Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja komórek dendrytycznych z ludzkiego żeńskiego układu rozrodczego do badań fenotypowych i funkcjonalnych

6.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57100

⸱

13 marca 2018

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, Geisel School of Medicine at Dartmouth

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy tutaj metodę izolowania i oczyszczania komórek dendrytycznych z różnych anatomicznych przedziałów w ludzkim żeńskim układzie rozrodczym w celu oceny ich cech fenotypowych i funkcjonalnych. Metodę tę można dostosować do izolowania innych komórek odpornościowych lub komórek dendrytycznych z innych tkanek błony śluzowej.

Streszczenie

Charakterystyka ludzkich komórek dendrytycznych (DC) rezydujących w tkankach błony śluzowej jest trudna ze względu na trudności w pobieraniu próbek i niską liczbę DC obecnych na tkankę. Jednakże, ponieważ fenotyp i funkcja DC są modyfikowane przez środowisko tkankowe, konieczna jest analiza populacji DC rezydujących w tkankach, ponieważ DC pochodzące z krwi nie odzwierciedlają w pełni złożoności DC w tkankach. W tym miejscu przedstawiamy protokół izolacji DC z ludzkiego żeńskiego układu rozrodczego (FRT) przy użyciu próbek z histerektomii, który umożliwia zarówno analizę fenotypową, jak i funkcjonalną. Protokół składa się z trawienia tkanek w celu wytworzenia zawiesiny komórek mieszanych z pojedynczą komórką, a następnie pozytywnej selekcji kulek magnetycznych. Nasz protokół trawienia tkanek nie rozszczepia markerów powierzchniowych, co umożliwia fenotypową i funkcjonalną analizę DC w stanie ustalonym, bez nocnej inkubacji lub aktywacji komórek. Protokół ten można dostosować do izolacji innych typów komórek odpornościowych lub izolacji DC z innych tkanek.

Wprowadzenie

FRT pełni podwójną funkcję ochrony przed patogenami, jednocześnie umożliwiając implantację i ciążę1. Aby to osiągnąć, FRT jest podzielony na przedziały, przy czym każdy obszar anatomiczny wykazuje unikalne cechy histologiczne, immunologiczne i funkcjonalne1.

DC obecne na powierzchni błony śluzowej stykają się z mikrobami w płucach, jelitach i drogach rodnych oraz zapewniają immunologiczny nadzór nad potencjalnymi patogenami2. DC mają unikalną zdolność do inicjowania naiwnych limfocytów T i wywoływania adaptacyjnych odpowiedzi immunologicznych3. DC w FRT są również wyspecjalizowane w tolerowaniu obcych antygenów, takich jak te znajdujące się w plemnikach i rozwijającym się płodzie, aby umożliwić udaną ciążę4. W związku z tym, w zależności od lokalizacji, fenotyp i funkcja DC będą różne. Wiadomo, że DC są pod silnym wpływem środowiska tkankowego, tak że ich liczba, fenotyp i funkcje są modyfikowane przez środowisko tkankowe, w którym się znajdują3. Dlatego, aby zrozumieć rolę, jaką FRT DC odgrywają w chorobach zakaźnych, ciąży i raku w FRT, należy zbadać rezydentne DC DC, ponieważ modele DC pochodzące z krwi są niewystarczające, aby rozwiązać złożoność regulacyjną występującą w tkankach FRT.

Charakterystyka DC rezydujących w tkance ludzkiej jest wyzwaniem ze względu na małą liczbę komórek obecnych w tkankach błony śluzowej i trudności w uzyskaniu próbek tkanek ludzkich. DC zostały przebadane w FRT przy użyciu immunohistochemistry5,6, który informuje o lokalizacji komórki w tkance, ale wyklucza badania funkcjonalne i jest ograniczony w liczbie identyfikujących markerów komórkowych, które można analizować jednocześnie. Ponadto opracowano protokoły izolacji pojedynczych komórek do analizy cytometrii przepływowej7,8,9. Niektóre z tych protokołów wykorzystują zdolność migracyjną kontrolerów domeny do izolowania tych komórek, które migrują. Metody te zwykle wymagają całonocnej inkubacji i selekcji aktywowanych DC, ale nie pozwalają na badanie DC w stanie ustalonym.

