Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Optymalizacja genetycznego włączenia sond chemicznych do GPCR w celu mapowania fotosieciowania i chemii bioortogonalnej w żywych komórkach ssaków

8.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57069

⸱

9 kwietnia 2018

 ,  ,  , 
1Institute of Biochemistry, Faculty of Life Sciences, University of Leipzig

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiono łatwy test fluorescencyjny w celu oceny skuteczności par syntetazy amino-acyl-tRNA/tRNA zawierających niekanoniczne aminokwasy (ncAA) do białek ulegających ekspresji w komórkach ssaków. Opisano zastosowanie ncAA do badania receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR), w tym fotosieciowanie miejsc wiązania i bioortogonalne znakowanie GPCR na żywych komórkach.

Streszczenie

Genetyczna inkorporacja niekanonicznych aminokwasów (ncAA) poprzez tłumienie kodonu bursztynowego stop jest potężną techniką instalowania sztucznych sond i reaktywnych ugrupowań na białkach bezpośrednio w żywej komórce. Każdy ncAA jest włączany przez dedykowaną ortogonalną parę supresora-tRNA/amino-acylo-tRNA-syntetazy (AARS), która jest importowana do organizmu gospodarza. Skuteczność inkorporacji różnych ncAA może się znacznie różnić, a w niektórych przypadkach być niezadowalająca. Pary ortogonalne można poprawić, manipulując AARS lub tRNA. Jednak ukierunkowana ewolucja tRNA lub AARS przy użyciu dużych bibliotek i metod selekcji martwe/żywe nie jest możliwa w komórkach ssaków. W tym artykule przedstawiono łatwy i solidny test oparty na fluorescencji do oceny skuteczności par ortogonalnych w komórkach ssaków. Test umożliwia badanie przesiewowe od dziesiątek do setek wariantów AARS/tRNA przy umiarkowanym wysiłku i w rozsądnym czasie. Opisano zastosowanie tego testu do generowania nowych tRNA, które znacznie poprawiają wydajność ortogonalnego układu pirolizyny, wraz z zastosowaniem ncAA do badania receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR), które są trudnymi obiektami dla mutagenezy ncAA. Po pierwsze, poprzez systematyczne wprowadzanie fotosieciującego ncAA na zewnątrzkomórkowej powierzchni receptora, miejsca wiązania różnych ligandów na nienaruszonym receptorze są mapowane bezpośrednio w żywej komórce. Po drugie, poprzez włączenie ncAA ostatniej generacji do GPCR, zademonstrowano ultraszybkie znakowanie receptorów wolnych od katalizatorów za pomocą barwnika fluorescencyjnego, które wykorzystuje bioortogonalną, promowaną przez szczep odwrotną cykloaddycję Dielsa Aldera (SPIEDAC) na żywej komórce. Ze względu na to, że ncAA mogą być ogólnie stosowane do dowolnego białka niezależnie od jego wielkości, metoda ta ma ogólne znaczenie dla wielu zastosowań. Ponadto inkorporacja ncAA nie wymaga żadnego specjalnego sprzętu i jest łatwa do przeprowadzenia w standardowych laboratoriach biochemicznych.

Wprowadzenie

Genetyczne włączenie sond chemicznych do białek jest potężną metodą ułatwiającą badanie strukturalnych i dynamicznych aspektów funkcji białek bezpośrednio w natywnym kontekście żywej komórki. Obecnie setki niekanonicznych aminokwasów (ncAA) wyposażonych w najbardziej zróżnicowane grupy chemiczne mogą być specyficznie włączane do białek w procesie biosyntezy1,2,3,4. Pomiędzy nimi znajdują się światłoczułe ncAA, takie jak foto-crosslinkery5, photo-caged6,7,8,9 oraz fotoprzełączalne aminokwasy10,11, aminokwasy zawierające naprężone alkeny i alkiny do bioortogonalnej chemii bez katalizatora2,12,13,14,15,16,17, aminokwasy niosące Dansyl18, coumarin9,19, oraz prodan20,21 Fluorofory i aminokwasy wyposażone w inne sondy biofizyczne, a także w modyfikacje potranslacyjne1,2,3,4,22,23,24,25.

Kodowanie genetyczne ncAA jest możliwe dzięki dedykowanej syntetazie amino-acyl-tRNA (AARS) sparowanej z pokrewnym supresorem tRNA, który włącza ncAA w odpowiedzi na bursztynowy kodon stop podczas regularnej syntezy rybosomalnej. Pary ncAARS/tRNA są zaprojektowane tak, aby były ortogonalne w organizmie gospodarza, tzn. nie przesłuchiwały się z parami endogennymi. Technika ta jest dobrze znana zarówno w przypadku gospodarzy prokariotycznych, jak i eukariotycznych i łatwa do zastosowania w komórkach ssaków. Pary do inkorporacji ncAA w komórkach ssaków opierają się na trzech głównych układach ortogonalnych: systemie tyrozylowym, który łączy TyrRS z E. coli26 z tyrozylobursztynowym supresorem z B. stearothermophilus27 (para EcTyrRS/BstYam), system leucylowy E. coli (para EcLeuRS/tRNALeuCUA)6,18,28 i archeonowy system pirolizylowy (para PylRS/tRNAPyl)3, przy czymtRNA Pyl jest naturalnym bursztynowym supresorem. Ogólnie rzecz biorąc, każdy ncAA jest rozpoznawany przez wyspecjalizowany ncAARS. W zależności od struktury ncAA, ncAARS uzyskuje się poprzez ukierunkowaną ewolucję TyrRS, LeuRS lub PylRS, chociaż niektóre syntetazy mogą akceptować więcej niż jeden ncAA.

Para ortogonalna jest importowana do komórek za pomocą wektora plazmidowego. Najpowszechniejsze i najbardziej wydajne plazmidy są bicystroniczne i kodują zarówno syntetazę, jak i tRNA, tworząc parę ortogonalną29. Drugi plazmid kodujący białko będące przedmiotem zainteresowania, zawierający bursztynowy kodon w miejscu przeznaczonym do modyfikacji, jest kotransfekowany. ncAA jest po prostu dodawany do pożywki do wzrostu komórek. Jednak różne wyspecjalizowane grupy często używają różnych wariantów konstruktów plazmidowych, nawet do włączenia tego samego ncAA. Konstrukty różnią się rozmieszczeniem genów w wektorze, rodzajem syntetazy, zastosowaniem kodonu w genie syntetazy, użyciem promotora, wariantem tRNA i liczbą kaset ekspresyjnych tRNA. Co więcej, wydajność inkorporacji różnych ncAA może się drastycznie różnić ze względu na różną wydajność katalityczną różnych syntetaz, jakość tRNA i inne czynniki30. Dlatego ważne jest, aby mieć pod ręką szybką i niezawodną metodę oceny wydajności pary ortogonalnej, zarówno w celu wyboru najbardziej odpowiedniego systemu do pożądanego zastosowania, jak i wykonania pewnych kroków optymalizacyjnych, które poprawiają ogólną wydajność ekspresji białek.

