Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Odzyskiwanie fluorescencji zygotycznej po analizie fotowybielania pod kątem luźności chromatyny, która umożliwia pełny rozwój

7.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57068

⸱

12 czerwca 2018

 ,  ,  , 
1Faculty of Life and Environmental Sciences, Department of Biotechnology, University of Yamanashi, 2Department of Integrated Bioscience, Graduate School of Frontier Sciences, University of Tokyo, 3Advanced Biotechnology Center, University of Yamanashi

W tym artykule

Podsumowanie

Luźność chromatyny wydaje się być związana z potencjałem rozwojowym blastomerów. Nie wiadomo jednak, czy luźność chromatyny może być stosowana jako wiarygodny wskaźnik potencjału rozwojowego zarodków. W tym miejscu opisano system eksperymentalny, w którym zygoty oceniane pod kątem luźności chromatyny mogą rozwinąć się do pełnego terminu.

Streszczenie

Obrazowanie na żywo to potężne narzędzie, które pozwala na analizę zdarzeń molekularnych podczas ontogenezy. Ostatnio wykazano, że rozluźnienie lub otwartość chromatyny jest zaangażowana w potencjał różnicowania komórkowego pluripotencjalnych embrionalnych komórek macierzystych. Wcześniej informowano, że w porównaniu z embrionalnymi komórkami macierzystymi, zygoty mają niezwykle rozluźnioną strukturę chromatyny, co sugeruje jej związek z ich totipotencją. Jednak do tej pory nie zajęto się kwestią, czy ta niezwykle rozluźniona/otwarta struktura chromatyny jest ważna dla potencjału rozwojowego embrionalnego. W niniejszym badaniu, aby zbadać tę hipotezę, opracowano system eksperymentalny, w którym zygoty, które analizowano przez regenerację fluorescencji po fotowybielaniu, mogą rozwijać się do terminu bez żadnych znaczących uszkodzeń. Co ważne, ten eksperymentalny system wymaga jedynie grzałki termosowej oprócz konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego. Wyniki tego badania sugerują, że odzyskiwanie fluorescencji po analizie fotowybielania (FRAP) można wykorzystać do zbadania, czy zdarzenia molekularne w chromatynie zygotycznej są ważne dla długoterminowego rozwoju.

Wprowadzenie

Po zapłodnieniu, struktura chromatyny zmienia się dynamicznie, a struktura chromatyny zygotycznej jest ostatecznie ustalana1,2. W tym okresie w ojcowskich przedjądrzach dominujące białko chromatyny zmienia się z protaminy w histon. Otrzymana chromatyna jest skrajnie różna od chromatyny plemników i oocytów żeńskich w kilku punktach (np. skład wariantu histonu, modyfikacja histonów). W związku z tym uważa się, że utworzona chromatyna zygotyczna jest ważna dla późniejszego rozwoju embrionalnego. Jednak pomimo wysiłków zmierzających do ujawnienia szczegółów struktury chromatyny zygotycznej w długich okresach, nigdy nie ustalono metod oceny jakości zygot lub przewidywania ich pełnego rozwoju w stadium jednokomórkowym poprzez analizę ich struktury chromatyny.

W poprzednim badaniu odkryto, że zygoty mają bardzo rozluźnioną strukturę chromatyny3. Obecnie uważa się, że luźność lub otwartość chromatyny jest ważnym czynnikiem wpływającym na potencjał różnicowania komórkowego w embrionalnych komórkach macierzystych (ES)4. Komórki ES nie wykazują jednorodności w naturze, ale są raczej niejednorodne; w koloniach komórek ES niektóre przejściowo uzyskują wyższy potencjał różnicowania porównywalny z blastomerami zarodków w stadium dwukomórkowym. Podczas tego przejścia do stanu podobnego do dwukomórkowego, luźność chromatyny w komórkach ES zmienia się w to, co jest porównywalne z zarodkami w stadium dwukomórkowym5. Tak więc luźność chromatyny wydaje się być ważna dla potencjału różnicowania komórkowego i możliwe, że szeroko otwarta chromatyna w zygotach jest przydatna do oceny potencjału rozwojowego zygoty.