Tutaj, korzystając z próbek z histerektomii, zoptymalizowaliśmy protokół izolowania DC z różnych miejsc anatomicznych w FRT, endometrium (EM), szyjce macicy (CX) i szyjce macicy (ECX), co umożliwia zarówno analizę fenotypową, jak i funkcjonalną. Korzystając z nieproteolitycznego protokołu trawienia enzymatycznego, możemy natychmiast po trawieniu tkanek przejść do izolacji komórek i charakterystyki cytometrii przepływowej bez aktywacji komórek. Korzystając z wielokolorowej cytometrii przepływowej i dostosowując badania funkcjonalne do małej liczby komórek, możemy zidentyfikować i scharakteryzować rzadkie podzbiory DC w różnych miejscach FRT.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Badania z udziałem ludzi były prowadzone zgodnie z zasadami wyrażonymi w Deklaracji Helsińskiej. Badania zostały zatwierdzone przez Dartmouth College Institutional Review Board oraz Committee for the Protection of Human Subject (CPHS). Pisemną świadomą zgodę uzyskano przed operacją od kobiet zakażonych wirusem HIV poddawanych histerektomii w Dartmouth-Hitchcock Medical Center (Liban, NH). Przeszkoleni patolodzy wybrali próbki tkanek z EM, CX i ECX, wolne od zmian patologicznych i odległe od miejsc patologii. Próbki krwi pobrano od zdrowych dawców-ochotników zrekrutowanych w Dartmouth Hitchcock Medical Center. Krwiodawcy byli anonimowi. Świeżo wyizolowane tkanki EM, CX i ECX z sali operacyjnej zostały przeniesione do Patologii w celu izolacji i klasyfikacji przed przekazaniem do naszego laboratorium w oddzielnych, sterylnych probówkach polipropylenowych.

1. Trawienie enzymatyczne tkanek

UWAGA: Używaj sterylnych materiałów i pracuj w komorze bezpieczeństwa biologicznego.

  1. Przygotuj zmodyfikowany zrównoważony roztwór soli Hanka (HBSS) przy użyciu 1x HBSS z czerwienią fenolową, 100 U/ml penicyliny-streptomycyny, 0,35 g/LNaHCO3 i 20 mM HEPES.
  2. Przygotuj koktajl enzymatyczny (zmodyfikowany HBSS, 450 U/ml kolagenazy IV, 0,01% [wag./obj.] dezoksyrybonukleazy I i 2 mg/ml D-glukozy). Przepuść roztwór przez sterylny filtr 0,22 μm. Najlepiej przygotować enzym trawiący w dniu użycia, ale można go zamrozić w temperaturze -20 °C do przechowywania. Unikaj powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania.
  3. Opłucz tkankę zmodyfikowanym HBSS i umieść na szalce Petriego o wymiarach 100 x 15mm2. Dostosuj rozmiar szalki Petriego w oparciu o ilość dostępnej tkanki i objętość użytego koktajlu enzymatycznego (patrz krok 1.4.2 poniżej).
    UWAGA: Tkanki różnią się wielkością w zależności od próbki chirurgicznej uzyskanej z patologii, w zakresie od 1 do 10 g.
  4. Obróbka fizyczna za pomocą jednorazowego skalpela i kleszczy:
    1. Dodaj około 3 ml koktajlu enzymów trawiennych do tkanki, aby zapobiec wysuszeniu podczas krojenia.
    2. Użyj kleszczy, aby ustabilizować tkankę i zmielić skalpelem, aby zwiększyć powierzchnię tkanki wystawionej na działanie koktajlu enzymów trawiennych. Pokrój tkankę na małe kawałki (< 2 mm z boku). Dodać wystarczającą ilość koktajlu enzymów trawiennych, aby pokryć wszystkie kawałki tkanki (5 ml/g tkanki). Umieść pokrywkę na szalce Petriego.
    3. Inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 na rotatorze przy około 80 obr./min przez 45 minut. Upewnij się, że prędkość obrotowa rotatora dokładnie wymiesza koktajl enzymów trawiennych, nie rozlewając się ani nie wytwarzając pęcherzyków.
    4. Wizualizacja preparatu tkanek za pomocą mikroskopu światła odwróconego z obiektywami 4X i 10X.
      UWAGA: Po trawieniu powinny być obecne małe fragmenty tkanek i zawiesina komórek mieszanych, w tym widoczne gruczoły nabłonkowe (patrz Rysunek 1A).