Stworzyliśmy prosty i solidny test oparty na fluorescencji, aby ocenić efektywność par ortogonalnych29 (Rysunek 1). W teście komórki są kotransfekowane z plazmidem kodującym parę ortogonalną, wraz z bicystronicznym plazmidem reporterowym kodującym zarówno białko zielonej fluorescencji z bursztynowym kodonem stop w pozycji permisywnej (EGFPTAG), jak i gen mCherry. Czerwona i zielona fluorescencja lizatów całokomórkowych są odczytywane w oddzielnych kanałach na czytniku płytkowym w płytce 96-dołkowej. Intensywność zielonej fluorescencji bezpośrednio koreluje ze skutecznością tłumienia bursztynu, podczas gdy intensywność czerwonej fluorescencji daje bezpośrednie oszacowanie wielkości mierzonej próbki i skuteczności transfekcji. W odniesieniu do podobnych testów opartych na sortowaniu komórek wspomaganym fluorescencją (FACS) read out31,32, test daje natychmiastową i kompleksową ocenę ekspresji białka w całej populacji komórek, która jest bardziej reprezentatywna dla zwykłych warunków eksperymentalnych i oferuje łatwiejsze pozyskiwanie i przetwarzanie danych za pomocą standardowego oprogramowania. Ogólnie rzecz biorąc, główną zaletą testu jest to, że równolegle można analizować średnią lub dużą liczbę próbek. Korzystając z tego testu, przeprowadziliśmy badania przesiewowe racjonalnie zaprojektowanej biblioteki supresorów-tRNA, aby poprawić wydajność systemu ortogonalnego Pyl30. W niniejszej pracy opisano eksperymentalny protokół przeprowadzenia tego testu i przedstawiono przykłady jego zastosowania, w tym optymalizację pary ortogonalnej do włączenia fotosieciującej ncAA p-azydo-L-fenyloalaniny (Azi) oraz porównanie wydajności inkorporacji różnych aminokwasów (ryc. 2).

W ciągu ostatnich lat narzędzia ncAA okazały się bardzo skuteczne w badaniu strukturalnych i funkcjonalnych aspektów receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR)33,34,35,36,37,38. U ludzi GPCR tworzą dużą rodzinę receptorów błonowych (800 członków) i stanowią główne cele dla leków terapeutycznych. Bezpośrednia charakterystyka strukturalna GPCR jest nadal trudna, a do ich badań bardzo potrzebne są uzupełniające metody biochemiczne. Jesteśmy pionierami w wykorzystaniu fotosieciowania ncAA do mapowania powierzchni GPCR i odkrywania kieszeni wiążących ligandy34. Korzystając z naszego zoptymalizowanego systemu do inkorporacji Azi, systematycznie wprowadzaliśmy Azi w całej domenie błonowej GPCR bezpośrednio do żywych komórek ssaków. Po napromieniowaniu UV Azi tworzy wysoce reaktywny rodzaj azotenu, który kowalencyjnie wychwytuje sąsiednie cząsteczki. Kiedy ligand jest dodawany do systemu, Azi służy jako sonda zbliżeniowa, aby ujawnić, które pozycje receptora zbliżają się do związanego liganda. W ten sposób po raz pierwszy ujawniono sposób wiązania hormonu neuropeptydowego Urokortyny I (Ucn1) z receptorem czynnika uwalniającego kortykotropinę klasy B klasy B typu 1 (CRF1R)33. Ostatnio ujawniliśmy różne wzorce wiązania agonistów i antagonistów na tym samym receptorze38. Podobne podejście zostało zastosowane przez innych w celu ujawnienia ortosterycznych i allosterycznych miejsc wiązania innych peptydów i ligandów drobnocząsteczkowych na innych GPCRs39,40,41,42. Niniejszy manuskrypt opisuje protokół eksperymentalny zastosowany w naszym laboratorium do fotosieciowania powierzchni powierzchni GPCR. Metoda jest stosunkowo szybka, prosta i nie wymaga specjalnego sprzętu, dzięki czemu znajduje zastosowanie w standardowych laboratoriach biochemicznych. Co ważne, podejście to stanowi cenne narzędzie nie tylko do identyfikacji miejsc wiązania ligandów, w których dane strukturalne 3D są rzadkie, ale także do uzupełniania istniejących danych in vitro o informacje z w pełni zmodyfikowanych posttranslacyjnie receptorów w środowisku fizjologicznym żywej komórki.

Niedawny rozwój nowych grup chemicznych ncAA o łańcuchu bocznym, odpowiednich dla ultraszybkiej, bezkatalitycznej bioortogonalnej chemii, otworzył możliwość instalacji fluoroforów ostatniej generacji do obrazowania w superrozdzielczości w białkach bezpośrednio na żywych komórkach2,43. Do takich kotwic chemicznych należą odkształcony cyklooktyn w SCOK14, bicyclo[6.1.0]nonyne w BCNK12,17 oraz transcyklookteny w TCO*K13,15,17 wśród innych ncAA zawierających norbornen16,17,44 lub cyklopropen45,46 ugrupowania. Masywne ncAA do chemii bioortogonalnej są włączane przez wariant PylRS zwykle oznaczany jako PylRSAF (wskazujący na mutację Y271A i Y349F w M. barkeri PylRS), a także przez inne wyewoluowane ad hoc ncAARSs17,44. Kotwice bioortogonalne reagują z odczynnikami tetrazynowymi47 poprzez cykloaddycję Dielsa-Aldera z odwrotnym zapotrzebowaniem elektronów, aby uzyskać wysoką wydajność znakowania w ciągu kilku minut43,48. Jednak zastosowanie tego potężnego podejścia do oznaczania GPCR było wyzwaniem ze względu na niską ogólną wydajność ortogonalnego systemu inkorporacji ncAA. Korzystając z naszego ulepszonego systemu Pyl, niedawno wykazaliśmy wysoką wydajność włączania takich aminokwasów do GPCR i ultraszybkie znakowanie GPCR na powierzchni żywych komórek ssaków30. Znakowane receptory były nadal funkcjonalne, ponieważ fizjologicznie internalizowały się po aktywacji receptora za pomocą agonisty. Eksperymentalny protokół włączania kotew bioortogonalnych do GPCR oraz następujące etapy znakowania są opisane tutaj. Wyposażenie GPCR w małe, jasne fluorofory jest pierwszym fundamentalnym krokiem w kierunku badania dynamiki strukturalnej GPCR w żywej komórce za pomocą zaawansowanych technik mikroskopowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przesiewowe badanie wydajności inkorporacji metodą fluorescencyjną (Rysunek 1)

