Artykuł metodologiczny

Łatwy protokół do generowania specyficznie specyficznych dla miejsca acetylowanych białek w Escherichia coli

6.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57061

⸱

9 grudnia 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Arkansas, 2Cell and Molecular Biology Program, University of Arkansas, 3Department of Biological Sciences, University of Arkansas, 4Fayetteville High School

W tym artykule

Podsumowanie

Rozszerzenie kodu genetycznego służy jako potężne narzędzie do badania szerokiego zakresu procesów biologicznych, w tym acetylacji białek. Tutaj demonstrujemy prosty protokół wykorzystania tej techniki do generowania jednorodnie acetylowanych białek w określonych miejscach w komórkach Escherichia coli.

Streszczenie

Wykazano, że modyfikacje potranslacyjne, które zachodzą w określonych pozycjach białek, odgrywają ważną rolę w różnych procesach komórkowych. Wśród nich odwracalna acetylacja lizyny jest jedną z najszerzej rozpowszechnionych we wszystkich dziedzinach życia. Chociaż przeprowadzono liczne badania acetylomu oparte na spektrometrii mas, dalsza charakterystyka tych przypuszczalnych celów acetylacji była ograniczona. Jednym z możliwych powodów jest to, że trudno jest wytworzyć czysto acetylowane białka w pożądanych pozycjach za pomocą większości klasycznych podejść biochemicznych. Aby sprostać temu wyzwaniu, zastosowano technikę ekspansji kodu genetycznego w celu wykorzystania pary zmodyfikowanego wariantu syntetazy pirolizylo-tRNA i jej pokrewnego tRNA z gatunków Methanosarcinaceae do kierowania kotranslacyjną inkorporacją acetylolizyny w określonym miejscu w białku będącym przedmiotem zainteresowania. Po pierwszym zastosowaniu w badaniach nad acetylacją histonów, podejście to ułatwiło badania acetylacji na różnych białkach. W tej pracy zademonstrowaliśmy łatwy protokół wytwarzania specyficznie dla miejsca acetylowanych białek przy użyciu modelowej bakterii Escherichia coli jako gospodarza. Dehydrogenaza jabłczanowa została wykorzystana jako przykład demonstracyjny w tej pracy.

Wprowadzenie

Modyfikacje potranslacyjne (PTM) białek zachodzą po procesie translacji i powstają w wyniku kowalencyjnego dodawania grup funkcyjnych do reszt aminokwasowych, odgrywając ważną rolę w prawie wszystkich procesach biologicznych, w tym transkrypcji genów, reakcji na stres, różnicowania komórkowego i metabolizmu1,2,3. Do tej pory zidentyfikowano około 400 charakterystycznych PTM-ów4. Złożoność genomu i proteomu jest w dużym stopniu wzmacniana przez białkowe PTM, ponieważ regulują one aktywność i lokalizację białek oraz wpływają na interakcję z innymi cząsteczkami, takimi jak białka, kwasy nukleinowe, lipidy i kofaktory5.

Acetylacja białek była w czołówce badań nad PTM w ciągu ostatnich dwóch dekad6,7,8,9,10,11,12. Acetylacja lizyny została po raz pierwszy odkryta w histonach ponad 50 lat temu13,14, została dobrze zbadana i wiadomo, że występuje w ponad 80 czynnikach transkrypcyjnych, regulatorach i różnych białkach15,16,17. Badania nad acetylacją białek nie tylko dostarczyły nam głębszego zrozumienia mechanizmów regulacyjnych białka, ale także ukierunkowały leczenie wielu chorób spowodowanych dysfunkcyjną acetylacją18,19,20,21,22,23. Uważano, że acetylacja lizyny zachodzi tylko u eukariontów, ale ostatnie badania wykazały, że acetylacja białek odgrywa również kluczową rolę w fizjologii bakterii, w tym chemotaksji, odporności na kwasy, aktywacji i stabilizacji wysp patogenności i innych białek związanych z wirulencji24,25,26,27,28,29.

