń je folią aluminiową, aby chronić próbki przed światłem. Inkubować próbki przez 16 godzin w temperaturze 4 °C.
    3. Usuń szkiełko nakrywkowe za pomocą kleszczy i umyj je, przesuwając je w górę i w dół w zlewce o pojemności 100 ml wypełnionej 80 ml wody destylowanej. Powtórz ten krok w innej zlewce ze świeżą wodą. Ostrożnie osusz szkiełko nakrywkowe sprężonym powietrzem.

3. Nagrywanie stosu obrazów w FLM

  1. Umieść szkiełko nakrywkowe na stoliku popularnego FLM o szerokim polu.
  2. Wybierz odpowiedni zestaw filtrów (Tabela materiałów) dla obserwowanej fluorescencji.
  3. Za pomocą odpowiedniej soczewki obiektywowej zrób zdjęcie obiektu w każdej sekcji: staraj się wypełnić pole widzenia i utrzymuj stałą orientację. Do końcówki korzeniowej użyto obiektywu pneumatycznego 40X.
    UWAGA: Jeśli wstążki nie są idealnie proste, obrotowy stolik może pomóc w zmianie orientacji sekcji podczas robienia zdjęć. Jeśli to możliwe, wyśrodkuj obraz na określonym elemencie lub utrzymuj element, taki jak krawędź sekcji, w równej odległości od krawędzi zarejestrowanego obrazu.
  4. Jeśli to możliwe, użyj 16 bitów, aby ograniczyć nasycone piksele i utrzymać stały czas ekspozycji.

4. Rejestracja stosu obrazów FLM

  1. Zaimportuj serię obrazów do Fiji16 jako wirtualny stos.
  2. Otwórz nowy TrakEM17 (pusty) z menu plików.
  3. Kliknij prawym przyciskiem myszy pole obrazu i zaimportuj stos do TrakEM jako "Jeden plasterek na warstwę".
  4. Wyrównaj warstwy (kliknij prawym przyciskiem myszy w polu obrazu), ustaw zakres (od pierwszego obrazu do ostatniego) i wybierz brak jako odniesienie. Dla wszystkich ustawień należy użyć wartości domyślnych i wybrać opcję sztywny jako żądaną transformację.
  5. Gdy rejestracja zostanie zakończona i zadowalająca, zapisz wyrównany zestaw danych, klikając prawym przyciskiem myszy i wybierając opcję eksportuj. Utwórz płaski obraz, ustaw zakres od pierwszego do ostatniego obrazu i pozwól oprogramowaniu wyświetlić wynikowy stos. Zapisz stos w formacie tif.

5. Barwienie i montaż do obrazowania SEM

UWAGA: Aby przygotować roztwory do barwienia, zobacz Tabelę materiałów. Roztwory mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez okres do 12 miesięcy, chroniąc je przed światłem i powietrzem.

Uwaga: Cytrynian ołowiu i octan uranylu zawierają metale ciężkie, które są toksyczne. Nosić rękawice i utylizować odpady zgodnie z instrukcjami władz lokalnych.

  1. Przykryj dno dużej szklanej szalki Petriego (o średnicy 30 cm) parafilmem i wyłóż krawędź naczynia mokrą chusteczką, aby zbudować wilgotną komorę.
    UWAGA: Ważne jest, aby kilka granulek NaOH było umieszczonych na szalce Petriego w pobliżu kropli barwiących, aby zapobiec nadmiernemu wytrącaniu się cytrynianu ołowiu.
  2. Barwienie octanem uranylu
    1. Odwirować roztwór octanu uranylu o stężeniu 2,680 x g przez kilka sekund w celu osadzenia małych cząstek.
    2. Użyć około 300–500 μl roztworu na szkiełko nakrywkowe. Umieść jedną kroplę na każde szkiełko nakrywkowe na parafilmie i połóż szklankę do góry nogami na kropli, tak aby sekcje stykały się z płynem barwiącym.
    3. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej i przykryć naczynie podczas barwienia.
    4. Usunąć szkiełko nakrywkowe za pomocą kleszczy i umyć, przesuwając je w górę i w dół w zlewce wypełnionej wodą destylowaną (patrz krok 2.1.3).
  3. Barwienie cytrynianem ołowiu
    1. Podczas inkubacji octanu uranylu przygotować roztwór cytrynianu ołowiu.
      UWAGA: Cytrynian ołowiu należy zawsze filtrować bezpośrednio przed użyciem w celu usunięcia wszelkich osadów. Odwirować również roztwór cytrynianu ołowiu o stężeniu 2,680 x g przez kilka sekund, jak w kroku 5.2.1.
    2. Użyć około 300–500 μl roztworu na szkiełko nakrywkowe. Umieścić jedną kroplę na każde szkiełko nakrywkowe na parafilmie bezpośrednio przed umyciem szkiełek nakrywkowych po barwieniu octanem uranylu i położyć szklankę do góry nogami na kropli, tak aby skrawki stykały się z płynem barwiącym. Umieścić krople (300–500 μl) na parafilmie bezpośrednio przed umyciem szkiełek nakrywkowych po barwieniu octanem uranylu.
      UWAGA: Aby uniknąć tworzenia się osadów, nie wdychać kropelek cytrynianu ołowiu.
    3. Umyte szkiełko nakrywkowe połóż do góry nogami na kropli (nie ma potrzeby jej suszenia).
    4. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej i przykryć naczynie podczas barwienia.
    5. Usunąć szkiełko nakrywkowe za pomocą kleszczy i umyć je w sposób opisany powyżej w zlewce ze świeżą wodą (krok 5.2.4).
  4. Ostrożnie osusz szkiełko nakrywkowe sprężonym powietrzem.
  5. Montaż próbek do obrazowania SEM
    1. Zamontuj wafle krzemowe na aluminiowych króćcach za pomocą lepkiej podkładki węglowej.
      UWAGA: Szkiełka nakrywkowe z powłoką IT można montować za pomocą srebrnej farby i taśmy Cu — upewnij się, że powierzchnia przewodząca jest połączona z króćcem — lub za pomocą podkładek węglowych, jak powyżej. W takim przypadku przewodzące połączenie od powierzchni ITO do kkońcówki można wykonać za pomocą kropli srebrnej farby.

