Pełnopolowa optyczna mikroskopia koherentna do histologicznej analizy cech zrębu w przeszczepach rogówki

Podsumowanie

Opisujemy użycie pełnej koherentnej mikroskopii optycznej jako metody wysokiej jakości oceny zrębu dawcy rogówki. Protokół ten może być stosowany do identyfikacji cech wskazujących na zdrowie lub chorobę i ma na celu poprawę badań przesiewowych i selekcji tkanek dawcy, a tym samym wyników keratoplastyki.

Streszczenie

Jakość zrębu rogówki dawcy, który stanowi około 90% całkowitej grubości rogówki, prawdopodobnie będzie jednym z głównych, jeśli nie głównym, czynnikiem ograniczającym powodzenie głębokiej przedniej blaszki i penetrującej keratoplastyki. Są to zabiegi chirurgiczne, które polegają na zastąpieniu odpowiednio części lub wszystkich chorych warstw rogówki tkanką dawcy, przeszczepem, pobranym od niedawno zmarłej osoby. Jednak środki do oceny jakości zrębu przeszczepów rogówki w bankach oczu są ograniczone i brakuje im możliwości ilościowej oceny wskaźników choroby w wysokiej rozdzielczości. Pełnopolowa optyczna mikroskopia koherentna (FF-OCM), umożliwiająca obrazowanie 3D w wysokiej rozdzielczości świeżych lub utrwalonych próbek tkanek biologicznych ex vivo, jest nieinwazyjną techniką dobrze nadającą się do oceny rogówki dawcy. W tym miejscu opisano metodę analizy jakościowej i ilościowej zrębu rogówki za pomocą FF-OCM. Protokół został z powodzeniem zastosowany do prawidłowych rogówek dawcy i patologicznych guzików rogówki i może być stosowany do identyfikacji zdrowych i patologicznych cech zarówno na poziomie makroskopowym, jak i mikroskopowym, ułatwiając w ten sposób wykrywanie zaburzeń zrębu, które mogą zagrozić wynikowi keratoplastyki. Poprawiając kontrolę jakości przeszczepów, protokół ten może potencjalnie skutkować lepszą selekcją (i odrzuceniem) tkanek dawcy, a tym samym zmniejszeniem liczby niepowodzeń przeszczepów.

Wprowadzenie

Choroby rogówki są jedną z głównych przyczyn ślepoty na całym świecie¹. Niektóre choroby mogą być leczone tylko chirurgicznie, często polegające na wymianie części (np. keratoplastyka blaszkowa) lub całej (tj. keratoplastyka penetrująca) chorej rogówki, za pomocą tkanki dawcy, przeszczepu, pobranego od niedawno zmarłej osoby. W przypadku chorób rogówki, które nie wpływają na śródbłonek (np. stożek rogówki, blizny zrębowe po zakaźnym zapaleniu rogówki, urazach i dystrofiach zrębu), głęboka keratoplastyka blaszkowata przednia (DALK) jest obecnie uważana za technikę chirurgiczną z wyboru^2,3,4,5. Technika ta umożliwia zachowanie śródbłonka rogówki biorcy, zastępując tylko centralny nabłonek rogówki i zrąb, co wiąże się z mniejszą częstością odrzucania przeszczepu, brakiem odrzucenia śródbłonka, mniejszą utratą komórek śródbłonka i korzystnym stosunkiem kosztów do opłacalności^{6,7,8,9,10,11}. DALK pozwala ponadto na wykorzystanie rogówek o mniej niż optymalnej jakości śródbłonka jako przeszczepów, ponieważ ta uszkodzona warstwa nie zostanie przeszczepiona¹². I odwrotnie, jakość zrębu rogówki dawcy będzie prawdopodobnie głównym czynnikiem ograniczającym powodzenie przeszczepu i odzyskanie wzroku, ponieważ zrąb jest jedyną warstwą rogówki dawcy, która pozostaje, podczas gdy nabłonek dawcy zostanie zastąpiony nabłonkiem biorcy. Niestety, środki do oceny zrębu rogówki dawcy w bankach oczu są ograniczone. Zazwyczaj obejmują one badanie gałki ocznej dawcy w lampie szczelinowej, gdy pobieranie tkanek odbywa się za pomocą enukleacji oraz badanie zrębu dawcy pod mikroskopem świetlnym¹³. Niektóre banki okulistów zaczęły uzupełniać takie standardowe procedury za pomocą optycznej koherentnej tomografii w domenie Fouriera (FD-OCT)¹⁴.