  1. Hodować komórki HEK293 w pożywce Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM; wysoka zawartość glukozy, 4 mM glutaminy, pirogronianu) uzupełnionej o 10% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 100 J/ml penicyliny i 100 µg/mL streptomyciny w stężeniu 37 °C, 95% wilgotności i 5% CO22.
  2. Wysiać komórki w dniu poprzedzającym transfekcję.
    1. Odczepić komórki przez 5 min w temperaturze 37 °C w 0,05% trypsynie/PBS z dodatkiem 0,5 mM EDTA. Dla naczynia o średnicy 10 cm należy użyć 1 ml trypsyny/EDTA. Reakcję zatrzymuje się poprzez dodanie 10 objętości kompletnej pożywki, a następnie komórki resuspenduje za pomocą pipety. Liczbę komórek w zawiesinie należy ocenić przy użyciu komory licznikowej (hemocytometru).49.
    2. Zasiać 6,0 x 105 Komórki HEK293 w każdej studience płytek 6-dołkowych w 2 ml pełnej pożywki wzrostowej. Przygotować taką liczbę studienek, jaka odpowiada liczbie próbek, oraz dwie dodatkowe studienki odpowiednio dla EGFP typu dzikiego oraz próbki z transfekcją pozorowaną.
  3. Kontroluj konfluencję (obszar zajęty przez komórki) pod mikroskopem. Przeprowadź transfekcję komórek przy konfluencji około 70%, wykorzystując odczynnik polietylenoimina (PEI).
    1. Na 1 h przed transfekcją do wszystkich dołków należy dodać odpowiednią ilość świeżo przygotowanego roztworu zapasowego ncAA, aby uzyskać końcowe stężenie ncAA wynoszące 0,25–0,5 mM. ncAA należy dodać do wszystkich dołków, w tym do pozytywnej kontroli typu dzikiego oraz komórek poddanych transfekcji pozornej (mock), aby zapobiec różnicom w sygnałach fluorescencji, które mogą być spowodowane wpływem ncAA na wzrost komórek.
      Uwaga: Aby przygotować roztwory zapasowe, należy rozpuścić ncAA do stężenia 0,1–0,5 M, używając 0,2–0,5 M NaOH. Jednak niektóre ncAAs mogą wymagać wstępnego rozpuszczenia w DMSO i/lub neutralizacji za pomocą czterech objętości 1 M HEPES (pH 7,4) przed użyciem. Zazwyczaj producent zaleca określony protokół przygotowania roztworu zapasowego.
    2. W probówce do mikrocentryfugi wymieszać 1 µg pDNA (DNA plazmidowego) kodowanie dla pary ncAARS/tRNA, która ma zostać przetestowana 1 µg plazmidowego DNA reporterowego (pcDNA3.0-EGFP183TAG-mCherry). W osobnych probówkach przygotować identyczną transfekcję z wykorzystaniem referencyjnego typu dzikiego EGFP oraz transfekcję pozorowaną.
      Uwaga: Liczba kopii kasety tRNA osadzonej w plazmidzie kodującym parę ncAARS/tRNA zależy od zastosowania. Aby ułatwić klonowanie, podczas przesiewania różnych tRNA zaleca się stosowanie jednej kopii tRNA, natomiast w przypadku testowania różnych ncAARS lub wbudowywania różnych ncAA przez tę samą parę ortogonalną zaleca się stosowanie 4 kopii (choć nie jest to ściśle wymagane).
    3. Do każdej probówki zawierającej DNA dodać 100 µL roztwór soli fizjologicznej buforowany mleczanem (LBS) zawierający 20 mM mleczanu sodu o pH 4,0 oraz 150 mM NaCl. Krótko wymieszać.
    4. Do każdej probówki zawierającej DNA w buforze LBS dodać 6 µL z 1 µg/µL PEI w LBS (stosunek PEI/DNA = 3/1 w/w), a następnie natychmiast wymieszać w wortexie. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10–15 min.
    5. Pobierz 400 µL pożywkę komórkową z każdej studzienki i dodać ją do mieszaniny DNA-PEI w celu neutralizacji pH. Powolnym strumieniem nanieść mieszaninę DNA na komórki.
      Uwaga: DMEM zazwyczaj zawiera czerwień fenolową jako wskaźnik pH. Podczas etapu neutralizacji kolor mieszaniny dodawanej do probówki zmieni się z żółtego (odczyn kwasowy) na czerwony (odczyn obojętny). Mimo że tworzenie kompleksów DNA w LBS przy kwasowym pH pozwala uzyskać najwyższą wydajność transfekcji50kompleksy DNA-PEI można alternatywnie tworzyć bezpośrednio przy pH 7,4 (na przykład w medium DMEM bez surowicy). W przypadku użycia DMEM do tworzenia kompleksów DNA należy pominąć etap neutralizacji 1.3.5. W każdym przypadku niezbędne jest, aby podczas tworzenia kompleksów w mieszaninie nie znajdowała się surowica.
  4. Zebrać komórki 48 h po transfekcji.
    1. Odssać medium i wypłukać komórki raz 2 ml podgrzanego wcześniej PBS (37 °C). Dodaj 800 µL buforu PBS uzupełnionego o 0,5 mM EDTA i inkubować przez 20 min w temperaturze 37 °COddzielić i zawiesić komórki, pipetując je w górę i w dół.
    2. Przenieś zawiesinę komórkową do probówek o pojemności 1,5 ml zawierających 200 µL PBS uzupełniony o 5 mM MgCl22.
    3. Wirować przez 2 min w 800 x g, a następnie odrzucić nadsącz.
      Uwaga: Protokół można w tym miejscu przerwać. W takim przypadku należy zamrozić osady metodą szokową w ciekłym N2.2 i przechowywać w temperaturze -80 °C przez okres do jednego miesiąca. Zawsze należy nosić gogle ochronne.
  5. Dodaj 100 µL bufor lizujący Tris (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1 mM EDTA i świeżo dodany PMSF) do osadów komórkowych i inkubować na lodzie przez 30 min. Aby ułatwić lizę, co 5 min mieszać na wortexie.
  6. Odwirować resztki komórkowe przez 10 min przy 4 °C oraz 14 000 x g i przenieś 90 µL nadpływu do czarnych płytek 96-dołkowych. Pomiar fluorescencji EGFP i mCherry należy przeprowadzić za pomocą czytnika płytek wyposażonego w moduł fluorescencyjny.
    Uwaga: Użyj odpowiednich filtrów wzbudzenia i emisji dla EGFP (λstreszczenie: 488 nm; λem: 509 nm) oraz mCherry (λabstrakt: 588 nm; λem: 611 nm). Zmierzone wartości EGFP będą mieścić się w zakresie od wartości minimalnej uzyskanej z komórek poddanych transfekcji pozornej do wartości maksymalnej, którą zazwyczaj uzyskuje się dla EGFP typu dzikiego. Należy zadbać o ustawienie odpowiedniego okna pomiarowego w urządzeniu.
  7. Wydajność wbudowywania ncAA oblicza się jako stosunek fluorescencji próbki do fluorescencji uzyskanej z ekspresji EGFP typu dzikiego. Wszystkie wartości są normalizowane do fluorescencji mCherry.
    figure-protocol-1