6. Obrazowanie hierarchiczne w SEM

UWAGA: W SEM emisji pola wybierz niską energię pierwotną (3 kV lub niższą), prąd wiązki w zakresie od 50 do 800 pA, aby uniknąć ładowania, oraz odpowiednią odległość roboczą dla efektywnego zbierania elektronów wtórnych i/lub wstecznie rozproszonych. Dobór prądu wiązki zależy od właściwości próbki (np. zatapianie żywicy); Dawka elektronów będzie również kompromisem pomiędzy małym prądem (mniej szkodliwym dla próbki) a wysokim prądem, co korzystnie wpływa na szybkość obrazowania, a tym samym skraca całkowity czas akwizycji obrazu. Dedykowane detektory elektronów rozpraszanych wstecznie zapewniają dobry kontrast, są mniej wrażliwe na ładowanie próbki i pokazują mniej artefaktów na powierzchni próbki (fałdy, ślady noża). Kontrast i jasność należy dostosować tak, aby histogram był wyśrodkowany.

  1. Obrazowanie SEM
    1. Najpierw zdefiniuj cztery rogi tablicy, chwytając obraz każdego rogu w małym powiększeniu, około 100x. Utwórz obszar zainteresowania (ROI) otaczający całą tablicę. Przypisz protokół obrazowania z następującymi parametrami: Użyj detektora elektronów wtórnych (SE), który pozwala na szybkie obrazowanie przy dużym rozmiarze piksela obrazu (na przykład 1,000 nm) i krótkim czasie przebywania (np. 0,2 μs).
      UWAGA: Aby przezwyciężyć ograniczenia optyczne elektronów przy dużym polu widzenia skanowania (FOV), które mogą powodować zniekształcenia na obrzeżach obrazów, należy użyć dedykowanych trybów małego powiększenia (dostarczanych przez większość producentów SEM) lub użyć średnich, 1 do 2 tys. pól skanowania dla pojedynczych obrazów.
    2. Wygeneruj zestaw sekcji, tworząc ROI przedstawiający tylko tkankę w pierwszej sekcji. Sklonuj go do wszystkich kolejnych sekcji za pomocą narzędzia stempla. W razie potrzeby obróć ROI, aby pomieścić wygięte taśmy.
    3. Nagraj serię obrazów przy użyciu pośredniego rozmiaru piksela (około 50 nm) i czasu przebywania wystarczająco długiego, aby zidentyfikować i rozpoznać strukturę docelową. Użyj pola widzenia dla pojedynczych obrazów w zakresie 6-10 tys. pikseli.
      UWAGA: Oprogramowanie Atlas 5 może automatycznie zbierać mozaiki złożone z sąsiednich obrazów, aby pokryć duże obszary ROI/sekcji w sekcjach szeregowych.
    4. Utwórz zestaw witryn w tym zestawie sekcji, zawierający strukturę docelową dla obrazowania SEM o wyższej rozdzielczości. Spraw, aby zwrot z inwestycji był wystarczająco duży, aby uwzględnić precyzję etapu. Sprawdź i dostosuj pozycje witryn.
      UWAGA: Ważne jest, aby umieścić ROI w taki sposób, aby środek, w którym będzie wykonywany autofokus i autostygmatyzacja, nie znajdował się na "pustym" materiale bez szczegółów strukturalnych, np. wakuoli.
    5. Zdefiniuj ustawienia autofokusa i sprawdź wydajność co najmniej na długości wstęgi (tj. najdłuższej odległości, jaką musi pokonać stolik) przy niewielkim zwrocie z inwestycji w pobliżu miejsca, które zostanie zobrazowane.
    6. Zdefiniuj protokół obrazowania dla akwizycji SEM o wysokiej rozdzielczości. Aby zobaczyć przedziały membranowe, wybierz rozmiar piksela obrazu 3–5 nm. Wybierz czas przebywania w zależności od detektora, aby obraz nie był zbyt zaszumiony.
    7. Przed rozpoczęciem akwizycji zdefiniuj wartości fokusu w co najmniej pierwszej sekcji każdej wstążki przy użyciu opcji sprawdź protokół.
    8. Rozpocznij automatyczne obrazowanie SEM w całej serii docelowych zwrotów z inwestycji.
    9. Eksportuj pozyskane dane jako serie obrazów, najlepiej w formacie tif.