Okulistyczna optyczna koherentna tomografia koherentna (OCT), optyczny odpowiednik obrazowania ultradźwiękowego¹⁵, wykorzystuje interferencję szerokopasmowego lub przestrajalnego światła do generowania optycznych przekrojów siatkówki¹⁶ i przedniego segmentu¹⁷. W OCT w dziedzinie czasu, podstawie wczesnych systemów klinicznych, położenie lustra referencyjnego jest zmienione, tak że wzorce interferencyjne pojawiają się, gdy wiązka referencyjna przebyła prawie tyle samo czasu, co wiązka odbita na różnych interfejsach tkankowych, przy czym skany A są generowane w funkcji czasu. W FD-OCT (zwanym również KTT w dziedzinie spektralnej lub częstotliwości), który jest podstawą większości nowoczesnych systemów klinicznych, lustro referencyjne jest ustalane w jednej pozycji, a pojedynczy skan A, ze wszystkimi wzorcami interferencyjnymi zmieszanymi ze sobą, jest rejestrowany na raz i analizowany za pomocą analizy Fouriera.

Podczas gdy kliniczne (czasowe lub spektralne) systemy OCT pozwalają na przekrojowe widoki rogówki i wykrywanie zmętnień zrębu przy wyższej rozdzielczości osiowej niż biomikroskopia w lampie szczelinowej, ich rozdzielczość boczna jest ograniczona. Mikroskopia konfokalna¹⁸ pozwala na badanie rogówki w rozdzielczości bocznej zbliżonej do szczegółów histologicznych, ale jest ograniczona osiowo.

Pełnopolowa optyczna koherentna tomograficzna mikroskopia (FF-OCT lub FF-OCM)^19,20 łączy w sobie elementy zarówno mikroskopii konfokalnej, jak i OCT, osiągając rozdzielczość poprzeczną porównywalną do rozdzielczości osiowej około 1 μm. Mówiąc dokładniej, FF-OCM wykorzystuje niespójne szerokopasmowe źródła światła (np. lampę halogenową) i optykę o dużej aperturze numerycznej do uzyskiwania obrazów tomograficznych 2D en face bez skanowania bocznego. Skanując w kierunku głębokości, FF-OCM umożliwia nieinwazyjne obrazowanie 3D świeżych lub utrwalonych próbek tkanek biologicznych ex vivo. Został on użyty do zobrazowania klasy cornea21^,22,23. Zapewniając zarówno widoki en face, jak i przekroje poprzeczne w wysokiej rozdzielczości, FF-OCM dostarcza informacji zarówno o strukturze histologicznej, jak i szczegółach komórkowych rogówki. W rzeczywistości wykazano, że FF-OCM dostarcza informacji strukturalnych lepszych niż histologia i był w stanie zidentyfikować więcej wskaźników choroby, co było możliwe dzięki połączeniu OCT w domenie spektralnej i mikroskopii konfokalnej^24,25.

Tutaj opisujemy protokół jakościowej i ilościowej oceny zrębu dawcy rogówki za pomocą FF-OCM. Metoda opiera się na podobnej do histologicznej analizie makroskopowych i mikroskopowych cech wskazujących na stan zrębu, w tym trzech ilościowych parametrów zrębu (tj. grubości warstwy Bowmana i jej zmienności oraz odbicia zrębu). Opisany protokół jest zatem stosowany do prawidłowych i nieprawidłowych tkanek rogówki i umożliwia różnicowanie chorych od normalnych tkanek rogówki ludzkiej.

Protokół

Wszystkie opisane tutaj metody zostały przeprowadzone zgodnie z założeniami Deklaracji Helsińskiej i przestrzegały międzynarodowych wymagań etycznych dotyczących tkanek ludzkich. Było to prospektywne obserwacyjne badanie kliniczno-kontrolne. Uzyskano świadomą zgodę pacjentów. Nie wprowadzono żadnych modyfikacji do francuskich standardów leczenia ani obserwacji. Uzyskano zgodę Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej (IRB) od Komitetu Ochrony Pacjentów, Ile-de-France V (14944).

1. Wybór i przygotowanie tkanek

1. Wybierz rogówkę dawcy.
   1. Przenieś rogówki dawcy przechowywane w pożywce do hodowli narządów²⁶ do pożywki do hodowli narządów uzupełnionej dekstranem na 3 dni, aby umożliwić deturgescencję²⁷ przed obrazowaniem FF-OCM²⁸ (patrz Tabela materiałów).
2. Przygotuj próbki.
   1. Umieścić rogówkę, zanurzoną w podłożu do przechowywania, w uchwycie na próbkę nabłonkiem skierowanym do góry.
   2. Umieść czyste szkiełko nakrywkowe z krzemionki (dostarczone z uchwytem próbki) na rogówce i zamknij uchwyt, delikatnie obracając jego podstawę, aż próbka zostanie lekko spłaszczona i unieruchomiona pod szkiełkiem nakrywkowym, zapewniając stosunkowo równą powierzchnię obrazowania. Podejmij środki ostrożności, aby uniknąć pęcherzyków powietrza.
   3. Nałóż grubą warstwę żelu okulistycznego lub optycznego na szkiełko nakrywkowe jako medium zanurzeniowe.

