Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Profilowanie izotopologu kwasów tłuszczowych 13C zapewnia wgląd w troficzny transfer węgla i metabolizm lipidów u konsumentów bezkręgowców

8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57110

⸱

17 kwietnia 2018

 ,  ,  , 
1Ecology, Institute of Biology, Humboldt-Universität zu Berlin

W tym artykule

Podsumowanie

Podejście markerów troficznych kwasów tłuszczowych, tj. asymilacja kwasów tłuszczowych jako całej cząsteczki i transfer do tkanki konsumenckiej bez lub z niewielkimi modyfikacjami, jest utrudnione przez luki w wiedzy na temat metabolizmu kwasów tłuszczowych u małych bezkręgowców glebowych. Profilowanie izotopologiczne jest cennym narzędziem do rozplątywania oddziaływań troficznych.

Streszczenie

Kwasy tłuszczowe (FA) są użytecznymi biomarkerami w ekologii sieci pokarmowej, ponieważ są zazwyczaj asymilowane jako kompletna cząsteczka i przenoszone do tkanek konsumenckich z niewielkimi lub żadnymi modyfikacjami, co pozwala na dietetyczne przekierowywanie między różnymi poziomami troficznymi. Jednak podejście oparte na markerach troficznych FA jest nadal utrudnione ze względu na ograniczoną wiedzę na temat metabolizmu lipidów w faunie glebowej. W badaniu tym wykorzystano całkowicie znakowany kwas palmitynowy (13C16:0, 99 atomów%) jako znacznik w szlakach metabolizmu kwasów tłuszczowych dwóch szeroko rozpowszechnionych glebowych Collembola, Protaphorura fimata i Heteromurus nitidus. W celu zbadania losów i modyfikacji metabolicznych tego prekursora przedstawiono metodę profilowania izotopologicznego, realizowaną za pomocą spektrometrii mas z wykorzystaniem monitorowania pojedynczych jonów. Ponadto opisano eksperyment żywienia laboratoryjnego na wcześniejszym etapie, jak również ekstrakcję i metylację dominujących frakcji lipidowych (lipidy obojętne, fosfolipidy) oraz związany z tym wzór i obliczenia. Profilowanie izotopologiczne nie tylko pozwala na ogólne wzbogacenie 13C w kwasy tłuszczowe pochodzące z prekursora znakowanego 13C, ale także wytwarza wzór izotopologów przekraczających masę jonu macierzystego (tj. jonu cząsteczkowego FA M+) każdego znakowanego FA o jedną lub więcej jednostek masowych (M+1, M+2, M+3, itp.). Wiedza ta pozwala na wyciągnięcie wniosków na temat stosunku trasowania w diecie całkowicie zużytego FA w porównaniu z biosyntezą de novo. Profilowanie izotopologiczne sugeruje się jako użyteczne narzędzie do oceny metabolizmu kwasów tłuszczowych u zwierząt glebowych w celu rozwikłania interakcji troficznych.

Wprowadzenie

W tajemniczym środowisku, takim jak gleba, relacje troficzne są trudne do rozwiązania i dodatkowo ograniczane przez mały rozmiar fauny. W ciągu ostatniej dekady nastąpił postęp w ekologii biochemicznej, w szczególności w wykorzystaniu kwasów tłuszczowych jako biomarkerów do określania strategii żywieniowych fauny glebowej w warunkach polowych1,2,3. Opiera się to na fakcie, że kwasy tłuszczowe z zasobów mogą być włączane do tkanek konsumentów jako całe cząsteczki, proces ten określa się mianem routingu dietetycznego4. Przenoszenie kwasów tłuszczowych zostało zgłoszone na trzech poziomach troficznych, tj. z grzybów na nicienie do Collembola5. Ostatnio fauna drapieżna była brana pod uwagę6,7 i opublikowano pierwsze opinie na temat kwasów tłuszczowych jako markerów troficznych w glebowych sieciach pokarmowych8,9.

Bardziej szczegółowe informacje na temat oddziaływań troficznych uzyskuje się za pomocą sondowania stabilnych izotopów kwasów tłuszczowych (FA-SIP). Określenie proporcji 13C/12C w kwasach tłuszczowych w diecie i konsumentach może przypisać powiązania binarne i oszacować związany z tym przepływ węgla, a także zostało zastosowane w lądowych, słodkowodnych i morskich sieciach pokarmowych10,11,12,13. Podstawowym założeniem jest to, że kwasy tłuszczowe kierowane w diecie nie podlegają procesom enzymatycznym; w związku z tym ich sygnał 13C, tj. stosunek 13C do 12C kwasu tłuszczowego u konsumenta jest podobny do tego w diecie1. Jednak w systemach wodnych odnotowano stopniowe zubożenie sygnatury 13C w górę łańcucha pokarmowego, co utrudnia szerokie zastosowanie FA-SIP w badaniach troficznych14,15,16. Co więcej, wiedza na temat metabolizmu lipidów u większości bezkręgowców w lądowych sieciach pokarmowych jest nadal ograniczona.

Zrozumienie szlaków metabolizmu lipidów u konsumentów jest niezbędne do wykorzystania markerów troficznych kwasów tłuszczowych jako środków do określenia ilościowego przepływu węgla w ekologii sieci pokarmowej. Mając to na uwadze, obiecującą metodą jest profilowanie izotopologii 13C, które w zasadzie może być stosowane do badania metabolizmu węgla w dowolnym systemie biologicznym17. Po wprowadzeniu substratu węglowego znakowanego 13C, rozkład 13C w sieci metabolicznej jest możliwy do prześledzenia, ponieważ produkty przemiany materii wytwarzane u konsumenta wykazują specyficzny rozkład izotopologów. Można to ocenić za pomocą ilościowej spektroskopii rezonansu metabolizmu jądrowego18,19 lub spektrometrii mas20,21, przy czym ta ostatnia jest preferowana w próbkach biologicznych o niskiej biomasie ze względu na wyższą czułość.