7. Rejestracja stosu obrazów SEM

  1. Importuj serie obrazów na Fidżi jako wirtualny stos.
    UWAGA: Będą to duże pliki danych w zakresie kilku GB w zależności od liczby sekcji i wielkości ROI.
  2. Przytnij stos obrazów SEM w celu dalszego przetwarzania do obszaru jak najbardziej zbliżonego do interesującej Cię struktury, a następnie dostosuj jasność i kontrast.
  3. Otwórz nowy TrakEM17 (pusty) z menu plików.
  4. Kliknij prawym przyciskiem myszy pole obrazu i zaimportuj stos do TrakEM jako "Jeden plasterek na warstwę".
  5. Wyrównaj warstwy (kliknij prawym przyciskiem myszy w polu obrazu), wybierz tryb najmniejszych kwadratów, ustaw zakres (od pierwszego obrazu do ostatniego) i wybierz brak jako odniesienie. W ustawieniach użyj wartości domyślnych i wybierz sztywny jako żądaną transformację.
  6. Gdy rejestracja zostanie zakończona i zakończona i zadowalająca, zapisz wyrównany zestaw danych, klikając prawym przyciskiem myszy i wybierając opcję eksportuj. Utwórz płaski obraz, ustaw zakres od pierwszego do ostatniego obrazu i pozwól oprogramowaniu wyświetlić wynikowy stos. Zapisz stos w formacie tif.

Wyniki

Opisany tutaj schemat postępowania (Rycina 1) rozpoczyna się od próbki zatopionej w bloku żywicy. Podczas przygotowania próbki do tkanki należy wprowadzić pewną ilość metali ciężkich, jednak nie jest konieczne stosowanie protokołów zoptymalizowanych pod kątem silnej metalizacji. Rycina 1A przedstawia korzeń rośliny (rzeżuchy) barwiony konwencjonalnie w bloku przy użyciu 1% OsO4 i 1% octanu uranylu, podczas gdy korzeń Arabidopsis na Rycynie 1B jest jedynie słabo zmetalizowany przy użyciu 0,5% octanu uranylu. Ten drugi typ próbki jest najlepiej dostosowany do podejść korelacyjnych, ponieważ niektóre metale ciężkie mają tendencję do gaszenia fluorescencji. Przy użyciu dedykowanego uchwytu do podłoży (Rycina 2) można przygotować serie składające się z kilkuset przekrojów (Rycina 1C). Po znakowaniu fluorescencyjnym takie serie są obrazowane w standardowym szerokopolowym mikroskopie fluorescencyjnym (FLM) (Rycina 1D), a następnie barwione roztworami metali ciężkich i obrazowane w SEM przy różnych rozdzielczościach (Rycina 1E-G).

Ważnymi narzędziami do odtwarzalnego tworzenia preparatów, szczególnie podczas przenoszenia kilku taśm z rynienki noża mikrotomu na podłoże, są uchwyt do podłoża (Rycina 2A, zaprojektowany na zamówienie w laboratorium autorów) oraz diamentowy nóż Jumbo z rynienką wystarczająco dużą, aby pomieścić szkiełka mikroskopowe (Rycina 2B). Niezbędny jest płaski menisk, umożliwiający dobrą obserwację taśm, co można osiągnąć poprzez czyszczenie podłoża plazmą: mała kropla wody destylowanej nie powinna tworzyć struktury soczewkowej na podłożu, jak pokazano na Rycina 2C (podłoże nieobrobione), lecz cienki film (Rycina 2D, podłoże aktywowane plazmą). W tych warunkach taśmy przymocowane do suchej części szkiełka nakrywkowe powlekanego ITO są łatwo widoczne (Rycina 2E) i mogą być obserwowane oraz kontrolowane podczas wyjmowania podłoża z wody.

Przykładowo, macierze barwione jodeczkiem propidyny w celu oznakowania ścian komórkowych roślin obrazowano za pomocą standardowego szerokopolowego mikroskopu fluorescencyjnego FLM (Rysunek 3A). Ponieważ przekroje mają grubość zaledwie 100 nm, nawet nadmierne barwienie, jak pokazano tutaj, powoduje niewielkie rozmycie. Po rejestracji, ze stosu obrazów wybrano dwie komórki całkowicie zamknięte w zrekonstruowanej objętości (Rysunek 3B) do obrazowania 3D o wysokiej rozdzielczości (patrz również Film uzupełniający S1). Po dodatkowym barwieniu octanem uranylu i cytrynianem ołowiu, macierze obrazowano w SEM. Rysunek 3C przedstawia widok ogólny, zarejestrowany z rozdzielczością piksela 60 nm; ciemny kwadrat w centrum obrazu wskazuje miejsce, w którym wykonano funkcje autofokusu, a dodatkowa dawka doprowadziła do niewielkiego zanieczyszczenia. Odpowiednie obszary ROI w tych przekrojach seryjnych (plastry od 51 do 248 z łącznie 435 plastrów) zawierające dwie komórki docelowe wybrane w stosie FLM, zarejestrowano następnie z rozdzielczością piksela 5 nm (Rysunek 3D; patrz również Film uzupełniający S2).

