Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Mikropreparacja narządu szkliwa z siekacza żuchwy szczurów narażonych na działanie toksyn środowiskowych

10.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57081

⸱

29 marca 2018

 ,  ,  ,  , 
1Institut National de la Santé et Recherche Médicale (INSERM) UMRS 1138, Paris-Diderot University, Pierre & Marie Curie University, Paris-Descartes University, Laboratory of Molecular Oral Pathophysiology, Cordeliers Research Centre, 2Unit of Formation and Research (UFR) of Odontology, Paris-Diderot University

W tym artykule

Podsumowanie

Zrozumienie powstawania szkliwa i możliwych zmian wymaga zbadania aktywności ameloblastów. W tym miejscu opisano wiarygodną i spójną metodę mikropreparacji narządów szkliwa zawierających ameloblasty w fazie sekrecji i dojrzewania, które mogą być wykorzystane do dalszych ilościowych i jakościowych procedur eksperymentalnych.

Streszczenie

Wady szkliwa wynikające z warunków środowiskowych i stylu życia stanowią problem zdrowia publicznego ze względu na ich częste występowanie. Wady te wynikają ze zmienionej aktywności komórek odpowiedzialnych za syntezę szkliwa zwanych ameloblastami, które są obecne w narządzie szkliwa. Podczas amelogenezy ameloblasty podążają za określoną i precyzyjną sekwencją zdarzeń proliferacji, różnicowania i śmierci. Szczur z ciągle rosnącymi siekaczami jest odpowiednim modelem eksperymentalnym do badania aktywności ameloblastów i etapów różnicowania w stanach fizjologicznych i patologicznych. Tutaj opisujemy niezawodną i spójną metodę mikropreparacji narządu szkliwa szczurów narażonych na działanie toksyn środowiskowych. Mikrowycięty nabłonek zębów zawiera ameloblasty w fazie wydzielania i dojrzewania, które mogą być wykorzystywane do eksperymentów jakościowych, takich jak testy immunohistochemiczne i hybrydyzacja in situ, a także do analiz ilościowych, takich jak RT-qPCR, sekwencjonowanie RNA i Western blot.

Wprowadzenie

Wiele rozwojowych wad szkliwa może wynikać z narażenia na toksyny środowiskowe i/lub niewłaściwego stylu życia1,2,3,4. Charakterystyka zdarzeń zakłócających i cząsteczek amelogenezy przy użyciu obecnie opisanej procedury będzie promować wykorzystanie powstałych defektów szkliwa jako wczesnych markerów narażenia na kilka substancji toksycznych i może pomóc w odtworzeniu historii zdrowia każdej pacjentki w okresie okołoporodowym, kiedy szkliwo jest syntetyzowane1,2. Syntezę szkliwa można podzielić na cztery główne etapy w zależności od aktywności ameloblastów5. Pierwszy etap przegrupowuje proliferację komórek prekursorowych i pre-ameloblastów. W drugim etapie zróżnicowane ameloblasty wydzielają białka macierzy szkliwa (EMP), głównie amelogeninę, szkliwo i ameloblastynę, które decydują o grubości końcowego szkliwa. Tak więc każde zakłócenie syntezy EMP prowadzi do ilościowych defektów szkliwa. Po osadzeniu się pełnej grubości szkliwa rozpoczyna się etap dojrzewania. Na tym etapie wzrost krystalitu apatytu pod względem szerokości i grubości pozwala szkliwu osiągnąć najwyższy współczynnik mineralizacji występujący w tkance biologicznej, wynoszący do 96% masy. Zdarzenia zakłócające, które zachodzą na etapie dojrzewania, prowadzą do jakościowych wad szkliwa. Wreszcie ameloblasty wchodzą w fazę pomaturalną, zwaną również pigmentacją u gryzoni, i ulegają apoptozie podczas wyrzynania się zębów, co sprawia, że ubytki szkliwa (jeśli występują) są nieodwracalne i nieodwracalne, a zatem wady zapewniają potencjalną retrospektywną rejestrację stresów ameloblastowych. U gryzoni amelogeneza przebiega zgodnie z podobną sekwencją zdarzeń, ze szczególnym wyjątkiem, że ich siekacze stale rosną, co czyni je odpowiednim modelem do badania ogólnego procesu amelogenezy. Tak więc każde zakłócenie amelogenezy powoduje zmiany jakości i/lub ilości szkliwa, w zależności od okna czasowego zdarzenia zakłócającego. W tym sensie wykazano, że narażenie na dioksyny, ołów i substancje chemiczne zaburzające gospodarkę hormonalną (EDC), takie jak bisfenol A (BPA), genisteina i winklozolina, generują hipomineralizację szkliwa1,2,3,6,7,8. Na siekaczach szczurów narażonych na niską dawkę BPA w okresie płodowym i w pierwszym miesiącu po urodzeniu zidentyfikowano asymetryczne><, białe, nieprzezroczyste plamki. Te wady szkliwa u szczurów oraz hipomineralizacja ludzkich siekaczy trzonowych (MIH) mają podobne cechy kliniczne, strukturalne i biochemiczne. MIH to niedawno opisana patologia szkliwa zębów, której etiologia nadal pozostaje niejasna9,10 pomimo hipotezy o wielu czynnikach przyczynowych9,10,11,12.

