Artykuł metodologiczny

Analizowanie wielobiałkowych kompleksów sygnalizacyjnych za pomocą oczyszczania powinowactwa z komplementacją bimolekularną (BiCAP)

DOI:

10.3791/57109

⸱

15 czerwca 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The Kinghorn Cancer Centre, Garvan Institute of Medical Research, 2Ubiquitin Signaling Group, Protein Signaling Program, The Novo Nordisk Foundation Center for Protein Research, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, 3RCSI Molecular Medicine, Royal College of Surgeons in Ireland, 4Department of Epigenetics, Max Planck Institute of Immunobiology and Epigenetics, 5School of Medical Sciences, University of New South Wales, 6St Vincent's Hospital Clinical School, University of New South Wales, 7School of Medicine and Medical Science, University College Dublin

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten manuskrypt opisuje protokół oczyszczania powinowactwa do uzupełnienia bimolekularnego (BiCAP). Ta nowatorska metoda ułatwia specyficzną izolację i dalszą charakterystykę proteomiczną dowolnych dwóch oddziałujących białek, wykluczając jednocześnie nieskompleksowane pojedyncze białka, a także kompleksy utworzone z konkurującymi partnerami wiążącymi.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Składanie kompleksów białkowych jest centralnym mechanizmem leżącym u podstaw regulacji wielu komórkowych szlaków sygnałowych. Głównym celem badań biomedycznych jest rozszyfrowanie, w jaki sposób te dynamiczne kompleksy białkowe działają w celu integracji sygnałów z wielu źródeł w celu kierowania określoną reakcją biologiczną i w jaki sposób ulega ona rozregulowaniu w wielu warunkach chorobowych. Pomimo znaczenia tego kluczowego mechanizmu biochemicznego, brakuje technik eksperymentalnych, które mogłyby ułatwić specyficzną i czułą dekonwolucję tych wielocząsteczkowych kompleksów sygnałowych.

Tutaj to niedociągnięcie jest rozwiązywane poprzez połączenie testu komplementacji białek z nanociałem specyficznym dla konformacji, które nazwaliśmy Oczyszczaniem Powinowactwa Komplementacji Dwumolekularnej (BiCAP). Ta nowatorska technika ułatwia specyficzną izolację i dalszą charakterystykę proteomiczną dowolnej pary oddziałujących białek, z wyłączeniem nieskompleksowanych pojedynczych białek i kompleksów utworzonych z konkurującymi partnerami wiążącymi.

Technika BiCAP jest przystosowana do szerokiego wachlarza dalszych testów eksperymentalnych, a wysoki stopień specyficzności zapewniany przez tę technikę pozwala na bardziej zniuansowane badania nad mechaniką składania kompleksów białkowych, niż jest to obecnie możliwe przy użyciu standardowych technik oczyszczania powinowactwa.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Składanie kompleksu białkowego jest kluczowym procesem w utrzymaniu czasoprzestrzennej specyficzności wielu szlaków sygnałowych1,2. Chociaż krytyczny charakter tej roli regulacyjnej jest powszechnie uznawany, brakuje dostępnych technik eksperymentalnych do badania tych kompleksów. Większość badań interaktomicznych koncentruje się na interakcjach z pojedynczymi białkami lub sekwencyjnym wzbogacaniu poszczególnych składników kompleksu. W tym miejscu przedstawiamy technikę izolacji określonego dimeru białkowego z wyłączeniem poszczególnych ugrupowań białek składowych, a także kompleksów utworzonych z konkurującymi ze sobą partnerami wiążącymi3. Nazwaliśmy tę technikę oczyszczaniem powinowactwa do komplementacji bimolekularnej (BiCAP), ponieważ jest to połączenie wcześniej istniejącego testu komplementacji fragmentów białka, bimolekularnej komplementacji fluorescencji (BiFC), z nowatorskim zastosowaniem rekombinowanego nanonika specyficznego dla konformacji w kierunku GFP i jego pochodnych (patrz tabela materiałów).