Zautomatyzowane obrazowanie hierarchiczne matryc w SEM opisane w niniejszym protokole zostało przeprowadzone przy użyciu platformy sprzętowo-programowej ZEISS Atlas 5. Najpierw, przy użyciu detektora SE, stworzono obraz ogólny całej matrycy z bardzo dużymi pikselami obrazu (1 000 nm) i bardzo krótkim czasem przebywania wiązki (Rycina 4A). Na pierwszej sekcji wyznaczono obszar zainteresowania (ROI) obejmujący wyłącznie tkankę, a następnie przeniesiono go na wszystkie pozostałe sekcje matrycy. Zestaw sekcji ten został następnie zarejestrowany z pikselami obrazu o wielkości 60 nm przy dłuższym czasie przebywania wiązki (Rycina 4B). Na koniec skonfigurowano zestaw punktów, zawierający dwie komórki docelowe oraz jedną „warstwę” komórek otaczających, aby zrekompensować niedokładność pozycjonowania stolika, stosując następujące parametry: detektor ESB (Energy Selective Backscatter), piksele obrazu 5 nm oraz bardzo długi czas przebywania wiązki (40 µs) (Rycina 4C). Powiększenie takiego obrazu ukazuje szczegóły subkomórkowe (Rycina 4D), takie jak wakuole (V), mitochondria (M), jądro komórkowe (N) i retikulum endoplazmatyczne (strzałki). Patrz również Supplemental Movie S3, aby zobaczyć przejście od obrazu ogólnego całej matrycy do szczegółów subkomórkowych jednej komórki docelowej.

Przedstawiony tutaj zestaw (200 przekrojów) oraz dodatkowy zestaw 250 przekrojów zajęły około 8 h w produkcji, jedną noc na barwienie do LM i jeden dzień na (ręczne) rejestrowanie w FLM. Barwienie potranskrypcyjne zajmuje łącznie około 1-2 h, w zależności od liczby poszczególnych zestawów. W przypadku rejestracji SEM, kilka godzin jest wymaganych na konfigurację pracy Atlasa, a zautomatyzowana rejestracja trwała 3–4 h dla zestawu przekrojów o średniej rozdzielczości (rozmiar piksela 60 nm) (200 przekrojów, 450 x 200 µm2) i około 5 dni dla ROI o wysokiej rozdzielczości (rozmiar piksela 5 nm) zawierającego dwie komórki docelowe (200 przekrojów, 55 x 30 µm2). Należy zauważyć, że ze względu na niską zawartość metalu w prezentowanej tutaj próbce, konieczne było zastosowanie bardzo niskiej prędkości skanowania, aby uzyskać dobry stosunek sygnału do szumu, co (dla obecnie dostępnego detektora) oznaczało czas przebywania (dwell time) wynoszący 40 µs dla ROI o wysokiej rozdzielczości.

W całym procesie istnieje kilka etapów podatnych na błędy: idealnie wstążki powinny być mniej więcej proste i ułożone w odpowiedniej kolejności (Rysunek 5A). Często jednak powstają wstążki zagięte (Rysunek 5B), zakrzywione (Rysunek 5D) lub nawet przerwane. Może to być wynikiem nieprawidłowego przycinania (krawędzie prowadząca i końcowa nie są dokładnie równoległe) lub nierównomiernego nałożenia kleju, ale także asymetrycznej lub nierównomiernie zinfiltrowanej próbki. Szczególnie problematyczne są próbki zawierające zarówno komponenty miękkie, jak i bardzo twarde. Te ostatnie mogą być trudne do infiltracji, czego przykładem jest ściana komórkowa korzeni roślin pokazana tutaj (Rysunek 5C). W takim przypadku fałdy (groty strzałek) mogą łatwo powstać w wyniku zmiennej kompresji i relaksacji podczas sekcjonowania. W przypadku automatycznego obrazowania w SEM zakrzywione wstążki nie stanowią dużego problemu, ponieważ obszary zainteresowania (ROI) można obrócić, aby dostosować je do krzywizny wstążki.

Kolejnym krytycznym krokiem w protokole jest barwienie: niewystarczające przemywanie może prowadzić do powstania osadów na przekroju (Rysunek 5E, F), a w najgorszym przypadku do zakrycia obszaru najciekawszego (okrąg na jednej z dwóch komórek docelowych na Rysunku 5F). Ponadto kurz (Rysunek 5D, cząstki silnie rozpraszające światło) wprowadzony do łódki nożowej, np. poprzez zanieczyszczony nośnik podłoża, może powodować poważne problemy: w FLM kurz może wykazywać tak silną fluorescencję (por. niektóre przekroje w Supplemental Movie S1), że niektóre algorytmy rejestracji mogą nie działać. Funkcja „align” w programie TrakEM17 potrafi jednak obsłużyć takie stosy obrazów, co zademonstrowano w Supplemental Movie S1.

