Test krwi do wykrywania transkryptów fuzji ROS1 i RET z krążącego kwasu rybonukleinowego przy użyciu cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy

Podsumowanie

Wykrywanie krążącego kwasu rybonukleinowego (cRNA) we krwi jest niezaspokojoną potrzebą w diagnostyce klinicznej. W tym miejscu opisujemy metody charakteryzujące cRNA od pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca przy użyciu czułej i specyficznej cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy. Testy spełniają wymagania projektowe, aby wykryć warianty fuzji w ciągu 72 godzin.

Streszczenie

Opracowaliśmy nowatorskie metody izolacji i charakterystyki krążącego kwasu rybonukleinowego (cRNA) pochodzenia nowotworowego do płynnej biopsji krwi. Skuteczne wykrywanie cRNA odzyskanego z krwi stanowi rozwiązanie krytycznej, niezaspokojonej potrzeby w diagnostyce klinicznej. Test rozpoczyna się od pobrania krwi pełnej do probówek do pobierania krwi zawierających konserwanty stabilizujące cRNA. Bezkomórkowy, egzosomalny i związany z płytkami krwi RNA jest izolowany z osocza w tym systemie testowym. cRNA jest poddawane odwrotnej transkrypcji na komplementarne DNA (cDNA) i amplifikowane za pomocą cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy (dPCR). Próbki są oceniane zarówno pod kątem docelowego biomarkera, jak i genu kontrolnego. Walidacja testów obejmowała badania granic wykrywalności, dokładności i odporności na próbkach analitycznych. Metoda opracowana w wyniku tych badań w sposób powtarzalny wykrywa wiele wariantów fuzji dla ROS1 (protoonkogen C-Ros 1; 8 wariantów) i RET (przegrupowany podczas transfekcji protoonkogen; 8 wariantów). Przebieg przetwarzania próbek został zoptymalizowany tak, aby wyniki testów mogły być konsekwentnie generowane w ciągu 72 godzin od otrzymania próbki.

Wprowadzenie

Do 25% pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca (NSCLC) może nie mieć wystarczającej ilości tkanki do badania w momencie diagnozy. Nawet w przypadkach, gdy tkanka jest dostępna, może nie być wystarczająca do wykonania zalecanych testów molekularnych^1,2. W przypadkach, gdy tkanka z biopsji jest wystarczająca do profilowania molekularnego, pacjenci mogą być zmuszeni do oczekiwania na wyniki przez kilka tygodni lub dłużej lub rozpoczęcia leczenia bez wyników molekularnych^3,4. Jednak niezwykle ważne jest, aby dostępna była pouczająca diagnostyka molekularna, biorąc pod uwagę pojawienie się wielu ukierunkowanych opcji leczenia u pacjentów, u których zdiagnozowano niedrobnokomórkowy rak płuca. Badanie krążącego DNA wolnego od komórek (cfDNA) z płynnej biopsji jest rozwiązaniem wyzwań związanych z tradycyjnym testowaniem tkanek^4,5,6. Obecne opcje testowania mutacji w NSCLC przy użyciu cfDNA i podobnego przepływu pracy opartego na dPCR w celu szybkiego generowania wyników obejmują mutacje uwrażliwiające na receptor naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR) ΔE746-A750 i L858R, mutację oporności na EGFR T790M, warianty protoonkogenu KRAS (KRAS) oraz wariant protoonkogenu B-Raf (BRAF) V600E. Chociaż nie jest tak szeroko stosowany w tej dziedzinie, krążący informacyjny RNA (mRNA) pochodzący z nowotworu wyizolowany z płynnej biopsji może również dostarczyć ważnych informacji klinicznych^7,8,9. Wcześniej opracowaliśmy i opisaliśmy metody multipleksowanego wykrywania wariantów fuzji kinazy tyrozynowej receptora szkarłupni z mikrotubulami, takich jak 4-anaplastyczny receptor chłoniaka tyrozynowego (EML4-ALK) z osocza krwi¹⁰. W tym badaniu rozszerzyliśmy te metody, aby uwzględnić cele multipleksowanego RNA wyższego rzędu dla ROS1 i RET, obejmujące osiem wariantów fuzji w każdym teście. Celem było opracowanie szybkiej, czułej, specyficznej i powtarzalnej techniki wykrywania tych wariantów fuzji z osocza pacjentów, u których wcześniej zdiagnozowano niedrobnokomórkowy rak płuca.

Proces testowy jest inicjowany w gabinecie lekarskim za pomocą probówek do pobierania krwi stabilizujących RNA¹¹. Probówki te zawierają środek konserwujący komórki, a także inhibitory RNazy. Próbki są wysyłane priorytetowo z dnia na dzień do scentralizowanego laboratorium (Clinical Laboratory) akredytowanego przez College of American Pathologists (CAP) / certyfikowanego przez Clinical Laboratory Improvement Amendments (CLIA) w celu przetworzenia przez kompetentny personel. Po otrzymaniu przez laboratorium kliniczne, każdy etap przetwarzania jest przeprowadzany zgodnie z zatwierdzonymi standardowymi procedurami operacyjnymi (SOP). Krew pełna jest odwirowywana w celu odzyskania osocza, które jest następnie wykorzystywane do izolowania krążącego RNA, które jest wolne we krwi lub w otaczających ugrupowaniach, takich jak egzosomy i płytki krwi^7,8,9. Aby wyizolować RNA z tych przedziałów, wybraliśmy system do odzyskiwania RNA na podstawie porównań kilku metod ekstrakcji. Wyizolowane RNA jest zagęszczane i poddawane odwrotnej transkrypcji do cDNA. Podczas optymalizacji metody syntezy cDNA oceniono kilka enzymów odwrotnej transkryptazy i starterów specyficznych dla genów w celu maksymalizacji docelowej konwersji transkryptu ROS1 i RET¹⁰. Ma to kluczowe znaczenie dla krążących transkryptów o niskiej liczebności, takich jak warianty fuzji pochodzące z nowotworu. Na koniec zoptymalizowaliśmy stężenia startera i sondy dPCR, aby umożliwić multipleksowane wykrywanie wariantów fuzji RET lub ROS1 oraz genu kontrolnego, glukuronidazy-β (GUSB). Następnie połączyliśmy najlepsze warunki z każdego z badań optymalizacyjnych w ostateczny zablokowany protokół przed przeprowadzeniem analitycznych badań walidacyjnych opisanych w tym raporcie. Protokół ten i wyniki stanowią podstawę dla szybkiego i czułego przepływu pracy w rutynowym wykrywaniu rzadkich wariantów fuzji w obiegu.

Protokół

Instrukcje producentów są przestrzegane dla odczynników wymienionych poniżej, chyba że opisano inaczej. Testy PCR są dostępnymi na rynku produktami przeznaczonymi do wykrywania fuzji ROS1 i RET.

1. Praca z RNA w ramach przygotowań do odwrotnej transkrypcji (RT)-dPCR: Najlepsze praktyki laboratoryjne

1. Utwórz środowisko wolne od RNaz podczas pracy z RNA.
   1. Używaj dostępnych w handlu sprayów przeznaczonych do inaktywacji zanieczyszczających RNaz.
   2. Używaj certyfikowanych odczynników, końcówek i probówek wolnych od RNaz. Do pipetorów należy stosować końcówki barierowe, aby zapobiec wprowadzeniu RNaz lub zanieczyszczeniu krzyżowemu próbek.
2. Zawsze noś fartuch laboratoryjny, aby zapobiec wpadaniu cząstek stałych z ubrania do próbki. Wyznacz fartuch laboratoryjny specyficzny do użycia przy przetwarzaniu RNA.
3. Nosić rękawice, aby zapobiec zanieczyszczeniu próbki przez RNazy w skórze. Często zmieniaj rękawice.
   nuta: Załóżmy, że powierzchnie laboratoryjne są zanieczyszczone RNazą, ponieważ są narażone na działanie środowiska. Zakłada się, że rękawice, które mają kontakt ze skórą, włosami, klamkami, uchwytami zamrażarki, długopisami/markerami itp., nie są już wolne od RNaz.
4. Przed użyciem należy odkazić pipety, blaty stołowe, wirówki i inne powierzchnie robocze za pomocą sprayu do inaktywacji RNazy.
5. Jeśli to możliwe, utrzymuj zestaw sprzętu do użytku tylko z RNA.
6. Zminimalizuj zakłócenia przepływu powietrza w obszarach laboratoryjnych podczas pracy z próbkami RNA, aby zapobiec wpadaniu cząstek stałych do próbek lub zanieczyszczeniu obszaru roboczego.
7. Oczyszczony RNA przechowywać w temperaturze -80 °C.
8. Unikaj wielokrotnego zamrażania i rozmrażania próbek RNA, ponieważ może to spowodować degradację.