Obrazowanie na żywo jest potężnym narzędziem, które pozwala na analizę zdarzeń molekularnych podczas ontogenezy, ponieważ ta metoda pozwala na późniejszy rozwój, a nawet na pełny rozwój6. Jako jedna z metod obrazowania na żywo, analiza FRAP została wykorzystana do zbadania luźności chromatyny w zarodkach preimplantacyjnych i komórkach ES3,4,5. Jeśli luźność chromatyny zygotycznej może być analizowana bez szkodliwego wpływu na rozwój w pełnym okresie za pomocą analizy FRAP, może to być cenne narzędzie do oceny jakości zarodków w stadium jednokomórkowym. Nie zbadano jednak wpływu tej metody eksperymentalnej na rozwój w pełnym okresie. Niedawno opracowano eksperymentalny system wykorzystujący FRAP do oceny luźności chromatyny zygotycznej. Ponieważ był to nowy system obserwacji zygot, został on nazwany zygotycznym FRAP (zFRAP). zFRAP nie miał krytycznego wpływu na rozwój w pełnym okresie i został opisany gdzie indziej7. W niniejszym raporcie opisano protokół tej metody eksperymentalnej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

To badanie zostało przeprowadzone w ścisłej zgodności z zaleceniami zawartymi w Przewodniku do opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych Uniwersytetu Yamanashi. Protokół został zatwierdzony przez Komitet ds. Etyki Doświadczeń na Zwierzętach Uniwersytetu Yamanashi (numer zezwolenia: A24-50). Wszystkie operacje przeprowadzano w znieczuleniu tribromoetanolowym i dołożono wszelkich starań, aby zminimalizować cierpienie. Ilustrowany przegląd procedur i harmonogram są pokazane odpowiednio w Rysunek 1 i Tabela 1.

1. Przygotowanie informacyjnego RNA (transkrypcja in vitro mRNA eGFP-H2B)

  1. Linearyzuj 5 μg matrycy DNA pTOPO-eGFP-H2B3,7 z 30 U Not I w 50 μL w temperaturze 37 °C przez noc.
  2. Zbierz 1,5 μl strawionego DNA, aby potwierdzić, czy zostało całkowicie strawione przez elektroforezę.
    1. Nanieść odpowiednio 1,5 μl i 3 - 5 μl niestrawionego DNA z barwnikiem ładującym do dołka 2% żelu agarozowego i poddać elektroforezie.
      UWAGA: W przypadku całkowitego strawienia obserwuje się pojedyncze prążko (ok. 5 kb). Niestrawione DNA jest używane jako kontrola, która pojawia się w innej pozycji.
  3. Dodać 151,5 μl ddH2O i 200 μl fenolu/chloroformu/alkoholu izoamylowego (25:24:1) do pozostałego strawionego DNA.
    1. Wymieszać energicznie za pomocą wiru.
    2. Wirować z maksymalną prędkością przez 15 min.
  4. Odzyskać sklarowany osad, a następnie dodać 200 μl chloroformu.
    1. Wymieszać energicznie za pomocą wiru.
    2. Wirować z maksymalną prędkością przez 15 minut.
  5. Odzyskać supernatant, a następnie dodać 20 μl octanu sodu 3M i 1,5 μl echaminwięźniu.
    1. Wymieszać energicznie za pomocą wiru.
    2. Dodać 550 μl 100% etanolu, a następnie energicznie wymieszać wirowo.
    3. Wirować z maksymalną prędkością przez 15 minut.
    4. Wyrzucić supernatant, a następnie przemyć osad 70% etanolem.
    5. Suszyć granulki przez odparowanie przez 5 - 10 minut.
  6. Rozpuść wytrącone plazmidowe DNA w 8 μl wody wolnej od nukleaz
    7. .
  7. Oceń stężenie plazmidu (oczekiwane stężenie to około 300 - 500 ng/μL) za pomocą nanokropli, postępując zgodnie z instrukcją producenta.
  8. Przeprowadzić transkrypcję in vitro mRNA kodującego eGFP-H2B z 1 μg oczyszczonego DNA jako matrycy w 20 μl całkowitej objętości reakcji, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
    1. Po transkrypcji in vitro dodaj 36 μl wody, a następnie odzyskaj 1,5 μl z 56 μl zsyntetyzowanego mRNA do analizy za pomocą elektroforezy (jak bez poli A).
  9. Wykonaj ogonowanie poli A dla zsyntetyzowanego mRNA w objętości reakcyjnej 100 μl, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
  10. Dodaj 60 μl roztworu wytrącającego chlorek litu do mRNA z poli A ogoniastym eGFP-H2B, a następnie energicznie wymieszaj.
    1. Schłodzić w temperaturze -30 °C przez 30 min.
    2. Wirować z maksymalną prędkością przez 15 minut.
    3. Wyrzucić supernatant, a następnie przemyć osad 70% etanolem.
    4. Suszyć granulki przez odparowanie przez 5 - 10 minut.
  11. Rozpuścić osad w 20 μl wody wolnej od nukleaz, ogrzewając w temperaturze 55 °C przez 30 minut.
  12. Oceń stężenie wytrąconego mRNA za pomocą nanokropli. Rozcieńczyć do 500 ng/μl wodą wolną od nukleaz i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia.
  13. Potwierdź preferowaną produkcję mRNA; poddaj 1 μl mRNA z/bez (uzyskane odpowiednio w krokach 1.8.1 i 1,12) ogona poli A zmieszanego z 1,5 μl 0,1 mg/ml bromku etydyny i 3 μl barwnika ładującego próbkę do analizy elektroforetycznej. Zastosowana objętość wynosiła 5,5 μL.
    UWAGA: Jeśli ogonowanie Poly A zakończyło się sukcesem, należy zaobserwować przesunięte prążki w porównaniu z mRNA bez ogona poli A (Rysunek 2A).