2. Inicjalizacja, konfiguracja i akwizycja obrazu FF-OCM

1. Zainicjuj urządzenie.
   1. Włącz urządzenie, naciskając wyłącznik zasilania z tyłu urządzenia; świecenie się zielonej diody LED z przodu urządzenia wskazuje, że zasilanie jest włączone.
   2. Włącz dedykowany komputer i halogenowe źródło światła, naciskając wyłącznik zasilania z przodu.
   3. Uruchom oprogramowanie do akwizycji (patrz Spis materiałów), klikając dwukrotnie skrót na pulpicie.
   4. Upewnij się, że stolik do obrazowania jest czysty, z wyjątkiem ruchomej tacy. Następnie kliknij "OK", aby zainicjować silniki po wyświetleniu monitu.
   5. Wyciągnij tackę i włóż uchwyt na próbkę do dedykowanego pojemnika, a następnie delikatnie popchnij tackę.
2. Skonfiguruj urządzenie.
   1. W wyznaczonym i obowiązkowym polu należy wpisać "identyfikator próbki"; opcjonalnie można wpisać "opis próbki" i/lub "opis badania".
   2. Kliknij "Uzyskaj obraz makro", gdy będziesz gotowy, aby utworzyć migawkę próbki, którą można później wykorzystać do pozycjonowania bocznego i nawigacji; po spełnieniu oczekiwań, zatwierdź obraz po wyświetleniu monitu, klikając "Tak", po czym urządzenie przesunie tacę na próbkę pod obiektyw i wykona automatyczną regulację.
   3. Przed kontynuowaniem upewnij się, że obiektyw mikroskopu jest dobrze zanurzony w żelu optycznym.
3. Zdobądź stosy.
   1. Wybierz zakładkę "Eksploruj", aby przygotować przejęcie.
      1. Przed uzyskaniem stosu obrazów przejdź do środka rogówki, poprzez przesunięcie joysticka lub ręczny wybór na ekranie (to znaczy klikając i przeciągając czerwony kwadrat na uzyskanym obrazie makro w żądane miejsce).
      2. Zmieniaj głębokość obrazowania poprzez obracanie joysticka, regulację suwaka lub ręczne wprowadzanie danych z klawiatury w graficznym interfejsie użytkownika (GUI) i dostosuj wartość uśredniania (uśrednienie 40 jest ogólnie zalecane w celu optymalnego obrazowania rogówki).
         UWAGA: Ma to na celu określenie grubości próbki rogówki i uśrednienia niezbędnego do zobrazowania całej grubości rogówki, przy jednoczesnym odnotowywaniu w głębi pierwszego i ostatniego obrazu. Dolna powierzchnia szkiełka nakrywkowego tworzy równoległe prążki interferencyjne, które są widoczne na obrazie tomograficznym (po prawej stronie graficznego interfejsu użytkownika), co ułatwia zlokalizowanie powierzchni rogówki.
      3. Wprowadź wartość powierzchni rogówki lub lokalizację pierwszego obrazu w głębi w polu "Głębokość".
   2. Wybierz zakładkę "Nabierz", aby pobrać obrazy.
      1. Wybierz "Odstępy między plasterkami" (domyślne i zalecane ustawienie to 1 μm, odpowiadające rozdzielczości osiowej urządzenia) i wprowadź odpowiednią wartość grubości rogówki w polu "Liczba plastrów".
      2. Przejrzyj parametry i czas akwizycji, a gdy będziesz zadowolony, naciśnij "OK", aby rozpocząć akwizycję.
      3. Podczas akwizycji należy unikać kontaktu ze stołem, na którym umieszczony jest FF-OCM.