2. Generowanie analitycznego materiału RNA dla kontroli pozytywnych

1. Zaprojektuj syntetyczne DNA przy użyciu opublikowanych sekwencji mRNA dla interesujących wariantów fuzji¹⁰.
   1. Dla danego wariantu fuzji wybierz sekwencję fuzji mRNA, która obejmuje miejsce fuzji oraz wystarczającą długość flankowania z każdej strony, aby pokryć amplikon PCR.
   2. Wybierz sekwencje nukleotydowe w zakresie od 50 do 250 nt, aby naśladować rozmiar krążącego RNA wychwyconego przy użyciu osocza wzbogaconego w płytki krwi.
   3. Dodać sekwencję promotora T7 (5'-CAGAGATGCATAATACGACTCACTATAGAGA-3') do końca 5' sekwencji docelowej.
2. Zamów sekwencje syntetyczne jako dwuniciowe fragmenty kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA).
3. Odtworzyć syntetyczne DNA w buforze Tris-EDTA (TE) do końcowego stężenia 10 ng/μl.
4. Przekształć 60 ng syntetycznego DNA w RNA za pomocą transkrypcji in vitro.
5. Oczyść transkrypty RNA za pomocą odczynnika na bazie fenolu/guanidyny¹².
   1. Uwzględnij DNazę I, wolną od RNazy, aby usunąć resztki matrycowego DNA.
6. Zmierz stężenie oczyszczonego RNA in vitro za pomocą dostępnego na rynku fluorometru z barwnikami i wzorcami specyficznymi dla RNA. Upewnij się, że RNA mieści się w zakresie akceptowalnym dla wybranych standardów. Może być konieczne rozcieńczenie.
7. Potwierdź pomyślną transkrypcję za pomocą elektroforezy żelowej przy użyciu 2% żelu agarozowego zmieszanego z barwnikiem żelowym RNA i drabiną RNA o wysokim zasięgu, w tym zakresem rozmiarów 50 - 250 nt.
   1. Załaduj 500 ng każdego RNA in vitro na żel.
   2. Uruchomić żel przy napięciu 5 V/cm.
   3. Wizualizuj pojedyncze pasma za pomocą oświetlenia i dokumentuj wyniki.
   4. Potwierdź oczekiwany rozmiar transkryptu dla każdego z wariantów fuzji (na podstawie projektu w kroku 2.1.2).
8. Potwierdź wykrycie każdego RNA in vitro za pomocą RT-dPCR przy użyciu dopasowanego testu PCR specyficznego dla wariantu (patrz kroki 5 - 8 niniejszego protokołu).
9. Opcjonalnie: Przygotować równomolową mieszaninę RNA in vitro, która zawiera każdy z wariantów fuzji i gen kontrolny GUSB.
10. Jeśli wykonywany jest krok 2.9: Potwierdzić wykrycie każdego z wariantów fuzji zawartych w mieszaninie kontrolnej za pomocą dPCR przy użyciu testów PCR specyficznych dla wariantu (patrz kroki 5–8 niniejszego protokołu).
11. Określ pożądane stężenie wejściowe dla analitycznych kontroli dodatnich, testując stężenia w zakresie od 0,25 do 2,5 fg¹⁰. Wybierz stężenie na podstawie żądanego numeru wyjściowego kopii.
12. Po potwierdzeniu przygotować 10 μl podwielokrotności analitycznego RNA jednorazowego użytku do wykorzystania w kontroli pozytywnej (etap 4.4) i przechowywać w temperaturze -80 °C.

3. Próbki dawców

1. Pobrać 10 ml próbek ludzkiej krwi pełnej do 10 ml probówek do pobierania krwi (BCT) zawierających bezkomórkowy środek konserwujący RNA.
   nuta: Wszyscy dawcy muszą wyrazić zgodę na wykorzystanie do celów badawczych, a podczas badań nie mogą być zbierane ani wykorzystywane żadne informacje identyfikujące konkretnego dawcę.
2. Próbki krwi pełnej należy przetwarzać w terminie określonym przez producenta BCT.
3. Połączone normalne osocze ludzkie można nabyć ze źródła komercyjnego do wykorzystania w analitycznej kontroli dodatniej. Przygotować jednorazowe 1 ml podwielokrotności zebranego normalnego osocza ludzkiego i przechowywać w temperaturze -80 °C do użycia z kontrolą dodatnią (etap 4.4).

4. Odzyskiwanie krążącego RNA z osocza

Uwaga: Ważne jest, aby podczas tej procedury pracować szybko.

1. Odwirować probówki z krwią pełną o sile 200 x g przez 20 min.
2. Pobrać do 4 ml osocza z odwirowanej probówki do pobierania krwi za pomocą pipety serologicznej. Uważaj, aby nie naruszyć ani nie zassać warstwy kożuchowej sierści.
3. Wyizoluj krążące RNA za pomocą dostępnego na rynku zestawu, który może wychwytywać egzosomy, płytki krwi i bezkomórkowe RNA z osocza. Wyizolować RNA z pozytywnej próbki kontrolnej obok każdej partii.
4. Przygotować kontrolę pozytywną dla każdej partii próbek klinicznych w następujący sposób:
   1. Rozmrozić 1 ml zebranej normalnej porcji osocza ludzkiego (krok 3.3).
   2. Rozmrozić 10 μl analitycznej porcji RNA (krok 2.12).
   3. Przygotować kontrolę pozytywną, dodając 10 μl analitycznego RNA do normalnej próbki ludzkiego osocza po dodaniu etanolu do lizatu osocza.
5. Eluować próbki za pomocą 100 μl wody wolnej od nukleaz. Natychmiast przystąp do oczyszczania i koncentracji RNA.
   1. Próbki mogą być przechowywane na mokrym lodzie i przykryte przez okres do jednej godziny.
6. Zagęścić RNA metodą kolumnową i wymyć w 9 μl wody wolnej od RNaz.
   1. Przejdź natychmiast do kroku 5 lub przechowuj próbki na mokrym lodzie przez maksymalnie jedną godzinę.

5. Odwrotna transkrypcja RNA do cDNA

1. Przekształć skoncentrowaną krążącą próbkę RNA w cDNA za pomocą dostępnego na rynku zestawu do reakcji odwrotnej transkrypcji, w tym losowych starterów (patrz tabela 1 dla składników).
   nuta: Startery specyficzne dla genu są opcjonalne i mogą być zaprojektowane dla wariantów testowych. Startery są projektowane w oparciu o docelową sekwencję RNA. Użyj sekwencji wariantów fuzji z kroku 2.1.
   1. Nie należy dołączać próbki kontrolnej z odwrotną transkryptazą ani próbki kontrolnej RNA (patrz Tabela 1).
2. Wyizolować cDNA z reakcji odwrotnej transkrypcji za pomocą dostępnej na rynku kolumny wirowej koncentratora DNA.
   nuta: Ten krok ułatwia usuwanie enzymów, starterów i wolnych trifosforanów deoksynukleotydów (dNTP).
3. CDNA należy stosować natychmiast w reakcjach PCR lub przechowywać w temperaturze -80 °C.

6. Cyfrowy PCR

Uwaga: Ten PCR jest specyficzny dla kropelkowego cyfrowego PCR (Zobacz Tabelę Materiałów).