2. Genetyczne wbudowywanie ncAAs do GPCR w celu mapowania oddziaływań ligand-GPCR za pomocą fotousieciowania (Rysunek 3)

  1. Hoduj komórki HEK293T w pożywce DMEM uzupełnionej o 10% (v/v) FBS oraz 100 J/ml penicyliny i 100 µg/mL streptomycyna w stężeniu 37 °C, 95% wilgotności i 5% CO22.
  2. Wysiać komórki dzień przed transfekcją.
    1. Odczepić komórki przez 5 min w 37 °C w 0,05% trypsynie w PBS z dodatkiem 0,5 mM EDTA. Dla naczynia o średnicy 10 cm należy użyć 1 ml trypsyny/EDTA. Reakcję należy przerwać, dodając 10 objętości pełnej pożywki, a następnie resuspender komórki poprzez pipetowanie. Liczbę komórek w zawiesinie należy określić za pomocą komory licznej (hemocytometru).49.
    2. Zasiać 5,0 x 105 komórek 293T na dołek w 2 ml pełnej pożywki wzrostowej w płytkach 6-dołkowych. Dla każdej pozycji poddawanej przesiewowi należy przygotować 1 dołek na ligand oraz jeden dołek dla kontroli wiązania33,38Można uwzględnić dodatkową studzienkę do transfekcji receptorem typu dzikiego (wt) w celu sprawdzenia poziomu ekspresji mutanta.
  3. Następnego dnia pod mikroskopem sprawdź konfluencję (obszar zajęty przez komórki). Przeprowadź transfekcję komórek przy konfluencji wynoszącej ok. 70%, używając PEI.
    1. Na 1 godzinę przed transfekcją dodać Azi do wszystkich studni do stężenia końcowego 0,5 mM.
      1. Przygotować 0,5 M roztwór stokowy Azi. Na każdą płytkę 6-dołkową odważyć 1,2 mg Azi do probówki i rozpuścić w 15 µL 0,5 M NaOH. Rozcieńczyć roztwór zapasowy w 1,2 ml pożywki kompletnej i dodać 200 µL mieszaniny do każdej studzienki.
        Uwaga: Dla każdego eksperymentu należy przygotować świeży roztwór zapasowy Azi. Część azydowa ma krótki okres półtrwania w roztworach wodnych, zwłaszcza przy zasadowym pH, a AziRS włącza zarówno formę nienaruszoną, jak i zdegradowaną.
    2. Przetransfekuj całkowitą ilość 2 µg Ilość DNA na dołek: 1 µg plazmidu kodującego GPCR z tagiem FLAG, zawierającego kodon TAG w pożądanym położeniu, oraz 1 µg plasmidu kodującego ortogonalną parę dedykowaną dla Azi (E2AziRS51 oraz 4 kopie cognate supresorowego tRNA BstYam33,38.
      Uwaga: W przypadku uwzględnienia porównania z typem dzikim (wt) w celu sprawdzenia poziomów ekspresji, należy przetransfekować mniejszą ilość plazmidowego DNA. dla receptora typu dzikiego (wt). W zależności od GPCR, 0,2-0.5 µg plazmidu kodującego receptor typu dzikiego dają podobne poziomy co 1.0 µg plazmidu mutantowego. Przeprowadź transfekcję tej samej ilości DNA we wszystkich dołkach, uzupełniając brakującą ilość DNA za pomocą próbki pozorowanej (na przykład pustego wektora).
    3. Postępuj zgodnie z opisem w punktach 1.3.3-1.3.5.
    4. 48 h po transfekcji należy przejść do kroku 2.4 w celu fotousieciowania ligandów lub do kroku 2.5 w celu bezpośredniego zbioru i analizy w celu weryfikacji ekspresji receptorów.
  4. Fotousieciowanie ligandu.
    1. Przygotować 1000-krotny roztwór zapasu liganda. Rozpuścić ligand peptydowy w stężeniu 100 µM w DMSO.
      Uwaga: Stężenie ligandu zależy od stałej dysocjacji KD oddziaływania ligand-GPCR. Końcowe stężenie 100 x KD jest zalecane. Jeśli ligand peptydowy jest solą kwasu trifluorooctowego (TFA), przy obliczaniu masy cząsteczkowej należy uwzględnić wagę TFA (1 x TFA na każdy zasadowy aminokwas w peptydzie). Należy również pamiętać, że peptydy są ogólnie higroskopijne. Należy unikać wielokrotnego zamrażania proszku peptydowego i nigdy nie otwierać pojemnika z peptydem, dopóki nie osiągnie on temperatury pokojowej.
    2. Rozcieńczyć roztwór zapasowy liganda w stosunku 1:1000 w buforze wiążącym składającym się z 0,1% BSA, 0,01% Triton-X 100 i 5 mM MgCl22 w buforze dysocjacyjnym HEPES (HDB) zawierającym 12,5 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES)-HCl pH 7,4, 140 mM NaCl i 5 mM KCl. Przygotować 1 ml na każdy mutant Azi-GPCR. Zastąpić pożywkę komórkową 1 ml roztworu ligandu. Inkubować przez 10 min w temperaturze pokojowej.
      Uwaga: Dostosuj czas inkubacji do konkretnego GPCR, uwzględniając kinetykę ligandów oraz internalizację receptorów. Wydłużenie czasu inkubacji nie zwiększa wydajności sieciowania.
    3. Naświetlaj próbki przez 20 min w crosslinkerze UV przy długości fali 365 nm, używając 5 lamp o mocy 8 W, zachowując odległość około 5 cm od komórek. Oderwij komórki poprzez pipetowanie i przenieś je do probówki reakcyjnej o objętości 1,5 ml. Wirowanie komórek wykonaj przez 3 min przy 800 x g, a następnie odlej nadsącz.
    4. Rozpuścić tabletkę koktajlu inhibitorów proteaz (PI) w 1 ml 25 mM EDTA/H2Aby przygotować 50-krotny (50x) roztwór zapasu. Rozdziel roztwór zapasu PI na alikwoty i przechowuj go w temperaturze -20 °CRozcieńczyć 50-krotny roztwór zapasowy w stosunku 1:25 w HDB i resuspendować pellet komórkowy w 50 µL 2 x PI w buforze HDB. Komórki zamrozić gwałtownie w ciekłym N22.
      Uwaga: Należy założyć okulary ochronne. Na tym etapie próbki można przechowywać w temperaturze -80 °C przez maksymalnie jeden miesiąc. Przejdź do kroku 2.6.
  5. Bezpośredni zbiór komórek.
    1. Odssać pożywkę. Dodać 800 µL 0,5 mM EDTA w HDB. Inkubować przez 10 min w temperaturze pokojowej lub na lodzie.
    2. Oddziel komórki, pipetując je w górę i w dół, a następnie przenieś je do probówki reakcyjnej o pojemności 1,5 ml. Dodaj 200 µL 5 mM MgCl22 w HDB. Wirować komórki przez 3 min w 800 x g w celu uzyskania osadu, a następnie odrzucić nadsącz.
    3. Resuspendować osady komórkowe w 50 µL 2 x PI w HDB i szybkie zamrażanie w ciekłym N22Należy założyć okulary ochronne.
      Uwaga: Na tym etapie próbki można przechowywać w temperaturze -80 °C przez maksymalnie 1 miesiąc.
  6. Lizowanie komórek.
    1. Rozmrozić komórki w kąpieli wodnej w temperaturze 37 °C przez 30-45 s, a następnie krótko wymieszać w wirówce vortex. Od tego momentu przechowywać próbki w niskiej temperaturze. Odwirować membrany przy 2 500 x g i 4 °C przez 10 min. Odrzuć nadsącz, który zawiera większość białek cytozolowych.
    2. Resuspendować osady w 50 µL bufor lizujący HEPES zawierający 50 mM HEPES-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 10% glicerolu, 1% Triton X-100, 1,5 mM MgCl22, 1 mM EGTA, 1 mM DTT oraz świeżo dodany 2 x koktajl inhibitorów proteaz. Wymieszać dokładnie. Lizować komórki przez 30 min na lodzie, mieszając w vorteksie co 5 min.
    3. Odwirować resztki komórkowe przez 10 min przy 14 000 x g i 4 °CNatychmiast przenieś nadsącz do nowej probówki reakcyjnej.
      Uwaga: Należy niezwłocznie przystąpić do analizy. Lizaty można przechowywać w temperaturze -20 °Cjednakże każdy cykl zamrażania i rozmrażania pogarsza jakość wyników.
  7. Analiza Western blot.
    1. Aby przygotować próbkę, pobierz 3-5 µL lizat i dopełnić do 7 µL z H2O. Dodaj 2 µL 1 M DTT oraz 3 µL 4x bufor do próbek zawierający 63 mM Tris-HCl pH 6,8, 2% SDS, 10% glicerolu i 0,04% błękitu bromfenolowego. Inkubować przez 30 min w 37 °C.
    2. W przypadku gdy GPCR jest glikozylowany, a problemem są słabe lub rozmyte prążki, należy odglikozylować próbki za pomocą PNGazy F, aby zwiększyć intensywność sygnału i wyostrzyć prążki. Należy użyć 3-5 µL lizować i odglikozylować w całkowitej objętości wynoszącej 10 µL zgodnie z protokołem dostawcy. Dodać 3 µL 4x bufor do próbek.
      Uwaga: Białka błonowe są często glikozylowane w wielu miejscach i stanach, co pogarsza rozdzielczość w analizie SDS-PAGE. Jednak w przypadku analizy poziomu ekspresji mutantów Azi-GPCR przy użyciu przeciwciał anty-FLAG nie należy deglikozylować próbek, ponieważ istotne jest określenie frakcji w pełni glikozylowanego, dojrzałego receptora na powierzchni komórki.
    3. Rozdziel próbek za pomocą standardowa elektroforeza SDS-PAGE i transfer białek na membranę PVDF.
      UWAGA: Akrylamid jest neurotoksyczny. Należy stosować rękawice i ochronę oczu.
    4. Blokować membranę przez 1 h w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C w 5% odtłuszczonym mleku w buforze TBS-T zawierającym 20 mM Tris-HCl pH 7,4, 0,15 M NaCl oraz 0,1% Tween 20.
    5. Inkubuj membranę z przeciwciałem antyligandowym, a następnie z przeciwciałem wtórnym sprzężonym z HRP. Pomiędzy etapami wykonaj przemywanie w buforze TBS-T. Aby wykryć poziom ekspresji Azi-GPCR, inkubuj membranę z komercyjnym przeciwciałem sprzężonym z HRP (patrz Tabela materiałów).
    6. Przeprowadzić reakcję wzmocnionej chemiluminescencji (ECL) z użyciem własnoręcznie przygotowanego odczynnika ECL i rejestrować sygnały przez 5 min w ciemności.