2. Fizyczna separacja pojedynczych komórek

  1. W sterylnym środowisku umieść napiętą siatkę 250 μm z uchwytem na szalce Petriego o wymiarach 150 x 15 mm2. Upewnij się, że siatka znajduje się około 0,5 cm nad powierzchnią szalki Petriego.
  2. Zwilż siatkę 2 ml zmodyfikowanego HBSS i przenieś strawioną tkankę na siatkę.
  3. Używając płaskiej powierzchni tłoka strzykawki o pojemności 10 ml, delikatnie, ale stanowczo, zmiel strawioną tkankę mieloną przez siatkę.
    Uwaga: Zbyt agresywne mielenie uszkodzi siatkę i zwiększy śmiertelność komórek. Ten krok oddzieli komórki nabłonkowe i komórki zrębu (w tym komórki odpornościowe) od tkanki łącznej i śluzu.
  4. Po dokładnym rozproszeniu fragmentów tkanek należy podnieść siatkę i uchwyt 2-3 cm ponad szalkę Petriego i spłukać 3 ml zmodyfikowanego HBSS w celu odzyskania dodatkowych komórek.
  5. Zebrać zawiesinę komórek. Umieścić siatkę o grubości 20 μm z uchwytem na szalce Petriego i zwilżyć 2 ml zmodyfikowanego HBSS. Przelać zawiesinę komórkową przez siatkę, przytrzymując siatkę 2-3 cm powyżej szalki Petriego i spłukać 6 ml modyfikowanego HBSS.
    UWAGA: Ten krok oddzieli arkusze nabłonka, które są zachowane na górze, od pojedynczych komórek przechodzących przez siatkę. Przepływ jest mieszaną zawiesiną komórkową, która obejmuje komórki odpornościowe i fibroblasty zrębu.
  6. Zebrać zawiesinę mieszanych komórek i odwirować przy 500 x g przez 10 minut. Zassać ciecz i ponownie zawiesić osad w 4 ml zmodyfikowanego HBSS do odwirowania w gradiacji gęstości.
  7. Zawiesinę mieszanych komórek należy nałożyć na 3 ml roztworu polisacharozy i odwirować w temperaturze pokojowej przy 500 x g przez 30 minut bez przerwy. Zebrać białą opaskę z górnej części roztworu polisacharozy i przemyć PBS.
    UWAGA: Ta frakcja jest wzbogaconą zawiesiną komórek mieszanych, która jest bogata w komórki odpornościowe i zawiera pewne fibroblasty zrębu.

3. Usuwanie martwych komórek

UWAGA: Jeśli duży procent martwych komórek (> 20%) jest obecny we wzbogaconej zawiesinie mieszanych komórek po odwirowaniu w gradiacji gęstości, zaleca się usunięcie martwych komórek za pomocą kulek magnetycznych. Martwe komórki muszą zostać usunięte, ponieważ mogą zakłócać proces selekcji dodatnich kulek magnetycznych.

  1. Policz komórki za pomocą hemocytometru na mikroskopie świetlnym z obiektywem 10X. Odwirować wszystkie komórki we wzbogaconej zawiesinie komórek mieszanych (500 x g, 10 min, 4 °C). Całkowicie odessać i wyrzucić supernatant. Dodać 100 μl kulek do usuwania martwych komórek na 1 x 107 komórek (żywych i martwych), zgodnie z instrukcjami producenta. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
  2. Umieść filtr 30 μm na kolumnie magnetycznej, nałóż zawiesinę komórek i pozwól, aby komórki oznaczone kulkami wpadły przez kolumnę magnetyczną.
  3. Przepłukać kolumnę buforem do usuwania martwych komórek zgodnie z zaleceniami (3 ml). Zebrać przepływ zawierający żywe komórki. Zakres regeneracji komórek po usunięciu martwych komórek jest przedstawiony w Rysunek 1B.
    UWAGA: Komórki te można wykorzystać do barwienia cytometrią przepływową w badaniach fenotypowych (sekcja 5) lub kontynuować izolację DC (sekcja 4).