1. Środki ostrożności dotyczące mieszanki PCR.
   1. Noś jednorazowy fartuch laboratoryjny i rękawice nitrylowe.
   2. Użyj odczynników do mieszania PCR w dedykowanym obszarze przygotowania odczynników. Nie należy dotykać cDNA w obszarze przygotowania samego odczynnika.
   3. Zakryj sondy podczas pracy, aby chronić je przed światłem. Nadmierne światło może spowodować fotobielenie barwnika fluorescencyjnego dołączonego do sondy.
   4. Mieszaniny transportowe, przykryte i chronione przed światłem, do oddzielnego obszaru przed amplifikacją przed dodaniem cDNA.
   5. Dodaj cDNA do testu, aby zmieszać z PCR w czystym kapturze PCR znajdującym się w obszarze wstępnej amplifikacji.
2. Przygotować mieszaniny PCR dla końcowej objętości reakcyjnej 20 μl zgodnie z tabelą 2.
3. Rozprowadź mieszaniny PCR + cDNA na płytkach PCR.
   nuta: Zaleca się stosowanie układu płyt jako prowadnicy.
4. Przykryj płytkę za pomocą wymiennego uszczelniacza do płyt.
5. Odwirować płytki na krótko, aby pobrać próbki z dna studzienek.
6. Mieszaj na wytrząsarce talerzowej na niskim ustawieniu przez 10 sekund.
7. Odwirować płytki na krótko, aby pobrać próbkę na dnie studzienki.
8. Usuń uszczelniacz do płyt. Wykonaj generowanie kropelek do mieszaniny PCR-cDNA za pomocą ręcznego lub automatycznego systemu generowania kropel.
   1. W przypadku ręcznego wytwarzania kropel należy przenieść 20 μl mieszanki PCR do dołków do pobierania próbek na kartridżu z wytwarzaniem kropel. Dodać 70 μl olejku do wytwarzania kropelek. Przykryj gumową uszczelką i przenieś wkład do ręcznego generatora kropel, aby zainicjować wytwarzanie kropli. Po wytworzeniu się kropli należy przenieść kropelki na świeżą płytkę do PCR, używając końcówek zalecanych przez producenta. Zasysać i dozować kropelki powoli, przez 5 do 6 s każda, nie dotykając otworu końcówki wkładu lub płytki kropelkowej.
   2. W celu automatycznego generowania kropel należy uszczelnić płytkę uszczelką foliową i przenieść do generatora kropel. Upewnij się, że wszystkie końcówki, wkłady i płytki są na swoim miejscu przed rozpoczęciem generowania kropel.
9. Po wytworzeniu kropel i przeniesieniu kropelek na świeżą płytkę do PCR, należy uszczelnić płytką foliową i płytkami do cykli termicznych, korzystając z ustawień podanych w tabeli 3.
10. Po zakończeniu pracy termocyklera odczytaj płytkę za pomocą czytnika kropelkowego. Utwórz układ tabliczek dla oprogramowania czytnika, który identyfikuje lokalizację kontrolek, próbek itp., a następnie załaduj do oprogramowania, aby rozpocząć odczyt.

7. Analiza i przegląd danych oraz generowanie wyników

1. Analizuj wyniki odczytu płytek za pomocą dostępnego na rynku oprogramowania.
2. Przejdź do menu Analizuj, aby wyświetlić dwuwymiarowe (2D) wykresy amplitudy.
3. Oceń ogólną jakość danych, badając dane z kropli.
   1. Oceń dane pod kątem łącznej liczby zaakceptowanych zdarzeń za pomocą menu Zdarzenia. Jeśli na odwiert przypada mniej niż 10 000 zdarzeń, dokładnie oceń dane pod kątem dodatkowych problemów.
   2. Sprawdź dane pod kątem nieprawidłowych amplitud fluorescencji. Znaczne różnice w amplitudzie i stężeniach między powtórzonymi próbkami wskazują na niewłaściwe obchodzenie się z próbkami lub ich mieszanie.
   3. Zanotuj skupiska kropel z wzorami rozpylania na osi 45 stopni, co wskazuje na krople niskiej jakości lub problematyczne próbki.
   4. Najpierw zbadaj dane dotyczące kontroli pozytywnej, braku odwrotnej transkryptazy (bez RT) i braku kontroli RNA (NRC). Wybierz wszystkie próbki kontrolne i zbadaj jakość klastra za pomocą wykresu 2D. Aby zapewnić prawidłowe progowanie, powinna być widoczna wyraźna separacja między skupiskami kropel.
4. Dla każdego wariantu testu należy ustawić próg na podstawie studzienek kontrolnych.
   1. Ustaw progi na wykresach 2D za pomocą narzędzia krzyżyk, aby oddzielić podwójnie ujemną populację kropel od populacji genów kontrolnych (znakowanych sondą fosforoamidynową 5'-heksachloro-fluoresceiny-CE), osi y i populacji genów wariantowych, jeśli występuje (znakowanej sondą amidytu fluoresceiny LUB sondą 6-karboksyfluoresceiny), oś x.
   2. Zsumować kopie z każdego dołka repliki dla pojedynczej próbki.
   3. Wyrażaj wyniki testu jako liczbę wykrytych kopii wariantów.
      nuta: Aby określić analityczną wartość odcięcia dla wywołania próbki dodatniej lub ujemnej, należy przeprowadzić normalny zestaw próbek zdrowego dawcy (co najmniej 10 pojedynczych próbek) przez sfinalizowany proces i ustalić punkt odcięcia powyżej dowolnego wykrywalnego sygnału tła dla mutacji będącej przedmiotem zainteresowania. Dodatkowo ustal liczbę kopii genów kontrolnych wymaganych do wywołania wyniku dodatniego lub ujemnego. To odcięcie genu kontrolnego działa jako wewnętrzna kontrola jakości (QC) w celu oceny ilości i jakości każdej próbki RNA, która jest przetwarzana.

8. Weryfikacja warunków reakcji RT-dPCR za pomocą linii komórkowych (opcjonalnie)

1. Aby zweryfikować wykrywanie wariantów fuzji, użyj dostępnych na rynku linii komórkowych wyrażających mRNA fuzyjne ROS1 lub RET, które są przedmiotem zainteresowania. Postępuj w następujący sposób:
   1. Homogenizuj zamrożone komórki w roztworze do lizy na bazie guanidyny bezpośrednio ze stanu zamrożonego. Nawet krótkie rozmrażanie przed homogenizacją może spowodować degradację i utratę RNA.
   2. Wyizoluj RNA za pomocą kolumn wirowych z membraną krzemionkową przeznaczonych do RNA.
   3. Zmierz stężenie próbek RNA za pomocą fluorometru z odczynnikami i wzorcami specyficznymi dla RNA.
   4. Rozcieńczyć wyizolowany RNA na tle RNA typu dzikiego z osocza lub innego komercyjnego źródła.
2. Wykonaj kroki od odwrotnej transkrypcji RNA do cDNA, cyfrowego PCR oraz analizy i przeglądu danych oraz generowania wyników wymienionych w tym protokole, aby potwierdzić wykrycie pożądanego wariantu.

Wyniki

Ten protokół opisuje system testowy opracowany do wykrywania wariantów fuzji RNA do wykorzystania w pomiarze mutacji sterownika w osoczu pacjentów z NSCLC (Rysunek 1A). Zidentyfikowano produkty fuzji mRNA z ekspresji najczęstszych rearanżacji RET i ROS1 w populacji NSCLC^{13,14,15,16,17}. Następnie zaprojektowano multipleksowane testy PCR w celu wykrycia ośmiu najczęstszych wariantów transkryptu dla każdego celu w NSCLC w ramach jednej reakcji. Najczęstsze translokacje w locus ROS1 generują asocjacje z częściami 5' genów CD74, SDC4, SLC34A2, EZR lub TPM3 (Rysunek 1B). Najczęstsze translokacje w locus RET prowadzą do zestawienia z KIF5B, dla którego test obejmuje sześć połączeń eksonowych. Dodatkowi partnerzy RET, którzy są objęci ochroną, to ci z CCDC6 i TRIM33 (Rysunek 1C). W sumie testy obejmują około 88% zmian ROS1 i 99% zmian RET, o których wiadomo, że występują w populacji pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca¹⁷.