Chociaż profilowanie izotopologiczne zostało z powodzeniem zastosowane do aminokwasów i dostarczyło wglądu w metabolizm węgla in vivo patogenów bakteryjnych17,22,23, jego implementacja w kwasach tłuszczowych pozostaje w tyle. Pierwszą szczegółową analizę losu stabilnego izotopu znakowanego prekursorem kwasu tłuszczowego, jego trasowania w diecie lub degradacji poprzez β-utlenianie u konsumentów bezkręgowców glebowych przeprowadzili niedawno Menzel i wsp.24. Tutaj przedstawiono podstawy metodologiczne eksperymentów z inkorporacją z kwasami tłuszczowymi znakowanymi 13C, a następnie analizę izotopologiczną kluczowych potomków częstych bezkręgowców glebowych, Collembola. Te mikrostawonogi są dobrą grupą modelową, ponieważ stanowią ważne składniki sieci pokarmowej gleby i są dobrze zbadane pod kątem ich markerów troficznych kwasów tłuszczowych8,25.

Zrozumienie szlaków metabolizmu lipidów u konsumentów jest niezbędne do wykorzystania markerów troficznych kwasów tłuszczowych jako środków do określenia ilościowego przepływu węgla w ekologii sieci pokarmowej. Niniejszy protokół zawiera projekt i konfigurację laboratoryjnego eksperymentu żywieniowego oraz procedury biochemiczne ekstrakcji i metylacji dominujących frakcji lipidów (obojętnych lipidów, fosfolipidów) z Collembola. Pokazano, w jaki sposób skład izotopologiczny kwasów tłuszczowych jest analizowany za pomocą spektrometrii mas oraz opisano powiązany wzór i obliczenia. Procedura ta powoduje: (i) stosunek izotopologiów przekraczających masę jonu macierzystego (tj. jonu cząsteczkowego kwasu tłuszczowego M+) o jedną lub więcej jednostek masowych (M+1, M+2, M+3 itd.) oraz (ii) całkowite wzbogacenie 13C w kwasy tłuszczowe pochodzące z prekursora znakowanego 13C. Chociaż podejście to jest stosowane w przypadku Collembola, można je ogólnie zastosować do każdej innej interakcji drapieżnik-ofiara, zakładając, że są one zdolne do hodowli w wystarczającej ilości w kontrolowanych warunkach, aby zapewnić pomyślne przyjęcie etykiety i późniejszą weryfikację.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Opisany protokół nie podlega kompetencjom komisji ds. etyki badań na zwierzętach. Jednakże w przypadku adaptacji opisanych protokołów do badań na zwierzętach wyższych, należy upewnić się, że instytucjonalna komisja ds. etyki badań na zwierzętach zatwierdziła protokół postępowania ze zwierzętami.

1. Hodowla zwierząt

UWAGA: Wszystkie opisane kroki eksperymentalne opierają się na uznanych protokołach26,27,28. Bioanalizy laboratoryjne wymagają ciągłych dostaw organizmów łatwych w hodowli. W niniejszym przypadku wykorzystano gatunki Collembola Protaphorura fimata (Gisin, 1952) oraz Hetermurus nitidus (Templeton, 1835). Oba gatunki są łatwe w utrzymaniu jako wydajne kultury laboratoryjne karmione drożdżami piekarniczymi.

  1. W plastikowych mikrokosmosach z dopasowanymi pokrywami (średnica 7 cm, wysokość 4,5 cm) umieścić mieszaninę węgla aktywnego, gipsu budowlanego i wody destylowanej, aby zapewnić silnie wilgotne podłoże rozrodcze (Rysunek 1A).
    1. Podczas przygotowywania mikrokosmosów należy zmieszać odpowiednią ilość podłoża, np. na 10 mikrokosmosów w jednej partii. W naczyniu do gipsu wymieszać 9 części gipsu budowlanego (225 g) i 1 część suchego węgla aktywnego (25 g), ostrożnie dodać około 10 części wody destylowanej (250 mL) i pozostawić na 5 minut w temperaturze pokojowej bez mieszania.
    2. Mieszać łyżką laboratoryjną z umiarkowaną prędkością w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara, aby uniknąć pęcherzyków powietrza, aż do uzyskania gęstej, zupowatej konsystencji. Natychmiast przelać do mikrokosmosów do wysokości około 1 cm.
    3. Wygładzić gips poprzez delikatne opukiwanie o blat i obracanie. Należy zauważyć, że otwory (przypadkowe produkty pęcherzyków powietrza) i bruzdy (celowo dodane sterylną szpatułką) mogą zachęcać płodne Collembola do składania w nich jaj. W niniejszym badaniu zrezygnowano z otworów i bruzd na rzecz uzyskania tych samych, powtarzalnych warunków. Jednakże, w celach demonstracyjnych Rysunek 1B przedstawia niektóre otwory.
    4. Pozostawić do wyschnięcia przez około 1 - 2 dni w temperaturze pokojowej; inkubacja w 60 °C może skrócić ten czas do 1 - 2 h.
    5. Przed użyciem nawilżyć mikrokosmosy, dodając wodę z kranu za pomocą pipety, aż podłoże stanie się lekko wilgotne. Utrzymywać mikrokosmos w stanie wilgotnym poprzez regularne dodawanie wody destylowanej, ponieważ Collembola mają miękką kutykulę i są podatne na wysychanie.
  2. Przenieść Collembola na gipsową podstawę za pomocą prostej rurki ssącej, tj. długiej rurki silikonowej o długości około 25 cm z końcówką pipety wyposażoną w małą siatkę, aby zapobiec zassaniu zwierząt do rurki. Alternatywnie można przenieść zwierzęta, pozwalając im przyczepić się do włosia małego pędzla.
  3. Przenieść (patrz krok 1.2) 30 świeżo wyklutych Collembola do nowych mikrokosmosów i dostarczyć granulowany suchy drożdże piekarskie jako pokarm (około końcówki noża) (Rysunek 1B); odnawiać co najmniej dwa razy w tygodniu. Zaplanować trzy niezależne powtórzenia na każdy dzień pobierania próbek; w niniejszym badaniu były to dni 0 - 7 i 14. Inkubować w 15 °C w ciemności. Utrzymywanie stałej temperatury jest niezbędne, ponieważ kwasy tłuszczowe są modyfikowane przez metabolizm zwierząt w celu zaspokojenia wymagań dotyczących płynności błon.
  4. Karmić Collembola drożdżami piekarskimi przez cztery tygodnie przed rozpoczęciem eksperymentów z ekspozycją, aby uzyskać jednorodny sygnał i wzorzec 13C/12C w kwasach tłuszczowych. Używać rurki ssącej lub pędzla, aby regularnie usuwać wszystkie jaja (Rysunek 1C), pellety fekaliów i egzuwie, ponieważ zwierzęta mogą się nimi żywić, zmieniając tym samym swój profil lipidowy.