4. Oczyszczanie DC przez pozytywny wybór koralików magnetycznych

  1. Po usunięciu martwych komórek (krok 3.2) należy odwirować komórki, usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 80 μl buforze selekcji magnetycznej na 1 x 107 komórek (PBS, 0,5% inaktywowana termicznie ludzka surowica AB (HS), 2 mM EDTA).
  2. W celu pozytywnej selekcji populacji DC należy dodać kulki magnetyczne CD1a lub CD14 zgodnie z instrukcjami producenta (20 μL kulek magnetycznych na 1 x 107 komórek). Inkubować przez 15 minut w temperaturze 4°C.
  3. Umyj komórki buforem wyboru magnetycznego, odkręć w dół i całkowicie usuń bufor. Ponownie zawiesić komórki w co najmniej 500 μl bufora selekcji magnetycznej.
  4. Przymocuj kolumnę do magnesu i dodaj filtr 30 μm na górze kolumny, aby zatrzymać wszelkie pozostałe grudki komórek. Przepłukać filtr i kolumnę magnetycznym buforem selekcyjnym zgodnie z zaleceniami.
  5. Zastosuj zawiesinę komórki do kolumny. Spłucz 3 razy buforem magnetycznym.
  6. Przenieś kolumnę do probówki o pojemności 15 ml, dodaj 5 ml buforu wyboru magnetycznego i nałóż tłok, aby uwolnić wybrane komórki z kolumny.
  7. Aby zwiększyć czystość, powtórz kroki 4.4-4.6 z odzyskanymi komórkami przy użyciu nowej kolumny. Zakres regeneracji komórek po wybraniu kulki magnetycznej jest przedstawiony w Rysunek 1C.

5. Ocena czystości komórek: cytometria przepływowa i mikroskopia

  1. Barwienie przeciwciał w cytometrii przepływowej:
    1. Zawiesić do 1 x 106 komórek w 100 μl PBS zawierającego 20% inaktywowanego termicznie HS w celu zablokowania receptorów Fc i inkubować przez 10 minut na lodzie.
    2. Dodać żądane przeciwciała znakowane fluorescencyjnie i odczynnik do identyfikacji martwych komórek (na przykład, patrz punkt 6.5). Ustaw kontrolki fluorescencji minus jeden (FMO), aby ustalić bramki, i użyj koralików kompensacyjnych, aby przygotować pojedyncze kontrole barwienia do kompensacji. Przykłady stosowanych przeciwciał podano w tabeli 1. Inkubować przez 20 minut w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem.
    3. Umyj komórki 2 ml buforu do selekcji magnetycznej.
      UWAGA: Obecność EDTA jest ważna, aby uniknąć tworzenia się zlepiania się komórek do analizy cytometrii przepływowej. Odwirować i wyrzucić supernatant.
    4. Napraw komórki, dodając 100 μl 2% roztworu paraformaldehydu na probówkę.
    5. Przeanalizuj próbki za pomocą cytometru przepływowego10,11.
  2. Zakręć kolumną (np. cytospina) i użyj barwienia Giemsy do analizy morfologii:
    1. Ponownie zawiesić komórki w 200 μl bufora selekcji magnetycznej.
    2. Załaduj do kolumny wirującej i wiruj przez 5 minut. Pozostaw szkiełko do całkowitego wyschnięcia.
    3. Zamocuj szkiełko przez zanurzenie w 100% metanolu na 2 minuty. Opłucz szkiełko wodą dejonizowaną i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.
    4. Wykonaj standardowe barwienie Wrights-Giemsa. Przykryj komórki Eozyną i inkubuj przez 10 minut, spłucz wodą dejonizowaną i pozostaw do wyschnięcia. Przykryj komórki barwnikiem Wrights-Geimsa, inkubuj przez 1 minutę, spłucz wodą dejonizowaną i wysusz na powietrzu.
    5. Zbadaj preparaty za pomocą odwróconego mikroskopu (Rysunek 2A, obiektyw 40X).