Typowy test komplementacji fragmentów białek opiera się na ekspresji białek "przynęty" i "ofiary" połączonych w celu rozszczepienia fragmentów reporterów, takich jak lucyferaza4, β-galaktozydaza5, lub zielone białko fluorescencyjne (GFP)6 (Rysunek 1A). Poprzez interakcję białek przynęty i ofiary, podzielone domeny reporterowe są zachęcane do ponownego złożenia w funkcjonalną strukturę, co pozwala na wizualizację lub ilościowe określenie interakcji między przynętą a białkami ofiary. BiCAP został zaadaptowany z wersji tej techniki, która wykorzystywała fragmenty wariantu GFP Venus. Testy komplementacji białek fluorescencyjnych są popularną metodą wizualizacji interakcji białko-białko w żywej komórce, ale do tej pory ograniczały się do tej jednej funkcji7. BiCAP stanowi znaczący postęp w tym względzie, ponieważ technika ta pozwala nie tylko na wizualizację, ale także na izolację i badanie wynikowej interakcji białko-białko.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Zasada strukturalna stojąca za techniką BiCAP. (A) Schemat przedstawiający zasadę dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencyjnej, pokazujący białka "przynęty" i "ofiary" oznaczone N-końcowymi fragmentami V1 lub C-końcowymi V2 pełnowymiarowego białka Wenus. (B) Analiza strukturalna interfejsu interakcji (cyjan) między nanocząsteczką GFP (zielony) a rekombinowaną Wenus, pokazująca położenie fragmentów V1 (szary) i V2 (pomarańczowy) (akces PDB 3OGO). Ten rysunek został przedrukowany z Croucher et al.3 Przedruk za zgodą AAAS. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Technika BiCAP wykorzystuje dwa niefluorescencyjne fragmenty Wenus (nazwane V1 i V2), które łączą się z niskim stopniem pokrewieństwa, chyba że dojdzie do interakcji między ich partnerami fuzyjnymi. W tym przypadku dwie podzielone domeny przekształcają się w funkcjonalną strukturę β-beczkową fluoroforu (Rysunek 1B)6. Kluczową innowacją BiCAP jest wprowadzenie rekombinowanego nanociała GFP, które rozpoznaje trójwymiarowy epitop na β-lufie GFP (i wariantach takich jak Venus), który jest obecny tylko na prawidłowo rekombinowanym i złożonym fluoroforze (Rysunek 1B)8. Co najważniejsze, nanocząsteczka GFP nie wiąże się z żadnym z pojedynczych fragmentów Wenus. Ułatwia to izolację dimerów białkowych dopiero po tym, jak oba białka utworzą kompleks z własnej woli, co prowadzi do bardziej reprezentatywnych wyników niż te uzyskane za pomocą metod wykorzystujących chemicznie indukowane, wymuszone interakcje9.

BiCAP to potężna technika, która skupia się na kompleksach wielobiałkowych, które potencjalnie mogą być łączone z wieloma dalszymi aplikacjami, aby poprawić szczegółowość naszego zrozumienia roli, jaką te kompleksy odgrywają w transdukcji sygnału. Obejmuje również ważną cechę, jaką jest umożliwienie wizualizacji interakcji białek in situ. Do tej pory wykazano, że BiCAP jest skuteczną metodą analizy interaktomu dimerów receptorowej kinazy tyrozynowej (RTK)3, ale zdolność adaptacyjna tej metody oznacza, że można ją zastosować w prawie każdym kontekście interakcji białkowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Klonowanie plazmidu

UWAGA: Aby wygenerować wektory plazmidowe ze znacznikami V1 lub V2 połączonymi z N-końcem lub C-końcem interesującego genu, wektory docelowe BiFC zostały zdeponowane za pomocą Addgene [N-końcowy znacznik: pDEST-V1-ORF (#73635), pDEST-V2-ORF (#73636). Znacznik C-terminala: pDEST-ORF-V1 (#73637), pDEST-ORF-V2 (#73638)]. Aby kontynuować klonowanie, geny będące przedmiotem zainteresowania będą musiały znajdować się w specyficznych wektorach wejściowych kompatybilnych z klonowaniem rekombinacji (tj. pDONR223 lub pENTR221), bez kodonów stop. Wiele kompatybilnych klonów jest już dostępnych w różnych kolekcjach plazmidów, w tym w Kolekcji Genomu Ssaków (https://genecollections.nci.nih.gov/MGC/).