Układ szalki Petri przedstawiający drobne organizmy i materiały; zdjęcia makro do badania behawioralnego.
Rysunek 1: Hodowla Collembola. (A) Mikrokosmos wypełniony podłożem hodowlanym, będącym wysuszoną mieszaniną gipsu paryskiego, węgla aktywnego i wody destylowanej. (B) oraz (C) Reprezentatywny okaz z hodowli Protaphorura fimata; należy zwrócić uwagę na małe grudki suchych drożdży piekarskich stosowanych jako źródło pożywienia oraz tworzących otwory w podłożu hodowlanym (czarna strzałka) (B), a także na dwa jaja (biała strzałka) (C). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

2. Etykietowanie diety, pobieranie materiału i przygotowanie próbek

  1. Znakowanie
    1. Cztery tygodnie po ustanowieniu kultur Collembola, umieść po 30 osobników w nowych mikrokosmosach i inkubuj w temperaturze 15 °C w ciemności.
    2. Wprowadź znakowanie pulsacyjne, podając im drożdże piekarskie zawierające całkowicie znakowany 13C kwas palmitynowy (13C16:0, 99 atom%), mieszając znakowany 13C kwas palmitynowy z drożdżami piekarskimi za pomocą szpatułki w stosunku 0,5:1, np. 5 g 13C16:0 i 10 g suchych drożdży piekarskich. Nałóż ilość wielkości czubka noża na każdy mikrokosmos.
    3. Po 6 h zastąp ten znakowany pokarm całkowicie nieznakowanymi drożdżami piekarskimi.
  2. Dalsza hodowla
    1. W trakcie eksperymentu odnawiaj dietę drożdżową co trzy dni, dodając ilości większe niż te, które Collembola spożyją w tym okresie. Co najważniejsze, używaj rurki ssącej lub pędzelka, aby regularnie usuwać jaja Collembola, pellety fekaliów i egzuviae, aby zapewnić zwierzętom żywienie wyłącznie dostarczonym pokarmem.
  3. Zbiór materiału
    1. Próbkuj mikrokosmosy metodą destrukcyjną codziennie do dnia 7. Następnie w dniu 14 pobierz trzy niezależne powtórzenia w każdym czasie próbkowania; możliwe są różne czasy próbkowania.
    2. Przygotuj szklane probówki o pojemności 10 mL wyposażone w zakrętki pokryte Teflonem, po jednej dla każdej próbki. Wcześniej umyj te probówki w myjce do szkła laboratoryjnego i przepłucz je dwukrotnie wodą dejonizowaną. Na koniec, aby usunąć wszelkie ślady zanieczyszczeń hydrofobowych, przemyj je dwukrotnie, dodając 2 mL chloroformu (klasy HPLC), wymieszaj intensywnie na vortexie i odlej rozpuszczalnik.
    3. W przypadku próbek kontrolnych (dzień 0), pobierz 3 grupy po 30 nieeksponowanych osobników Collembola z prekultur jako próbki z dnia 0.
    4. W przypadku próbek eksponowanych (dzień 1 i kolejne), pobierz dla próbek dziennych w każdym przypadku 3 grupy po 30 eksponowanych osobników Collembola z kultur karmionych pośrednio mieszaniną znakowanego 13C kwasu palmitynowego i drożdży piekarskich.
    5. Zapisz masę świeżą Collembola za pomocą ultramikrowagi. Przenieś zwierzęta za pomocą aspiratora lub pędzelka do odpowiednich naczyń wagowych. Aby zapewnić łatwą manipulację osobnikami Collembola podczas ważenia w naczyniach wagowych, schłodź zwierzęta szokowo wcześniej (-80 °C przez 2 h). Alternatywnie, strumień CO2 przez 10 min może bezpiecznie ogłuszyć zwierzęta.
  4. Bezpośrednio po ważeniu ostrożnie umieść zwierzęta z naczyń wagowych w szklanych probówkach o pojemności 10 mL. Napełnij probówki 1 mL metanolu (klasy HPLC) i przechowuj w temperaturze -20 °C do czasu analizy.
    UWAGA: Od tego etapu unikaj manipulowania próbkami przy użyciu sprzętu plastikowego, ponieważ stosowane są rozpuszczalniki organiczne; zamiast tego używaj dozowników i pipet odpowiednich dla rozpuszczalników, a także naczyń szklanych.