3. Ultraszybkie znakowanie bioortogonalne receptorów GPCR w żywych komórkach ssaków

Uwaga: Protokół został zoptymalizowany dla szkiełek nakrywkowych w komorach 4-dołkowych (pole powierzchni dołka = 2,2 cm2). W przypadku innych rozmiarów dołków protokół należy odpowiednio przeskalować.

  1. Powlekanie powierzchni szkiełek mikroskopowych. Całą procedurę należy przeprowadzić w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza.
    1. Przygotować roztwór zapasowy hydrobromianu poli-D-lizyny (MW=500-550 kDa) (PDL) o stężeniu 1 mg/mL w 50 mM buforze boranowym (pH 8,5). Przechowywać w temperaturze 4 °C do 6 miesięcy. Nie zamrażać.
    2. Rozcieńczyć roztwór zapasowy PDL w stosunku 1:40 w sterylnej wodzie ultra-czystej do stężenia końcowego 25 µg/mL (roztwór roboczy), a następnie przefiltrować roztwór przez sterylny filtr 0,22 µm.
      Uwaga: Roztwór roboczy można przechowywać w temperaturze 4 °C do 3 miesięcy.
    3. Całkowicie pokryć dno każdego dołka szkiełka mikroskopowego 500 µL roztworu roboczego PDL. Inkubować przez 20 min w RT, a następnie odessać roztwór roboczy PDL.
      Uwaga: Roztwór roboczy PDL można wykorzystać do trzech razy. W przypadku konieczności ponownego użycia, przenieść zużyty roztwór z powlekanych szkiełek do nowej sterylnej probówki i odpowiednio ją oznakować. Nigdy nie mieszać roztworu odzyskanego ze świeżym roztworem.
    4. Przepłukać każdy dołek 3 x ~ 700 µl sterylną wodą ultra-czystą i pozostawić do wyschnięcia na co najmniej 1 h.
      Uwaga: Bardzo ważne jest dokładne przepłukanie dołków, ponieważ pozostałości roztworu PDL są toksyczne dla komórek. Powleczone szkiełka można wykorzystać natychmiast do mikroskopii lub przechowywać do jednego tygodnia w temperaturze 4 °C.
  2. Kultury komórek HEK293T utrzymywać w pożywce DMEM uzupełnionej o 10 % (v/v) FBS, 100 U/mL penicyliny i 100 µg/mL streptomycyny w temperaturze 37 °C, przy 95 % wilgotności i 5 % CO2.
  3. Wysiać komórki w dniu poprzedzającym transfekcję.
    1. Odczepić komórki przez 5 min w temperaturze 37 °C w 0,05 % Trypsynie/PBS uzupełnionej o 0,5 mM EDTA. Do szalki 10-cm użyć 1 mL Trypsyny/EDTA. Zneutralizować 10 objętościami pożywki kompletnej i resuspendować komórki poprzez pipetowanie. Policzyć liczbę komórek w zawiesinie za pomocą hemocytometru49.
    2. Wysiać 1,0 x 105 komórek HEK293T na dołek (pole 2,2 cm²) w 600 µL kompletnej pożywki DMEM bez barwnika.
      Uwaga: W celach obrazowania bardzo wygodne jest rozpoczynanie pracy w pożywce, która nie zawiera żadnego barwnika. Formuły DMEM bez barwnika są dostępne w sprzedaży.
  4. Kontrolować konfluencję (pole zajęte przez komórki) pod mikroskopem i przeprowadzić transfekcję komórek przy konfluencji ~70 % przy użyciu odczynnika do transfekcji opartego na lipidach.
    1. Na 1 h przed transfekcją przygotować świeży roztwór zapasowy TCO*K o stężeniu 100 mM w 0,2 M NaOH i 15 % (v/v) DMSO.
    2. Na każdy dołek zmieszać 3 µl roztworu zapasowego TCO*K z 12 µL 1 M HEPES pH 7,4. Ostrożnie dodać roztwór do dołków, aby uzyskać końcowe stężenie TCO*K wynoszące 0,5 mM.
    3. Przygotować całkowitą ilość 500 ng DNA na dołek. W probówce do mikrocentryfugi rozcieńczyć 200 ng pcDNA3.1_CRF1R-95TAG-EGFP, 200 ng plazmidu kodującego ortogonalną parę MbPylRSAF/tRNAPyl (cztery kasety tRNAM15) oraz 100 ng plazmidu pcDNA3.1_Arrestin3 w 50 µL pożywki (bez barwnika, bez surowicy, bez antybiotyków).
      Uwaga: Zasadniczo kotransfekcja Arrestyny nie jest konieczna do obserwacji internalizacji GPCR. Jednak kotransfekcja Arrestyny3 przyspiesza internalizację CRF1R, co jest bardzo wygodne przy analizie internalizacji wielu mutantów.
    4. Rozcieńczyć 1,25 µL odczynnika do transfekcji opartego na lipidach (2,5 µL na 1 µg DNA) w 50 µL pożywki (bez barwnika, bez surowicy, bez antybiotyków) i dodać roztwór do mieszaniny DNA. Natychmiast wymieszać w wortexie i inkubować przez 5-10 min w RT. Dodać kompleksy DNA-lipid do komórek.
      Uwaga: W naszym doświadczeniu morfologia komórek transfekowanych za pomocą odczynników lipidowych wygląda bardziej fizjologicznie w porównaniu do komórek transfekowanych PEI. Ponieważ PEI zapewnia wyższą wydajność transfekcji, należy go preferować w aplikacjach analitycznych, takich jak Western blot, natomiast transfekcja lipidowa jest lepszym wyborem w przypadku transfekcji komórek do eksperymentów obrazowania.
  5. W 24 h po transfekcji oznakować receptor barwnikami fluorescencyjnymi.
    1. Przygotować 0,5 mM roztwór zapasowy barwnika-tetrazyny w DMSO oraz roztwór zapasowy barwnika do barwienia DNA o stężeniu 10 mg/mL w ultra-czystej H2O.
    2. Przenieść 100 µL pożywki z każdego dołka do probówki reakcyjnej 1,5 mL. Dodać 1,8 µL roztworu zapasowego barwnika-tetrazyny i 0,3 µL roztworu zapasowego barwnika do barwienia DNA. Przenieść pożywkę zawierającą barwniki z powrotem do dołka i inkubować przez 5 min w 37 °C.
      Uwaga: Końcowe stężenie pomarańczowego barwnika fluorescencyjnego z tetrazyną wynosi 1,5 µM.
    3. Odessać pożywkę i ostrożnie przepłukać komórki dwukrotnie PBS, aby usunąć nadmiar barwnika. Dodać 600 µL kompletnej pożywki wzrostowej bez barwnika, uprzednio podgrzanej do 37 °C.
  6. Mikroskopia fluorescencyjna i internalizacja receptora.
    1. Wizualizować oznakowane receptory przy powiększeniu 63x (lub podobnym) przy użyciu filtrów odpowiednich dla GFP (λabs: 488 nm; λem: 509 nm), pomarańczowego barwnika fluorescencyjnego (λabs: 550 nm; λem: 570 nm) oraz barwnika do barwienia DNA (λabs: 350 nm; λem: 461 nm). Wykonać zdjęcie za pomocą każdego filtra przed aktywacją receptora.
    2. Stymulować internalizację receptora za pomocą 200 nM Ucn1.
      1. Przygotować 1000-krotny roztwór zapasowy Ucn1 o stężeniu 200 µM w DMSO.
        Uwaga: W zależności od rozpuszczalności peptydu, możliwe jest przygotowanie roztworu w czystej wodzie lub buforze.
      2. Przenieść 100 µL pożywki z dołka do probówki reakcyjnej 1,5 mL i dodać 0,6 µL roztworu zapasowego agonisty peptydowego. Przenieść pożywkę z powrotem do dołka.
      3. Obserwować internalizację pod mikroskopem. Wykonać zdjęcia po wyraźnym wystąpieniu internalizacji (od 10-15 min do kilku godzin, w zależności od receptora i nadekspresji Arrestyn) przy użyciu filtrów wspomnianych wcześniej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Schemat badania fluorescencyjnego przedstawiono na Rycina 1Test ten znajduje zastosowanie w trzech obszarach. Po pierwsze, przesiewowi poddawana jest liczba wariantów tRNA w celu inkorporacji Lys(Boc) przez ortogonalną parę Pyl. Lys(Boc) jest aminokwasem o podobnej strukturze sterycznej do Pyl. Ponieważ Pyl nie jest dostępny w sprzedaży, Lys(Boc) jest powszechnie stosowany jako standardowy substrat dla PylRS. Przesiewowe tRNA oparto na tRNAPylKażdy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół opisuje prosty i wiarygodny test do oceny skuteczności par ortogonalnych do włączania ncAA do białek ulegających ekspresji w komórkach ssaków. Główną zaletą tej metody w odniesieniu do powszechnie stosowanych testów opartych na FACS jest to, że pozwala na jednoczesne przygotowanie i pomiar większej liczby próbek, a także dostarcza danych, które można łatwo analizować za pomocą zwykłego oprogramowania. Dostępność średnioprzepustowej metody analizy par ortogonalnych w komórkach ssaków jest bardzo ważna dla rozwoju...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania żadnych konfliktów.