  1. Przeprowadź reakcję rekombinacji w celu wstawienia interesującego genu między miejsca attR odpowiedniego wektora docelowego BiFC:
    1. W probówce o pojemności 0,2 ml dodaj 150 ng wektora wejściowego, 150 ng wektora docelowego BiFC i 8 μl buforu TE (pH 8,0).
    2. Dodać 2 μl mieszaniny enzymów rekombinazy (patrz tabela materiałów). Dobrze wymieszaj i krótko odwiruj.
    3. Inkubować reakcję przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub w temperaturze 16 °C przez noc.
    4. Zatrzymać reakcję, dodając 1 μl roztworu proteinazy-K i inkubując w temperaturze 37 °C przez 10 minut.
  2. Przekształć ogniwa kompetentne do szoku cieplnego (patrz tabela materiałów) za pomocą produktu reakcji LR:
    UWAGA: W tym momencie można sobie wyobrazić użycie dowolnego szczepu podstawowego, o ile nie zawiera antytoksyny Ccdb, która uniemożliwiłaby specyficzną selekcję plazmidów zawierających insert.
    1. Rozmrozić właściwe komórki na lodzie i przenieść 50 μl komórek do 14 ml okrągłodennej probówki polipropylenowej.
    2. Dodać 1 μl produktu reakcji do komórek i delikatnie wymieszać. Inkubować przez 20 minut na lodzie.
    3. Szok termiczny w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C przez 45 s. Natychmiast powrócić do lodu na 2 min.
    4. Dodać 1 ml pożywki LB i inkubować z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
    5. Przemianę należy umieścić na 10 cm płytce agarowej zawierającej ampicylinę (100 μg/ml) i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.
  3. Oczyszczanie plazmidu BiFC.
    1. Aby oczyścić plazmid z pojedynczej kolonii, dodaj 100 ml pożywki LB do dużej stożkowej kolby i dodaj ampicylinę (100 μg/ml). Aby przesiać wiele kolonii, dodaj 5 ml pożywki LB do 14 ml okrągłodennych probówek polipropylenowych i dodaj ampicylinę (100 μg/ml).
    2. Używając sterylnej pętli do zaszczepiania, wybierz pojedynczą kolonię z płytki agarowej. Umieścić pętlę inokulacyjną w pożywce LB i krótko wymieszać.
    3. Przykryć górną część kolby stożkowej folią aluminiową i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C, wstrząsając.
    4. Wyprodukuj plazmidowe DNA klasy transfekcyjnej za pomocą standardowego zestawu do oczyszczania plazmidowego DNA maxiprep lub midiprep (patrz Tabela materiałów)10. Oceń jakość DNA za pomocą widm absorbancji.
      UWAGA: DNA powinno mieć stosunek A260/A280 >1,8 i stosunek A260/A230 >2,0. W tym momencie zaleca się przesiewanie wielu pojedynczych kolonii, aby sprawdzić, czy ekspresja insertu i znacznika jest efektywna.

2. Hodowla komórkowa i transfekcja

UWAGA: Dla transfekcji wektorów BiFC ważne jest osiągnięcie wysokiej wydajności i względnie jednorodnej transfekcji. Wektory będą prawdopodobnie kompatybilne z dowolnym standardowym odczynnikiem do transfekcji, a warunki transfekcji powinny być odpowiednio zoptymalizowane. Aby przeprowadzić spektrometrię mas, zwykle hodujemy komórki w odległości 10 cm od szalek, chociaż można to również proporcjonalnie zmniejszyć do mniejszych szalek lub płytek w przypadku eksperymentów, które wymagają mniejszej ilości materiału.