3. Ekstrakcja lipidów z tkanki zwierzęcej i metanoliza

  1. Przygotować trzy szklane probówki (wyposażone w nakrętki z teflonową powłoką) na każdą partię, zawierające 1 ml metanolu jako próbki ślepe. Ważne jest, aby jakikolwiek rozpuszczalnik stosowany w niniejszym protokole dodawać lub przenosić wyłącznie za pomocą pipet szklanych lub dozowników odpornych na rozpuszczalniki, wypłukanych chloroformem/metanolem.
  2. Na początku procesu ekstrakcji lipidów należy odparować metanol zastosowany do przechowywania (lub do prób ślepych); zaleca się użycie kompaktowego laboratoryjnego wirnikowego koncentratora próżniowego (RVC) wyposażonego w pompę próżniową i pułapkę niskotemperaturową. Otwarte probówki należy przenieść do RVC i odparowywać do suchości w temperaturze 50 °C or ciśnienie próżniowe 200 hPa przez 20 min.
  3. Do każdej próbki (łącznie z próbkami ślepymi) dodać 5 ml rozpuszczalnika do ekstrakcji jednofazowej (chloroform/metanol/0,05 M bufor fosforanowy 1:2:0,8, pH 7,4) i przeprowadzić ekstrakcję lipidów z Collembolan w temperaturze pokojowej, wytrząsając próbki przez noc (~ 200 obr./min).
  4. Przenieść rozpuszczalnik do nowych probówek i ponownie wyekstrahować próbki, wstrząsając przez 3 h z dodatkowymi 2,5 ml rozpuszczalnika do ekstrakcji. Następnie połączyć ekstrakty z obu etapów; zaleca się użycie szklanych pipet Pasteura. Dodać 0,8 ml chloroformu i 0,8 ml wody destylowanej, a następnie wymieszać i wirować z przyspieszeniem 2000 g przy 20 °C przez 5 min. Na koniec pozostawić próbki na 5 min w celu rozdzielenia fazy wodnej i chloroformowej.
  5. W celu analizy profilu kwasów tłuszczowych należy rozdzielić całkowite lipidy komórkowe Collembola na frakcje lipidów obojętnych, glikolipidów i fosfolipidów.
    1. Dla każdej próbki przygotować kolumnę z kwasem krzemowym (kolumna komercyjna zawierająca 0,5 g kwasu krzemowego, wielkość ziarna 100-200 µm, patrz Tabela materiałów) poprzez dodanie 1 ml chloroformu (kondycjonowanie). Aby przyspieszyć ten proces, należy zamontować kolumny na bloku próżniowym, powszechnie stosowanym w chromatografii do ekstrakcji do fazy stałej. Nie należy używać igieł nylonowych; nad probówkami należy zastosować elementy ze stali nierdzewnej.
    2. Po przepłynięciu przez kolumnę chloroformu użytego do kondycjonowania, należy przenieść całą dolną fazę chloroformową każdej próbki do osobnej kolumny. Aby uprościć tę procedurę, można wcześniej usunąć górną fazę wodną. Należy używać szklanych pipet Pasteura, dbając jednocześnie o to, aby kolumny nie wyschły.
    3. Kolejno elueuj frakcje lipidowe za pomocą 5 ml chloroformu (w tym kwasy tłuszczowe lipidów neutralnych, NLFA), 10 ml acetonu (glikolipidy – nieanalizowane w tym projekcie) oraz 5 ml metanolu (w tym kwasy tłuszczowe fosfolipidów, PLFA). Każdą frakcję zbieraj do osobnych szklanych naczyń.
    4. Po zakończeniu ekstrakcji odparować chloroform (NLFA) i metanol (PLFA) za pomocą koncentratora próżniowego (RVC). Przenieść otwarte probówki do RVC i odparowywać do sucha przez ok. 90 min w 60 °C or pod próżnią 24 hPa.
  6. Rozpocząć zmydlanie lipidów (frakcje NLFA i PLFA) zgodnie z protokołem opracowanym przez Welcha (1991)29 z dodatkiem 1 ml roztworu wodorotlenku sodu w metanolu (45 g wodorotlenku sodu, 150 ml metanolu i 150 ml wody destylowanej), a następnie inkubować w 100 °C przez 30 min w kąpieli wodnej. Schładzać próbkę w wodzie z lodem przez 2 min, a następnie odstawić próbki na blat i kontynuować pracę w temperaturze pokojowej.
  7. Do każdej próbki, w tym do prób ślepych, należy dodać standard wewnętrzny. Należy wybrać kwas tłuszczowy, który nie występuje powszechnie w organizmach badanych; należy również zastosować nasycony kwas tłuszczowy, aby zminimalizować straty wynikające z rozszczepienia, oraz wybrać cząsteczkę o średniej długości łańcucha. W wielu zastosowaniach dobrze sprawdza się nieparzysty kwas nonadekanowy (19:0). Zatem należy dodać 30 µL roztworu o stężeniu 0,74 mM w izooktaną. Dokładna ilość jest bardzo istotna – należy wcześniej sprawdzić precyzję pipety za pomocą mikrowagi.
  8. Dodać 2 ml mieszaniny kwasu solnego z metanolem (zmieszać 325 ml kwasu solnego 6,0 N z 275 ml metanolu), inkubować w 80 °C przez 10 min w kąpieli wodnej, a następnie szybko schłodzić na lodzie przez 2 min. Ten etap jest wrażliwy na czas i temperaturę; należy stosować 80 ± 1 °C oraz 10 ± 1 min. Sprawdzić, ile próbek można jednocześnie umieścić w kąpieli wodnej, aby utrzymać 80 °C.
    UWAGA: Procedura ta prowadzi do otrzymania metyloestrów kwasów tłuszczowych (FAME), t. j. anality kwasów tłuszczowych stabilizowane do waporyzacji w chromatografii gazowej.
  9. Na koniec dodać 1,25 ml mieszaniny heksanu i metylu tert-butylu eteru (1:1), delikatnie kołysać przez 10 min, a następnie wirować przy 2000 g przez 5 min. Za pomocą szklanych pipet Pasteura usunąć fazę dolną i zachować fazę górną zawierającą FAME. W celu przemycia próbki dodać 3 ml wodnego roztworu wodorotlenku sodu (10,8 g NaOH rozpuszczone w 900 ml wody destylowanej).
    1. Inkubować w inkubatorze obrotowym, a następnie ponownie odwirować.
  10. Pobierz całą górną fazę lipidową za pomocą szklanej pipety Pasteura i przenieś ją do fiolki do chromatografii gazowej wyposażonej w septę teflonową. Należy unikać przenoszenia nawet niewielkich ilości fazy wodnej, ponieważ spowoduje to problemy podczas pomiaru GC. Zamknij fiolkę i przechowuj w temperaturze -20 °C do czasu analizy.