3. Zarządzanie pozyskanymi obrazami

1. Przeglądaj i eksportuj obrazy.
   1. Uruchom oprogramowanie do przeglądania FF-OCM (patrz Spis materiałów), klikając dwukrotnie skrót na pulpicie; pozyskane obrazy (identyfikowane przez identyfikator próbki) pojawiają się na liście "Badania lokalne".
   2. Wybierz badanie z odpowiednim identyfikatorem próbki, które zawiera zarówno obraz makro, jak i uzyskany stos obrazów, a następnie "wyeksportuj" ten ostatni, klikając prawym przyciskiem myszy serię obrazów i wybierając format "DICOM", aby zachować surowe dane pikseli i metadane do dalszej analizy.
   3. Wyświetlaj stosy obrazów 3D w widokach en face i przekrojowych za pomocą trybu rekonstrukcji wielopłaszczyznowej (MPR), klikając dwukrotnie serię obrazów; poruszaj się po obrazach (np. za pomocą przewijania kółka myszy lub regulacji suwaka) i wybierz reprezentatywne widoki en face i przekroje poprzeczne każdego stosu.
   4. Wyeksportuj wybrane widoki, klikając ikonę w prawym dolnym rogu okna, używając formatu "DICOM".
2. Importowanie obrazów.
   1. Otwórz oprogramowanie do przetwarzania obrazów (patrz Spis materiałów), klikając dwukrotnie skrót na pulpicie i przejdź do "Bio-Formats" "Importer" w sekcji "Wtyczki", aby zaimportować obrazy DICOM; upewnij się, że w oknie "Opcje importu bioformatów" jest zaznaczona opcja "Grupuj pliki o podobnych nazwach".

4. Analiza obrazu: jakościowa i ilościowa ocena morfologii i cech zrębu

1. Oceń grubość warstwy zrębu i Bowmana.
   1. Ręczne pomiary odległości na przekrojach rogówki, na przykład w pięciu równomiernie rozmieszczonych punktach w przekroju poprzecznym²⁵.
      1. Narysuj linię między dwoma punktami o znanej odległości (np. od lewej do prawej od całego obrazu, czyli zgodnie z domyślnym polem widzenia, 1,024 pikseli lub 780 μm), przejdź do "Analizuj" i wybierz "Ustaw skalę", a następnie wprowadź "Znana odległość" i "Jednostka długości" w odpowiednich polach i kliknij "OK".
      2. Narysuj linię między dwoma punktami o nieznanej odległości; odczytaj długość lub odległość mierzoną bezpośrednio od paska stanu.
   2. Zapisać średnią i współczynnik zmienności (COV). Grubość warstwy Bowmana mniejsza niż 6,5 μm i COV większy niż 18,6% były związane z nieprawidłowym zrębem rogówki²⁵.
2. Określ gęstość keratocytów.
   1. Zgodnie z konwencją mikroskopii konfokalnej: sumuj obrazy zrębu en face w grupach po 7, aby uzyskać plastry o porównywalnej grubości. W tym celu przejdź do zakładki "Obraz" i wybierz "Pokrój ponownie Z" w sekcji "Stosy".
   2. Weź pod uwagę różną (malejącą) gęstość komórek podczas progresji przez zrąb^24,25. W tym celu można uznać, że zrąb składa się z 4 regionów w zależności od głębokości: (1) bardzo przedniego zrębu poniżej warstwy Bowmana, czyli 2% całej grubości zrębu; Pozostały zrąb (czyli 98% całej grubości zrębu), z trzema strefami o identycznej grubości: (2) zrębem przednim, (3) zrębem środkowym i (4) zrębem tylnym.
   3. W celu dalszej analizy uwzględnij wszystkie dostępne wycinki en face dla zrębu przedniego, 15 obrazów dla zrębu przedniego, 5 obrazów dla zrębu środkowego, a także 5 obrazów dla zrębu tylnego (gdzie liczba obrazów na region wymagana do wiarygodnego zliczenia została określona przez analizę krokową²⁹).