2. Przygotowanie samców myszy poddanych wazektomii

  1. Zważ samce myszy ICR w wieku 8 - 12 miesięcy za pomocą wagi.
  2. Wstrzyknąć dootrzewnowo samcom myszy 0,7 - 0,9 ml 1,2% znieczulenia tribromoetanolowego.
    UWAGA: Ilość znieczulenia zależy od wielkości myszy. Na przykład myszy o wadze 40 g wstrzykuje się 0,8 ml znieczulenia tribromoetanolowego.
  3. Zwilż jagodę 70% etanolem.
  4. Wykonaj małe nacięcie (3 - 5 mm) na jagodzie, a następnie wykonaj nacięcie na ścianie mięśniowej za pomocą nożyczek.
    UWAGA: Nożyczki i kleszcze należy oczyścić 70% etanolem przed rozpoczęciem zabiegu.
  5. Chwyć poduszeczkę tłuszczową kleszczami i delikatnie ją wyciągnij. Następnie pojawiają się jądra i nasieniowody.
    UWAGA: Vas deferens to rurka w kształcie litery U z czerwonym naczyniem krwionośnym.
  6. Zwiąż nasieniowody w dwóch punktach szwami chirurgicznymi, a następnie wytnij środkową część między związanymi punktami.
  7. Delikatnie wepchnij poduszeczkę tłuszczową i jądro do jagody.
    1. Powtórz operację z pozostałym jądrem.
  8. Zszyj ścianę mięśniową dwoma szwami ze szwem chirurgicznym.

3. Zapłodnienie in vitro

  1. Wstrzyknąć 8 - 10-tygodniowym samicom myszy B6D2F1 (BDF1) dootrzewnowo 7,5 j.m. końskiej gonadotropiny kosmówkowej (eCG) i ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej (hCG) w odstępie 46 - 50 godzin.
  2. Przygotuj krople 300 μl ludzkiego płynu jajowodowego (HTF)8 pożywki do kapacytacji i inseminacji 1 dzień przed zapłodnieniem in vitro w naczyniu o średnicy 30 mm, przykryj te krople olejem mineralnym na stole laboratoryjnym, a następnie wstępnie inkubuj w inkubatorze przez noc.
  3. Ofiaruj dojrzałe samce myszy ICR przez zwichnięcie szyjki macicy. Wypreparuj ogon najądrza za pomocą igły 27-G i zbierz plemniki. Hodować je w celu uzyskania pojemności w 300 μl pożywki HTF przez 1 - 2 godziny w temperaturze 38 °C.
  4. 16 godzin po wstrzyknięciu hCG poświęć super owulowane samice myszy przez zwichnięcie szyjki macicy. Przenieś bańkę jajowodu do oleju mineralnego obok pożywki HTF, a następnie wyciągnij kompleks komórek wzgórka i oocytów z tej bańki jajowodu za pomocą igły 30-G do preinkubowanej pożywki do inseminacji-HTF.
    nuta: Niektóre samice myszy często nie wykazują owulacji pomimo leczenia super owulacją. Powiększona bańka jajowodu jest oznaką owulacji.
  5. Po kapacytacji przenieść 2 - 3 μL zpojemnościonego plemnika do pożywki inseminacyjnej HTF, w której pobrano owulowane oocyty.
  6. 1 godzinę po inseminacji zebrać zapłodnione zygoty i potraktować je hialuronidazą w stężeniu 100 μg/ml przez 10 minut w CZB9 media.
    nuta: Gdy inseminacja zostanie wykonana prawidłowo, 1 godzinę po inseminacji, obserwuje się zapłodnione zygoty z 2ciałem polarnym. Jeśli używa się plemników o mniejszej lub niskiej jakości, obserwuje się tylko małe zygoty z 2.ciałem biegunowym. Ponadto, jeśli do inseminacji używa się wielu plemników, dochodzi do polispermii. Prawidłowa inseminacja prowadzi do powstania zygot z przedjądrzami męskimi i żeńskimi. Korzystając z tych kryteriów, można stwierdzić, czy inseminacja jest przeprowadzona dobrze, czy nie.
    1. Po umyciu w pożywce CZB zygoty z drugim ciałem polarnym poddać mikroiniekcji mRNA eGFP-H2B.