Przygotowanie próbki do SEM: zatapianie w żywicy, sekcjonowanie, mikroskopia świetlna, sekwencja obrazowania SEM.
Rycina 1: Schemat korelacyjnego obrazowania hierarchicznego. Wychodząc z próbki zatopionej w bloku żywicy (A, próbka silnie metalizowana), próbka jest najpierw przycinana (B, próbka słabo metalizowana), a następnie za pomocą ultramikrotomu przygotowuje się zestawy składające się z kilku wstęg serii przekrojów (C), tutaj umieszczone na szkiełku nakrywkowym powlekanym ITO. Po barwieniu barwnikiem fluorescencyjnym, stosy obrazów są rejestrowane w szerokopolowym mikroskopie fluorescencyjnym FLM (D). Po kolejnych rundach barwienia solami ciężkich metali, stosy są obrazowane w SEM (E-G) przy różnych rozdzielczościach (rozmiarach pikseli obrazu). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Układ procesu mikrotomii, ostrze do okrzemków, sekcjonowanie; analiza obrazu w mikroskopii optycznej.
Rysunek 2: Narzędzia do przygotowania macierzy. Uchwyt podłoża złożony z mikromanipulatorów z siedmioma osiami ruchu przymocowany do standardowego ultramikrotomu (A): śruby, zaznaczone okręgami, służą do ruchu pionowego (1) i poziomego (2) oraz do pochylania (3) nośnika podłoża. Duży nóż diamentowy z powiększoną łodzią w celu pomieszczenia dużych podłoży (strzałka), tutaj z kawałkiem aktywowanego plazmowo wafla krzemowego zamontowanym na aluminiowym nośniku o rozmiarze szkiełka przedmiotowego (B). Krople 20 µL wody destylowanej umieszczone na nieobrobionym podłożu z wafla krzemowego (C) lub na podłożu aktywowanym plazmowo (D). Cztery wstążki pływające w łodzi noża, przymocowane dolnymi końcami do szkiełka zakryjącego powleczonego ITO. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Obrazy z mikroskopii struktury komórek korzenia; mikrografie fluorescencyjne i elektronowe w różnych skalach.
Rycina 3: Korelacja danych z mikroskopii świetlnej (LM) z danymi z mikroskopii elektronowej skaningowej (SEM). Przeglądy (A, C) oraz komórki docelowe (B, D) zarejestrowane za pomocą FLM (A, B) i SEM (C, D). Obraz (B) stanowi powiększenie programowe; oryginalne dane zarejestrowano przy użyciu obiektywu 40X na matrycy kamery o rozdzielczości 1,388 x 1,040 pikseli, podczas gdy obraz (C) zarejestrowano przy wielkości piksela obrazu 60 nm, a obraz (D) przy 5 nm, co ilustruje rzeczywisty wzrost rozdzielczości w SEM. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza mikroskopowa nanostruktur; schemat przedstawiający poziomy sekcjowania i powiększenia obrazowania.
Rycina 4: Hierarchiczne obrazowanie w SEM z użyciem ZEISS Atlas 5 AT. Przegląd macierzy zapisany z rozdzielczością pikseli 1 000 nm przy użyciu detektora SE (A). Zestawy sekcji z ROI umieszczonym na tkance w każdym przekroju, zapisane z rozdzielczością pikseli 60 nm (B). Zestawy obszarów z seryjnym ROI umieszczonym na komórkach docelowych, zapisane z rozdzielczością pikseli 5 nm (C). Podczas powiększania tak wysokorozdzielczych obrazów (D) widoczne stają się wewnątrzkomórkowe przedziały błonowe, takie jak wakuole (V), jądro (N), mitochondria (M) i retikulum endoplazmatyczne (strzałki). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Powłoki optyczne pod naprężeniem: wzory pęknięć, analiza SEM, schemat integralności mikrostrukturalnej.
Rysunek 5: Typowe problemy. 1. Wynikające z procesu krojenia: Wstążki umieszczone na szkiełkach podstawowych pokrytych ITO są idealnie proste (A), ale nierównomierna kompresja podczas krojenia może spowodować zgięcia (B) lub zakrzywienia wstążek (D), a nawet fałdy (C). 2. Spowodowane manipulowaniem podłożem i wstążkami w wodzie, np. podczas krojenia i barwienia: Cząstki rozpraszające światło na podłożu (D), obwódki kropli na przekroju (okrąg w E) lub zanieczyszczenia rozmazane na tkance z powodu niewłaściwego płukania po barwieniu (F). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Film uzupełniający S1: Stos obrazów FLM. 435 obrazów wyrównanych w programie Fiji16 przy użyciu TrakEM17 i zapisanych jako plik wideo (.avi). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Film uzupełniający S2: Stos obrazów SEM. 210 obrazów wyrównanych w programie Fiji16 przy użyciu TrakEM17. Oryginalny stos (300 obrazów) tego zestawu danych miał rozmiar 15 GB. Aby zmniejszyć rozmiar stosu z 3,3 GB (po wyrównaniu i przycięciu wyłącznie do dwóch komórek docelowych), przeskalowano go w osiach x i y o współczynnik 0,2 za pomocą programu Fiji, a następnie zapisano jako plik wideo .avi. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Film uzupełniający S3: Powiększanie przy różnych poziomach rozdzielczości w SEM. Film utworzony i wyeksportowany z oprogramowania Atlas 5 w formacie .mp4. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Zademonstrowano przepływ pracy do celowania w określone komórki w tkance za pomocą multimodalnego hierarchicznego AT: próbka zanurzona w żywicy jest krojona na tablice szeregowych sekcji, które są umieszczane na podłożu przewodzącym za pomocą specjalnie zaprojektowanego uchwytu podłoża. Po znakowaniu fluoroforem i zobrazowaniu w FLM, zrekonstruowana objętość jest wykorzystywana do selekcji komórek docelowych. Po dodatkowym barwieniu metalami ciężkimi w celu wprowadzenia kontrastu, cele te są obrazowane na kilkuset odcinkach w rozdzielczości nanoskali w SEM przy użyciu zautomatyzowanej platformy oprogramowania.