4. Ilościowe oznaczenie kwasów tłuszczowych metodą GC-FID

  1. Wykorzystaj chromatografię gazową do identyfikacji i oznaczania ilościowego FAME w frakcjach NFLA i PLFA lipidów Collembola (zwierzęcych). Chromatograf gazowy (GC) wyposażony w detektor jonizacji płomieniowej (FID) jest ugruntowanym i sprawdzonym urządzeniem30.
  2. W celu identyfikacji FAME porównaj czas retencji pików w próbce z czasami retencji w standardzie FAME. Są to jakościowe lub ilościowe mieszaniny standardowe kluczowych FAME, obejmujące różnorodne produkty spożywcze i organizmy.
  3. Stosuj mieszaniny standardowe FAME zawierające reprezentatywne FA dla badanej grupy organizmów i diety eksperymentalnej. W przypadku Collembola są to kwasy tłuszczowe charakterystyczne dla eukariotów, np. długołańcuchowe wielonienasycone kwasy tłuszczowe, takie jak kwas arachidonowy (20:4ω6). Przy zastosowaniu drożdży jako diety są to markery grzybowe, takie jak kwas linolowy (18:2ω6). Dobrym wyborem jest tzw. FAME mix, zawierający 37 różnych kwasów tłuszczowych często występujących w materiale zwierzęcym, grzybowym i roślinnym, oraz mieszanina estrów metylowych kwasów bakteryjnych (BAME mix) (patrz Tabela materiałów).
  4. Aby przeprowadzić analizę próbek na GC-FID, ustaw sekwencję w odpowiednim oprogramowaniu urządzenia. Instrukcje znajdują się w podręczniku producenta. Sekwencja rozpoczyna się od zewnętrznych mieszanin standardowych (np. FAME i BAME mix), a następnie następują próbki. Należy pamiętać, że podczas analizy próbek występuje przesunięcie czasu retencji, tzn. niewielkie opóźnienie czasu elucji kwasów tłuszczowych z kolumny GC w każdym cyklu! Należy albo uwzględnić standard co 10th analizę w sekwencji próbek, albo zastosować blokowanie czasu retencji (retention time locking) dla kwasu palmitynowego (16:0).
  5. Dostosuj ustawienia GC w zależności od instrumentu. Poniższy program jest sugerowany dla wysokosprawnej (HP) kolumny kapilarnej (25 m x 0.2 mm i.d., grubość warstwy 0.33 µm). Ustaw objętość wtrysku na 1 µL w trybie splitless i użyj wodoru jako gazu nośnego. Zastosuj program temperaturowy rozpoczynający się od 50 °C (utrzymywany przez 1 min) i wzrastający o 25 °C min-1 do 175 °C, a następnie o 3 °C min-1 do 230 °C (utrzymywany przez 5.7 min).
  6. Oblicz nmol kwasu tłuszczowego na gram świeżej (suchej) masy organizmów, wykorzystując odpowiedź otrzymaną z FID dla każdego FAME, stosując znane ilości dla odpowiedniego kwasu tłuszczowego według następującego wzoru:
    Wzór na stężenie kwasów tłuszczowych; równanie transestryfikacji; metoda analizy chemicznej.
    AFAME: Pole piku odpowiedniego FAME w próbce
    MWFM: Masa cząsteczkowa odpowiedniego FAME w µg/µmol
    CIS: Stężenie standardu wewnętrznego w µg
    AIS: Pole piku standardu wewnętrznego
    mCol: Świeża (sucha) masa odpowiedniej próbki Collembola w g
    1000: Współczynnik przeliczeniowy z µmol na nmol
    cBW: Stężenie odpowiedniego FAME w średniej z odpowiadających mu wartości ślepych w nmol