Powszechnie stosowaną metodą biochemicznego charakteryzowania acetylacji lizyny jest użycie mutagenezy ukierunkowanej na miejsce. Glutamina jest stosowana jako naśladownica acetylolizyny ze względu na jej podobny rozmiar i polarność. Arginina jest wykorzystywana jako nieacetylowany naśladowca lizyny, ponieważ zachowuje swój dodatni ładunek w warunkach fizjologicznych, ale nie może być acetylowana. Jednak obie mimiki nie są prawdziwymi izosterami i nie zawsze dają oczekiwane rezultaty30. Najbardziej rygorystycznym podejściem jest generowanie jednorodnie acetylowanych białek przy określonych resztach lizyny, co jest trudne lub niemożliwe dla większości klasycznych metod ze względu na niską stechiometrię acetylacji lizyny w naturze7,11. Wyzwanie to zostało rozwikłane dzięki strategii ekspansji kodu genetycznego, która wykorzystuje zmodyfikowany wariant syntetazy pirolizylo-tRNA z gatunku Methanosarcinaceae do ładowania tRNAPyl acetylolizyną, wykorzystuje maszynerię translacyjną gospodarza do tłumienia kodonu stop UAG w mRNA i kieruje włączeniem acetylolizyny w zaprojektowanej pozycji docelowego białka31. Ostatnio zoptymalizowaliśmy ten system za pomocą ulepszonego tRNA32 i ulepszonej syntetazy acetylylizylo-tRNA33. Ponadto zastosowaliśmy ten ulepszony system inkorporacji w badaniach acetylacji dehydrogenazy jabłczanowej 34 i syntetazy tyrozylo-tRNA35. W tym miejscu demonstrujemy protokół generowania czysto acetylowanych białek od klonowania molekularnego do identyfikacji biochemicznej przy użyciu dehydrogenazy jabłczanowej (MDH), którą intensywnie badaliśmy jako przykład poglądowy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Mutageneza docelowego genu ukierunkowana na miejsce

Uwaga: MDH jest wyrażony pod promotorem T7 w wektorze pCDF-1 o pochodzeniu CloDF13 i liczbie kopii od 20 do 4034.

  1. Wprowadzić bursztynowy kodon stop w pozycji 140 w genie za pomocą starterów (starter do przodu: GGTGTTTATGACTAGAACAAACTGTTCGGGG i starter odwrotny: GGCTTTTTTCAGCACTTCAGCAGCAATTGCC), postępując zgodnie z instrukcją zestawu do mutagenezy ukierunkowanej na miejsce.
  2. Amplifikować plazmid matrycowy zawierający gen dehydratazy jabłczanu typu dzikiego i wprowadzić mutację kodonu stop w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). W mieszaninie reakcyjnej należy dodać 12,5 μl mieszaniny enzymów polimerazy 2X DNA, 1,25 μl 10 μM startera Forward, 1,25 μL 10 μM startera odwróconego, 1 μL matrycowego DNA (20 ng/μL) (plazmid pCDF-1 zawierający gen MDH typu dzikiego) i 9 μl wody wolnej od nukleaz.
    1. Parametry reakcji PCR należy stosować w następujący sposób: wstępna denaturacja w temperaturze 98 °C przez 30 s; 25 cykli po 10 s w temperaturze 98 °C, 30 s w temperaturze 55 °C i 3 minuty w temperaturze 72 °C; końcowe przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 3 minuty. Po PCR dodać amplifikowany materiał bezpośrednio do mieszaniny enzymów kinazy-ligazy-DpnI z zestawu na 1 godzinę w temperaturze pokojowej w celu cyrkularyzacji i usunięcia matrycy.
      Uwaga: Mieszanina reakcyjna zawiera 1 μl produktu PCR, 5 μl 2X buforu reakcyjnego, 1 μL 10-krotnej mieszaniny enzymów kinazy-ligazy-DpnI oraz 3 μl wody wolnej od nukleaz.
  3. Dodać 5 μl mieszaniny reakcyjnej do probówki z 25 μl, rozmrożonymi, kompetentnymi komórkami DH5α E. coli z zestawu. Ostrożnie przesuń probówkę, aby wymieszać i umieść mieszaninę na lodzie na 30 minut. Szok termiczny mieszaniny w temperaturze 42 °C przez 30 s i umieszczenie na lodzie na dodatkowe 5 minut.
    1. Odpipetować 600 μl bulionu Super Optimal o temperaturze pokojowej z pożywką do tłumienia katabolitu (SOC) z zestawu do mieszaniny, inkubować w temperaturze 37 °C przez 60 minut z wytrząsaniem przy 250 obr./min, rozprowadzić 100 μl na płytce agarowej bulionu lizogennego (LB) z odpowiednim antybiotykiem i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 250 obr./min.
  4. Zebrać 4-6 pojedynczych kolonii do 6 ml świeżej pożywki LB z odpowiednim antybiotykiem i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc, wytrząsając z prędkością 250 obr./min. Ekstrahuj plazmidy z każdej nocnej hodowli za pomocą zestawu do oczyszczania plazmidu, postępując zgodnie z instrukcją producenta, a następnie wyślij plazmidy do sekwencjonowania DNA zgodnie z protokołem dostawcy usług w celu potwierdzenia mutacji kodonu stop we właściwych pozycjach.
  5. Szczep należy przechowywać w odpowiedniej kolejności w temperaturze -80 °C, mieszając 1 ml kultury przez noc i 300 μl 100% DMSO.