Innym ważnym patologiem hipomineralizacji szkliwa spowodowanym czynnikami środowiskowymi jest fluoroza zębów (DF), która jest konsekwencją nadmiernego wchłaniania fluoru (>0.1 mg/kg/dzień)13,14. Głównym źródłem fluoru jest woda pitna, która jest albo uzupełniona, albo naturalnie wzbogacona w fluor. Fluor jest również często przepisywany w celu zapobiegania próchnicy, ale dawka profilaktyczna jest tylko o 50% niższa niż toksyczna (≤0,05 mg/kg/dzień). MIH i DF, dwie częste patologie wynikające z narażenia na czynniki środowiskowe, mogą wykazywać wspólne cechy, które należy scharakteryzować ze względu na nasilenie hipomineralizującego działania fluoru w połączeniu z innymi substancjami toksycznymi, takimi jak EDCs2 lub amoksycylina15.

Mikropreparacja szczurzego narządu szkliwa zawierającego ameloblasty na różnych etapach różnicowania pomoże zrozumieć mechanizm działania cząsteczek zdolnych do zakłócania aktywności ameloblastów i powodowania diagnozy wad szkliwa po wyrzynaniu się zębów. Innymi słowy, charakterystyka zmian ekspresji genów szkliwa i składu matrycy szkliwa spowodowanych toksynami środowiskowymi pozwala na odtworzenie historii narażenia na substancje toksyczne i ułatwia monitorowanie bezpieczeństwa środowiskowego dla zdrowia publicznego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie zwierzęta użyte w niniejszym badaniu były utrzymywane zgodnie z wytycznymi francuskiego Ministerstwa Rolnictwa dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych (A-75-06-12).

1. Narażenie zwierząt na substancje toksyczne

  1. Przed wykonaniem tego protokołu należy uzyskać niezbędną zgodę instytucjonalną i upewnić się, że przestrzegasz wszystkich wytycznych dotyczących opieki nad zwierzętami.
  2. Zastosowanie projektu protokołu badawczego umożliwiającego utworzenie różnych grup doświadczalnych w celu zbadania wpływu badanej cząsteczki (cząsteczek) na etap wydzielania ameloblastów i etap dojrzewania ameloblastów. W tym przypadku utworzono cztery grupy samców szczurów rasy Wistar w zależności od ich ekspozycji na fluor (NaF) w połączeniu lub nie z BPA ( Rysunek 1A)2. Wszystkie zwierzęta zostały zaobserwowane i poddane sekcji w 65 dniu (Ryc. 1B).