  1. Nasiona 1.0 × 106 HEK293T komórek w 10 cm naczyniu z 10 ml pożywki DMEM, uzupełnionej 10% FBS i penicyliną/streptomycyną (1:100).
  2. Rozcieńczyć 2,5 μg każdego wektora BiFC w 500 μl buforu transfekcyjnego (patrz tabela materiałów) w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
  3. Dodać 10 μl odczynnika do transfekcji (patrz tabela materiałów).
  4. Wiruj mieszaninę przez 10 s, a następnie krótko odwiruj. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Dodaj mieszaninę transfekcji DNA do płytki, kroplami. Inkubuj komórki przez wystarczająco długi czas, aby białka fuzyjne BiFC mogły oddziaływać oraz aby Wenus składała się i dojrzewała fluorofor, zwykle ~ 8 - 24 godziny < br / > UWAGA: Szczytowe wzbudzenie Wenus wynosi 515 nm, a jej szczytowa emisja wynosi 528 nm, chociaż można to łatwo zobaczyć za pomocą standardowego mikroskopu fluorescencyjnego ustawionego do wizualizacji fluorescencji GFP.

3. Przygotowanie próbki

  1. Zbiór lizatów
    1. Przed pobraniem lizatu należy przygotować bufor do lizy komórek [50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% (v/v) niejonowy detergent (patrz tabela materiałów)]. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
    2. Bezpośrednio przed zbiorem należy uzupełnić 10 ml buforu do lizy komórek inhibitorem proteazy i inhibitorem fosfatazy (patrz tabela materiałów). Uzupełniony bufor do lizy komórek należy przechowywać na lodzie.
    3. Umyj komórki dwukrotnie w lodowatym PBS. Odessać PBS i dodać 1 ml lodowatego buforu do lizy komórek. Umieść naczynie na lodzie, upewniając się, że bufor jest rozprowadzony na całej powierzchni.
    4. Inkubować na lodzie przez około 5 minut, a następnie użyć skrobaka do komórek (patrz Tabela materiałów) w celu zeskrobania komórek i przeniesienia do wstępnie schłodzonej probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
    5. Usunąć resztki komórkowe poprzez odwirowanie zebranego lizatu w stężeniu 18 000 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i przenieść oczyszczony supernatant do świeżych probówek do mikrowirówek.
      UWAGA: W tym momencie lizat może być natychmiast użyty lub przechowywany w temperaturze -80 °C. Zaleca się również przechowywanie podwielokrotności surowego lizatu, aby można było potwierdzić skuteczność transfekcji i oczyszczanie powinowactwa.
  2. Oczyszczanie powinowactwa
    UWAGA: Etap izolacji BiCAP przeprowadza się przy użyciu nanonury GFP sprzężonej z kulkami agarozy (patrz Tabela materiałów).
    1. Przygotować kulki agarozy, przemywając odpowiednią objętość (20 μl na próbkę + 10 μl nadmiaru) w 1 ml PBS. Odwirować kulki o sile 300 x g i usunąć supernatant.
    2. Dodać 20 μl do każdej próbki lizatu.
    3. Próbki inkubować przez 2 godziny w temperaturze 4 °C z rotacją od końca do końca.
      UWAGA: Na tym etapie próbki można przygotować do SDS-PAGE i western blot lub do analizy za pomocą spektrometrii mas.
  3. Przygotowanie eluantu BiCAP do western blot.
    1. Odwirować kulki o masie 300 x g i przemyć trzykrotnie w buforze do lizy komórek.
    2. Ponownie zawiesić przemyte kulki w 50 μl odpowiednio rozcieńczonego buforu do próbek (patrz tabela materiałów) i podgrzewać próbki w temperaturze 95 °C przez 2-3 minuty
      UWAGA: Tak przygotowane próbki mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy.
    3. Wykonaj SDS-PAGE i western blotting11 zarówno dla znaczników V1, jak i V2 (patrz Tabela materiałów), a także dla wszelkich innych interesujących białek.
  4. Przygotowanie eluantu BiCAP do spektrometrii mas.
    UWAGA: W przypadku analizy za pomocą ilościowej spektrometrii mas bez znaczników (LFQ) zaleca się przygotowanie próbek w co najmniej czterokrotnym powiększeniu, aby zapewnić solidną moc statystyczną.
    1. Odwirować kulki o masie 300 x g i umyć sześć razy w buforze do lizy komórkowej bez detergentu. Jest to konieczne, aby usunąć zarówno nadmiar białka, jak i detergent, który będzie zakłócał analizę spektrometrii mas. Natychmiast przejdź do następnego kroku lub przechowuj koraliki w temperaturze -80 °C.
    2. Kulki trypsynizujące w 60 μL buforze 1 [2 M mocznik, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 μg/ml trypsyny]. Pozostawić kulki do strawienia przez 30 minut w temperaturze 27 °C w termomikserze, wstrząsając z prędkością 800 obr./min.
    3. Krótko odwirować kulki, a następnie zebrać supernatant i przenieść do probówek do mikrowirówek (patrz Tabela materiałów).
    4. Przemyć kulki w 25 μl buforu 2 [2 M mocznik, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM ditiotreitol], w celu redukcji związanych białek.
    5. Zebrać kulki i supernatant w jednej probówce do mikrowirówki. Pozostaw trawienie na noc w temperaturze pokojowej.
    6. Alkilować próbki, dodając 20 μl jodoacetamidu (5 mg/ml w ultraczystej wodzie) do każdej próbki i inkubować w ciemności przez 30 minut.
    7. Zahamować trawienie, traktując każdą próbkę 1 μl kwasu trifluorooctowego (TFA). Na tym etapie próbki zostaną również zakwaszone w ramach przygotowań do przechylania etapu.
    8. Skonstruuj końcówki do etapów C18, układając 6 warstw krążków membranowych C18 (oktadecylowych) do ekstrakcji do fazy stałej o średnicy 1 mm (patrz Tabela materiałów) w końcówce do mikropipet o pojemności 200 μl. Przygotuj pojedynczą końcówkę dla każdej próbki.
    9. Zwilż końcówki etapu metanolem i zrównoważ 50 μl 0,1% (v/v) kwasu trifluorooctowego (TFA), 80% (v/v) acetonitrylu.
    10. Umyj końcówki 50 μl 0,1% (v/v) TFA.
    11. Załaduj zakwaszone peptydy na końcówki sceny, a następnie eluuj za pomocą 0,1% (v/v) TFA, 80% (v/v) acetonitrylu w dwóch etapach.
    12. Odparować próbki za pomocą koncentratora próżniowego.
    13. W razie potrzeby przechowywać wysuszone peptydy w temperaturze -80 °C.