2. Ekspresja białka acetylowanego

  1. Wstaw geny zoptymalizowanej syntetazy acetylylizylo-tRNA33 i zoptymalizowanego tRNAPyl 32 do plazmidu pTech. Umieść gen syntetazy tRNA pod konstytutywnym promotorem lpp. Umieść gen tRNA pod konstytutywnym promotorem proK34.
    1. Współprzekształcaj wektor wyrażenia34 zawierający zmutowany gen dehydrogenazy jabłczanowej zawierający TAG oraz plazmid zawierający zoptymalizowany system inkorporacji acetylolizyny, w 25 μl rozmrożonych kompetentnych komórek E. coli BL21(DE3) przez szok termiczny w temperaturze 42 °C przez 10 s i umieść na lodzie na dodatkowe 5 minut.
    2. Odpipetować 600 μl pożywki SOC o temperaturze pokojowej do mieszaniny, inkubować w temperaturze 37 °C przez 60 minut z wytrząsaniem z prędkością 275 obr./min, rozprowadzić 100 μl na płytce ze 100 μg/ml streptomycyny i 50 μg/ml chloramfenikolu i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 275 obr./min.
  2. Pobrać pojedynczą kolonię z płytki i zaszczepić w 15 ml świeżej pożywki LB ze 100 μg/ml streptomycyny i 50 μg/ml chloramfenikolu w probówce o pojemności 50 ml przez noc w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 250 obr./min. Przenieść 15 ml kultury przez noc do 300 ml świeżej pożywki LB z antybiotykami w kolbie o pojemności 1 l i inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 250 obr./min.
  3. Rozpuścić acetylolizynę w wodzie, aby uzyskać 100 mM roztwór podstawowy, przechowywać w temperaturze 4 °C. Dodać 5 mM acetylolizyny i 20 mM nikotynamidu (inhibitora deacetylaz) do pożywki wzrostowej, gdy absorbancja osiągnie 0,5 przy 600 nm.
    1. Hoduj komórki przez dodatkowy 1 h w temperaturze 37 °C, wstrząsając z prędkością 250 obr./min, następnie dodaj 0,5 mM IPTG w celu ekspresji białka i hoduj komórki w temperaturze 25 °C przez noc, wytrząsając przy 180 obr.
      nuta: Warunki ekspresji mogą wymagać optymalizacji dla różnych białek.
  4. Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 3 000 x g w temperaturze 4 °C przez 15 minut, odrzucić supernatant i przemyć granulki komórek buforem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) (10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl). Zebrać umyte komórki w temperaturze 10 000 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut, wyrzucić supernatant i przechowywać granulki komórek w temperaturze -80 °C.