2. Sekcja żuchwy od dorosłych szczurów

  1. Eutanazja szczurów przez uduszenie CO2 , opcjonalnie po której następuje dekapitacja głowy od reszty ciała. Wystaw szczury na działanie CO2 przez 5 minut w dedykowanym pudełku16.
  2. Usuń całą skórę z dolnych warg za pomocą skalpela #11, aby uzyskać łatwy dostęp do dolnych siekaczy.
  3. Tym samym skalpelem wykonaj nacięcie między dwoma dolnymi siekaczami z lekkim naciskiem, a żuchwa zostanie podzielona na dwie połowy.
  4. Przetnij staw skroniowo-żuchwowy skalpelem, aby odłączyć szczękę, i przytrzymaj półżuchwę delikatną pęsetą.
  5. Przetnij otaczające tkanki miękkie skalpelem i usuń wszystkie mięśnie, ścięgna i więzadła za pomocą skrobaka, aż kość będzie całkowicie czysta.

3. Izolacja siekacza class<="xref">17,18

  1. Ostrożnie ogol kość, umieszczając ostrze równolegle do głównej osi podłużnej siekacza. Zacznij od grzbietu kostnego w pobliżu końców siekacza (koniec proksymalny) aż do końca siekacza w pobliżu pętli szyjnej. Ruch nacięcia przebiega od kierunku bliższego do dalszego.
  2. Wykonaj pierwsze cięcie dystalnie do pętli szyjnej za pomocą skalpela, aby usunąć gonion półżuchwy i umożliwić łatwe zdjęcie siekacza bez uszkadzania pętli szyjnej lub etapu wydzielniczego ameloblastów (czerwona linia w Ryc. 2).
  3. Wykonaj drugie cięcie poniżej drugiego zęba trzonowego i włóż skalpel między kość a przyśrodkową powierzchnię siekacza. Kiedy cała kość podstawna zostanie podniesiona, obróć siekacz na zewnątrz i ostrożnie go zdejmij, aby uniknąć uszkodzenia tkanki szkliwa narządu, używając cienkiej pęsety.

4. Mikropreparacja narządu szkliwa pod soczewką lornetkową

  1. Upuść 200 μl buforu fosforanowo-solnego (PBS 1X) na siekacz za pomocą pipety. Weź siekacz cienkim pęsetą z powierzchnią wargową skierowaną do góry. Zrób znak skalpela między bezbarwną a pomarańczową częścią tkanki. Znak ten odpowiada znajdującej się pod spodem białej plamie, którą można później zaobserwować (Rysunek 2).
  2. Zeskrobać za pomocą koparki lub równoważnego narzędzia powierzchnię komórki od śladu skalpela do wierzchołkowego końca odpowiadającego ameloblastom w stadium wydzielania (bezbarwnym) oraz od śladu skalpela do końca siekacza w przypadku ameloblastów w fazie dojrzewania (pomarańczowy).
  3. Usuń 2-milimetrową tkankę odpowiadającą etapowi przejścia, jak opisano wcześniej19. Nie otwieraj siekacza podczas preparacji narządu szkliwa, aby uniknąć zanieczyszczenia mezenchymą.
  4. Przeciąć pętlę szyjną znajdującą się bezpośrednio w wierzchołkowej części siekacza (Rysunek 2), jak opisano wcześniej20.
  5. Zbierz go w 10% roztworze formaliny lub roztworze do lizy w celu dalszych badań (patrz tabela materiałów).