Podziękowania

Ta praca została założona przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) w ramach grantów CO822/2-1 (program Emmy-Noether) i CO822/3-1 dla I.C.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Chemicals
Akrylamid/Bisakryloamid 30% (37,5:1)Carl Roth3029.1
Nadsiarczan amonu (APS)Carl Roth9592.2
p-Azydofenyloalanina (Azi)BachemF-3075.0001
Kwas borowySigma AldrichB6768
BromphenolblueSigma-AldrichB0126-25G
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Carl Roth8076.2
Karbobenzyloksy-L-lizyna (Lys(Z))NovaBiochem8540430100
Cyklooktyno-L-lizyna (SCOK)SichemSC-8000
DMEMLife Technologies41966052
DMSOCarl RothA994.2
DTTCarl Roth6908.1
wzmocniony odczynnik chemiluminescencyjny (ECL) domowyluminol 10 mg/l w 0,1 M Tris-HCl pH 8,6 ; 1100 mg/l  kwas p-kumarowy w DMSO ; 30 % H2O2 (1,000 : 100 : 0,3)
EDTACarl Roth8043.1
EGTACarl Roth3054.1
endo-bicyklo[6.1.0]nonyno-L-lizyna (BCNK)SichemSC-8014
FBSThermo Fisher ( Gibco)10270106
FluoroBrite DMEMThermo Fisher (Gibco)A1896701
GlicerolCarl Roth7533.1
GlicynaCarl Roth3908.3
HEPESCarl Roth9105.3
Hoechst 33342Sigma AldrichB2261
KClCarl Roth6781.3
Lipofektamina 2000 Thermo Fisher11668019
LuminolApplichemA2185,0005
MetanolCarl Roth0082.3
MgCl2Carl Roth2189.2
NaClCarl RothHN00.2
Na-LactateSigma-Aldrich71718-10G
NaOHGrü ssing121551000
PBSSigma-AldrichP5493-1L
kwas p-kumarowySigma-AldrichC9008-1G
bromowodorek poli-D-lizynyCorning354210
PEIPolysciences23966
Penicylina/StreptomycynaThermo Fisher (Gibco)11548876 (15140-122)
PMSFCarl Roth6367.1
PNGase FNEBP0704L
Inhibitor proteazyRoche11873580001
membrana PVDF Immobilon-PMilliporeIPVH00010
Odtłuszczone mleko w proszku Sigma70166
Dodecylosiarczan sodu (SDS)Carl RothCN30.2
Tetrazyna-Cy3Jena BioscienceCLK-014-05
Tetrametyloetylenodiamina (TEMED)Carl Roth2367.3
trans-cyklookten-L-lizyna (TCO*K)SichemSC-8008
TRISSigma-AldrichT1503
Triton X-100Carl Roth3051.4
Trypsyna 2.5%Thermo Fisher (Gibco)15090046
Tween 20Carl Roth9127.2
Wasserstoffperoxid (30%)Merck1.07210.0250
Cell lines
HEK293 komórkiNiemiecka kolekcja Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ)ACC-305
HEK293T cellsGerman Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ)ACC-635
Equipment
Crosslinker Bio-Link 365 nmBio-Budget Technologies GmbH40-BLX-E365x 8 Watt Lamps
Czytnik płytek BMG LABTECH FLUOstar Omega BMG LABTECH
Plasmids
Plasmid E2AziRSZhuminizowany gen dla E2AziRS został zsyntetyzowany przez plazmid Geneart (Life Technologies)zawierający 4 tandemowe kopie supresorowego tRNA Bst-Yam sterowanego przez ludzki promotor U6 i jedną kopię humanizowanego genu dla ulepszonego wariantu syntetazy Azi-tRNA (EAziRS) napędzanego przez promotor
PGKZmutowane plazmidyPlazmid kodujący POI sterowany przez promotor CMV, C-końcowy połączony ze znacznikiem FLAG, opatrzony kodonem TAG w żądanej pozycji 
CRF1R-95TAG-EGFPSklonowany w MCS pcDNA3.1
HA-PTH1R-79TAG-CFPSklonowany w MCS pcDNA3.1
Arrestin3-FLAGZsyntetyzowany przez Genart (Life Technologies)Sklonowany w MCS pcDNA3.1
przeciwciała
Anti-FLAG-HRP M2 koniugat Sigma-AldrichA8592 monoklonalny, wytwarzany w mysim klonie M2
Przeciwciało kozie przeciwko królikowi HRPSanta Cruzsc-2004
Królicze przeciwciało anty-CRFdomowej robotyPBL #rC69poliklonalne
Turnbull, AV, Vaughan, J., Rivier, J.E. i Vale, WW Endokrynologia, 140, (1), 71-78 (1999)
Domowe przeciwciało króliczo-anty-Ucn1PBL # 5779poliklonalne
Turnbull, AV, Vaughan, J., Rivier, J.E. i Vale, WW Endocrinology, 140, (1), 71-78 (1999)
5 POI-TAG