3. Oczyszczanie acetylowanego białka

  1. Rozmrozić zamrożone granulki komórek na lodzie i ponownie zawiesić 15 ml buforu do lizy (50 mM tris(hydroksymetylo)aminometanu (Tris) pH 7,8, 300 mM NaCl, 20 mM imidazolu i 20 mM nikotynamidu), 5 μl β-merkaptoetanolu i 1 μl nukleazy benzonazy (250 jednostek).
  2. Rozbij ogniwa za pomocą sonikacji 40 kHz przy 70% mocy wyjściowej z 10 cyklami krótkich serii po 10 sekund, po których następują przerwy 30 s na schłodzenie w celu uzyskania surowego ekstraktu. Odwirować ekstrakt surowy przy 20 000 x g przez 25 minut w temperaturze 4 °C. Przefiltrować supernatant za pomocą filtra membranowego 0,45 μm i załadować do kolumny zawierającej 1 ml żywicy kwasu niklowo-nitrylotrioctowego (Ni-NTA) zrównoważonej z 20 ml wody i 20 ml buforu do lizy.
    nuta: Komórki mogą być również rozbijane przez łagodne detergenty, jeśli sonikacja nie jest dostępna.
  3. Przemyć kolumnę 20 ml buforu płuczącego (50 mM Tris pH 7,8, 300 mM NaCl, 50 mM imidazolu i 20 mM nikotynamidu), a następnie wymyć 2 ml buforu elucyjnego (50 mM Tris pH 7,8, 300 mM NaCl, 150 mM imidazolu i 20 mM nikotynamidu).
  4. Frakcję elucyjną odsalać buforem odsalającym (25 mM Tris pH 7,8 i 10 mM NaCl) za pomocą kolumny PD-10, postępując zgodnie z instrukcją producenta. Zmierzyć stężenie eluowanego białka, postępując zgodnie z instrukcją odczynnika do oznaczania białek Bradforda. Odsolone białko jest gotowe do dalszych eksperymentów.
    nuta: Przygotuj 50% zapasu glicerolu białka i przechowuj w temperaturze -80 °C do przechowywania.