6. Test stymulacji allogenicznej do oceny funkcji komórki DC

  1. Rozmrozić zamrożone komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC)
    1. Ogrzać pożywkę do hodowli komórkowych z 10% HS do temperatury 37 °C.
    2. Rozmrozić PBMC, umieszczając krioprobówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aż niewielka ilość zamrożonych pożywek komórkowych pozostanie w krioprobówce. W sterylnym środowisku przenieś zawartość krioprobówki do 10 ml wstępnie podgrzanej pożywki do hodowli komórkowych z 10% HS w probówce o pojemności 15 ml.
    3. Wirować przy ~ 500 x g przez 7 min. Usunąć pożywkę, rozproszyć osad, ponownie zawiesić PBMC w 10 ml pożywki do hodowli komórkowych z 10% HS i odwirować komórki.
    4. Powtórz krok prania po raz trzeci. Policz komórki.
  2. Naiwny wybór limfocytów T:
    1. Użyj zestawu do selekcji komórek przeciwciał magnetycznych o negatywnej selekcji, aby wyizolować naiwne limfocyty T zgodnie z protokołem producenta.
    2. Po izolacji sprawdzić czystość za pomocą przeciwciał CD45RA i CCR7.
      UWAGA: Typowa czystość to > 99% naiwnych limfocytów T.
  3. Naiwne barwienie barwnikiem proliferacji komórek T:
    1. Przygotuj 600 μL 2x roztworu barwnika proliferacji komórek, chroniąc barwnik przed ekspozycją na światło.
    2. Umyj naiwne limfocyty T 2x za pomocą PBS. Zawieś komórki w 500 μl PBS.
    3. Delikatnie wirując komórki w komorze bezpieczeństwa biologicznego, dodaj 500 μl barwnika proliferacyjnego do naiwnych limfocytów T.
    4. Inkubować komórki przez 10 minut w temperaturze 37°C.
    5. Zatrzymaj znakowanie komórek, dodając do komórek 5 ml pożywki do hodowli komórkowych z 10% HS. Inkubować na lodzie przez 5 minut, chronić przed światłem.
    6. Odwirować komórki przy ~ 500 x g przez 7 minut, odessać pożywkę i ponownie zawiesić komórki w 4 °C pożywki do hodowli komórkowych z 10% HS. Powtórz jeszcze dwa razy, w sumie 3 prania. Pobrać podwielokrotność komórek do policzenia przed ostatnim wirowaniem.
      UWAGA: Zazwyczaj ostateczna liczba naiwnych komórek T będzie się wahać od 5% do 15% początkowej liczby komórek PBMC.
    7. Ponownie zawiesić komórki za pomocą pożywki do hodowli komórkowych z 10% HS przy pożądanym stężeniu komórek.
  4. Pierwotna kohodowla komórek T allogenicznych DC:
    1. Umieść izolowane DC i naiwne limfocyty T w 96-dołkowej płytce z okrągłym dnem, w stosunku 1:15 DC do limfocytów T. Upewnij się, że optymalna liczba dla DC mieści się w zakresie od 3 000 do 5 000 komórek/studzienkę.
    2. Odwirować płytkę przy ~ 500 x g przez 3 minuty, aby upewnić się, że komórki znajdują się w środku studzienki. Kontakt między komórkami jest ważny dla prawidłowego wystąpienia sygnalizacji.
    3. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 6 dni. Monitoruj skupisko komórek, które pojawiają się w studzienkach w miarę zachodzenia proliferacji, za pomocą mikroskopii (Rysunek 3A).
  5. Barwienie cytometrią przepływową w celu oceny proliferacji:
    1. Po 6 dniach komórki można badać za pomocą cytometrii przepływowej. Zabarwić kokulturę do cytometrii przepływowej.
    2. Przygotować 2x roztwór żółtego barwnika żywotności (maksymalna emisja 572 nm) w PBS.
      UWAGA: Stosowanie PBS bez surowicy jest ważne, ponieważ białka surowicy zakłócają działanie barwnika).
    3. Odwirować płytkę z komórkami o stężeniu ~ 500 x g przez 5 min.
    4. Usunąć 100 μl supernatantu.
      UWAGA: W tym momencie należy zebrać i przechowywać supernatant do oddzielnej analizy czynników rozpuszczalnych.
    5. Przemyć komórki dwukrotnie PBS: dodać 150 μl/studzienkę PBS, odwirować przy ~ 500 x g przez 5 min, usunąć 150 μl supernatantu za pomocą pipety. Upewnij się, że w każdej studzience pozostało 50 μl supernatantu.
    6. Dodaj 50 μl 2x barwnika żywotności do każdego dołka. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut, chronić przed światłem.
    7. Podczas inkubacji należy przygotować główną mieszaninę pożądanych markerów przeciwciał. Na przykład: CD3 APC/Cy7, CD4 PE, CD8 FITC itp.
    8. Dodaj mieszaninę przeciwciał do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut, chronić przed światłem.
    9. Przemyć komórki 2x PBS + 2% HS: dodać 150 μL/studzienkę PBS + 2% HS. Wirować przy ~ 500 x g przez 5 min. Usunąć 150 μl supernatantu za pomocą pipety.
    10. Utrwal komórki, dodając 100 μl/studzienkę 2% para-formaldehydu. W razie potrzeby: przenieść komórki i pożywki do probówek do polipropylenowej cytometrii przepływowej. Probówki można przechowywać w temperaturze 4 °C i chronić przed światłem do czasu analizy metodą cytometrii przepływowej.
    11. Odczytaj probówki w cytometrze przepływowym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Po trawieniu tkanki można zaobserwować uwalnianie płatów nabłonkowych i gruczołów, co przedstawiono na Rysunku 1A; jest to kontrola pozytywna wskazująca na pomyślny przebieg trawienia enzymatycznego. Liczba wszystkich odzyskanych żywych komórek oraz komórek DC na gram tkanki przedstawiona jest odpowiednio na Rysunku 1B i Rysunku 1C. Komórki odpornościowe stanowią od 5-30% komórek zrębu przed wirowani...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Błony śluzowe DC są rzadką populacją komórek, na którą duży wpływ ma środowisko tkankowe, które zmienia ich fenotyp i funkcję po dostaniu się do tkanek3. Chociaż DC pochodzące z krwi są bardzo użytecznym modelem, nie reprezentują one w pełni różnorodności populacji DC znajdujących się w tkankach. Dlatego, aby zrozumieć unikalne cechy błony śluzowej DC, konieczna jest izolacja komórek pierwotnych z tkanek. Izolacja DC z różnych miejsc anatomicznych w FRT daje możliwość zbadania funkcji DC in vi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Podziękowania