Bibliografia

  1. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu Rev Biochem. 79, 413-444 (2010).
  2. Lang, K., Chin, J. W. Cellular incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins. Chemical reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).
  3. Wan, W., Tharp, J. M., Liu, W. R. Pyrrolysyl-tRNA synthetase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool. Biochim Biophys Acta. 1844 (6), 1059-1070 (2014).
  4. Wang, L. Genetically encoding new bioreactivity. N Biotechnol. 38 (Pt A), 16-25 (2017).
  5. Zhang, M., et al. A genetically incorporated crosslinker reveals chaperone cooperation in acid resistance. Nat Chem Biol. 7 (10), 671-677 (2011).
  6. Wu, N., Deiters, A., Cropp, T. A., King, D., Schultz, P. G. A genetically encoded photocaged amino acid. Journal of the American Chemical Society. 126 (44), 14306-14307 (2004).
  7. Gautier, A., et al. Genetically encoded photocontrol of protein localization in mammalian cells. J Am Chem Soc. 132 (12), 4086-4088 (2010).
  8. Arbely, E., Torres-Kolbus, J., Deiters, A., Chin, J. W. Photocontrol of tyrosine phosphorylation in mammalian cells via genetic encoding of photocaged tyrosine. J Am Chem Soc. 134 (29), 11912-11915 (2012).
  9. Luo, J., et al. Genetically encoded optochemical probes for simultaneous fluorescence reporting and light activation of protein function with two-photon excitation. J Am Chem Soc. 136 (44), 15551-15558 (2014).
  10. Bose, M., Groff, D., Xie, J., Brustad, E., Schultz, P. G. The incorporation of a photoisomerizable amino acid into proteins in E. coli. J Am Chem Soc. 128 (2), 388-389 (2006).
  11. Hoppmann, C., et al. Genetically Encoding Photoswitchable Click Amino Acids in Escherichia coli and Mammalian Cells. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (15), 3932-3936 (2014).
  12. Borrmann, A., et al. Genetic encoding of a bicyclo[6.1.0]nonyne-charged amino acid enables fast cellular protein imaging by metal-free ligation. Chembiochem. 13 (14), 2094-2099 (2012).
  13. Nikic, I., et al. Minimal tags for rapid dual-color live-cell labeling and super-resolution microscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (8), 2245-2249 (2014).
  14. Plass, T., Milles, S., Koehler, C., Schultz, C., Lemke, E. A. Genetically encoded copper-free click chemistry. Angew Chem Int Ed Engl. 50 (17), 3878-3881 (2011).
  15. Plass, T., et al. Amino acids for Diels-Alder reactions in living cells. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (17), 4166-4170 (2012).
  16. Lang, K., et al. Genetically encoded norbornene directs site-specific cellular protein labelling via a rapid bioorthogonal reaction. Nature Chemistry. 4 (4), 298-304 (2012).
  17. Lang, K., et al. Genetic Encoding of bicyclononynes and trans-cyclooctenes for site-specific protein labeling in vitro and in live mammalian cells via rapid fluorogenic Diels-Alder reactions. J Am Chem Soc. 134 (25), 10317-10320 (2012).
  18. Summerer, D., et al. A genetically encoded fluorescent amino acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (26), 9785-9789 (2006).
  19. Wang, J., Xie, J., Schultz, P. G. A genetically encoded fluorescent amino acid. J Am Chem Soc. 128 (27), 8738-8739 (2006).
  20. Chatterjee, A., Guo, J., Lee, H. S., Schultz, P. G. A genetically encoded fluorescent probe in mammalian cells. J Am Chem Soc. 135 (34), 12540-12543 (2013).
  21. Lee, H. S., Guo, J., Lemke, E. A., Dimla, R. D., Schultz, P. G. Genetic incorporation of a small, environmentally sensitive, fluorescent probe into proteins in Saccharomyces cerevisiae. J Am Chem Soc. 131 (36), 12921-12923 (2009).
  22. Neumann, H., Peak-Chew, S. Y., Chin, J. W. Genetically encoding N(epsilon)-acetyllysine in recombinant proteins. Nat Chem Biol. 4 (4), 232-234 (2008).
  23. Nguyen, D. P., Garcia Alai, M. M., Kapadnis, P. B., Neumann, H., Chin, J. W. Genetically encoding N(epsilon)-methyl-L-lysine in recombinant histones. Journal of the American Chemical Society. 131 (40), 14194-14195 (2009).
  24. Hoppmann, C., et al. Site-specific incorporation of phosphotyrosine using an expanded genetic code. Nat Chem Biol. 13 (8), 842-844 (2017).
  25. Schmidt, M. J., Borbas, J., Drescher, M., Summerer, D. A genetically encoded spin label for electron paramagnetic resonance distance measurements. J Am Chem Soc. 136 (4), 1238-1241 (2014).
  26. Chin, J. W., et al. An expanded eukaryotic genetic code. Science. 301 (5635), 964-967 (2003).
  27. Sakamoto, K., et al. Site-specific incorporation of an unnatural amino acid into proteins in mammalian cells. Nucleic Acids Research. 30 (21), 4692-4699 (2002).
  28. Lemke, E. A., Summerer, D., Geierstanger, B. H., Brittain, S. M., Schultz, P. G. Control of protein phosphorylation with a genetically encoded photocaged amino acid. Nat Chem Biol. 3 (12), 769-772 (2007).
  29. Serfling, R., Coin, I. Incorporation of Unnatural Amino Acids into Proteins Expressed in Mammalian Cells. Methods Enzymol. 580, 89-107 (2016).
  30. Serfling, R., et al. Designer tRNAs for efficient incorporation of non-canonical amino acids by the pyrrolysine system in mammalian cells. Nucleic Acids Res. , (2017).
  31. Wang, W. Y., et al. Genetically encoding unnatural amino acids for cellular and neuronal studies. Nature Neuroscience. 10 (8), 1063-1072 (2007).
  32. Chatterjee, A., Xiao, H., Bollong, M., Ai, H. W., Schultz, P. G. Efficient viral delivery system for unnatural amino acid mutagenesis in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 11803-11808 (2013).
  33. Coin, I., et al. Genetically encoded chemical probes in cells reveal the binding path of urocortin-I to CRF class B GPCR. Cell. 155 (6), 1258-1269 (2013).
  34. Coin, I., Perrin, M. H., Vale, W. W., Wang, L. Photo-Cross-Linkers Incorporated into G-Protein-Coupled Receptors in Mammalian Cells: A Ligand Comparison. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 8077-8081 (2011).
  35. Ye, S., et al. Tracking G-protein-coupled receptor activation using genetically encoded infrared probes. Nature. 464 (7293), 1386-1389 (2010).
  36. Damian, M., et al. Ghrelin receptor conformational dynamics regulate the transition from a preassembled to an active receptor:Gq complex. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (5), 1601-1606 (2015).
  37. Tian, H., Furstenberg, A., Huber, T. Labeling and Single-Molecule Methods To Monitor G Protein-Coupled Receptor Dynamics. Chem Rev. 117 (1), 186-245 (2017).
  38. Seidel, L., Zarzycka, B., Zaidi, S. A., Katritch, V., Coin, I. Structural insight into the activation of a class B G-protein-coupled receptor by peptide hormones in live human cells. Elife. 6, (2017).