Specyficzność składników testu została najpierw oceniona przy użyciu ośmiu indywidualnych RNA in vitro, które zawierają sekwencję mRNA dla transkryptów fuzyjnych objętych testami multipleksowymi ROS1 lub RET. Każdy gatunek RNA został przetestowany pod kątem każdego indywidualnego testu wariantu, który składa się na wersję multipleksowaną. Nie stwierdzono reaktywności krzyżowej tych testów, wykazując w ten sposób 100% swoistość analityczną w ramach zaprojektowanych testów multipleksowych (dane nie pokazane). Aby określić dolną granicę wykrywalności protokołu testowego, całkowite RNA pochodzące z linii komórkowych wyrażających wariant fuzyjny zawarty w teście zmieszano z tłem normalnego RNA w stężeniach 5%, 1%, 0,2% i 0,04%. Multipleksowane testy PCR wariantów RET i ROS1 wykryły zaledwie 0,2% wariantu fuzji (Rysunek 2A-B). Dodatkowo, preparat 5% RNA pochodzącego z linii komórkowej poza celem (wyrażającego transkrypt fuzyjny EML4-ALK) nie został wykryty w multipleksowanych testach ROS1 i RET, co dodatkowo wykazuje specyficzność (Figura 2A-B).

Przeprowadzono precyzyjne testy procesu RT-dPCR zarówno dla ROS1, jak i RET. Analityczny materiał kontrolny składający się z równomolowych RNA in vitro został przetworzony w trzech stężeniach (wysokim, średnim i niskim) poprzez odwrotną transkrypcję i dPCR przy trzech różnych okazjach w ciągu tego samego dnia (w ciągu dnia), przez trzy kolejne dni (między dniami) i z dwoma operatorami (między operatorami). Wyniki precyzyjnych testów wykazały dokładne wykrywanie zarówno transkryptu fuzyjnego, który jest przedmiotem zainteresowania, jak i genu kontrolnego, GUSB, który jest uwzględniony jako wewnętrzna metryka QC (Rysunek 2C-D).

Oprócz wewnętrznej kontroli GUSB, każda partia próbek klinicznych była przeprowadzana z zestawem kontroli partii. Kontrolę pozytywną uzyskano z mieszaniny analitycznego RNA in vitro, który reprezentował każdy z wariantów fuzji testowanych w RT-dPCR, a także analitycznego RNA in vitro dla GUSB. To RNA zostało wzbogacone do normalnego lizatu ludzkiego osocza podczas ekstrakcji RNA i było przetwarzane wraz z próbkami klinicznymi przez cały protokół. Kontrola bez odwrotnej transkryptazy (No RT) była kontrolą negatywną w celu potwierdzenia braku materiału zanieczyszczającego w procesie ekstrakcji RNA i wykazania specyficzności starterów dla RNA. Kontrola No RT została wygenerowana przy użyciu tego samego materiału co kontrola pozytywna, ale nie obejmuje enzymu w reakcji syntezy cDNA. Kontrola bez RNA (NRC) jest kontrolą ujemną mającą na celu potwierdzenie braku zanieczyszczających transkryptów w składnikach reakcji odwrotnej transkrypcji. Ta kontrola została wprowadzona do przepływu pracy na etapie syntezy cDNA, a do reakcji dodano wodę zamiast matrycy RNA. Kontrole No RT i NRC muszą być ujemne w obu kanałach, jeśli mają być dostarczone dokładne wyniki. W tabeli 1 wymieniono składniki reakcji odwrotnej transkrypcji dla każdej kontroli. Przykłady wykresów 2D dla każdej z tych kontroli są pokazane dla testów multipleksowych ROS1 (Rysunek 3 A-C) i RET (Rysunek 3 E-G). Warianty fuzyjne wykryto za pomocą sondy amidytu fluoresceiny (FAM) i są one reprezentowane wzdłuż osi y, podczas gdy gen kontrolny, GUSB, został wykryty za pomocą sondy 5'-heksachloro-fluoresceiny-CE fosforoamidytu (HEX) i znajduje się na osi x. Te kontrole partii oceniano w ciągu 21 dni w celu określenia wiarygodności testu. Krople dodatnie do fuzji i kropelki genu kontrolnego GUSB zaobserwowano dla ROS1 i RET we wszystkich 21 przebiegach przeprowadzonych w trakcie badania (Rysunek 3D,H). Wszystkie kontrole ujemne (brak RT i NRC) dały wyniki ujemne w ciągu całych 21 dni (dane nie pokazane).

Możliwość rozwiązywania problemów jest kluczowym elementem każdego protokołu testowego, który ma być przeprowadzony w laboratorium klinicznym. W tym miejscu przedstawiamy rzeczywiste przykłady nieoptymalnych wyników przy użyciu protokołu RT-dPCR. Pierwszym z nich jest przykładowy wykres 2D pokazujący znaczenie kontroli bez odwrotnej transkryptazy (Rysunek 4A). W tym przykładzie zmutowane dodatnie kropelki były obecne, mimo że nie było konwersji cDNA z powodu braku enzymu. Wynik ten był prawdopodobnie spowodowany starterami dPCR amplifikującymi genomowe DNA poza celem. W tym przypadku zaprojektowanie testu obejmującego intron zapobiegnie amplifikacji genomowego DNA. Alternatywnie, enzym DNazy wolny od RNaz może być użyty do wyeliminowania zanieczyszczającego DNA, ale nie jest to zalecane do wykrywania rzadkich celów, ponieważ podczas inkubacji z enzymem może wystąpić pewna degradacja RNA. Następnym przykładowym wykresem 2D był NRC z dodatnimi kroplami w obu kanałach (Rysunek 4B). Wskazywało to na zanieczyszczenie w pewnym momencie konfiguracji RT-dPCR. W takim przypadku zaleca się wyrzucenie wszelkich potencjalnie zanieczyszczonych odczynników używanych do testowania, dokładne odkażenie całego sprzętu i ponowne przetestowanie z nowymi składnikami reakcji. Trzeci przykładowy wykres 2D przedstawiony jako rozprysk kropel wzdłuż linii 45° (Rysunek 4C). Jest to często spowodowane ścinaniem i łączeniem kropel. Niezbędne jest ostrożne obchodzenie się z kroplami przed cyklami termicznymi, ponieważ kropelki są podatne na uszkodzenia. Zalecamy korzystanie z automatycznego generowania kropel, jeśli jest to możliwe. W przypadku przenoszenia ręcznie generowanych kropel należy wybrać zalecane końcówki o szerokim otworze i stosować staranną technikę pipetowania. Przenoszenie kropelek wymaga powolnego zasysania i dozowania, przy czym każde z nich odbywa się w ciągu 5-6 sekund, przy czym ważne jest, aby otwór końcówki pipety nie dotykał wkładu z kroplami ani studzienki. Podczas dozowania trzymaj końcówkę pipety na poziomie cieczy i powoli podnoś ją w miarę dozowania kropel (obejrzyj film demonstracyjny). Ostatni przykład wykresu 2D pokazuje brak separacji między dodatnimi i ujemnymi populacjami kropel (Rysunek 4D). Może to mieć kilka przyczyn. Silne inhibitory PCR, takie jak detergenty stosowane w do lizy i nadmiar wysoce zdegradowanego DNA, mogą powodować utratę separacji. W takim przypadku rozważ dodanie etapu oczyszczania między syntezą cDNA a dPCR (takiego jak opisano w kroku 5 tego protokołu). Wreszcie, brak separacji może być również spowodowany nieoptymalnymi warunkami amplifikacji, należy również rozważyć optymalizację etapu PCR.

Dane w obrębie Rysunek 5 przedstawia 984 rzeczywiste czasy przetwarzania próbek pacjentów i pokazuje szybki charakter tego procesu testowego. Wyniki zostały zgłoszone lekarzowi prowadzącemu już w ciągu 48 godzin (79% przypadków) od otrzymania próbki, a w 95% przypadków w ciągu 72 godzin. Podsumowując, zastosowanie stabilizowanych probówek do pobierania krwi krążącego RNA, zoptymalizowanych procedur ekstrakcji RNA z krwi oraz RT-dPCR przebiegających zgodnie ze zoptymalizowanym protokołem z odpowiednimi kontrolami wewnętrznymi i wsadowymi, może zapewnić szybki system testowy do dokładnego wykrywania wariantów fuzyjnego RNA istotnych w NSCLC.