Badanie wspierane przez granty NIH AI102838 i AI117739 (CRW). Dziękujemy Richardowi Rossollowi za pomoc techniczną. Analizę cytometrii przepływowej przeprowadzono w DartLab, wspólnym zasobie w Dartmouth, wspieranym przez (P30CA023108-37) i (P30GM103415-15).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zrównoważony roztwór soli Hanka (HBSS)HyklonSH30015.03
Hyklon penicyliny-streptomycynySV30010
HEPES (1M)Hyclon15630-080
Kolagenaza IVSigmaC5138
Deoksyrybonukleaza IWorthington BiochemicznyLS002140
D-glukozaSigma Aldritch50-99-7
0,22 um Stericup 500 mL  filtrMilliporeSCGPU05RE
100mm x 15mm polistyrenowa szalka PetriegoFisherbrandFB0875712
150mm x 15mm polistyrenowa szalka PetriegoFisherbrandFB0875714
150mm x 25mm naczynie z polistyrenuCorning430599Przetworzone naczynie
Inkubator izotemperaturowyFisher Scientific FICO3500TABB5,0% CO2
American Rotator VAmerican DADER4140
250 um siatka nylonowaSefar03-250/50
20 um siatka nylonowaSefar03-20/14
Beckman GS-6R WirówkaBeckman358702
X-VIVO 15 z gentamycyną L-Gln, czerwień fenolowa, 1 lLonza04-418Q
Ludzka AB SerumValley BiomedicalHP1022
Histopaque-1077 SigmaAldritch10771
Roztwór buforu fosforanowego (PBS)National DiagnosticsCL-253pH 7,4
Zestaw do usuwania martwych komórekMiltenyi Biotec130-090-101
Filtr wstępnej separacji (30um)Miltenyi Biotec130-041-407
Kolumna LSMiltenyi Biotec130-042-410
Separator Quadro MACSMiltenyi Biotec130-090-976
MACS wielostanowiskowyMiltenyi Biotec130-042-303
EDTAUSB15694
CD1a Mikrokulki, ludzkieMiltenyi Biotec130-051-001
CD14 Mikrogranulki, ludzkieMiltenyi Biotec130-050-201
eFluor 670 barwnik proliferacji komórekeBiosciences65-0840-85
96-dołkowa okrągła płyta dolnaSokół9/8/2866
Zombie żółty barwnik żywotnościBiolegend423104
CD3 APC/Cy7, anty-ludzkiTonbo Biosciences25-0038-T100
CD4 PE, anty-ludzkieBiosciences12-0048-42
CD8a FITC, anty-ludzkiTonbo Biosciences35-0086-T100
Cytometr przepływowy GalliosBeckman Coulter Life SciencesB4361810 kolorów, VBR
MACSquant Analyzer 10Miltenyi Biotec130-096-3438 kolorów, VBR
do hodowli komórkowych