5. Pobranie oddzielonych tkanek narządów szkliwa do dalszych badań

  1. Upuść 200 μl buforu PBS 1X na siekacz.
  2. Za pomocą ostrza skalpela #11 ostrożnie odłączaj komórki nabłonka zębów stopniowo w buforze, osobno dla każdego etapu za pomocą wykonanego wcześniej śladu skalpela.
  3. W przypadku ekstrakcji RNA komórek i białek należy umieścić tkankę w roztworze do lizy, który umożliwia ekstrakcję zarówno białek, jak i RNA (patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: Przygotuj wysokiej jakości RNA, obracając koparkę tkankową w probówce, a następnie mieląc komórki aż do uzyskania jednorodnej mieszaniny. Mieszanina jest gotowa do ekstrakcji RNA i białek zgodnie z procedurą producenta, która została wcześniej opisana2,8,17. Zazwyczaj dla każdego preparatu uzyskuje się około 5-10 μg całkowitego RNA i 150 μg białek ogółem.
  4. W przypadku analiz histologicznych, immunohistochemii (IHC) i hybrydyzacji in situ (ISH) należy umieścić warstwę komórkową w 10% formalinie na 2 godziny, a następnie przechowywać w temperaturze 4 °C w PBS 1X. Tkanka może być następnie zanurzona w wosku/parafinie lub tkance OCT w celu zamrożonych skrawków.
  5. W przypadku ekstrakcji EMP weź siekacz za pomocą cienkiej pęsety. Po krótkiej ekspozycji na powietrze (lekkie odwodnienie) wokół środkowej części wargowej powierzchni siekacza widoczna będzie biała plama, która reprezentuje inicjację mineralizacji szkliwa. Ta biała plama odpowiada etapowi przejściowemu/wczesnemu dojrzewaniu ameloblastów, więc użyj jej jako wskaźnika do ekstrakcji EMPs21.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wiele defektów szkliwa, takich jak fluorosis zębów12,13, może wynikać z warunków środowiskowych spowodowanych nadmiernym wchłanianiem fluorków lub hipomineralizacją szkliwa podobną do MIH w wyniku ekspozycji na niektóre EDCs1,7,22. Te rozwojowe defekty szkliwa można odtworzyć eksperymentalnie u szczurów (Rycina 1

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zmieniona aktywność ameloblastów i/lub zaburzone procesy proliferacji, różnicowania i dojrzewania ameloblastów prowadzą do nieodwracalnych wad szkliwa, a z kolei charakterystyka wad szkliwa może pomóc w zrozumieniu zmienionej aktywności ameloblastów podczas amelogenezy. Tym samym badania na izolowanym narządzie szkliwa są wyznacznikiem zdarzeń patologicznych prowadzących do wad szkliwa niezależnie od ich pochodzenia, środowiskowego czy genetycznego.

Technika ta została pierwotnie opisana przez...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana przez Uniwersytet Paris-Diderot, Francuski Narodowy Instytut Zdrowia i Badań Medycznych (INSERM) oraz Francuski Instytut Badań Onodontologicznych (IFRO).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Bisfenol ASigma Aldrich, Saint Louis MO239658
formalina 10%Sigma-Aldrich, Saint Louis, MOHT5012
Tri-ReagentEuromedex, FrancjaTR118
RLT bufferQiagen, Les Ulis, Francja74126RNeasy Protect Mini Kit
Przeciwciało przeciwko receptorowi androgenowemuSanta Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)sc-816królicze przeciwciało poliklonalne
PBS 10xEUOMEDEXET330. A
Fluorek sodu (NaF)Sigma-Aldrich, Saint Louis, MOS-1504
paraplast regularnemikrosystemy Leica, Nanterre cedex,  Francja39601006nazywana was/parafin w tkance tekstowej
OCTVWR, Fontenay-sous-Bois, Francja411243
Nożyczki Extra Fine Bonn - proste/8.5 cmPHYMEP , Paryż, Francja14084-08
Rękojeść do ostrzy skalpela - 12.5 cmPHYMEP, Paryż, Francja10035-12
Zakrzywione ostrze skalpelaPHYMEP , Paryż, Francja10035-20
Nóż preparacyjny - cienka/prosta końcówkaPHYMEP , Paryż, Francja10055-12
Nóż okrągłyPHYMEP, Paryż, Francja10059-15
ostrzy skalpela n° 11 Swann-MortonVWR, Fontenay-sous-Bois, Francja233-0024
lornetkowaLeica biosystems, Nanterre cedex,  FrancjaMZFLIII
soczewka