Rysunek 1: Przegląd etapów przetwarzania próbek krwi w celu wykrywania wariantów fuzji przy użyciu testów specyficznych dla najbardziej rozpowszechnionych wariantów RET i ROS1 w NSCLC. (A) Badanie próbki rozpoczyna się, gdy pobierana jest krew pełna, a BCT jest wysyłany w zestawie do pobierania próbek do Laboratorium Klinicznego. Krążące RNA jest odzyskiwane z wielu źródeł w osoczu wzbogaconym w płytki krwi, poddawane odwrotnej transkrypcji za pomocą torowania specyficznego dla genu i oczyszczane do stosowania w dPCR. Próbki są przetwarzane przy użyciu dostępnego na rynku systemu, który składa się z generowania kropel (emulsji), amplifikacji i zliczania kropel. Dane są analizowane za pomocą komercyjnie dostępnego oprogramowania. Wyniki testu są następnie dokumentowane i zgłaszane z powrotem do lekarza zlecającego badanie. Proces został zaprojektowany tak, aby działał w ciągu 72 godzin od otrzymania próbki do wydania wyniku. Osiem wariantów dla (B) ROS1 i (C) RET jest objętych testami multipleksowanymi. Na podstawie strony internetowej Biodesix za zgodą. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Walidacja analityczna. Linie komórkowe wykazujące ekspresję fuzji (A) SDC4-ROS1 i (B) fuzji CCDC6-RET rozcieńczono na tle całkowitego ludzkiego RNA TYPU DZIKIEGO (WT RNA). Dla każdego wariantu fuzyjnego granica wykrywalności została ustalona na poziomie 0,2% częstości występowania wariantu przy użyciu wstępnie zdefiniowanych kryteriów dla każdego testu wariantu. Wszystkie próbki powyżej tego progu zawierały również co najmniej 21 kopii genu kontrolnego. Przetestowano 5% wzorzec EML4-ALK (ALK) na tle RNA typu dzikiego w celu wykazania swoistości testowej, która została potwierdzona wynikiem ujemnym. Analityczne wzorce multipleksowanego RNA mierzono w wysokich, średnich i niskich stężeniach dla (C) ROS1 i (D) RET. Precyzja oceniano w trzech seriach tego samego dnia (Intra-day), trzech seriach w trzech kolejnych dniach (Inter-day) oraz z dwoma niezależnymi operatorami (Inter-operator). Pokazane są średnie liczby kopii i odchyleń standardowych. Na podstawie strony internetowej Biodesix za zgodą. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Przykłady kontroli przetwarzania wsadowego i dane dotyczące solidności. Wykres 2D wyników testu dPCR multipleksowanego ROS1 dla (A) kontroli pozytywnej, (B) braku kontroli odwrotnej transkryptazy i (C) braku kontroli matrycy RNA. (D) Kontrole prowadzono przez 21 kolejnych dni (z wyłączeniem weekendów i świąt). Średnia liczba kopii +/- odchylenia standardowe dla kontroli pozytywnej ROS1 wyniosły 439 +/- 141. Nie przeprowadzano również żadnej odwrotnej transkryptazy ani żadnych kontrolek szablonów każdego dnia, a wszystkie były negatywne (dane nie pokazane). Wykres 2D wyników testu multipleksowanego RET dPCR dla (E) kontroli pozytywnej, (F) braku kontroli odwrotnej transkryptazy i (G) braku kontroli matrycy RNA. (H) Kontrole prowadzono przez 21 kolejnych dni (z wyłączeniem weekendów i świąt). Średnie kopie +/- odchylenia standardowe dla kontroli dodatniej RET wynosiły 586 +/- 182. Nie pokazano żadnych odwrotnych transkryptaz ani kontrolek szablonu, które były również uruchamiane każdego dnia i wszystkie były negatywne. Na podstawie strony internetowej Biodesix za zgodą. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Rozwiązywanie problemów z RT-dPCR. Wykresy 2D reprezentujące nieoptymalne wyniki dPCR uzyskane, gdy występuje (A) zanieczyszczenie w ramach kontroli bez odwrotnej transkryptazy, (B) zanieczyszczenie w ramach kontroli bez RNA, (C) ścinanie i łączenie kropel, oraz (D) słabo zoptymalizowane warunki PCR lub hamowanie PCR. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Czas realizacji (TAT). TAT (w godzinach) został opracowany dla testów wymagających wariantu RNA (n = 984). Dane nie obejmują weekendów, świąt i próbek przechowywanych przez >24 godziny z powodu niekompletnych informacji klinicznych w formularzach wniosków o przeprowadzenie badań laboratoryjnych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Przygotowanie odczynników do odwrotnej transkrypcji do kontroli procesu.

składnik	głośność
2x dPCR supermix do sond (bez 5'-trifosforanu 2'-deoksyurydyny)	10 μL
20x zestaw starterów/sond do celów wariantowych (startery 450 nmol/L, sonda FAM 250 nmol/L)	1 μL
20x zestaw starterów do celów kontrolnych/sondy (startery 450 nmol/L, sonda HEX 250 nmol/L)	1 μL
Woda wolna od nukleaz	1 μL
Zawartość cDNA	7 μL

Tabela 2: Przygotowanie mieszanki wzorcowej do dPCR.

Krok rowerowy	temperatura	Godzina	# Cykle	Szybkość narastania
Aktywacja enzymatyczna	95 °C	Czas trwania: 10 min	1	~2 oC/s
denaturacja	94 °C	30 sekund	40
Wyżarzanie/wydłużanie	55 °C	1 min
Dezaktywacja enzymów	98 °C	Czas trwania: 10 min	1
Przytrzymaj (opcjonalnie)	4 °C	nieskończony	1	~1 oC/s

Tabela 3: Warunki cyklu termicznego.

Dyskusja

Rearanżacje RET i ROS1 razem stanowią ~ 3% mutacji sterownika w populacji NSCLC¹⁸. Chociaż rzadko, wykrycie tych zmian genetycznych jest niezbędne. Pacjenci z niedrobnokomórkowym rakiem płuca z tymi zmianami mogą odnieść korzyści z celowanych terapii, które specyficznie hamują nieprawidłową aktywność kinazy wynikającą z onkobiałka¹³. Niektóre takie terapie są już zatwierdzone przez FDA do stosowania w NSCLC z dodatnim wynikiem ROS1, podczas gdy inne okazały się skuteczne przeciwko RET w badaniach klinicznych¹⁹.

Technologia Digital PCR zapewnia czułość, która jest idealna do zastosowań w płynnej biopsji²⁰. Technologia ta została w znacznym stopniu przyjęta do stosowania z krążącym bezkomórkowym DNA do pomiaru mutacji nowotworowych u pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca 4,6,21,22,23. Oprócz cfDNA opracowaliśmy protokół przeznaczony do solidnego pomiaru najbardziej rozpowszechnionych wariantów fuzji u pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca z krążącego RNA guza (Figura 1A)¹⁰.

Nasz ustalony protokół pozwala na analityczne limity wykrywalności do 0,2% (rysunek 2). Chociaż RT-dPCR jest wyjątkowo specyficzny i czuły, testy są ograniczone do panelu znanych wariantów fuzji, które są wybierane i multipleksowane do wykrywania w teście PCR. W związku z tym fuzje, które mają zostać włączone do testów multipleksowych, muszą być starannie dobrane, aby zapewnić odpowiednie pokrycie w populacji pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca. Z powodzeniem zaprojektowaliśmy testy dla RET i ROS1, które jednocześnie wykrywają osiem wariantów fuzji wynikających z rearanżacji loci RET lub ROS1 i obejmują odpowiednio 99% i 88% populacji RET i ROS1 dodatnich (Figura 1B-C)¹⁷.