Bibliografia

  1. Wira, C. R., Rodriguez-Garcia, M., Patel, M. V. The role of sex hormones in immune protection of the female reproductive tract. Nat Rev Immunol. 15 (4), 217-230 (2015).
  2. Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
  3. Schlitzer, A., McGovern, N., Ginhoux, F. Dendritic cells and monocyte-derived cells: Two complementary and integrated functional systems. Semin Cell Dev Biol. 41, 9-22 (2015).
  4. Tagliani, E., Erlebacher, A. Dendritic cell function at the maternal-fetal interface. Expert Rev Clin Immunol. 7 (5), 593-602 (2011).
  5. Kaldensjo, T., et al. Detection of intraepithelial and stromal Langerin and CCR5 positive cells in the human endometrium: potential targets for HIV infection. PLoS One. 6 (6), e21344(2011).
  6. Schulke, L., Manconi, F., Markham, R., Fraser, I. S. Endometrial dendritic cell populations during the normal menstrual cycle. Hum Reprod. 23 (7), 1574-1580 (2008).
  7. Ballweber, L., et al. Vaginal langerhans cells nonproductively transporting HIV-1 mediate infection of T cells. J Virol. 85 (24), 13443-13447 (2011).
  8. Hladik, F., et al. Initial events in establishing vaginal entry and infection by human immunodeficiency virus type-1. Immunity. 26 (2), 257-270 (2007).
  9. Duluc, D., et al. Functional diversity of human vaginal APC subsets in directing T-cell responses. Mucosal Immunol. 6 (3), 626-638 (2013).
  10. Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Parks, D. R. Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed. Nat Immunol. 7 (7), 681-685 (2006).
  11. Juno, J. A., Boily-Larouche, G., Lajoie, J., Fowke, K. R. Collection, isolation, and flow cytometric analysis of human endocervical samples. J Vis Exp. (89), (2014).
  12. Givan, A. L., et al. Flow cytometric analysis of leukocytes in the human female reproductive tract: comparison of fallopian tube, uterus, cervix, and vagina. Am J Reprod Immunol. 38 (5), 350-359 (1997).
  13. Rodriguez-Garcia, M., et al. Dendritic cells from the human female reproductive tract rapidly capture and respond to HIV. Mucosal Immunol. 10 (2), 531-544 (2017).
  14. Rodriguez-Garcia, M., Barr, F. D., Crist, S. G., Fahey, J. V., Wira, C. R. Phenotype and susceptibility to HIV infection of CD4+ Th17 cells in the human female reproductive tract. Mucosal Immunol. 7 (6), 1375-1385 (2014).
  15. Shen, Z., Rodriguez-Garcia, M., Ochsenbauer, C., Wira, C. R. Characterization of immune cells and infection by HIV in human ovarian tissues. Am J Reprod Immunol. , (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Izolacja kom rek dendrytycznychtrawienie tkanekselekcja za pomoc kulek magnetycznychanaliza cytometrycznamarkery CD1a CD14wirowanie w gradiencie g sto ciusuwanie martwych kom rekprzygotowanie zawiesiny kom rkowejbadania fenotypowe i funkcjonalne
Izolacja komórek dendrytycznych z ludzkiego żeńskiego układu rozrodczego do badań fenotypowych i funkcjonalnych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.