  39. Grunbeck, A., et al. Genetically encoded photo-cross-linkers map the binding site of an allosteric drug on a G protein-coupled receptor. ACS Chem Biol. 7 (6), 967-972 (2012).
  40. Koole, C., et al. Genetically encoded photocross-linkers determine the biological binding site of exendin-4 peptide in the N-terminal domain of the intact human glucagon-like peptide-1 receptor (GLP-1R). J Biol Chem. 292 (17), 7131-7144 (2017).
  41. Rannversson, H., et al. Genetically encoded photocrosslinkers locate the high-affinity binding site of antidepressant drugs in the human serotonin transporter. Nat Commun. 7, 11261(2016).
  42. Valentin-Hansen, L., et al. Mapping substance P binding sites on the neurokinin-1 receptor using genetic incorporation of a photoreactive amino acid. Journal of Biological Chemistry. 289 (26), 18045-18054 (2014).
  43. Nikic, I., Kang, J. H., Girona, G. E., Aramburu, I. V., Lemke, E. A. Labeling proteins on live mammalian cells using click chemistry. Nat Protoc. 10 (5), 780-791 (2015).
  44. Kaya, E., et al. A genetically encoded norbornene amino acid for the mild and selective modification of proteins in a copper-free click reaction. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (18), 4466-4469 (2012).
  45. Elliott, T. S., et al. Proteome labeling and protein identification in specific tissues and at specific developmental stages in an animal. Nature Biotechnology. 32 (5), 465-472 (2014).
  46. Yu, Z., Pan, Y., Wang, Z., Wang, J., Lin, Q. Genetically encoded cyclopropene directs rapid, photoclick-chemistry-mediated protein labeling in mammalian cells. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (42), 10600-10604 (2012).
  47. Mayer, S., Lang, K. Tetrazines in Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Cycloadditions and Their Use in Biology. Synthesis-Stuttgart. 49 (4), 830-848 (2017).
  48. Lang, K., Davis, L., Chin, J. W. Genetic encoding of unnatural amino acids for labeling proteins. Methods Mol Biol. 1266, 217-228 (2015).
  49. Phelan, K., May, K. M. Basic techniques in mammalian cell tissue culture. Curr Protoc Cell Biol. 66, 1-22 (2015).
  50. Fukumoto, Y., et al. Cost-effective gene transfection by DNA compaction at pH 4.0 using acidified, long shelf-life polyethylenimine. Cytotechnology. 62 (1), 73-82 (2010).
  51. Takimoto, J. K., Adams, K. L., Xiang, Z., Wang, L. Improving orthogonal tRNA-synthetase recognition for efficient unnatural amino acid incorporation and application in mammalian cells. Mol Biosyst. 5 (9), 931-934 (2009).
  52. Nikic, I., et al. Debugging Eukaryotic Genetic Code Expansion for Site-Specific Click-PAINT Super-Resolution Microscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 55 (52), 16172-16176 (2016).
  53. Lykke-Andersen, S., Jensen, T. H. Nonsense-mediated mRNA decay: an intricate machinery that shapes transcriptomes. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (11), 665-677 (2015).
  54. Schmied, W. H., Elsasser, S. J., Uttamapinant, C., Chin, J. W. Efficient multisite unnatural amino acid incorporation in mammalian cells via optimized pyrrolysyl tRNA synthetase/tRNA expression and engineered eRF1. J Am Chem Soc. 136 (44), 15577-15583 (2014).
  55. Ye, S. X., et al. Site-specific incorporation of keto amino acids into functional G protein-coupled receptors using unnatural amino acid mutagenesis. Journal of Biological Chemistry. 283 (3), 1525-1533 (2008).
  56. Grunbeck, A., Huber, T., Sachdev, P., Sakmar, T. P. Mapping the ligand-binding site on a G protein-coupled receptor (GPCR) using genetically encoded photocrosslinkers. Biochemistry. 50 (17), 3411-3413 (2011).
  57. Grunbeck, A., Huber, T., Sakmar, T. P. Mapping a ligand binding site using genetically encoded photoactivatable crosslinkers. Methods Enzymol. 520, 307-322 (2013).
  58. Naganathan, S., Grunbeck, A., Tian, H., Huber, T., Sakmar, T. P. Genetically-encoded molecular probes to study G protein-coupled receptors. J Vis Exp. (79), (2013).
  59. Huber, T., Naganathan, S., Tian, H., Ye, S., Sakmar, T. P. Unnatural amino acid mutagenesis of GPCRs using amber codon suppression and bioorthogonal labeling. Methods Enzymol. 520, 281-305 (2013).
  60. Gronemeyer, T., Chidley, C., Juillerat, A., Heinis, C., Johnsson, K. Directed evolution of O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase for applications in protein labeling. Protein Eng Des Sel. 19 (7), 309-316 (2006).
  61. Los, G. V., et al. HaloTag: a novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis. ACS Chem Biol. 3 (6), 373-382 (2008).
  62. Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells. Science. 281 (5374), 269-272 (1998).
  63. Adams, S. R., et al. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: synthesis and biological applications. J Am Chem Soc. 124 (21), 6063-6076 (2002).
  64. Hoffmann, C., et al. A FlAsH-based FRET approach to determine G protein-coupled receptor activation in living cells. Nature Methods. 2 (3), 171-176 (2005).
  65. Nuber, S., et al. beta-Arrestin biosensors reveal a rapid, receptor-dependent activation/deactivation cycle. Nature. 531 (7596), 661-664 (2016).
  66. Lee, M. H., et al. The conformational signature of beta-arrestin2 predicts its trafficking and signalling functions. Nature. 531 (7596), 665-668 (2016).
  67. Uttamapinant, C., et al. Genetic code expansion enables live-cell and super-resolution imaging of site-specifically labeled cellular proteins. J Am Chem Soc. 137 (14), 4602-4605 (2015).
  68. Knorr, G., Kozma, E., Herner, A., Lemke, E. A., Kele, P. New Red-Emitting Tetrazine-Phenoxazine Fluorogenic Labels for Live-Cell Intracellular Bioorthogonal Labeling Schemes. Chemistry. 22 (26), 8972-8979 (2016).
  69. Park, M., Tian, H., Naganathan, S., Sakmar, T. P., Huber, T. Quantitative Multi-color Detection Strategies for Bioorthogonally Labeled GPCRs. Methods Mol Biol. 1335, 67-93 (2015).
  70. Tyagi, S., Lemke, E. A. Genetically encoded click chemistry for single-molecule FRET of proteins. Methods Cell Biol. 113, 169-187 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Niekanoniczne aminokwasysupresja kodonu bursztynowegomapowanie GPCRznakowanie bioortogonalnetest fluorescencyjnyortogonalna syntetaza tRNAaminokwasy do fotousieciowaniaodwrotna reakcja Dielsa-Aldera promowana naprężeniem pierścieniaobrazowanie żywych komórekkomórki HEK 293
Optymalizacja genetycznego włączenia sond chemicznych do GPCR w celu mapowania fotosieciowania i chemii bioortogonalnej w żywych komórkach ssaków
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.