4. Biochemiczna charakterystyka acetylowanego białka

  1. SDS-PAGE i analizy spektrometrii mas.
    1. Denaturować białka buforem próbki dodecylosiarczanu sodu (SDS) (5 μl próbki białka z 2 μl 4-krotnym buforem próbki SDS) w probówce o pojemności 2 ml w temperaturze 105 °C przez 5 min, odwirować mieszaninę przy 2000 x g przez 10 s, naładować na 4-20% żel do elektroforezy w żelu poliakrylamidowym dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE), i pracować pod napięciem 200 V przez 30 min.
    2. Umyj żel wodą destylowaną i delikatnie wstrząsaj przez 5 minut, powtarzając proces 3 razy. Wylej wodę i zaplamij żel niebieską plamą Coomassie przez 1 godzinę, delikatnie potrząsając. Odplamić żel wodą destylowaną, delikatnie wstrząsać przez 30 minut i powtórzyć to odplamianie 3 razy.
    3. Przeciąć pasmo o ciśnieniu 33 kDa na barwionym na niebiesko żelu SDS-PAGE Coomassie i wysłać go do zakładów spektrometrii mas lub firm w celu potwierdzenia, że acetylolizyna została włączona w zaprojektowanej pozycji.
      UWAGA: Protokół analizy spektrometrii mas był zgodny z poprzednim eksperymentem34.
  2. Zachodnia plama
    1. Uruchom żel SDS-PAGE z tym samym protokołem w kroku 4.1. Po przebiegu żelu nasącz żel buforem transferowym (25 mM Tris, 192 mM glicyny, pH 8,3 i 20% metanolu) przez 15 minut.
    2. Aktywuj membranę z polifluorku winylidenu (PVDF) o wymiarach 0,2 μm, 7 cm x 8,5 cm z metanolem przez 1 minutę i spłucz buforem transferowym przed przygotowaniem kanapki transferowej.
      nuta: Metanol jest niebezpieczny w przypadku kontaktu ze skórą, kontaktu z oczami, spożycia lub wdychania. Poważne nadmierne narażenie może spowodować śmierć.
    3. Wykonaj warstwę transferową z katody na anodę (gąbka, bibuła filtracyjna, żel SDS-PAGE, membrana PVDF, bibuła filtracyjna i gąbka). Umieść komin w zbiorniku transferowym, pracuj ze stałym prądem 350 mA przez 45 min.
      nuta: Czas transferu może wymagać optymalizacji.
    4. Przemyć membranę PVDF buforem 25 ml soli fizjologicznej buforowanej Tris, 0,1% Tween 20 (TBST) (137 mM NaCl, 20 mM Tris, 0,1% Tween-20, pH 7,6) przez 5 minut, delikatnie wstrząsając. Zablokować błonę 5% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) w buforze TBST na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    5. Inkubować błonę z przeciwciałem acetylolizynowym sprzężonym z HRP o końcowym stężeniu 1 μg/ml, rozcieńczonym 5% BSA w TBST w temperaturze 4 °C przez noc, delikatnie wstrząsając.
      nuta: Aby uzyskać szybsze rezultaty, ten krok można wykonać w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Rozcieńczenie przeciwciała może wymagać optymalizacji.
    6. Przemyć membranę 20 ml buforu TBST przez 5 minut, delikatnie wstrząsając, powtarzając krok 4 razy. Podłoże chemiluminescencyjne nanieść na membranę, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Uchwyć sygnał za pomocą przetwornika obrazu opartego na kamerze ze sprzężeniem ładunkowym (CCD).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wydajność białka MDH w formie acetylowanej wyniosła 15 mg na 1 L hodowli, podczas gdy w przypadku MDH typu dzikiego było to 31 mg na 1 L hodowli. Oczyszczone białka przeanalizowano metodą SDS-PAGE, co przedstawiono na Rysunku 1. MDH typu dzikiego posłużyło jako kontrola pozytywna34. Jako kontrolę negatywną wykorzystano białko oczyszczone z komórek posiadających system inkorporacji acetylolizyny (AcK) oraz zmutowany gen mdh, al...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Genetyczna inkorporacja aminokwasów niekanonicznych (ncAA) opiera się na supresji przypisanego kodonu, głównie bursztynowego kodonu stop UAG 36,37,38,39, przez naładowane ncAA tRNA zawierające odpowiedni antykodon. Jak wiadomo, kodon UAG jest rozpoznawany przez czynnik uwalniania-1 (RF1) u bakterii, a także może być tłumiony przez prawie pokrewne tRNA z gospodarzy naładowanych przez aminokwasy ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez NIH (AI119813), start-up z University of Arkansas, oraz nagrodę od Arkansas Biosciences Institute.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Test białkowyBradford Bio-Rad5000006Stężenie białka
4x Laemmli Bufor do próbekBio-Rad1610747SDS Bufor do próbek
Coomassie G-250 StainBio-Rad1610786SDS-PAGE barwienie w żelu
4-20% SDS-PAGE gotowy żelBio-Rad4561093Oznaczanie białka
Ac-K-100 (koniugat HRP)Komórka Sygnalizacja6952Przeciwciało
IPTGCHEM-IMPEX194Induktor ekspresji
Nε -acetylo-L-lizynaCHEM-IMPEX5364Niekanoniczna
kolumna odsalająca aminokwasy PD-10GE Healthcare17085101Odsalanie
Q5 Zestaw do mutagenezy ukierunkowanej na miejsceNEBE0554Przedstawiamy komórki kodonu stop
BL21 (DE3)NEBC2527Eksprymujący szczep
QIAprep Spin Miniprep KitQIAGEN27106Ekstrakcja plazmidów
Żywica Ni-NTAQIAGEN30210Żywica oczyszczająca powinowactwa
nikotynamidSigma-AldrichN3376Inhibitor deacetylazy
i beta;-merkaptoetanolSigma-AldrichM6250Środek redukujący
Odczynnik do ekstrakcji białek BugBusterSigma-Aldrich70584Rozbijanie komórek
Benzonaza nukleazaSigma-AldrichE1014DNaza
ECL Western Blotting SubstrateThermoFisher32106Chemiluminescencyjny
wstępnie zmieszany bulion LBVWR97064Pożywka do wzrostu komórek
Albumina surowicy bydlęcejVWR97061-416blokowanie western blot