Końcowy przebieg testu opisany w tym badaniu obejmuje kontrole partii w celu zapewnienia spójności wyników. Kontrole te obejmują zarówno dodatni wzorzec analityczny, jak i dwie kontrole ujemne, które razem zapewniają, że w partii nie dochodzi do zanieczyszczenia lub zahamowania PCR (rysunek 3). Aby zapewnić solidność testu, przeprowadzono badanie z wykorzystaniem kontroli partii przez okres 21 dni (ryc. 3D,H). Dane te pokazują spójność procesu RNA ustalonego w ramach tego protokołu.

Dobre praktyki laboratoryjne i odpowiednie obchodzenie się z RNA są kluczowymi elementami zapewniającymi wiarygodne i dokładne wyniki. Przestrzeń laboratoryjna i sprzęt przeznaczony do stosowania z RNA, czyszczenie sprzętu po każdym użyciu, stosowanie odczynników i materiałów eksploatacyjnych wolnych od RNaz oraz stosowanie sprayu do inaktywacji RNazy w przestrzeni roboczej pomaga zmniejszyć zanieczyszczenie RNaz. Sumienne obchodzenie się z próbkami RNA przez techników, w tym dedykowany fartuch laboratoryjny, częsta zmiana rękawic, szybka praca nad procedurą ekstrakcji RNA i przechowywanie próbek na lodzie mają ogromne znaczenie dla zachowania integralności próbki. Po odwrotnej transkrypcji RNA na cDNA próbka jest w bardziej stabilnej formie, która jest mniej podatna na degradację. Oprócz praktyk wspierających integralność RNA, komponenty i próbki PCR powinny być przechowywane w oddzielnych obszarach, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu, które mogłoby prowadzić do fałszywie dodatnich wyników. Podstawowe odczynniki do PCR i przygotowanie głównych mieszanin PCR powinny być przechowywane oddzielnie od matryc PCR i należy zachować szczególną ostrożność w celu oddzielenia amplifikowanej matrycy (po PCR) od wszystkich wstępnie amplifikowanych materiałów, w tym odczynników, RNA i próbek cDNA. Wreszcie, prawidłowe wytwarzanie i obchodzenie się ze zemulgowanymi mieszaninami PCR przed amplifikacją ma kluczowe znaczenie dla utrzymania integralności kropelek i optymalnych warunków dPCR. Takie środki ostrożności mają kluczowe znaczenie podczas wykonywania tego protokołu, aby uzyskać spójne i dokładne wyniki. Wszystkie dane powinny zostać sprawdzone przez przeszkolony personel przed publikacją wyników, aby upewnić się, że wszystkie wskaźniki kontroli jakości zostały spełnione. W przypadku nieoptymalnych wyników (rysunek 4) partia musi zostać poddana przeglądowi przez personel techniczny i dyrektora laboratorium i może wymagać ponownego przetworzenia.

Wyniki RT-dPCR można uzyskać już po 24 godzinach od otrzymania próbki, a 95% wyników próbek w zestawie testowym użytym w tym badaniu (n = 984) zostało zgłoszonych lekarzowi zamawiającemu w czasie krótszym niż 72 godziny od momentu otrzymania (ryc. 5). Ten czas realizacji dostarcza lekarzom bardzo potrzebnych informacji molekularnych w ramach czasowych, które umożliwiają rozpoczęcie odpowiedniej terapii. Wyniki te są zazwyczaj dostępne wcześniej niż te uzyskane przy użyciu konwencjonalnej biopsji tkanki. Dodatkowe biomarkery dla NSCLC i innych nowotworów mogłyby zostać opracowane przy użyciu podobnych podejść opartych na krążącym RNA i skorzystałyby na tym samym krótkim czasie oczekiwania na wyniki. Na przykład pomiar transkryptu mRNA ligandu programowanej śmierci 1 (PD-L1) za pomocą RT-dPCR może dostarczyć lekarzom informacji o możliwościach immunoterapii. Rośnie również zainteresowanie przydatnością płynnej biopsji i dPCR w monitorowaniu skuteczności terapeutycznej. Wcześniejsze oznaki nawrotu nowotworu za pomocą testów genomowych dla określonych wariantów mogą pozwolić lekarzom na dostosowanie schematów leczenia, zanim u pacjentów pojawią się objawy, za pomocą standardowych środków opieki, takich jak obrazowanie²⁴. Protokoły takie jak ten opisany w tym badaniu są idealne do monitorowania ze względu na ich nieinwazyjność, czułość, szybki czas realizacji i opłacalność. Test opisany w niniejszym dokumencie dostarcza wyniki w ciągu 72 godzin od otrzymania próbki, przy minimalnych wskaźnikach wykrywalności wyników fałszywie dodatnich, co ułatwia szybkie podejmowanie decyzji dotyczących leczenia i pozwala obejść niektóre ograniczenia występujące w przypadku testów tkankowych⁴.