   4. Na każdym obrazie en face wybierz obszar zainteresowania o wymiarach 300 μm x 300 μm. Aby poprawić wizualizację jądra, odwróć obraz za pomocą opcji "Odwróć" w zakładce "Edycja" i dostosuj kontrast i jasność. W przypadku tych ostatnich przejdź do "Obraz" i przejdź do "Jasność/Kontrast" w sekcji "Analizuj".
   5. Ręcznie policz jądra komórkowe, używając na przykład funkcji "licznik komórek"²⁵. W tym celu przejdź do "Wtyczki" i przejdź do "Licznik komórek" w sekcji "Analizuj". Naciśnij "inicjalizuj", a następnie wybierz typ licznika. Następnie zacznij liczyć jądra komórki, klikając ciemne owalne cechy na odwróconym obrazie, biorąc pod uwagę te, które lądują na obramowaniu obrazu tylko dla dwóch z czterech stron obrazu²⁵.
   6. Zapisz gęstość komórek pod względem gęstości powierzchniowej, czyli w komórkach/mm² (podziel liczbę komórek zliczonych przez 0,09, aby przeliczyć z komórek/90 000 μm² na komórki/mm²), zgodnie z konwencją mikroskopii konfokalnej, w której wykazano, że gęstość keratocytów jest niższa u pacjentów (np. ze stożkiem rogówki) niż u zdrowych osób i jest skorelowana z ciężkością choroby²⁵.
      UWAGA: Konieczne są dalsze badania kliniczne w celu ustalenia, czy minimalny próg gęstości keratocytów jest wymagany do uzyskania idealnie czystego przeszczepu rogówki po przeszczepie.
3. Oceń współczynnik odbicia zrębu.
   1. Generuj profile średniej intensywności głębokości stosów obrazów zrębowych, korzystając na przykład z funkcji "Profil osi Z" i/lub niestandardowego oprogramowania^25,30,31.
      UWAGA: W rzeczywistości są to profile głębokości amplitudy, ponieważ FF-OCM mierzy amplitudę światła wstecznie rozproszonego przez próbkę, a nie jego intensywność.  
      1. Oblicz średni poziom szarości dla każdego stosu na powierzchni.
      2. Odejmij minimalną wartość szarości i znormalizuj przez maksymalną wartość szarości.
      3. Wyświetlanie w skali logarytmicznej w funkcji głębokości zrębu (% grubości zrębu).
      4. Przybliż wynikowy profil logarytmiczny za pomocą linii regresji liniowej, która minimalizuje sumę reszt kwadratowych (dopasowanie metodą najmniejszych kwadratów).
      5. Zapisz wartość R-kwadrat (R²) jako miarę liniowości. Wartości poniżej 0,94 mogą wskazywać na patologię rogówki²⁵.
         UWAGA: Aby odróżnić nieadekwatność liniowego modelu regresji logarytmicznej (lub modelu rozpadu monowykładniczego) spowodowaną obecnością patologii od zwykłego szumu pomiarowego, można przeprowadzić analizę sygnału za pomocą wnioskowania bayesowskiego³¹. Również w rogówkach z liniowymi logarytmicznymi (lub monowykładniczymi) profilami głębokości zrębu (np. reprezentowanymi przez wartości R-kwadrat³⁰ lub Birge ratios³¹ close to 1), obliczenie średniej ścieżki wolnej od fotonów na podstawie szybkości zaniku sygnału może być wykorzystane do dalszego ilościowego określenia stopnia przezroczystości³¹.
4. Oceń widoczność innych cech zrębu i wskaźników choroby.
   1. Sprawdź, czy nie ma blizn, tkanki zwłóknieniowej, jezior lub rozstępów Vogta.
   2. Oceń średnią grubość nerwów w zrębie, jeśli jest wystarczająco widoczna do pomiaru²⁴.
      1. Wybierz jeden obraz en face, na którym nerw zrębowy jest najbardziej widoczny (zwykle w środkowej części zrębu).
      2. Zmierz grubość nerwu, na przykład w pięciu punktach²⁴, a następnie oblicz średnią i odchylenie standardowe. Grubość nerwu powyżej 9 μm może być dodatkowym wskaźnikiem patologii, takim jak stożek rogówki²⁴.