Do produkcji gęsto upakowanych macierzy z kilkoma długimi wstęgami niezbędny jest uchwyt podłoża podobny do opisanego tutaj. Wprawna i cierpliwa osoba może być w stanie przymocować kilka taśm do podłoża silikonowego, częściowo zanurzonego w łodzi z nożem, i odzyskać matrycę, stopniowo obniżając poziom wody, aż wstążki osiądą na podłożu. Jednak z naszego doświadczenia wynika, że istnieje tendencja do pękania, gdy podłoże dotyka jakiejkolwiek części łodzi nożowej (por. uwaga w 1.3.2 w protokole). Ponadto procedura ta jest znacznie trudniejsza w przypadku podłoży pokrytych ITO: (1) ze względu na przezroczystość szkła ITO trudno jest dostrzec krawędź wody, do której należy przymocować końce wstążek; oraz (2) ponieważ powierzchnia pokryta ITO jest znacznie bardziej szorstka niż wysoce wypolerowana płytka krzemowa, wstęgi mają tendencję do pękania podczas podnoszenia, a mniejsze fragmenty składające się z kilku sekcji mogą unosić się na wodzie, niszcząc w ten sposób kolejność sekcji.

Cały przepływ pracy jest również możliwy do zrealizowania bez korelacji z danymi FLM. W takim przypadku może być konieczne zebranie danych w SEM w kilku sesjach. Wstępna rekonstrukcja 3D lub przynajmniej ocena danych o niskiej lub średniej rozdzielczości może być konieczna do zidentyfikowania celów. Ponadto można stosować konwencjonalne barwienia histologiczne dla LM jasnego pola (niewymagające FLM). Oczywiście, inne opcje 6,7,8 to znakowanie przeciwciał na matrycach, jak już wykazano w początkowym artykule na temat AT18, lub genetycznie kodowane białka fluorescencyjne (XFP) lub wstępne osadzanie znakowania z zachowaniem fluorescencji podczas przygotowywania próbki.

Ogólnym ograniczeniem omawianej metody jest użycie przekrojów o określonej grubości i wynikające z tego dyskretne próbkowanie objętości 3D: Rozdzielczość w Z może być tylko tak dobra, jak grubość przekrojów, ponieważ SEM zbiera tylko dane z powierzchni przekroju (w zależności od wybranej energii pierwotnej/energii lądowania). Oznacza to, że uzyskana objętość 3D ma woksele anizotropowe, np. 5 x 5 x 100 nm3 jeśli użyte są odcinki 100 nm i rozmiar piksela obrazu 5 nm. W przypadku bardzo małych jednostek w zakresie rozmiarów poniżej 1 μm może to nie wystarczyć do prawdziwego opisu ultrastrukturalnego. Bardziej technicznym ograniczeniem jest dokładność etapu używanego w SEM do automatycznego obrazowania. Z tego powodu konieczne jest wybranie zwrotu z inwestycji większego niż specyfikacja dokładności stolika, aby zagwarantować, że obrazowany jest cały obszar docelowy.

W porównaniu z SBF-SEM i FIB-SEM jako metodami obrazowania blokowego, korelacyjny AT ma ostateczną wadę w postaci wokseli anizotropowych, jak opisano powyżej. Dzięki FIB-SEM można uzyskać woksele izotropowe o wymiarach 5 x 5 x 5 nm3 przy odpowiedniej korekcie dryftu.

Luki w zrekonstruowanej objętości spowodowane utratą sekcji podczas przygotowywania macierzy mogą być również problemem, który nie występuje w przypadku SBF-SEM lub FIB-SEM. Przy dobrej stabilizacji wstążki za pomocą kleju zwykle stanowi to problem tylko w przypadku ostatniego odcinka wstążki: może ona zostać uszkodzona podczas zdejmowania jej z krawędzi noża za pomocą rzęsy. Jednak z naszego doświadczenia wynika, że utrata jednej sekcji na 20–50 sekcji nie ma wpływu na rejestrację obrazu.

Z drugiej strony, możliwość post-stainingu zapewnia dobry sygnał i kontrast dla obrazowania SEM, nawet w przypadku słabo zmetalizowanych próbek, takich jak pokazane tutaj zamrożone końcówki korzeni pod wysokim ciśnieniem. W związku z tym nie jest konieczne rezygnowanie z optymalnej ochrony ultrastrukturalnej poprzez liczne etapy chemicznego utrwalania i metalizacji. Również rutynowe próbki z laboratorium patomorfologicznego o średnim stopniu metalizacji dostarczają doskonałych danych10. Takie wzmocnienie kontrastu po osadzeniu nie jest możliwe w przypadku SBF-SEM i FIB-SEM w ogóle. Ponadto, ponieważ metody te są destrukcyjne, tj. konsumpcja próbki podczas obrazowania, obrazowanie hierarchiczne w różnych rozdzielczościach i miejscach lub wielokrotne obrazowanie w późniejszych momentach jest niemożliwe. Zasadniczo nieograniczone objętości, składające się z dużych pól widzenia (np. do kilku milimetrów dla całych mózgów myszy w konektomice) utworzonych przez zszywanie mozaik, oraz ogromna liczba sekcji mogą być uzyskane przez AT, podczas gdy w FIB-SEM pola widzenia powyżej 100 μm x 100 μm są trudne do osiągnięcia za pomocą rutynowych instrumentów.