Bibliografia

  1. Jedeon, K., et al. Enamel defects reflect perinatal exposure to bisphenol A. Am J Pathol. 183, 108-118 (2013).
  2. Jedeon, K., et al. Chronic Exposure to Bisphenol a Exacerbates Dental Fluorosis in Growing Rats. J Bone Miner Res. 31, 1955-1966 (2016).
  3. Alaluusua, S., et al. Developmental dental aberrations after the dioxin accident in Seveso. Environ Health Perspect. 112, 1313-1318 (2004).
  4. Chapple, I. L., et al. Interaction of lifestyle, behaviour or systemic diseases with dental caries and periodontal diseases: consensus report of group 2 of the joint EFP/ORCA workshop on the boundaries between caries and periodontal diseases. J Clin Periodontol. 44, S39-S51 (2017).
  5. Nanci, A. Enamel: Composition, Formation, and Structure. Ten Cate's Oral Histology Development, Structure, and Function. , 8th ed, Elsevier mosby. 122-164 (2012).
  6. Leite, G. A., Sawan, R. M., Teofilo, J. M., Porto, I. M., Sousa, F. B., Gerlach, R. F. Exposure to lead exacerbates dental fluorosis. Arch Oral Biol. 56, 695-702 (2011).
  7. Jedeon, K., et al. Enamel hypomineralization due to endocrine disruptors. Connect Tiss Res. 55, 1-5 (2014).
  8. Jedeon, K., et al. Androgen receptor involvement in rat amelogenesis: an additional way for endocrine disrupting chemicals to affect enamel synthesis. Endocrinology. 157, 4287-4296 (2016).
  9. Weerheijm, K. L., Jalevik, B., Alaluusua, S. Molar-incisor hypomineralisation. Caries Res. 35, 390-391 (2001).
  10. Jälevik, B. Prevalence and Diagnosis of Molar-Incisor- Hypomineralisation (MIH): A systematic review. Eur Arch Paediatr Dent. 11, 59-64 (2010).
  11. Alaluusua, S. Aetiology of Molar-Incisor Hypomineralisation: A systematic review. Eur Arch Paediatr Dent. 11, 53-58 (2010).
  12. Jedeon, K., Berdal, A., Babajko, S. The tooth, target organ of Bisphenol A, could be used as a biomarker of exposure to this agent. Bisphenol A: Sources, Risks of Environmental Exposure and Human Health Effects. Gibert, Y. , Nova Science Publishers. 205-225 (2015).
  13. Fejerskov, O., Larsen, M. J., Richards, A., Baelum, V. Dental tissue effects of fluoride. Adv Dent Res. 8, 15-31 (1994).
  14. Robinson, C., Connell, S., Kirkham, J., Brookes, S. J., Shore, R. C., Smith, A. M. The effect of fluoride on the developing tooth. Caries Res. 38, 268-276 (2004).
  15. Sahlberg, C., Pavlic, A., Ess, A., Lukinmaa, P. L., Salmela, E., Alaluusua, S. Combined effect of amoxicillin and sodium fluoride on the structure of developing mouse enamel in vitro. Arch Oral Biol. 58, 1155-1164 (2013).
  16. Pritchett-Corning, K. R. Euthanasia of neonatal rats with carbon dioxide. J Am Assoc Lab Anim Sci. 48, 23-27 (2009).
  17. Hiller, C. R., Robinson, C., Weatherell, J. A. Variations in the composition of developing rat incisor enamel. Calcif Tissue Res. 18, 1-12 (1975).
  18. Robinson, C., Kirkham, J., Nutman, C. A. Relationship between enamel formation and eruption rate in rat mandibular incisors. Cell Tissue Res. 254, 655-658 (1988).
  19. Smith, C. E., Nanci, A. A method for sampling the stages of amelogenesis on mandibular rat incisors using the molars as a reference for dissection. Anat Rec. 225, 257-266 (1989).
  20. Chavez, M. G., et al. Isolation and culture of dental epithelial stem cells from the adult mouse incisor. J Vis Exp. (87), (2014).
  21. Brookes, S. J., Kingswell, N. J., Barron, M. J., Dixon, M. J., Kirkham, J. Is the 32-kDa fragment the functional enamelin unit in all species? Eur J Oral Sci. 119, 345-350 (2011).