Nasz protokół i dane wskazują na solidny system testowy do identyfikacji wariantów RNA o niskiej liczebności, a także potencjał testowania mutacji krwi w praktyce klinicznej. W przypadku pacjentów, u których nie stwierdzono mutacji powodującej podjęcie działań za pomocą szybkich, celowanych metod biopsji płynnej, takich jak ta, dodanie bardziej obszernych testów genomu i proteomu zarówno z tkanek, jak i krwi może dostarczyć jeszcze szerszych informacji klinicznych wspierających planowanie leczenia.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ultraczysta woda destylowana (bez DNAzy, RNAzy) (500 ml)	Life Technologies	10977-015	1604071
Ultraczysta woda destylowana (bez DNAzy, RNAzy) (500 ml)	Life Technologies	10977-015	1809353
Woda wolna od nukleaz (klasa molekularna)	Ambion	AM9938	1604071
Woda wolna od nukleaz (klasa molekularna)	Ambion	AM9938	1606077
buforowana fosforanami 1X, sterylna	Amresco	K812-500mL	1446C189
sól fizjologiczna buforowana fosforanami 1X, sterylna – 500 mL	Invitrogen	10010023	1916C092
RNase Zap (Life Tech) (250 mL)	Ambion	AM9780	353952
Beta-merkaptoetanol (BME)  (250 ml)	CalbioChem	6050	W105B
OmniPur Alkohol etylowy	CalbioChem	4455-4L	56054611
OmniPur Alkohol etylowy	CalbioChem	4455-4L	56238638
Alkohol izopropylowy	VWR	0918-4L	2116C416
TranscriptAid T7 Wysokowydajny zestaw do transkrypcji	Thermo Scientific	K0441	403648
TranscriptAid T7 High Zestaw do transkrypcji	plonów Thermo Scientific	K0441	288461
DNase I	Thermo	K0441	371299
QIAzol Odczynnik do lizy	Qiagen	79306	54809699
20x bufor TE pH 8,0	Alfa Aesar	J62388	R13C548
UltraPure Agaroza	Invitrogen	16500-100	552730
10x bufor TBE	Invitrogen	AM9863	353065
Bezkomórkowy RNA	BCT Streck	218976	60110327
Bezkomórkowy RNA BCT	Streck	218976	61900327
Bezkomórkowy RNA BCT	Streck	218976	61480327
Bezkomórkowy RNA BCT	Streck	218976	62320327
Zestaw do oczyszczania krążącego i egzosomalnego RNA (format gnojowicy) 50 przygotowań	Norgen	42800	585849
Zestaw do oczyszczania krążącego i egzosomalnego RNA w surowicy (format gnojowicy) 50 przygotowań	Norgen	42800	588308
Bufor do lizy	Norgen	21205	A5F61E
Zestaw mikroelutu do oczyszczania i koncentracji RNA (Norgen) 50 przygotowań	Norgen	61000	585848
Zestaw do oczyszczania i koncentracji RNA Micro-Elute (Norgen) 50 przygotowań	Norgen	61000	588309
Clean and ConcentratorTM- 5  200 preparatów (próbki)	Zymo	D4014	ZRC186976
DNA Clean and ConcentratorTM- 5  200 preparatów (próbek)	Zymo	D4014	ZRC188077
DNA Clean and ConcentratorTM- 5  200 preparatów (próbki)	Zymo	D4014	ZRC188413
Collection Tubes 500 sztuk	Zymo	C1001-500	N/A
SuperScript IV System syntezy pierwszej nici 200 rxn (próbki)	Life Technologies	18091200	391657
SuperScript IV System syntezy pierwszej nici 200 rxn (próbki)	Life Technologies	18091200	392504
SuperScript IV System syntezy pierwszej nici 200 rxn (próbki)	Life Technologies	18091200	448001
SuperScript IV Rewers Transcriptase	Life Technologies	18090200	Zestaw
do oznaczania RNA 451702 Qubit HS (500)	Life Technologies	Q32854	1745264
probówki do testów kubitowych (500)	Life Technologies	Q32856	13416Q311
ddPCR Supermix do sond (bez dUTP)	Bio-Rad	1863023	64031651
ddPCR Supermix do sond (bez dUTP)	Bio-Rad	1863023	64063941
ddPCR Supermix do sond (bez dUTP)	Bio-Rad	1863023	64065740
ddPCR Supermix do sond (bez dUTP)	Bio-Rad	1863023	64065741
ddPCR Supermix do sond (bez dUTP)	Bio-Rad	1863023	64079083
kontrola bufora ddPCR dla sond	Bio-Rad	1863052	64025320
kontrola bufora ddPCR dla sond	Bio-Rad	1863052	64052358
gBlock KIF5B-RET K15:R12	IDT	151004172	4-paź-16
gBlock KIF5B-RET K16:R12	IDT	151004173	4-paź-16
gBlock KIF5B-RET K22:R12	IDT	151004174	4-paź-16
gBlock KIF5B-RET K23:R12	IDT	151004175	4-paź-16
gBlok KIF5B-RET K24:R11	IDT	151004176	4-paź-16
gBlock KIF5B-RET K24:R8	IDT	151004177	4-paź-16
gBlock CCDC6-RET C1:R12	IDT	151004178	4-paź-16
gBlok TRIM33-RET T14:R12	IDT	151004179	4-paź-16
RET ekson 8 RT Specyficzny dla genu podkład	IDT	150554385	28-wrz-16
5'-CTCCACTCACACCTG-3'	IDT	150554385	28-wrz-16
RET ekson 11 RT Specyficzny dla genu starter	IDT	150554384	28-wrz-16
5'-GCAAACTTGTGGTAGCAG-3'	IDT	150554384	28-wrz-16
RET ekson 12 RT Specyficzny dla genu starter	IDT	150554383	28-wrz-16
5'-CTGCCTTTCAGATGGAAG-3'	IDT	150554383	28-wrz-16
gBlock CD74-ROS1 C6:R34	IDT	152324366	15-lis-16
gBlock CD74-ROS1 C6:R32	IDT	152324367	15-lis-16
gBlock SDC4-ROS1 S2:R32	IDT	152324368	15-lis-16
gBlock SDC4-ROS1 S2:R34	IDT	152324369	15-lis-16
gBlock S13del2046-ROS1 S13del2046:R32	IDT	152324370	15-lis-16
gBlock S13del2046-ROS1 S13del2046:R34	IDT	152324371	15-lis-16
gBlock EZR-ROS1 E10:R34	IDT	152324372	15-lis-16
gBlock TPM3-ROS1 T8:R35	IDT	152324373	15-lis-16
ROS1 ekson 34 RT Specyficzny dla genu starter	IDT	152704983	21-lis-16
5'- CCTTCCTTGGCACTTT-3'	IDT	152704983	21-lis-16
ROS1 ekson 35 RT Specyficzny dla genu starter	IDT	152704985	21-lis-16
5'-CTCTTGGGTTGGAAGAGTATG-3'	IDT	152704985	21-lis-16
Specyficzny dla genu podkład ALK	IDT	140035422	26-sie-16
5'-CAGTAGTTGGGGGGGGGTAGTCG-3'	IDT	140035422	26-sie-16
EML4-ALK Granulat linii komórkowej	Horizon Discovery	N/A	11-Jun-15
SLC34A2-ROS1 Pellet linii komórkowej	Horizon Discovery	N/A	11-Jun-15
CCDC6-RET Pellet linii komórkowej	Horizon Discovery	N/A	11-Jun-15
Ludzki mózg Total RNA	Ambion	AM7962	1703548
Test PrimePCR ddPCR Expert Design Test: K15:R12	Bio-Rad	Nie dotyczy	17-sie-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Test: K16:R12	Bio-Rad	Nie dotyczy	17-sie-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Test: K22:R12	Bio-Rad	Nie	17-sie-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Test: K23:R12	Bio-Rad	Nie dotyczy	17-sie-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Test: K24:R11	Bio-Rad	Nie dotyczy	17-sie-16
Test PrimePCR ddPCR Expert Design Test: K24:R8	Bio-Rad	N/A	17-Aug-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Test: C1:R12	Bio-Rad	N/A	17-Aug-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Test: T14:R12	Bio-Rad	N/A	17-Aug-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Test: C6:R34	Bio-Rad /Biodesix	N/A	6-Dec-16
PrimePCR ddPCR Expert Test projektowy: C6: R32	Bio-Rad / Biodesix	Nie dotyczy	6 grudnia 16
PrimePCR ddPCR Ekspert Test projektowy: S2: R32	Bio-Rad / Biodesix	Nie dotyczy	6 grudnia 16
PrimePCR ddPCR Ekspert testowy projektowy: S2: R34	Bio-Rad / Biodesix	Nie dotyczy	6 grudnia 16
PrimePCR ddPCR Ekspert Design test: S13del2046: R32	Bio-Rad / Biodesix	Nie dotyczy	6 grudnia 16
PrimePCR ddPCR Expert Design Test testowy: S13del2046:R34	Bio-Rad /Biodesix	N/A	6-Dec-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Test: E10:R34	Bio-Rad /Biodesix	N/A	6-Dec-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: T8:R35	Bio-Rad /Biodesix	N/A	6-Dec-16
wersja 2)	Bio-Rad	12003909	213939881