Dalsza automatyzacja opisanego przepływu pracy AT byłaby niewątpliwą zaletą, ponieważ wyżej wymienione metody SBF-SEM i FIB-SEM wykonują zarówno sekcje, jak i obrazowanie w tym samym instrumencie w sposób w pełni zautomatyzowany. Istnieje jeden rodzaj automatyzacji sekcji: ATUMtome12 może generować i zbierać tysiące sekcji, ale użycie taśmy kaptonowej jako podłoża sprawia, że takie tablice są trudne do zobrazowania w FLM. Na stosowanych tutaj szkiełkach nakrywkowych z powłoką ITO powinno być możliwe nawet obrazowanie w super rozdzielczości. Kolejnym, bardzo pożądanym celem automatyzacji byłoby rejestrowanie stosów danych FLM. Z drugiej strony, automatyzacja może być kosztowna i z wyjątkiem uchwytu na podłoże, przedstawiony tutaj przepływ pracy opiera się (pod względem sprzętu) tylko na oprzyrządowaniu zwykle dostępnym w rutynowym laboratorium EM lub głównym obiekcie, co sprawia, że dostęp do niego jest niski.

Oświadczenia

KIT otrzymał zwrot kosztów od Boeckeler Instruments za dostarczenie funkcjonalnego modelu uchwytu podłoża. Marlene Thaler jest pracownikiem firmy ZEISS Microscopy GmbH, producenta systemów mikroskopowych, o których mowa w tym artykule. Ponadto ZEISS oferuje pewne rozwiązania, takie jak pakiety rozwiązań ZEISS Atlas do szerokiego zakresu zastosowań w obrazowaniu 3D dużych obszarów dla instrumentów SEM i FIB-SEM. Wszyscy pozostali autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez grant FKZ 13GW0044 z niemieckiego Federalnego Ministerstwa Edukacji i Badań, projekt MorphiQuant-3D. Dziękujemy Carolin Bartels za wsparcie techniczne.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Oprzyrządowanie
UltramicrotomeRMCPT-PCAlternatywa: Leica UC7
Uchwyt podłożaRMCASH-100Alternatywa: domowy
odkurzacz plazmowyDienerZepto 40kHzAlternatywy: Ted Pella Pelco lub inny stacjonarny odkurzacz plazmowy
Przykładowe parametry dla Diener Zepto z generatorem 40kHz (0-100W); 0,5 mbar, 5 sccm (powietrze), 10% wydajności 
Szerokokątny mikroskop fluorescencyjnyZeissAxio Observer.Z1Alternatywy:
Leica, Nikon, Olympus
Zestaw filtrów fluorescencyjnychZeiss43 HE (Cy3/DsRed)
Soczewka obiektywowaZeissZeiss Neofluar 40x  0.75 NA
Przyzwoita stacja robocza zdolna do obsługi danych
FESEMZeissUltra 55Alternatywy: FEI, Jeol, Hitachi, TESCAN
strong>NazwaCompanyNumer katalogowyKomentarze
Sectioning
ŻyletkiPlanoT585-V
Nóż diamentowy do przycinania 45°DiatomeDTB45
Nóż diamentowy do przycinania 90°DiatomeDTB90
Nóż diamentowy Jumbo do cięciaDiatomeDUJ3530
Wafel silikonowy (kawałki)Si-MatCustom MadeDoping: P / Bor, orientacja: < 100>, grubość: 525 ± 25 &mikro; m, rezystywność: 1-30 Ω-cm
http://si-mat.com/silicon-wafers.html
Szkiełka nakrywkowe z powłoką ITOBalzersTyp Z22 &krotnie; 22 &razy; 0,17 mm
https://www.opticsbalzers.com/de/produkte/deckglas-fenster/corrslide.html
Nośnik aluminiowyCustom Made76 & razy; 26 mm
Kleszczyki wafloweIdeal-tek34A.SA
Kciaki kleszczeDumont0103-2E1/2-PO-1Dumoxel-H 2E 1/2
Rysik diamentowyPlanoT5448
Rzęsy/bardzo miękka sierść kotaWłasnaalternatywa:
Plano BrushSelfmade
Klej kontaktowyPattex PattexPCL3CKraftkleber Classic (żółtawy)
FixogumMarabu290110001do mocowania podłoża do nośnika
Taśma klejąca3M851do mocowania podłoża do nośnika
IzopropanolBernd Kraft07029.4000
XyleneCarl Roth4436rozcieńczalnik do mieszanki klejowej
RotihistolCarl Roth6640alternatywa, rozcieńczalnik na bazie limonenu
Imię i nazwiskoCompanyNumer katalogowyKomentarze
Software
Przetwarzanie obrazuOpen sourceFidżi (http://fiji.sc/#download)
Akwizycja obrazuZeissAtlas 5 AT
(moduł dla Zeiss SEM)		Alternatywa dla automatycznego pozyskiwania obrazów: WaferMapper: https://software.rc.fas.harvard.edu/lichtman/LGN/WaferMapper.html
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
>Staining
PropidiumjodekSigma-AldrichP4170Roztwór podstawowy: 1,5 mM w 0,1% azydku sodu
Octan uranyoctanuE22400
Azotan ołowiu(II)Merck107398
Cytrynian trisodu DihydratMerck106448
1MBernd Kraft01030.3000
Szklana szalkaPetriego Duran23 755 56
NazwaFirmaNumer katalogowyUwagi
Montaż
StubsPlanoG301F
Klocki węglowePlanoG3347
Taśma miedzianaPlanoG3397dwustronny klej, przewodząca
Farba srebrnaPlanoG3692Acheson Elektrodag 1415M
NazwaFirmaNumer katalogowyUwagi
Roztwory/mieszaniny
Mieszanina klejowa do blokówKlej kontaktowy Pattex / ksylen jako rozcieńczalnik, stosunek 1:3,
(Alternatywa dla ksylenu: Rotihistol)
Reynolds cytrynian50 ml:
Rozpuść 1,33 g azotanu ołowiu(II) w 10 ml dH2O.
Rozpuść 1,76 g dwuwodnego cytrynianu trisodu w 10 ml mieszanki dH2O.
oba i dodać 1 M wodorotlenku sodu, aż roztwór będzie klarowny.
Napełnić dH2O do 50 ml.
barwiący jodku propidynyPrzygotować rozcieńczenie 1:1500 z zapasu w wirze dH2O.
w celu odpowiedniego wymieszania.
Wodny octanRozpuścić 3 % octanu uranylu w dH2O (dokładnie wymieszać).
obrazu o rozmiarze GB< Granulki NaOH Merck 106469 powlekających ołowiu Roztwór uranylu