Wyniki

Urządzenie FF-OCM (zobacz Tabelę materiałów)²⁸ i ogólna konfiguracja używana w tym manuskrypcie jest pokazana w Rysunek 1. Rysunek 2 pokazuje spuchniętą ludzką rogówkę dawcy po przechowywaniu w pożywce do hodowli organów, dając patofizjologiczny model obrzęku rogówki i uniemożliwiając akwizycję obrazu FF-OCM przez całą grubość rogówki z powodu ograniczonej głębokości penetracji. Przeniesienie do pożywki do hodowli narządów uzupełnionej dekstranem powoduje obrzęk i skutkuje powstaniem rogówek dawcy o normalnej grubości, jak pokazano w Rysunek 3. Chore rogówki można rozpoznać po zmianach morfologicznych i typowych cechach zrębu, w tym zmniejszonej i zmiennej grubości zrębu (Rysunek 4) i/lub warstwie Bowmana (Rysunek 5). Ocena gęstości keratocytów (Rysunek 6) i współczynnik odbicia zrębu (Figura 7) może dodatkowo pomóc w analizie histologicznej i różnicowaniu prawidłowych i patologicznych tkanek rogówki za pomocą FF-OCM, poza możliwościami klinicznych systemów OCT (Figura 8).

Rysunek 1: Schemat i zdjęcia ogólnej konfiguracji i urządzenia FF-OCM użytego w tej pracy. (A) Zdjęcie urządzenia FF-OCM (patrz Tabela Materiałów)²⁸. (B) Schemat i konfiguracja optyczna urządzenia. (C) Fotografia rogówki dawcy ludzkiego w uchwycie próbki. (D) Zbliżenie na obiektyw zanurzenia i uchwyt próbki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 2: Normalna ludzka rogówka z hodowlą narządów przed deturgescencją. Przekrój poprzeczny (A) i widok en face (B, przeciąć zrąb) spuchniętą ("obrzękniętą") rogówkę spowodowaną przechowywaniem w pożywce do hodowli narządów, gdzie jeziora mogą być widoczne jako ciemne obszary (jak wskazują strzałki). Grubość rogówki podwoiła się do ponad 1100 μm, co uniemożliwia uzyskanie obrazu na całej głębokości. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 3: Normalna ludzka rogówka po deturgescencji z kulturą narządową. Przekrój poprzeczny przez całą rogówkę (A) i widok zrębu en face (B) zdepuchniętej rogówki zanurzonej w pożywce uzupełnionej dekstranem, pokazujący regularnie rozmieszczone hiperrefleksyjne (białe) keratocyty. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 4: Ogólna ocena morfologii i cech zrębu, w tym grubości zrębu. W porównaniu z normalną ludzką rogówką (A), rogówki ze stożkiem rogówki (B) charakteryzują się zmniejszoną i zmienną grubością zrębu, wraz z licznymi, równoległymi prążkami Vogta, które można zaobserwować jako ciemne pionowe pasy w widoku przekrojowym, oraz grubymi nerwami zrębowymi, które można znaleźć w środkowych warstwach zrębu en face (C). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 5: Ocena grubości warstwy Bowmana, która jest wyznaczona z przodu przez hiperrefleksyjną błonę podstawną nabłonka, a z tyłu przez hiperrefleksyjne keratocyty w bardzo przednim zrębie. W porównaniu z normalną ludzką rogówką (A), patologiczna rogówka (np. stożek rogówki) (B) ma zmniejszone cechy i zmienną grubość warstwy Bowmana z powodu przerwania i bliznowacenia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 6: Ocena gęstości keratocytów. (A) Jądra keratocytów są ręcznie zliczane na wzmocnionych i odwróconych obrazach en face po wybraniu obszaru zainteresowania o wymiarach 300 μm x 300 μm. (B) Zliczone jądra są oznaczone strzałkami. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Ocena odbicia zrębowego. Ilość światła wstecznie rozproszonego zmniejsza się (wykładniczo) wraz z głębokością zrębu normalnych rogówek dawcy (patrz Rysunek 3 i Rysunek 4A), co skutkuje liniowymi logarytmicznymi profilami głębokości, reprezentowanymi przez wartości R-kwadrat bliskie 1 (zielony ślad). Może to nie być prawdą w przypadku patologicznych rogówek z obszarami zrębu o zwiększonym rozproszeniu wstecznym światła (patrz Rysunek 4B). Obecność takich cech makroskopowych, jak w przykładzie rogówki z blizną zrębową po zakaźnym zapaleniu rogówki (przedstawionym we wstawce), stworzy zatem nieliniowe logarytmiczne profile głębokości intensywności, reprezentowane przez wartość R-kwadrat poniżej pewnego progu (np. poniżej 0,94²⁵; czerwony ślad). Należy zauważyć, że logarytmiczne profile głębokości amplitudy są w rzeczywistości pokazane, ponieważ FF-OCM mierzy amplitudę światła wstecznie rozproszonego przez próbkę, a nie jego intensywność. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 8: Demonstracja korzyści płynących z FF-OCM w porównaniu z histologią i OCT w domenie spektralnej. (A) Histologia i (B) odpowiedni obraz spektralny-domena OCT uzyskany na tej samej rogówce in vivo przed keratoplastyką. (C) Odpowiedni przekrój FF-OCM po keratoplastyce guzika rogówki ex vivo, ilustrujący wyższą rozdzielczość w porównaniu z klinicznymi obrazami OCT w domenie spektralnej. Zwłóknienie jest również wyraźniej widoczne na obrazach FF-OCM niż w histologii. Duże zagęszczenie keratocytów w górnym zrębie jest wyraźnie widoczne zarówno w widoku przekrojowym (C), jak i (D) en face. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Opisany tutaj protokół jakościowej i ilościowej oceny zrębu dawcy rogówki za pomocą FF-OCM opiera się na podobnej do histologicznej analizie makroskopowych i mikroskopowych cech wskazujących na stan zrębu, wykraczający poza możliwości OCT w domenie spektralnej i mikroskopii konfokalnej 21,24,25 i umożliwia różnicowanie chorych tkanek od normalnych tkanek ludzkich.

Oprócz doskonałej oceny jakości śródbłonka ludzkich rogówek dawcy za pomocą mikroskopii zwierciadlanej, ocena jakości zrębu jest wyzwaniem w bankach oczu i zazwyczaj ogranicza się do ogólnej obserwacji za pomocą biomikroskopii w lampie szczelinowej i/lub mikroskopii świetlnej w obecnych protokołach. Brak drobnej rozdzielczości przy użyciu istniejących metod oznacza nie tylko, że rogówki z niektórymi chorobami zrębu mogą zostać wybrane, które pogarszają wynik keratoplastyki, ale także, że rogówki mogą zostać odrzucone z powodu zmętnień zrębu, które w rzeczywistości ograniczają przednie zręby lub obszary nabłonka i nadal mogą być stosowane do zabiegów keratoplastyki śródbłonka¹⁴.