4. Przygotowanie pipet komorowych i mikroiniekcyjnej

  1. Rozcieńczyć RNA kodujące eGFP-H2B za pomocą wody wolnej od nukleaz w celu uzyskania stężenia 250 ng/μL.
  2. Przygotuj 2 - 3 krople PVP-HTF i eGFP-H2B mRNA i 5 - 6 kropli Hepes buforowanych CZB (H-CZB) na 60-milimetrowej szalce. Przykryj te krople olejem mineralnym.
    UWAGA: Preparaty te można wykonywać na stole laboratoryjnym. Nie ma wymogu stosowania szafy z laminarnym przepływem powietrza.
  3. Pociągnij szkło borokrzemianowe za pomocą ściągacza do mikropipet (np. P = 500, ciepło = 825, ciągnięcie = 30, vel = 120 i czas = 200)
  4. Po złamaniu końcówki pipety należy zegnąć wyciągniętą szklaną pipetę do mikroiniekcji blisko końcówki (−300 μm do tyłu) pod kątem około 30° za pomocą mikrokuźni.

5. Mikroiniekcja

  1. Wyłącz grzałkę płytkową na stoliku mikromanipulatora, aby zapobiec zabiciu zygot piezoelektrycznym podczas wstrzykiwania mRNA.
  2. Umyć i pokryć wnętrze igieł iniekcyjnych preparatem HEPES-buffered-HTF zawierającym 10% PVP (PVP-HTF).
    3. Zbierz zapłodnione zygoty za pomocą drugiego ciała polarnego (Rysunek 2B) i przenieś 20 - 25 zygot do komory stolika mikroskopowego przymocowanego za pomocą mikromanipulatora.
  4. Wypełnij rozcieńczone mRNA eGFP-H2B do kapilar ze szkła borokrzemianowego z końcówek.
  5. Przytrzymaj zygotę pipetą podtrzymującą, a następnie rozbij osłonkę przejrzystą i błonę cytozolową za pomocą napędu piezoelektrycznego.
  6. Wstrzyknij około 10 pL mRNA do cytoplazmy zygot. Zakończ wstrzykiwanie mRNA w ciągu 10 minut, aby zapobiec uszkodzeniom spowodowanym dłuższą hodowlą zygot poza inkubatorem.
    nuta: Objętość wstrzyknięcia powinna być tak duża, jak 2.korpus biegunowy. Jeśli ilość wstrzykniętego mRNA jest zbyt duża, możliwe jest spowodowanie powstania wolnej frakcji eGFP-H2B, co może wpływać na frakcję ruchomą.
  7. 10 minut po mikroiniekcji przemyć co najmniej 3 krople, a następnie wyhodować wstrzyknięte zygoty w CZB w temperaturze 38 °C do czasu analizy zFRAP.