4. Spektrometria mas.

  1. Zawiesić próbki w 15 μl 5% kwasu mrówkowego, 2% acetonitrylu (w wodzie ultraczystej).
  2. Ostrożnie załadować 6 μl na płytkę LC i umieścić w systemie nanoLC HPLC (patrz tabela materiałów).
  3. Zapakuj kolumnę o średnicy wewnętrznej 20 cm i średnicy wewnętrznej 75 μM z cząstkami fazy stacjonarnej 1,9 μm C18 (patrz tabela materiałów). Załaduj 5 μl peptydu na każdą kolumnę.
  4. Eluować peptydy za pomocą liniowego gradientu acetonitrylu przy 250 nL/min przez 140 minut i wprowadzać za pomocą nanoelektrorozpylania do hybrydowego spektrometru mas z liniową pułapką kwadropolową (LTQ) sprzężonego z systemem nanoLC HPLC.
  5. Zbierz dane tandemowe MS dla 10 najobficiej występujących jonów na skan w 140-minutowym gradinie czasu. Losowo dobieraj kolejność zbierania i wymiany danych z BSA między każdą próbką, aby zminimalizować odchylenie czasowe.

5. Analiza

  1. Przetwarzaj nieprzetworzone dane MS przy użyciu ustawień domyślnych w oprogramowaniu MaxQuant w wersji 1.2.7.4 i analizuj dane wyjściowe MaxQuant przy użyciu zmodyfikowanej wersji przepływu pracy analizy statystycznej Perseus w środowisku oprogramowania R3.
    UWAGA: Proces analizy statystycznej od tego momentu jest podsumowany w Rysunek 2. Krótko mówiąc, intensywność LFQ białek zidentyfikowanych za pomocą MaxQuant jest przekształcana i filtrowana, a następnie normalizowana i przypisywana. Oddziałujące białka par dimerów są identyfikowane przez porównanie z kontrolą Wenus, w celu wykluczenia niespecyficznych spoiw tła, z testem t Studenta i poprawką Benjaminiego-Hochberga dla wielokrotnych porównań. Jakość danych potwierdzają porównania poszczególnych histogramów, regresja wieloraka i grupowanie hierarchiczne.