Obecny protokół banku oczu może być uzupełniony o FF-OCM, który ze względu na swoją doskonałą rozdzielczość stanowi potężne i nieinwazyjne narzędzie do zakończenia oceny jakości rogówki, zwłaszcza zrębu (w tym warstwy Bowmana). W przeciwieństwie do badania w lampie szczelinowej, przeszczep pozostaje zanurzony w zamkniętej komorze wypełnionej nośnikiem pamięci przez cały czas akwizycji obrazu FF-OCM, co zmniejsza potencjalne ryzyko zanieczyszczenia.

W celu pomyślnego uzyskania obrazu za pomocą FF-OCM (patrz Tabela materiałów) ważne jest, aby obiektyw mikroskopu był dobrze zanurzony w żelu optycznym, który jest nakładany na szkiełko nakrywkowe uchwytu próbki (krok 2.2.3). Ponadto zaleca się regularne sprawdzanie kalibracji urządzenia, procedurę, którą należy wykonać również po nieudanej automatycznej regulacji (krok 2.2.2) i uzyskać dostęp za pośrednictwem "Narzędzia i opcje" w oprogramowaniu do akwizycji (patrz tabela materiałów). Procedura, która polega na wykorzystaniu lustra kalibracyjnego w uchwycie próbki, jest taka sama, jak w przypadku zwykłego przygotowania próbki (patrz krok 1.2), z wyjątkiem tego, że żel optyczny należy nałożyć na lustro przed umieszczeniem szkiełka nakrywkowego.

Seria przeszczepów rogówki dawcy, u których stwierdzono prawidłowe zrąb zgodnie z istniejącymi procedurami banku oczu, została wykorzystana do opisania protokołu w tym manuskrypcie i w szczególności wykazania przydatności FF-OCM do precyzyjnej i wiarygodnej oceny jakości zrębu dawcy. Te normalne rogówki dawcy porównano z patologicznymi rogówkami zanurzonymi w pożywce magazynowej, wykazując, że analiza histologiczna, która była możliwa dzięki FF-OCM kilku cech zrębu (zilustrowanych na rycinie 2, rycinie 3, rycinie 4, rycinie 5, rycinie 6, figurze 7 i rycinie 8) w przeszczepach rogówki, pozwala odróżnić chore od normalnych ludzkich tkanek rogówki.

Oprócz zmian morfologicznych, takich jak obecność blizn (ryc. 5 i ryc. 7), tkanki zwłóknieniowej (ryc. 8), jezior (ryc. 2), prążków Vogta (ryc. 4) lub zwiększonej średnicy nerwu zrębu (ryc. 4), w chorej rogówce występują typowe cechy zrębu. Parametrami zrębu szczególnie istotnymi w ocenie jakości zrębu wydają się być grubość warstwy Bowmana i jej zmienność oraz współczynnik odbicia zrębu. Kluczowymi etapami w ramach protokołu są zatem kroki 4.1 i 4.3.

Podczas gdy jest wydzielana podczas rozwoju ludzkiej rogówki, warstwa Bowmana, w szczególności, staje się wyraźna w 19 tygodniu ciąży i nigdy nie naprawia się po urodzeniu³². Uszkodzenie warstwy Bowmana jest zatem nieodwracalne i służy jako idealny wskaźnik wcześniejszego uszkodzenia zrębu w tkance rogówki dawcy, w tym uszkodzeń spowodowanych chirurgią refrakcyjną, zakaźnym zapaleniem rogówki, stożkiem rogówki. Takie choroby rogówki, które stanowią przeciwwskazania do użycia rogówki dawcy, są związane ze zmniejszoną i zmienną grubością warstwy Bowmana z powodu przerwania i bliznowacenia (ryc. 5) i prawdopodobnie zostaną pominięte w obecnych protokołach banku oczu, gdy historia dawcy nie jest dokładnie znana.

Chociaż przezroczystość rogówki jest osłabiona po śmierci dawcy z powodu pośmiertnego obrzęku rogówki, oczekuje się, że ilość światła wstecznie rozproszonego lub odbicia zrębu będzie się zmniejszać wykładniczo wraz z głębokością zrębu (patrz ryc. 3 i ryc. 4A); w rezultacie logarytm znormalizowanego odbicia zrębu będzie funkcją liniową głębokości zrębu w normalnych rogówkach dawcy, reprezentowaną przez wartości R-kwadrat bliskie 1. I odwrotnie, obecność cech makroskopowych jest związana z nieliniowymi logarytmicznymi profilami głębokości i wskazuje na chorobę zrębu (Figura 4B i Figura 7)²⁵.