6. Analiza zFRAP

  1. Na 1 godzinę przed analizą zFRAP należy włączyć laser i płytę grzejną przymocowane do stolika mikroskopu konfokalnego. Ustaw temperaturę na 38 °C.
  2. Umieść 6 - 10 μl buforowanej przez HEPES pożywki CZB pokrytej olejem mineralnym na szklanym naczyniu o średnicy 60 mm i podgrzej na grzejniku do momentu zebrania zygoty.
  3. 8 - 12 godzin po inseminacji zebrać 5-10 zygot eksprymujących eGFP-H2B i przenieść do 6 - 10 μl wstępnie podgrzanej pożywki CZB buforowanej przez HEPES, kropli.
    UWAGA: Aby uniknąć dłuższej hodowli poza inkubatorem, przy każdej analizie użyto 5 - 10 zygot wykazujących ekspresję eGFP-H2B. W ciągu 1 godziny można przeanalizować od 5 do 10 zygot.
  4. Ustaw warunki wybielania i obrazowania zgodnie z instrukcjami producenta. Przypadek konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego (tabela materiałów) pokazano poniżej:
    1. Użyj obiektywu olejowego 60X (60X 60X/1.35 oleju).
      UWAGA: Obiektywy o większym powiększeniu (większa przysłona numeryczna) wykazują wyższą czułość.
    2. Ustaw szybkość skanowania na 4,0 μs/piksel, a rozmiar na "512" w "Ustawieniach akwizycji" (rysunek uzupełniający 1).
    3. Zwiększ zoom cyfrowy do "5" (rysunek uzupełniający 1).
      UWAGA: Większy zoom jest wymagany, aby rozpoznać, czy występuje przesunięcie ostrości, czy nie.
    4. Otwórz listę barwników (rysunek uzupełniający 1), a następnie wybierz "EGFP". Ustaw czas obserwacji na 1,6 s (interwał jest ustawiony jako ustawienie "swobodnego biegu") (Rysunek uzupełniający 1)
      UWAGA: Więcej punktów obserwacyjnych może spowodować bardziej szczegółowe dane, ale może również spowodować fototoksyczność. W analizie zFRAP czas obserwacji wynoszący 1,6 s wydaje się być wystarczający do wykrycia rodzicielskiej asymetrii luzu chromatyny.
    5. Ustaw łączną liczbę zdjęć na 12 (Rysunek uzupełniający 1).
    6. Uruchom panel "Ustawienie bodźca", a następnie kliknij "Główny" na UseScanner. Ustaw szybkość skanowania na 10,0 μs/piksel. Kliknij "Aktywacja w serii", a następnie ustaw Wstępna aktywacja jako "3 klatki", a Czas aktywacji jako "5 sekund" (Rysunek uzupełniający 1).
    7. Kliknij "Ostrość x 2" i ustaw ostrość, a następnie "Zatrzymaj".
    8. Ustaw moc lasera do wybielania i obrazowania (477 nm) odpowiednio na 110 i 15 μW, dostosowując "moc lasera" (rysunek uzupełniający 1).
      UWAGA: Bardzo silne wybielanie może spowodować większe wybielone obszary, co powoduje trudności w analizie ilościowej. Do pomiaru mocy lasera należy użyć miernika mocy. Ważne jest, aby potwierdzić moc lasera, aby uniknąć efektu pogorszenia mocy lasera związanego z czasem.
    9. Kliknij "Clip Rect" (Rysunek uzupełniający 1) w panelu Ustawienia bodźca. Ustaw obszar zainteresowania (ROI; czerwony; ROI #1B) jako 40 x 40 pikseli (7,6 μm2). Przygotuj region odniesienia (REF; zielony; ROI #2) i tło (BG; niebieskie; ROI #3) za pomocą "kopiuj ROI" i "wklej ROI" (przycisk prawego przycisku myszy myszy).
      UWAGA: Rozmiar piksela można ustawić za pomocą "Menedżera ROI", który można wywołać, klikając prawy przycisk myszy, gdy kursor znajduje się na ROI. Uważa się, że większe zwroty z inwestycji są lepsze, ponieważ mogą ustandaryzować rozproszenie wyniku zFRAP. Jednak zbyt duży zwrot z inwestycji nie może być użyty do tej analizy, ponieważ utrudnia to uniknięcie ciała prekursorowego jąderka (NPB). Uważano, że eGFP-H2B w tym przedziale jest wolny od chromatyny i wykazywał znacznie wyższą mobilność3. Obszary ROI i REF powinny być od siebie oddzielone w jak największym stopniu. Jeśli te dwa regiony są blisko, wybielanie może również wpływać na obszar REF.
    10. Kliknij "Na żywo" na pasku narzędzi, a następnie uruchom "Wykres na żywo" (rysunek uzupełniający 1).
      UWAGA: Wykres na żywo wskazuje intensywność sygnału fluorescencji w każdym ROI i służy do regulacji mocy lasera za pomocą HV. Należy pamiętać, że jeśli ROI nie zostanie wybrane, intensywność nie zostanie wykryta na panelu Wykres na żywo.
    11. Określanie pozycji ROI
      UWAGA: ROI można przesunąć, przeciągając do żądanej pozycji w przedjądrzach. (1) Upewnij się, że unikasz jąderka i (2) dopasuj cały ROI do nukleoplazmy. Nie zawierają obszaru poza obszarem błony jądrowej (cytoplazmy) w ROI. Lokalizacja eGFP-H2B jest wysoce ograniczona w nukleoplazmie, dzięki czemu łatwo jest stwierdzić, czy ROI zawiera cytoplazmę, czy nie, na podstawie fluorescencji eGFP-H2B. Przedjądrza męskie są zwykle większe niż u samic, które często są zlokalizowane w pobliżu 2.ciała biegunowego. Korzystając z tych kryteriów, oceń przedjądrza męskie lub żeńskie.
    12. Kliknij "Ostrość x 2" (rysunek uzupełniający 1), a następnie dostosuj miernik mocy WN kanału dla EGFP do intensywności fluorescencji na około 2000 (intensywność fluorescencji można zobaczyć w oknie "wykres na żywo").
  5. Kliknij "Czas", a następnie "XY" (Rysunek uzupełniający 1), aby rozpocząć analizę zFRAP.
    UWAGA: Jeśli przycisk "Czas" jest odpowiednio wybrany, na przycisku "XY" pojawia się "t".
    1. Kliknij "Series Done" (Rysunek uzupełniający 1), który pojawia się po obrazowaniu FRAP w pobliżu "przycisku XY", a następnie uzyskaj dane przeanalizowane przez FRAP.
    2. Zapisz plik "2D View-Image XXXXX" jako preferowany plik nazwany (oib. format pliku) za pomocą "zapisz jako" (można również użyć Ctrl + Shift + S).
    3. Wybierz ROI, REF i BG, a następnie kliknij (można również użyć Ctrl+A) "Analiza serii" w oknie "Obraz widoku 2D".
    4. Uzyskaj dane FRAP wiersza, a następnie kliknij przycisk "zapisz" w oknie wykresu na żywo.
      UWAGA: Dane ilościowe FRAP wiersza są zapisywane jako plik csv.
  6. Aby nie kontrolować zFRAP, umieść niektóre zygoty, którym wstrzyknięto mRNA, na kropli, która znajduje się blisko krawędzi naczyń ze szklanym dnem, aby uniknąć efektu obserwacji fluorescencji.