5. Analiza 13C poprzez profilowanie izotopologów

  1. Do wyznaczenia izotopologów należy użyć systemu GC sprzężonego z detektorem selektywnym masowo (MS) wyposażonego w źródło jonizacji elektronowej (EI).
    1. Należy zastosować polarną kolumnę kapilarną (np. DB 23, CP-Sil 88), ponieważ pozwala ona na dalszą separację nienasyconych kwasów tłuszczowych, nawet tych o tej samej liczbie wiązań podwójnych. Wybór kolumny GC jest kluczowy dla wyników, gdyż determinuje on reprezentatywność jonu cząsteczkowego w kwasach tłuszczowych.
    2. Dla kolumny DB 23 (60 m x 0.25 mm i.d., grubość filmu 0.15 µm) temperaturę pieca należy rozpocząć od 130 °C i zwiększać o 6.5 °C/min do 170 °C. Następnie zwiększyć temperaturę o 3 °C/min do 203 °C i utrzymać przez 1.9 min. Dalej zwiększyć temperaturę o 40 °C/min do 230 °C i utrzymać przez 8.3 min. Temperaturę linii transferowej należy ustawić na 280 °C. Metodę GC należy ponownie dostosować do konkretnego urządzenia.
    3. W przypadku wszystkich kwasów tłuszczowych badanych pod kątem wbudowania 13C należy użyć standardów ilościowych zawierających znane ilości FAME. Standardy te należy umieścić na początku i na końcu każdej serii pomiarowej próbek. Na podstawie tych standardów należy wyznaczyć czasy retencji interesujących nas kwasów tłuszczowych.
    4. Próbki z eksperymentów należy mierzyć, zawsze rozpoczynając od próbek nieoznakowanych, a następnie od prób znakowanych. Należy zastosować stosunek podziału (split ratio) odpowiedni do stężeń próbek, np. 1:12.5. Jeśli instrument na to pozwala, po każdym pomiarze próbki należy zastosować przepłukiwanie wsteczne (backflush) hellem, aby oczyścić kolumnę z pozostałych analitów.
    5. W metodzie GC-MS należy zastosować blokadę czasu retencji (retention time locking), aby akwizycja w trybie SIM nie była podatna na przesunięcia i aby czasy retencji analitów były powtarzalne.
  2. Wbudowanie 13C w jon cząsteczkowy kwasów tłuszczowych należy wyznaczyć za pomocą GC/EI-MS, korzystając z trybu monitorowania wybranych jonów (SIM) urządzenia. Praca w trybie SIM pozwala na wykrywanie specyficznych analitów z większą czułością w porównaniu do trybu pełnego skanowania (full scan).
    1. Najpierw należy wykonać skan wstępny, aby sprawdzić obecne składniki, a następnie uruchomić tryb SIM dla odpowiednich jonów. Dane należy zbierać dla interesujących mas cząsteczkowych, wybierając okna skanowania m/z (grupy SIM) obejmujące czas piku chromatograficznego odpowiedniego kwasu tłuszczowego. Zazwyczaj monitoruje się od dwóch do czterech jonów na analit i okno czasowe.
    2. W celu zwiększenia czułości należy dostosować szybkość skanowania mas i czasy zatrzymania (dwell times — czas poświęcony na analizę każdej masy). Dane najlepszej jakości uzyskuje się przy najniższej możliwej prędkości; ogólną zasadą w trybie SIM jest uzyskanie od 8 do 12 skanów w obrębie piku analitu. Przykładowe ustawienia instrumentu to średni czas zatrzymania na masę 9 ms, czas cyklu 6 s i czas skanowania 175 ms cykl-1.
    3. Należy wykryć jon cząsteczkowy (M+) odpowiedniego kwasu tłuszczowego oraz wszystkie jego izotopologi (M+1, M+2 i tak dalej). Przykłady znajdują się w sekcji Wyniki Reprezentatywne.
    4. Należy zapisać obfitość każdego fragmentu jonowego (izotopologu). Należy pamiętać, że obfitość jonu cząsteczkowego i jego izotopologów jest stosunkowo niska, a jakość analizy ilościowej w dużej mierze zależy od sprawności systemu MS. Przed rozpoczęciem dużej serii próbek (eksperymentu) należy przeprowadzić strojenie (tune) i w razie potrzeby oczyścić źródło jonów.
      UWAGA: W pierwszej kolejności dane te pozwalają na określenie całkowitego wzbogacenia 13C każdego kwasu tłuszczowego przez zużyty prekursor (tutaj 16:0).
    5. Aby przypisać troficzny przepływ węgla, należy wykorzystać proporcję składu izotopowego znakowanych kwasów tłuszczowych względem ich nieoznakowanych odpowiedników. Należy użyć wzoru na atom% z kroku 6.1, aby obliczyć procent znakowanego węgla (procent atomowy, atom%) w odpowiednim kwasie tłuszczowym. Procent 13C w kwasach tłuszczowych Collembola należy porównać pomiędzy zwierzętami znakowanymi (dzień 1 i późniejsze) a nieznakowanymi (dzień 0) jako względną wskazanie przepływu 13C z diety do konsumenta.
    6. Należy przypisać pozycję wbudowania 13C w łańcuch kwasu tłuszczowego. Na podstawie rozkładu izotopologów należy rozróżnić dietetyczną drogę całego znakowanego kwasu tłuszczowego (tutaj 16:0) od wydłużania łańcucha w wyniku metabolizmu lipidów. Podczas gdy asymilacja całej cząsteczki markera zwiększa obfitość izotopologów najdalej oddalonych od jonu macierzystego (M+), np. M+15, M+16, to przy wydłużaniu łańcucha z wykorzystaniem fragmentów C2 znakowanych 13C (13C acetylo-CoA) częściej występują izotopologi bliskie jonowi cząsteczkowemu.

6. Obliczenia wzbogacenia w 13C

  1. Na podstawie rozkładu izotopologów oblicz całkowity procent znakowanego węgla (w atom%) w odpowiednim kwasie tłuszczowym, korzystając z następnej zależności: atom% = (stosunek wbudowanego izotopologu 13C) x (częstość występowania danego izotopologu)
    Obliczenie to, zgodnie z metodą Kuppardt et al.31, wykonuje się następująco: równanie obliczania atom%, ΣNJ=1(J/N)×(AM+J/AT), wzór dla analizy ilościowej
    gdzie N to liczba atomów węgla w kwasie tłuszczowym, J to liczba izotopów 13C, AM+J to obfitość odpowiedniego izotopologu, a AT całkowita obfitość wszystkich izotopologów.
  2. Do obliczeń zsumuj wartości pól powierzchni piku jonu molekularnego (M+) odpowiedniego FA oraz wszystkich izotopologów (M+1, M+2 i następnych), wykrytych w analizie SIM-MS, i przyjmij je za 100% obfitości względnej. Udział każdego wykrytego izotopologu oblicz w prosty sposób, stosując regułę trzech.
  3. Od wartości eksperymentalnych odejmij wartość kontrolną z dnia 0 dla próbek nieznakowanych (naturalne tło 13C), aby uzyskać ostateczne dane odnoszące się wyłącznie do przeprowadzonego zewnętrznego znakowania 13C.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Masa świeża i zawartość lipidów Collembola
W przebiegu opisanego eksperymentu zawartość NLFAs i PLFAs nie uległa znaczącej zmianie w czasie, natomiast masa świeża osobników wzrosła nieznacznie, lecz nieistotnie statystycznie24. Oba parametry wskazują na dobry poziom kondycji fizycznej osobników Collembola. Należy pamiętać o badaniu masy świeżej i zawartości lipidów Collembola w trakcie całego eksperymentu, zgodnie z dniami pobierania próbek do ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Profilowanie izotopologów

Szczegółowa analiza aspektów ilościowych rozkładu 13C w FA wymaga zastosowania najnowocześniejszych technologii w celu określenia podziału węgla w sieciach troficznych. W niniejszej pracy wykorzystano profilowanie izotopologów do oceny stosunków 13C/12C w powszechnych biomarkerach FA w interakcjach troficznych. Metoda ta jest dobrze ugruntowana w analizie aminokwasów za pomocą chromatografii cieczowej (LC-MS) i była st...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Podziękowania