figure-protocol-1
Rysunek 2: Zarys procesu pracy analizy statystycznej. Diagram przepływu potoku analizy statystycznej używanego do analizy intensywności LFQ białek zidentyfikowanych na podstawie surowych danych spektrometrii mas przetworzonych przy użyciu MaxQuant. Zielone pola: filtrowanie, niebieskie pola: transformacja/normalizacja/skalowanie, brązowe pola: kontrola jakości danych, żółte pola: wykluczenie półilościowe/analiza porównawcza, szare pola: analiza statystyczna. Ten rysunek został przedrukowany z Croucher et al.3 Przedruk za zgodą AAAS. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po zastosowaniu klonowania rekombinacyjnego do generowania genów oznaczonych tagami V1 i V2 z plazmidami pDEST BiFC, kotransfekcja dwóch plazmidów zawierających oddziałującą parę białek spowoduje wygenerowanie sygnału fluorescencyjnego Wenus po około 8-24 godzinach. W przypadku braku sygnału dodatniego możliwe jest, że interakcja białkowa może nie zachodzić ze względu na wybór linii komórkowej, niską wydajność transfekcji lub orientację znaczników BiFC nie jest optymalna. Rozwiązywanie pr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BiCAP to skuteczna metoda izolowania określonych dimerów białkowych przy jednoczesnym wykluczeniu poszczególnych składników i ich konkurujących ze sobą partnerów wiążących3. BiCAP opiera się na adaptacji testu komplementacji białek fluorescencyjnych o nazwie BiFC6. Istniejące metody, w tym testy ligacji zbliżeniowej BiFC i zbliżeniowej, były szeroko stosowane do wizualizacji i ilościowego określania interakcji białek w żywych komórkach7, ale nie zape...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

D.R.C jest członkiem Cancer Institute NSW, a D.N.S był wcześniej członkiem Cancer Institute NSW. Wyniki badań przedstawione w tym manuskrypcie zostały sfinansowane przez Cancer Institute NSW (13/FRL/1-02 i 09/CDF/2-39), NHMRC (Project Grant GNT1052963), Science Foundation Ireland (11/SIRG/B2157), NSW Office of Science and Medical Research, Guest Family Fellowship i Mostyn Family Foundation. J.F.H. i R.S. zostali laureatami Australijskiej Nagrody Podyplomowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Enzym LR Clonase II PlusThermo Fisher Scientific12538120Enzym rekombinazy wymagany do klonowania Gateway (Krok 1) do wektorów docelowych pDEST BiFC
Proteinaza K, rekombinowana, klasa PCRThermo Fisher ScientificEO0491
14 ml okrągłodenna probówka polipropylenowaCorning352059
AmpicillinRoche Diagnostics Australia10835242001Roztwór podstawowy przygotowany w stężeniu 100 μ g/ml w wodzie destylowanej.
Zestaw MiniprepPromega CorporationA1330
Zestaw MaxiprepLife Technologies AustraliaK2100-07
DMEMGibco11995-073
FBSLife Technologies Australia10099-141
Penicylina/StreptomycynaLife Technologies Australia15070-063
bufor transfekcyjny jetPRIMEPolyplus114-15
jetPRIME odczynnik do transfekcjiPolyplus114-15
PhosSTOP (inhibitor fosfatazy)Sigma-Aldrich4906837001
cOmplete, Mini, wolny od EDTA koktajl inhibitorów proteazyRoche11873580001
Skrobak komórkowySarstedt83.1832
GFP-Trap_AChromotek Gmbhgta-100GFP nanonik sprzężony z kulkami agarozy
N-końcowe przeciwciało monoklonalne GFP CovanceMMS-118PWykryje znacznik V1 w wektorach BiFC
C-końcowe przeciwciało monoklonalne GFPRoche11814460001Wykryje znacznik V2 w wektorach BiFC
Bufor próbkiInvitrogenNP0008Uzupełniony 1 ml β-merkaptoetanolem.
Zmodyfikowana trypsyna do sekwencjonowaniaPromega CorporationV5117h
Probówki wirówkowe LoBind Diagnostykaw miejscu opieki nad pacjentem0030 108 116
JodoacetamidSigma-AldrichI1149-5GPrzygotowany w dawce 5 mg/ml w wodzie ultraczystej
Kwas trifluorooctowy - Sequanal GradeThermo Fisher10628494
Dyski 3M Empore do ekstrakcji do fazy stałej C18 (oktadecyl) - 4,7 cmThermo Fisher14-386-2Aby przygotować końcówki stolika, należy przyciąć krążki o średnicy 1 mm za pomocą dziurkacza o odpowiedniej wielkości. Alternatywnie można również zakupić wstępnie przygotowane wskazówki dotyczące etapów, patrz poniżej.
C18 Stage Tips, 10 i mikro; Łóżko LThermo Fisher87782
Kwas mrówkowy OPTIMA do klasy LC/MS 50mLThermo FisherFSBA117-50
1,9 μ m C18 Cząstki ReproSilDr. Maisch GmbHr119.aq.Cząstki fazy stacjonarnej
Acetonitryl Optima LC/MS gatunek Thermo FisherFSBA955-4
Easy-nLC HPLC Thermo Fisher
LTQ Orbitrap Velos ProThermo Fisher
Triton X-100Sigma-AldrichT8787Detergent niejonowy (100%)
Ogniwa DH5 i alfaThermo FisherKompetentne w przypadku szoku cieplnego