7. Obliczanie danych

  1. Korzystając z uzyskanych danych ilościowych, należy wykonać wykres "krzywej odzysku" i "frakcji ruchomej" w programie Excel, jak pokazano w referencji3,7 z pewnymi modyfikacjami (patrz poniżej i uzupełniający plik Excel).
  2. Oblicz względną intensywność, odejmując wartość BG od wartości ROI i REF na 12 obrazkach dla każdego punktu czasowego.
  3. Podziel wartość ROI przez wartość REF. W rezultacie można uzyskać 12 standaryzowanych wyników intensywności względnej w każdym punkcie czasowym.
  4. Oblicz średnią względnego wyniku dla ROI na 3 zdjęciach wykonanych przed wybielaniem zdjęć.
  5. Oblicz wskaźnik odzysku. Podziel 12 uzyskanych względnych wyników zwrotu z inwestycji na zdjęciach wykonanych w każdym punkcie czasowym (uzyskanych w 7.1.2.) przez średnią względnego wyniku przed wybielaniem zdjęć (uzyskanego w 7.1.3.). Narysuj krzywą odzysku, korzystając z tych wyników (Rysunek 2E).
  6. Oblicz szybkość bielenia.
    UWAGA: Szybkość wybielania (%) = 100 - szybkość regeneracji 4. obrazu.
  7. Oblicz ułamek ruchomy (MF), korzystając z następującego wzoru10,11,12
    MF (%) = 12th recovery rate (w punkcie końcowym) - 4th recovery rate / bielenie × 100.