Z wdzięcznością dziękujemy za wsparcie finansowe R. Menzela i L. Ruessa przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (RU RU780/11-1). R. Nehring został ufundowany przez RU 780/10-1. Na koniec jesteśmy niezmiernie wdzięczni dr Hazel Ruvimbo Maboreke za korektę naszego rękopisu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
neoLab-Słoiki okrągłeneoLab2-150669 x 40 mm, 10 op./opakowanie
Aktywowany węglem drzewnymCarl RothX865.1p.a., proszek, nr CAS 7440-44-0
Alabaster DentalRÖ HRICH-GIPSE---http://www.roehrich-gipse.de/dentalgipse.php
ChloroformCarl Roth7331.1HPLC ≥ 99,9 %
MetanolCarl RothP717.1HPLC ≥ 99,9 %
HexanCarl Roth7339.1HPLC ≥ 98 %
tert-butylowy eter metylowy (MTBE)Carl RothT175.1HPLC ≥ 99,5 %
AcetonCarl Roth7328.2HPLC ≥ 99,9 %
NaOHCarl Roth6771.1rocznie ≥ 99 %, w granulkach
di-NatriumhydrogenphosphatCarl RothP030.1p.a. ≥ 99 % , bezwodny
dihydrat fosforanu Na-dihydrogenuCarl RothT879.1rocznie ≥ 99 %
Kwas podchlorowy (6 N)VWR International26,115,000AVS TITRINORM vol. roztwór
Bond Elut (kolumny)Agilent Tech.14102037HF Bond Elut-SI, 500 mg, 3 mL, 50/PK
Prä paratenglä ser DuranGlasgerä tebau Ochs135215Ø 16 x 100 mm, z nakrętką z radełkowanym radełkowaniem i zintegrowaną uszczelką PTFE/silikonową
Supelco 37 Składnik FAME MixSigma-Aldrich47885-U Supelco10  mg/ml w chlorku metylenu, wzorzec analityczny
FlowMeshCarl Roth2796.1Siatka polipropylenowa o grubości około 0,3 mm, z odstępem między pasmami 1 mm
Mieszanka estrów metylowych kwasów bakteryjnych (BAME)Sigma-Aldrich47080-U Supelco10  mg/ml w kapronianu metylu, wzorzec analityczny
Nonadekanian metyluSigma-Aldrich74208wzorzec analityczny ≥ 98,0 %
Kwas heksadekanowy-1-13C (palmitynowy)Larodan Chemikalia wysokowartościowe78-1600GC ≥ 98,0 % (13C: 99,0 %)
RVC 2-25 CDplusMartin Christ Gefrier-trocknungsanlagenKompaktowy koncentrator
midiAlpha 2-4 LDplusMartin Christ Gefrier-trocknungsanlagenKolektor suszący
MZ 2C NTVacuubrand GMBHPompa próżniowa
Roto-Shake GenieScientific IndustriesPołączone urządzenie kołyszące i obrotowe
XP64 MikrokomparatorMettler ToledoSuper precyzyjna waga
GC-System 7890AAgilent Tech.Chromatograf gazowy
7000 GC/MS Triple QuadAgilent Tech.Potrójny spektrometr masowy Quad
Wtryskiwacz serii 7683BAgilent Tech.Nastrzykuje próbki
Heraeus Multifuge 3SR+ThermoScientificWirówka z rotorem probówki 10 ml