Bibliografia

  1. Peddie, C. J., Collinson, L. M. Exploring the third dimension: Volume electron microscopy comes of age. Micron. 61, 9-19 (2014).
  2. Wanner, A. A., Kirschmann, M. A., Genoud, C. Challenges of microtome-based serial block-face scanning electron microscopy in neuroscience. J Microsc. 259 (2), 137-142 (2015).
  3. Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. Focused ion beam scanning electron microscopy in biology. J Microsc. 254 (3), 109-114 (2014).
  4. Wacker, I., Schröder, R. R. Array tomography. J Microsc. 252 (2), 93-99 (2013).
  5. Tapia, J. C., Kasthuri, N., Hayworth, K. J., Schalek, R., Lichtman, J. W., Smith, S. J., Buchanan, J. High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy. Nat protoc. 7 (2), 193-206 (2012).
  6. Lucas, M. S., Günthert, M., Gasser, P., Lucas, F., Wepf, R. Bridging Microscopes: 3D Correlative Light and Scanning Electron Microscopy of Complex Biological Structures. Methods Cell Biol. 111, 325-356 (2012).
  7. De Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. Correlated light and electron microscopy: ultrasructure lights up! Nat Methods. 12 (6), 503-513 (2015).
  8. Verkade, P., Müller-Reichert, T. Methods in Cell Biology Correlative Light and Electron Microscopy III. 140, 1st ed, Elsevier. 1-352 (2017).
  9. Gibson, K. H., Vorkel, D., Meissner, J., Verbavatz, J. -M. Fluorescing the Electron: Strategies in Correlative Experimental Design. Methods Cell Biol. 124, 23-54 (2014).
  10. Wacker, I., Schröder, R. R., Schroeder, J. A. Pathology goes 3D: Exploring the potential of array tomography versus FIB nanotomography for a CADASIL sample. Ultrastruct Pathol. 41 (1), 114-115 (2017).
  11. Wacker, I., Spomer, W., Hofmann, A., Thaler, M., Hillmer, S., Gengenbach, U., Schröder, R. R. Hierarchical imaging: a new concept for targeted imaging of large volumes from cells to tissues. BMC Cell Biol. 17 (1), 38(2016).
  12. Hayworth, K. J., Morgan, J. L., Schalek, R., Berger, D. R., Hildebrand, D. G. C., Lichtman, J. W. Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits. Front Neural Circuits. 8, Article 68 (2014).
  13. Micheva, K. D., O'Rourke, N., Busse, B., Smith, S. J. Array Tomography: Production of Arrays. Cold Spring Harb Protoc. 11, 1267-1269 (2010).
  14. Fahrenbach, W. H. Continuous serial thin sectioning for electron microscopy. J. Elec. Microsc. Tech. 1 (4), 387-398 (1984).
  15. Harris, K. M., et al. Uniform serial sectioning for transmission electron microscopy. J Neurosci. 26 (47), 12101-12103 (2006).
  16. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., Kaynig, V., Longair, M., Pietzsch, T., Preibisch, S., Rueden, C., Saalfeld, S., Schmid, B., Tinevez, J. -Y., White, D. J., Hartenstein, V., Eliceiri, K., Tomancak, P., Cardona, A. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  17. Cardona, A., Saalfeld, S., Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Preibisch, S., Longair, M., Tomancak, P., Hartenstein, V., Douglas, R. J. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLoS ONE. 7 (6), e38011(2012).
  18. Micheva, K. D., Smith, S. J. Array Tomography: A new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Tomografia seryjnamikroskopia elektronowamikroskopia wietlnaobrazowanie SEMprzygotowanie serii tkanekautomatyczne obrazowanierekonstrukcja 3Danaliza ultrastrukturalna
Multimodalne hierarchiczne obrazowanie odcinków szeregowych w celu znalezienia określonych celów komórkowych w dużych objętościach
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.