8. Transfer zarodków

  1. Partneruj dojrzałe samice ICR w wieku 8-12 miesięcy z samcami myszy ICR poddanych wazektomii w noc przed transferem zarodków, pozwalając im przebywać w tej samej klatce na noc.
  2. Zbierz zarodki, które zostały przeanalizowane za pomocą zFRAP i określone do rozwoju do stadium dwukomórkowego.
  3. Samicom myszy wstrzyknąć dootrzewnowo 0,7 - 0,9 ml 1,2% znieczulenia tribromoetanolowego lub 0,35 - 0,45 ml mieszaniny 0,75/4/5 mg/kg medetomidyny/midazolamu/butorfanolu przed transferem zarodków.
    UWAGA: Objętość znieczulenia zależy od masy ciała myszy. Tribromoetanol: 0,2 ml/10 g masy ciała; Mieszanina medetomidyny/midazolamu/butorfanolu: 0,1 ml/ 10 g masy ciała.
    1. Przenieś te dwukomórkowe zarodki do jajowodów samic myszy ICR w ciąży rzekomej za pomocą czopa dopochwowego w 0,5 dnia po stosunku (dpc).
    2. Po transferze zarodków umieść samice myszy na grzejniku ustawionym na 37 °C, aż się obudzą.
  4. Po 18,5 dpc poświęć matkę zastępczą przez zwichnięcie szyjki macicy i odzyskaj młode pochodzące z zygot analizowanych przez zFRAP przez cesarskie cięcie. Niektóre z odzyskanych szczeniąt zostały dostarczone do matki zastępczej, a ich masa ciała była oceniana co tydzień.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Analiza zFRAP z użyciem eGFP-H2B

Prawidłowo otrzymane mRNA kodujące eGFP-H2B, widoczne jako przesunięty prążek spowodowany poliadenylacją (Ryc. 2A), wstrzyknięto do cytoplazmy zygot z drugim ciałkiem polarnym w czasie od 1 do 3 h po inseminacji (Ryc. 2B). Od ośmiu do dwunastu godzin po inseminacji zebrano zygoty z dwoma jąderkami wykazujące ekspresję eGFP-H2B i poddano je ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Jak ujawniono w tym badaniu, analiza zFRAP nie powoduje krytycznych uszkodzeń dla pełnego rozwoju, co sugeruje, że metoda ta jest bardzo użytecznym narzędziem do ujawnienia związku między zdarzeniami molekularnymi a embrionalnym potencjałem rozwojowym. Podczas przeprogramowania, do stanu dwukomórkowego komórek ES, w wyniku którego potencjał różnicowy tych komórek staje się tak wysoki, jak w przypadku zarodków w stadium dwukomórkowym, rozluźnienie chromatyny zmienia się na porównywalne z zarodkami w stadium

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Satoshi Kishigami, Sayaka Wakayama, Hiroaki Nagatomo, Satoshi Kamimura i Kana Kishida za krytyczne komentarze i wsparcie techniczne. Praca ta została częściowo sfinansowana przez program Ministerstwa Edukacji, Kultury, Sportu, Nauki i Technologii mający na celu promowanie reformy krajowych uniwersytetów do M.O.; Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki (16H02593), Fundacja Naukowa Asada oraz Fundacja Naukowa Takeda do T.W. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Konfokalny mikroskop skaningowyOlympusFV1200FV1000 może być również używany do analizy FRAP (odniesienie #7)
Płyta termicznaTokai HitTP-110RH26
Mikroskop odwróconyOlympusIX71
Mikro manupilatorNarishigeMMO-202ND
Mikromanipulator PiezePrime techPMAS-CT150
35 mm naczynie hodowlaneFalcom351008styl 35 x 100 mm; do IVF
Naczynie hodowlane 60 mmFalcom351007styl 60 x 15 mm; do hodowli zarodków
Naczyniehodowlane Falcom35100650 mm 50 x 9 mm; do manipulacji na stoliku
Naczynie ze szklanym dnem 50 mmMatsunamiD910400Szalka 50 mm, 27 mm & rozmiar otworu; do analizy FRAP
Olej mineralnyOrganiczne chemikalia specjalistyczne625071Do analizy FRAP na szklanych naczyniach dennych
Olej mineralnySigmaM8410-1LDo zapłodnienia in vitro i hodowli zarodków
szklana kapilarnaDrummond1-000-1000Do obsługi zygot mysich
Szkło borokrzemianowePrime techB100-75-10-PTDo mikroiniekcji mRNA
Ściągacz do mikropipetPrzyrząd SutterP-97/IVFDo przygotowania iniekcji lub trzymania w pozycji gładkiej (średnica strony zewnętrznej: 80 &mikro; m, średnica wewnętrzna: 10 µ m) 
Mikrokuźnia  NarishigeMF-900
mMESSAGE MACHINE SP6 Zestaw do transkrypcjiThermo
Fisher scientific		AM1340
Zestaw do usuwania części polimerowych (A)Thermo
Fisher scientific		AM1350
Roztwór PVP 10% (PVP-HTF)IrvineSceientific99311HEPES buforowany HTF zawierający 10% PVP
Sód HEPESSigmaH3784
pTOPO eGFP-H2BMatryca plazmidu dla mRNA eGFP-H2B (odniesienie #6)
NorthernMax Gly Ładowanie próbki Barwnik Thermo
Fisher scientific		AM8551Do elektroforezy transkrybowanego mRNA in vitro
Fenol chloroform alkohol izamylowynacalai tesque25970-14
Chloroformnacalai tesque  08401-65
NieI TOYOBONOT-111X
Więzień EthachinmateWAKO318-01793
3664 Miernik mocy OticalHioki3664  Miernik mocy lasera
Mikroskop stereoskopowyOlympusSZX16