PrimePCR ddPCR Expert Design Test: ROS1 Multiplex (wersja 3.2)	Bio-Rad	N/A	13-Dec-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Test: ROS1 Multiplex (wersja 3.2)	Bio-Rad	N/A	20170112v3.2
Test ekspresji genów PrimePCR ddPCR: GUSB, Human	Test
ekspresji genów bio-rad 10031257 212851151 PrimePCR ddPCR: GUSB, Human	Test
ekspresji genów Bio-Rad 10031257 207383915 PrimePCR ddPCR: GUSB, Human	Bio-Rad	10031257	195995635
PrimePCR ddPCR: GUSB, Human	Test
ekspresji genów Bio-Rad 10031257 212851152 PrimePCR ddPCR: GUSB, Human	Bio-Rad	10031257	213949301
PrimePCR ddPCR Expert Design Test: EML4-ALK	Bio-Rad	12003909	20160914
PrimePCR ddPCR Expert Design Test: EML4-ALK	Bio-Rad	12003909	211383227
Olej do generowania kropelek do sond	Bio-Rad	186-3005	1065C220
Olej do generowania kropelek do sond	Bio-Rad	186-3005	64052953
Olej do automatycznego generowania kropel do sond	Bio-Rad	186-3005	64052358
Olej do automatycznego generowania kropel do sond (20x96)	Bio-Rad	186-4110	1065C320
generowania kropel do sond (20x96)	Bio-Rad	186-4110	64052952
Olej do automatycznego generowania kropel do sond (20x96)	Bio-Rad	186-4110	64064127
Wkłady DG8 do generatora kropel QX100/QX200	Wkłady Bio-Rad	186-4008	C000065883
DG8 do generatora kropel QX100/QX200	Wkłady Bio-Rad	186-4008	C000084276
DG8 do generatora kropel QX100/QX200	Wkłady Bio-Rad	186-4008	C000079928
DG8 do generatora kropel QX100/QX200	Wkłady Bio-Rad	186-4008	C000084395
DG8 do generatora kropel QX100/QX200	Bio-Rad	186-4008
C000084634 Uszczelka generatora kropel DG8	Bio-Rad	186-3009
20160627 Uszczelka generatora kropel DG8	Bio-Rad	186-3009
20161107 Generator kropel DG8 Uszczelka	Bio-Rad	186-3009
Generator kropel 20161206 Uszczelka DG8	Bio-Rad	186-3009
20161216 Uszczelka generatora kropel DG8	Bio-Rad	186-3009	20170125
Końcówki do pipet do automatycznego generatora kropel	Bio-Rad	1864120
PR125340 Wkład DG32 do automatycznego generatora kropel (płytki 10-96 dołków)	Bio-Rad	186-4108	206894
DG32 Wkład do automatycznego generatora kropel (płytki 10-96 dołków)	Bio-Rad	186-4108	206893
Folia przebijalna zgrzewana	Bio-Rad	1814040	1409850
Folia przebijalna zgrzewana	Bio-Rad	1814040	100402
Folia przebijana zgrzewana	Uszczelki Bio-Rad	1814040	145851
Microseal 'B'	Bio-Rad	MSB1001	BR00428490
Olejek do czytnika kropelek ddPCR	Bio-Rad	186-3004	64039089
Czytnik kropelek ddPCR	Olejek Bio-Rad	186-3004	64049253
Czytnik kropelek ddPCR Olejek	Bio-Rad	186-3004	64049255
Czytnik kropelek ddPCR	Bio-Rad	186-3004	64081870
Probówka do odczytu kropel DNA Lo Bind 0,5 ml	Eppendorf	22431005	E1629620
Probówka DNA Lo Bind 1,5 ml	Eppendorf	22431021	F16698K
Probówka DNA Lo Bind 2 ml	Eppendorf	22431048	E160610I
50 ml Stożkowe, Polipropylenowe (25)	Thermo	339652	G5ZF5W8118
TempAssure PCR 8-paskowe, Nakładki optyczne, Naturalne, polipropylen (120)	USA Scientific	1402-4700	16202
Do pipet LTS 0,5-20 i mikro firmy Rainin; Końcówki L	Pipette.com	LF-20	40155-642C4-642C
Do pipetorów LTS Rainin 5-200 i mikro; Końcówki L	Pipette.com	LF-250	40154-642C4-642B
Końcówki LTS 200 ul Filtr 960/10 RT-L200F (10 pudełek)	Końcówki	17002927	1635
, 10 ul Kaseta wkładu do końcówki filtra TipOne RPT o ultra niskiej retencji, sterylna	USA Scientific	1181-3710	F1175551-1108
Końcówki do pipet, 10 ul Kaseta wkładu końcówki filtra TipOne RPT o bardzo niskiej retencji, sterylna	USA Scientific	1181-3710	F118054L-1720
Końcówki do pipet, 100 ul Kaseta wkładu końcówki filtra TipOne RPT o ultra niskiej retencji, sterylna (10x96)	USA Scientific	1180-1740	0014961Q-2501
Końcówki do pipet, 200 ul Kaseta wkładu do końcówki filtra TipOne RPT o ultra niskiej retencji, sterylna	USA Scientific	1180-8710	E116684P-1540
Końcówki do pipet, 1000 ul XL Kaseta wkładowa końcówki filtra TipOne RPT o ultra niskiej retencji, sterylna (10x96)	USA Scientific	1182-1730	F118815P
5 mL Standardowe końcówki referencyjne Gilson-fit	Scientific Specialties	4411-00	14312
Końcówki Combitips zaawansowane, 0,1 ml Biopur	Eppendorf	003 008 9618	F165414H
Combitips advanced, 0,2 ml Biopur	Eppendorf	0030 089.626	F166689J
Combitips advanced, 5 ml Biopur	Eppendorf	0030.089 669	F166054J
Combitips advanced, 50 mL Biopur	Eppendorf	003.008.9693	F166055I
Zbiornik na odczynniki	VWR	89094-680	141500
Twin tec PCR Plate 96, półlistwowy, przezroczysty	Eppendorf	951020303	E163697P
Płytka 96 Twin tec PCR 96, półlistkowa, przezroczysta	Eppendorf		951020303 F165029I
Płytka Twin tec PCR 96, półlistkowa, Przezroczysta	Eppendorf	951020303	F165028G
Twin tec PCR Plate 96, półlistkowa,	Eppendorf	951020303	E163697P
Twin tec PCR Plate 96, półlistkowa, zielona	Eppendorf	951020346	F166183K
Typ		ID
Waga		EQP0125
Zamrażarka kriogeniczna 1, -80oC		EQP0095
Lodówka 6,1 stopy sześciennej GP06W1AREF		EQP0139-20
oC Zamrażarka		EQP0140
Beckman Coulter Microfuge 22R		EQP0025
Beckman Coulter Microfuge 22R		EQP0124
Thermo Scientific Hereaus Megafuge 8		EQP0104
Mini wirówka		EQP0131
		EQP0136
Mini wirówka		EQP0134
Mini wirówka
Mini wirówka		EQP0216
Termo Scientific Inkubator		EQP0105
pipeta 0,1 - 2,5 μ L		EQP0182
Pipeta 0,1 - 2,5 μ L		EQP0072
Pipeta 0,1 - 2,5 μ L		EQP0070
Pipeta 0,5-10 μ L		EQP0218
Pipeta 0,5-10 μ L		EQP0075
Pipeta 0,5-10 μ L		EQP0169
Pipeta 0,5-10 μ L		EQP0074
Pipeta 0,5-10 μ L		EQP0147
Pipeta 2 - 20 μ L		EQP0128
Pipeta 2 - 20 μ L		EQP0160
Pipeta 2 - 20 μ L		EQP0018
Pipeta 2 - 20 μ L		EQP0146
Pipeta 10 - 100 μ L		EQP0079
Pipeta 10 - 100 μ L		EQP0181
Pipeta 10 - 100 μ L		EQP0085
Pipeta 10 - 100 μ L		EQP0077
Pipeta 20 - 200 μ L		EQP0088
Pipeta 20 - 200 μ L		EQP0087
Pipeta 20 - 200 μ L		EQP0231
Pipeta 100 - 1000 μ L		EQP0050
Pipeta 100 - 1000 μ L		EQP0158
Pipeta 100 - 1000 μ L		EQP0217
Pipeta 100 - 1000 μ L		EQP0082
Pipeta 100 - 1000 μ L		EQP0183
Pipeta 100 - 1000 μ Pipeta L		EQP0083
5 ml		EQP0153
Timer		S/N 140623950
Dygestorium Hamilton SafeAire VAV EQP0206
Szafka		EQP0205
Szafka		EQP0204
Qubit 3.0		EQP0102
Cyfrowy blok		EQP0108
Benchmarkowy cyfrowy blok		EQP0231
Cyfrowy aparat żelowy Polaroid Z2300 Instant Print z WiFi i kartą		16 GB EQP0111
Jednostka		EQP0113
Małe pudełko		EQP0116
Maestro Przezwietlacz		EQP0118
Mikrofalówka		EQP0215
Wielokanałowa pipeta 8-dołkowa 2 -  20 μ L		EQP0207
Wielokanałowa pipeta 8-dołkowa 10 - 100 μ L		EQP0090
Wielokanałowa pipeta 8-dołkowa Rainin 50 μ L		EQP0094
Wielokanałowa pipeta 8-dołkowa Rainin 50 μ L		EQP0161
Pipeta wielokanałowa 8-dołkowa Rainin 50 μ L		EQP0162
Wielokanałowa pipeta 8-dołkowa Rainin 50 μ L		EQP0163
Vortex Genie 2		EQP0052
Vortex Genie 2		EQP0007
Vortex Genie 2		EQP0132
Vortex Genie 2		EQP0137
Vortex Genie 2		EQP0135
Stacja		EQP0203
Air Stacja robocza Clean PCR	EQP0096
QX200 Generator		EQP0121
Automatyczny generator		EQP0179
Zgrzewarka do płytek PCR1 PX1	EQP0123
EQP0174 Cykler S1000 z termocyklerem 96W FS RM
Termocykler		EQP0180
Termocykler		EQP0175
Czytnik		EQP0194
Czytnik		EQP0122