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kolch, W., Pitt, A. Functional proteomics to dissect tyrosine kinase signalling pathways in cancer. Nat Rev Cancer. 10 (9), 618-629 (2010).
  2. Pawson, T., Kofler, M. Kinome signaling through regulated protein-protein interactions in normal and cancer cells. Curr Opin Cell Biol. 21 (2), 147-153 (2009).
  3. Croucher, D. R., et al. Bimolecular complementation affinity purification (BiCAP) reveals dimer-specific protein interactions for ERBB2 dimers. Sci Signal. 9 (436), ra69(2016).
  4. Cassonnet, P., et al. Benchmarking a luciferase complementation assay for detecting protein complexes. Nat Methods. 8 (12), 990-992 (2011).
  5. Rossi, F., Charlton, C. A., Blau, H. M. Monitoring protein-protein interactions in intact eukaryotic cells by beta-galactosidase complementation. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (16), 8405-8410 (1997).
  6. Magliery, T. J., et al. Detecting protein-protein interactions with a green fluorescent protein fragment reassembly trap: scope and mechanism. J Am Chem Soc. 127 (1), 146-157 (2005).
  7. Hu, C. D., Kerppola, T. K. Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis. Nat Biotechnol. 21 (5), 539-545 (2003).
  8. Kubala, M. H., Kovtun, O., Alexandrov, K., Collins, B. M. Structural and thermodynamic analysis of the GFP:GFP-nanobody complex. Protein Sci. 19 (12), 2389-2401 (2010).
  9. Fegan, A., White, B., Carlson, J. C., Wagner, C. R. Chemically controlled protein assembly: techniques and applications. Chem Rev. 110 (6), 3315-3336 (2010).
  10. JoVE Science Education Database. Basic methods in cellular and molecular biology. plasmid purification. J Vis Exp. , (2017).
  11. Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. J Vis Exp. (44), (2010).
  12. Shearer, R. F., et al. The E3 ubiquitin ligase UBR5 regulates centriolar satellite stability and primary cilia formation via ubiquitylation of CSPP-L. Mol Biol Cell. , (2018).
  13. Shannon, P., et al. Cytoscape: A software environment for integrated models of biomolecular interaction networks. Genome Res. 13 (11), 2498-2504 (2003).
  14. Schopp, I. M., et al. Split-BioID a conditional proteomics approach to monitor the composition of spatiotemporally defined protein complexes. Nat Commun. 8, 15690(2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Sk adanie kompleks w bia kowychoddzia ywania bia ko bia kokomplementacja fluorescencyjnaoczyszczanie z u yciem nanociareceptorowa tyrozynowa kinazatransfekcja kom rek HEK293Tobrazowanie konfokalnecharakterystyka proteomiczna

Powiązane artykuły