Ponieważ gęstość keratocytów jest odpowiedzialna za syntezę i odnowę włókien kolagenowych zrębu oraz macierzy zewnątrzkomórkowej, uzasadnione wydaje się założenie, że gęstość keratocytów jest kolejnym istotnym parametrem do oceny jakości zrębu dawcy i że tkanki wykazujące bardzo niską liczbę keratocytów nie powinny być przeszczepiane. Protokół zawiera zatem precyzyjną i wiarygodną metodę pomiaru gęstości keratocytów na podstawie obrazów FF-OCM, która może być łatwo stosowana w bankach oczu²⁵ i jest zgodna z konwencją mikroskopii konfokalnej. Należy zauważyć, że w przypadku FF-OCM gęstość keratocytów można również określić, licząc keratocyty bezpośrednio w widoku przekroju poprzecznym³³, co stanowi potencjalną przewagę nad mikroskopią konfokalną, która wymaga liczenia keratocytów na wielu wycinkach en face. Jednak w przeciwieństwie do żywych pacjentów, u których wykazano, że gęstość keratocytów jest niższa u pacjentów z chorobą niż u normalnych osób z grupy kontrolnej 34,35,36,37 i koreluje z ciężkością choroby ^34,38, nie miało to miejsca w próbkach tkanek ludzkich ex vivo ²⁵, a dalsze badania są konieczne w celu ustalenia, czy wymagana jest minimalna liczba keratocytów w rogówkach dawcy, aby zapewnić dobrą poprawę wzroku po przeszczepie. Niska gęstość keratocytów w tkance dawcy, podobnie jak w tkance patologicznej, może być wyjaśniona starzeniem się, pośmiertną utratą komórek wywołaną niedokrwieniem i/lub przechowywaniem tkanki dawcy 27,39,40,41. Należy również podkreślić, że normalne rogówki dawcy, które zostały pobrane i zobrazowane w tym protokole, były albo przechowywane i obrzęknięte, albo zopęczniałe, albo zostały wyrzucone przez bank oka przed przeszczepem z powodu złej jakości śródbłonka zgodnie ze standardami Stowarzyszenia Banków Oczu UE. Gdyby obrazowanie FF-OCM wraz z opisanym protokołem zostało włączone do ustawienia banku oczu, rogówki byłyby zazwyczaj oceniane w stanie świeższym niż było to możliwe w tym przypadku, co może wpływać na gęstość keratocytów.

Opisany tutaj protokół analizy jakości zrębu może zostać rozszerzony o ocenę błony Descemeta, którą można również rozwiązać za pomocą FF-OCM pod względem grubości i struktury^21,24. Może to okazać się przydatne do selekcji tkanek do keratoplastyki śródbłonka błony Descemeta, gdzie cienkie błony Descemeta mogą być trudniejsze do oddzielenia od zrębu.

Podsumowując, FF-OCM umożliwia precyzyjną i wiarygodną ocenę zrębu rogówki ludzkiego dawcy podczas przechowywania. Poprawiając jakość przeszczepów, dodanie tego protokołu do obecnych procedur bankowania oczu może potencjalnie poprawić badania przesiewowe i selekcję tkanek dawcy, a tym samym wyniki keratoplastyki. Rzeczywista integracja urządzenia FF-OCM z rutyną banku oczu powinna być ułatwiona dzięki najnowszym aktualizacjom technologicznym, w tym szybszej akwizycji obrazu i większemu polu widzenia dzięki opracowaniu niestandardowej kamery CMOS oraz projektowaniu niestandardowych sterylnych jednorazowych kaset do przechowywania i obsługi rogówki podczas obrazowania.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Light-CT Scanner	LLTech, Francja	http://www.lltechimaging.com/products-applications/products/	Urządzenie FF-OCM użyte w tym manuskrypcie do obrazowania
CorneaJet	EuroBio, Francja	http://www.eurobio-cornea.com/en/corneamax-10-100-ml-xml-352-822.html	Pożywka do hodowli narządów, w której przechowywane są rogówki dawcy
CorneaMax	EuroBio, Francja	http://www.eurobio-cornea.com/en/corneajet-10-50-ml-xml-352-823.html	Pożywka do hodowli narządów z dodatkiem dekstranu stosowana do deturgescencji
Fidżi (ImageJ)	National Institute of Health, Bethesda, MD, Stany Zjednoczone	https://fiji.sc/	Oprogramowanie do przetwarzania obrazów typu open source
Matlab	Mathworks, Inc., Natick, MA, USA	https://www.mathworks.com/products/matlab.html	Oprogramowanie do obliczeń matematycznych