  22. Babajko, S., Jedeon, K., Houari, S., Loiodice, S., Berdal, A. Disruption of Steroid Axis, a New Paradigm for Molar Incisor Hypomineralization (MIH). Front Physiol. 8, 343(2017).
  23. Houari, S., et al. Asporin and the mineralization process in fluoride-treated rats. J Bone Min Res. 29, 1446-1455 (2014).
  24. Denbesten, P., Li, W. Chronic fluoride toxicity: dental fluorosis. Monographs in oral science. 22, 81-96 (2011).
  25. Kirkham, J., Robinson, C., Phull, J. K., Shore, R. C., Moxham, B. J., Berkovitz, B. K. The effect of rate of eruption on periodontal ligament glycosylaminoglycan content and enamel formation in the rat incisor. Cell Tissue Res. 274, 413-419 (1993).
  26. Lacruz, R. S., et al. Identification of novel candidate genes involved in mineralization of dental enamel by genome-wide transcript profiling. J Cell Physiol. 227, 2264-2275 (2012).
  27. Wen, X., Paine, M. L. Iron deposition and ferritin heavy chain (Fth) localization in rodent teeth. BMC research notes. 6, 1(2013).
  28. Houari, S., Loiodice, S., Jedeon, K., Berdal, A., Babajko, S. Expression of Steroid Receptors in Ameloblasts during Amelogenesis in Rat Incisors. Front Physiol. 7, 503(2016).
  29. Kawano, S., et al. Establishment of dental epithelial cell line (HAT-7) and the cell differentiation dependent on Notch signaling pathway. Connect Tissue Res. 43, 409-412 (2002).
  30. Zhou, Y. L., Snead, M. L. Identification of CCAAT/enhancer-binding protein alpha as a transactivator of the mouse amelogenin gene. J Biol Chem. 275, 12273-12280 (2000).
  31. Nakata, A., et al. Establishment and characterization of a spontaneously immortalized mouse ameloblast-lineage cell line. Biochem Biophys Res Commun. 308, 834-839 (2003).
  32. Harada, H., et al. Establishment of ameloblastoma cell line, AM-1. Journal of oral pathology & medicine: official publication of the International Association of Oral Pathologists and the American Academy of Oral Pathology. 27, 207-212 (1998).
  33. Jussila, M., Thesleff, I. Signaling networks regulating tooth organogenesis and regeneration, and the specification of dental mesenchymal and epithelial cell lineages. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, a008425(2012).
  34. Tucker, A., Sharpe, P. The cutting-edge of mammalian development; how the embryo makes teeth. Nat Rev Genet. 5, 499-508 (2004).
  35. Vos, T., et al. Years lived with disability (YLDs) for 1160 sequelae of 289 diseases and injuries 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380, 2163-2196 (2012).
  36. Marcenes, W., et al. Global burden of oral conditions in 1990-2010: a systematic analysis. J Dent Res. 92, 592-597 (2013).
  37. National Institute of Dental and Craniofacial Research. Dental Caries (Tooth Decay) in Adults (Age 20 to 64). , Available from: https://www.nidcr.nih.gov/DataStatistics/FindDataByTopic/DentalCaries/DentalCariesAdults20to64.htm (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mikrodisekcja narządu szkliwnegoizolacja siekacza szczuraseparacja etapów ameloblastówameloblasty w fazie wydzielaniaameloblasty w fazie dojrzewaniaanalizy immunohistochemiczneprotokół ekstrakcji RNAanaliza Western blottingekspozycja na BPA z fluorkiembarwienie trichromowe Massona
Mikropreparacja narządu szkliwa z siekacza żuchwy szczurów narażonych na działanie toksyn środowiskowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.