Bibliografia

  1. Krishna, R. G., Wold, F. Post-translational modification of proteins. Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol. 67, 265-298 (1993).
  2. Lothrop, A. P., Torres, M. P., Fuchs, S. M. Deciphering post-translational modification codes. FEBS Lett. 587 (8), 1247-1257 (2013).
  3. Walsh, C. T. Posttranslational modification of proteins : expanding nature's inventory. , Roberts and Company Publishers. Englewood, Colorado. (2006).
  4. Khoury, G. A., Baliban, R. C., Floudas, C. A. Proteome-wide post-translational modification statistics: frequency analysis and curation of the swiss-prot database. Sci Rep. 1, (2011).
  5. Grotenbreg, G., Ploegh, H. Chemical biology: dressed-up proteins. Nature. 446 (7139), 993-995 (2007).
  6. Arif, M., Selvi, B. R., Kundu, T. K. Lysine acetylation: the tale of a modification from transcription regulation to metabolism. Chembiochem. 11 (11), 1501-1504 (2010).
  7. Cohen, T., Yao, T. P. AcK-knowledge reversible acetylation. Science's STKE : signal transduction knowledge environment. (245), pe42(2004).
  8. Drazic, A., Myklebust, L. M., Ree, R., Arnesen, T. The world of protein acetylation. Biochim Biophys Acta. 1864 (10), 1372-1401 (2016).
  9. Escalante-Semerena, J. C. Nε-acetylation control conserved in all three life domains. Microbe. 5, 340-344 (2010).
  10. Kouzarides, T. Acetylation: a regulatory modification to rival phosphorylation? The EMBO journal. 19 (6), 1176-1179 (2000).
  11. Soppa, J. Protein acetylation in archaea, bacteria, and eukaryotes. Archaea. , (2010).
  12. Verdin, E., Ott, M. 50 years of protein acetylation: from gene regulation to epigenetics, metabolism and beyond. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (4), 258-264 (2015).
  13. Allfrey, V. G., Faulkner, R., Mirsky, A. E. Acetylation and Methylation of Histones and Their Possible Role in the Regulation of Rna Synthesis. P Natl Acad Sci USA. 51, 786-794 (1964).
  14. Phillips, D. M. The presence of acetyl groups of histones. Biochem j. 87, 258-263 (1963).
  15. Sterner, D. E., Berger, S. L. Acetylation of histones and transcription-related factors. Microbiology and molecular biology reviews: MMBR. 64 (2), 435-459 (2000).
  16. Glozak, M. A., Sengupta, N., Zhang, X., Seto, E. Acetylation and deacetylation of non-histone proteins. Gene. 363, 15-23 (2005).
  17. Close, P., et al. The emerging role of lysine acetylation of non-nuclear proteins. Cell Mol Life Sci. 67 (8), 1255-1264 (2010).
  18. Iyer, A., Fairlie, D. P., Brown, L. Lysine acetylation in obesity, diabetes and metabolic disease. Immunol Cell Biol. 90 (1), 39-46 (2012).
  19. You, L., Nie, J., Sun, W. J., Zheng, Z. Q., Yang, X. J. Lysine acetylation: enzymes, bromodomains and links to different diseases. Essays Biochem. 52, 1-12 (2012).
  20. Bonnaud, E. M., Suberbielle, E., Malnou, C. E. Histone acetylation in neuronal (dys)function. Biomol Concepts. 7 (2), 103-116 (2016).
  21. Fukushima, A., Lopaschuk, G. D. Acetylation control of cardiac fatty acid beta-oxidation and energy metabolism in obesity, diabetes, and heart failure. Biochim Biophys Acta. 1862 (12), 2211-2220 (2016).
  22. Kaypee, S., et al. Aberrant lysine acetylation in tumorigenesis: Implications in the development of therapeutics. Pharmacol Ther. 162, 98-119 (2016).
  23. Tapias, A., Wang, Z. Q. Lysine Acetylation and Deacetylation in Brain Development and Neuropathies. Genomics Proteomics Bioinformatics. 15 (1), 19-36 (2017).
  24. Hu, L. I., Lima, B. P., Wolfe, A. J. Bacterial protein acetylation: the dawning of a new age. Molecular microbiology. 77 (1), 15-21 (2010).
  25. Jones, J. D., O'Connor, C. D. Protein acetylation in prokaryotes. Proteomics. 11 (15), 3012-3022 (2011).