Bibliografia

  1. Ruess, L., et al. Application of lipid analysis to understand trophic interactions in soil. Ecology. 86 (8), 2075-2082 (2005).
  2. Ruess, L., et al. Lipid composition of Collembola and their food resources in deciduous forest stands - Implications for feeding strategies. Soil Biology and Biochemistry. 39 (8), 1990-2000 (1990).
  3. Chamberlain, P. M., Bull, I. D., Black, H. I. J., Ineson, P., Evershed, R. P. Fatty acid composition and change in Collembola fed differing diets: identification of trophic biomarkers. Soil Biology and Biochemistry. 37 (9), 1608-1624 (2005).
  4. Stott, A. W., Davies, E., Evershed, R. P., Tuross, N. Monitoring the routing of dietary and biosynthesised lipids through compound-specific stable isotope (delta C-13) measurements at natural abundance. Naturwissenschaften. 84 (2), 82-86 (1997).
  5. Ruess, L., Haggblom, M. M., Langel, R., Scheu, S. Nitrogen isotope ratios and fatty acid composition as indicators of animal diets in belowground systems. Oecologia. 139 (3), 336-346 (2004).
  6. Pollierer, M. M., Scheu, S., Haubert, D. Taking it to the next level: Trophic transfer of marker fatty acids from basal resource to predators. Soil Biology and Biochemistry. 42 (6), 919-925 (2010).
  7. Ferlian, O., Scheu, S., Pollierer, M. M. Trophic interactions in centipedes (Chilopoda, Myriapoda) as indicated by fatty acid patterns: Variations with life stage, forest age and season. Soil Biology and Biochemistry. 52, 33-42 (2012).
  8. Ruess, L., Chamberlain, P. M. The fat that matters: Soil food web analysis using fatty acids and their carbon stable isotope signature. Soil Biology and Biochemistry. 42 (11), 1898-1910 (2010).
  9. Traugott, M., Kamenova, S., Ruess, L., Seeber, J., Plantegenest, M. Empirically characterising trophic networks: What emerging DNA-based methods, stable isotope and fatty acid analyses can offer. Adv Ecol Res. 49, 177-224 (2013).
  10. Hammer, B. T., Fogel, M. L., Hoering, T. C. Stable carbon isotope ratios of fatty acids in seagrass and redhead ducks. Chemical Geology. 152 (1-2), 29-41 (1998).
  11. Budge, S. M., Iverson, S. J., Koopman, H. N. Studying trophic ecology in marine ecosystems using fatty acids: A primer on analysis and interpretation. Marine Mammal Science. 22 (4), 759-801 (2006).
  12. Haubert, D., et al. Trophic structure and major trophic links in conventional versus organic farming systems as indicated by carbon stable isotope ratios of fatty acids. Oikos. 118 (10), 1579-1589 (2009).
  13. Ngosong, C., Raupp, J., Richnow, H. H., Ruess, L. Tracking Collembola feeding strategies by the natural 13C signal of fatty acids in an arable soil with different fertilizer regimes. Pedobiologia. 54 (4), 225-233 (2011).
  14. Bec, A., et al. Assessing the reliability of fatty acid-specific stable isotope analysis for trophic studies. Methods in Ecology and Evolution. 2 (6), 651-659 (2011).
  15. Gladyshev, M. I., Makhutova, O. N., Kravchuk, E. S., Anishchenko, O. V., Sushchik, N. N. Stable isotope fractionation of fatty acids of Daphnia fed laboratory cultures of microalgae. Limnologica. 56 (Supplement C. 56 (Supplement C), 23-29 (2016).
  16. Gladyshev, M. I., Sushchik, N. N., Kalachova, G. S., Makhutova, O. N. Stable isotope composition of fatty acids in organisms of different trophic levels in the Yenisei river. PLoS One. 7 (3), e34059(2012).
  17. Eisenreich, W., Dandekar, T., Heesemann, J., Goebel, W. Carbon metabolism of intracellular bacterial pathogens and possible links to virulence. Nature Reviews Microbiology. 8 (6), 401-412 (2010).
  18. Eylert, E., Bacher, A., Eisenreich, W. NMR-based isotopologue profiling of microbial carotenoids. Methods Mol Biol. 892, 315-333 (2012).
  19. Garton, N. J., O'Hare, H. M. Tuberculosis: feeding the enemy. Chemical Biology. 20 (8), 971-972 (2013).
  20. Rosenblatt, J., Chinkes, D., Wolfe, M., Wolfe, R. R. Stable isotope tracer analysis by GC-MS, including quantification of isotopomer effects. Am J Physiol. 263 (3), E584-E596 (1992).
  21. Fernandez, C. A., Des Rosiers, C., Previs, S. F., David, F., Brunengraber, H. Correction of 13C mass isotopomer distributions for natural stable isotope abundance. J Mass Spectrom. 31 (3), 255-262 (1996).
  22. Heuner, K., Eisenreich, W. The intracellular metabolism of legionella by isotopologue profiling. Methods Mol Biol. 954, 163-181 (2013).
  23. Willenborg, J., et al. Characterization of the pivotal carbon metabolism of Streptococcus suis serotype 2 under ex vivo and chemically defined in vitro conditions by isotopologue profiling. J Biol Chem. 290 (9), 5840-5854 (2015).
  24. Menzel, R., Ngosong, C., Ruess, L. Isotopologue profiling enables insights into dietary routing and metabolism of trophic biomarker fatty acids. Chemoecology. 27 (3), 101-114 (2017).
  25. Buse, T., Ruess, L., Filser, J. New trophic biomarkers for Collembola reared on algal diets. Pedobiologia. 56 (3), 153-159 (2013).
  26. Hutson, B. R. Effects of variations of the plaster-charcoal culture method on a Collembolan, Folsomia candida. Pedobiologia. 18, 138-144 (1978).
  27. Fountain, M. T., Hopkin, S. P. Folsomia candida (Collembola): a "standard" soil arthropod. Annu Rev Entomol. 50, 201-222 (2005).
  28. ISO, I. O. fS. Soil Quality-Inhibition of reproduction of Collembola (Folsomia candida) by soil pollutants. , ISO 11267:1999 (1999).
  29. Welch, D. F. Applications of cellular fatty acid analysis. Clin Microbiol Rev. 4 (4), 422-438 (1991).
  30. Dodds, E. D., McCoy, M. R., Rea, L. D., Kennish, J. M. Gas chromatographic quantification of fatty acid methyl esters: flame ionization detection vs. electron impact mass spectrometry. Lipids. 40 (4), 419-428 (2005).
  31. Kuppardt, S., Chatzinotas, A., Kastner, M. Development of a fatty acid and RNA stable isotope probing-based method for tracking protist grazing on bacteria in wastewater. Appl Environ Microbiol. 76 (24), 8222-8230 (2010).
  32. Zhang, X., He, H., Amelung, W. A GC/MS method for the assessment of 15N and 13C incorporation into soil amino acid enantiomers. Soil Biology and Biochemistry. 39 (11), 2785-2796 (2007).
  33. Vetter, W., Thurnhofer, S. Analysis of fatty acids by mass spectrometry in the selected ion monitoring mode. Lipid Technol. 19 (8), 184-186 (2007).
  34. Thurnhofer, S., Vetter, W. A gas chromatography/electron ionization-mass spectrometry-selected ion monitoring method for determining the fatty acid pattern in food after formation of fatty acid methyl esters. J Agric Food Chem. 53 (23), 8896-8903 (2005).
  35. Haubert, D., Haggblom, M. M., Scheu, S., Ruess, L. Effects of fungal food quality and starvation on the fatty acid composition of Protaphorura fimata (Collembola). Comparative Biochemistry and Physiology B-Biochemistry & Molecular Biology. 138 (1), 41-52 (2004).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Profilowanie izotopologów kwasów tłuszczowychanaliza z użyciem znacznika węgla-13szlaki metabolizmu lipidówbezkręgowce konsumenci glebyekstrakcja lipidów neutralnychfosfolipidowe kwasy tłuszczowemonitorowanie wybranych jonówanaliza chromatograficzna gazowadetekcja wzorców izotopologów
Profilowanie izotopologu kwasów tłuszczowych 13C zapewnia wgląd w troficzny transfer węgla i metabolizm lipidów u konsumentów bezkręgowców
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.