Bibliografia

  1. Burton, A., Torres-Padilla, M. E. Epigenetic reprogramming and development: a unique heterochromatin organization in the preimplantation mouse embryo. Brief Funct Genomics. 9, 444-454 (2010).
  2. Okada, Y., Yamaguchi, K. Epigenetic modifications and reprogramming in paternal pronucleus: sperm, preimplantation embryo, and beyond. Cell Mol Life Sci. 74, 1957-1967 (2017).
  3. Ooga, M., Fulka, H., Hashimoto, S., Suzuki, M. G., Aoki, F. Analysis of chromatin structure in mouse preimplantation embryos by fluorescent recovery after photobleaching. Epigenetics. 11, 85-94 (2016).
  4. Meshorer, E., et al. Hyperdynamic plasticity of chromatin proteins in pluripotent embryonic stem cells. Dev Cell. 10, 105-116 (2006).
  5. Boskovic, A., et al. Higher chromatin mobility supports totipotency and precedes pluripotency in vivo. Genes Dev. 28, 1042-1047 (2014).
  6. Yamagata, K., Ueda, J. Long-term live-cell imaging of mammalian preimplantation development and derivation process of pluripotent stem cells from the embryos. Dev Growth Differ. 55, 378-389 (2013).
  7. Ooga, M., Wakayama, T. FRAP analysis of chromatin looseness in mouse zygotes that allows full-term development. PLoS One. 12, e0178255(2017).
  8. Quinn, P., Begley, A. Effect of human seminal plasma and mouse accessory gland extracts on mouse fertilization in vitro. Australian journal of biological sciences. 37, 147-152 (1984).
  9. Chatot, C. L., Lewis, J. L., Torres, I., Ziomek, C. A. Development of 1-cell embryos from different strains of mice in CZB medium. Biology of reproduction. 42, 432-440 (1990).
  10. Bae, J., Sung, B. H., Cho, I. H., Song, W. K. F-actin-dependent regulation of NESH dynamics in rat hippocampal neurons. PLoS One. 7, e34514(2012).
  11. Dieteren, C. E., et al. Defective mitochondrial translation differently affects the live cell dynamics of complex I subunits. Biochim Biophys Acta. 1807, 1624-1633 (2011).
  12. Subramanian, V., et al. H2A.Z acidic patch couples chromatin dynamics to regulation of gene expression programs during ESC differentiation. PLoS Genet. 9, e1003725(2013).
  13. Hayashi-Takanaka, Y., et al. Tracking epigenetic histone modifications in single cells using Fab-based live endogenous modification labeling. Nucleic Acids Res. 39, 6475-6488 (2011).
  14. Yamazaki, T., Yamagata, K., Baba, T. Time-lapse and retrospective analysis of DNA methylation in mouse preimplantation embryos by live cell imaging. Dev Biol. 304, 409-419 (2007).
  15. Puschendorf, M., et al. PRC1 and Suv39h specify parental asymmetry at constitutive heterochromatin in early mouse embryos. Nat Genet. 40, 411-420 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

FRAP zygotymikroskopia konfokalnamikroiniekcjamRNA eGFP-H2Brozwój zygotyobrazowanie na żywopodgrzewacz płyty termicznej
Odzyskiwanie fluorescencji zygotycznej po analizie fotowybielania pod kątem luźności chromatyny, która umożliwia pełny rozwój
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.