  26. Bernal, V., et al. Regulation of bacterial physiology by lysine acetylation of proteins. New biotechnol. 31 (6), 586-595 (2014).
  27. Hentchel, K. L., Escalante-Semerena, J. C. Acylation of Biomolecules in Prokaryotes: a Widespread Strategy for the Control of Biological Function and Metabolic Stress. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 79 (3), 321-346 (2015).
  28. Ouidir, T., Kentache, T., Hardouin, J. Protein lysine acetylation in bacteria: Current state of the art. Proteomics. 16 (2), 301-309 (2016).
  29. Wolfe, A. J. Bacterial protein acetylation: new discoveries unanswered questions. Curr Genet. 62 (2), 335-341 (2016).
  30. Albaugh, B. N., Arnold, K. M., Lee, S., Denu, J. M. Autoacetylation of the histone acetyltransferase Rtt109. J Biol Chem. 286 (28), 24694-24701 (2011).
  31. Neumann, H., Peak-Chew, S. Y., Chin, J. W. Genetically encoding Nε-acetyllysine in recombinant proteins. Nat chem biol. 4 (4), 232-234 (2008).
  32. Fan, C., Xiong, H., Reynolds, N. M., Soll, D. Rationally evolving tRNAPyl for efficient incorporation of noncanonical amino acids. Nucleic Acids Res. 43 (22), e156(2015).
  33. Bryson, D., et al. Continuous directed evolution of aminoacyl-tRNA synthetases to alter amino acid specificity and enhance activity. Nat Chem Biol. , (2017).
  34. Venkat, S., Gregory, C., Sturges, J., Gan, Q., Fan, C. Studying the Lysine Acetylation of Malate Dehydrogenase. J Mol Biol. 429 (9), 1396-1405 (2017).
  35. Venkat, S., Gregory, C., Gan, Q., Fan, C. Biochemical characterization of the lysine acetylation of tyrosyl-tRNA synthetase in Escherichia coli. Chembiochem. 18 (19), 1928-1934 (2017).
  36. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu Rev Biochem. 79, 413-444 (2010).
  37. Mukai, T., Lajoie, M. J., Englert, M., Soll, D. Rewriting the Genetic Code. Annu Rev Microbiol. , (2017).
  38. O'Donoghue, P., Ling, J., Wang, Y. S., Soll, D. Upgrading protein synthesis for synthetic biology. Nat Chem Biol. 9 (10), 594-598 (2013).
  39. Chin, J. W. Expanding and reprogramming the genetic code of cells and animals. Annu Rev Biochem. 83, 379-408 (2014).
  40. O'Donoghue, P., et al. Near-cognate suppression of amber, opal and quadruplet codons competes with aminoacyl-tRNAPyl for genetic code expansion. FEBS Lett. 586 (21), 3931-3937 (2012).
  41. Aerni, H. R., Shifman, M. A., Rogulina, S., O'Donoghue, P., Rinehart, J. Revealing the amino acid composition of proteins within an expanded genetic code. Nucleic Acids Res. 43 (2), e8(2015).
  42. Huang, Y., et al. A convenient method for genetic incorporation of multiple noncanonical amino acids into one protein in Escherichia coli. Mol Biosyst. 6 (4), 683-686 (2010).
  43. Venkat, S., et al. Genetically encoding thioacetyl-lysine as a nondeacetylatable analog of lysine acetylation in Escherichia coli. FEBS Open. , (2017).
  44. Wan, W., Tharp, J. M., Liu, W. R. Pyrrolysyl-tRNA synthetase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool. Biochim Biophys Acta. 1844 (6), 1059-1070 (2014).
  45. Gregoretti, I. V., Lee, Y. M., Goodson, H. V. Molecular evolution of the histone deacetylase family: functional implications of phylogenetic analysis. J Mol Biol. 338 (1), 17-31 (2004).
  46. Weinert, B. T., et al. Acetyl-phosphate is a critical determinant of lysine acetylation in E. coli. Mol cell. 51 (2), 265-272 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Rozszerzenie kodu genetycznegoacetylacja specyficzna dla miejscawbudowywanie acetylolizynysyntetaza pyrrolizyl tRNAbursztynowy kodon stopekspresja w Escherichia colioczyszczanie bia ekWestern blottingtandemowa spektrometria maskom rki BL21 DE3

Powiązane artykuły