Artykuł metodologiczny

Wysuszone plamy krwi i surowicy jako przydatne narzędzie do przechowywania próbek w celu oceny biomarkerów raka

10.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57113

⸱

11 czerwca 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Osteoncology and Rare Tumors Center, Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, Meldola, Italy, 2Unit of Biostatistics and Clinical Trials, Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, Meldola, Italy, 3Biosciences Laboratory, Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, Meldola, Italy, 4Department of Oncology, Bugando Medical Center, Mwanza, Tanzania

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje prostą i użyteczną metodę przechowywania krwi obwodowej i surowicy/osocza do dalszych analiz, takich jak ocena polimorfizmu pojedynczego nukleotydu (SNP) i test ELISA.

Streszczenie

Jakość próbki krwi jest kluczowa dla zapewnienia dokładnych analiz, takich jak PCR w czasie rzeczywistym lub ELISA. Prawidłowe przechowywanie materiałów biologicznych jest punktem wyjścia do osiągnięcia powtarzalnych i wiarygodnych wyników. Wszystkie próbki powinny być traktowane w ten sam sposób od pobrania krwi do przechowywania. W zależności od analiz, które mają być wykonane, próbki krwi pełnej i surowicy powinny być przechowywane w temperaturze -20 °C lub -80 °C do czasu użycia. Próbki krwi/surowicy powinny być również porcjowane, aby uniknąć wielokrotnego zamrażania i rozmrażania. Kolejną ważną kwestią są warunki pobierania próbek podczas transportu z jednego laboratorium do drugiego. Jeśli suchy lód nie jest dostępny lub wysyłka trwa dłużej niż kilka dni, potrzebne są alternatywne podejścia. Jedną z opcji jest użycie bibuły filtracyjnej do pobierania krwi. W tym miejscu proponujemy metodę pobierania próbek krwi i surowicy, która wykorzystuje suche plamki krwi (DBS) i wysuszone plamy surowicy (DSS). Opracowaliśmy procedurę ekstrakcji DNA z DBS w celu dalszej oceny niektórych polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (SNP) za pomocą PCR w czasie rzeczywistym. Zoptymalizowaliśmy również test ELISA, zaczynając od białek eluowanych z DSS. Metoda ta może być stosowana z innymi testami ELISA lub procedurami oceniającymi białka.

Wprowadzenie

Głównym celem badań nad biomarkerami raka jest identyfikacja nowych parametrów biologicznych, które mogą być wykorzystane do diagnozy, przewidywania rokowania pacjenta oraz do określenia, czy pacjent odpowie na określone leczenie. Ten obszar badań ma zasadnicze znaczenie dla odkrywania innowacyjnych metod leczenia nowotworów i odgrywa kluczową rolę w leczeniu dostosowanym do jego potrzeb.

Procedury przeprowadzane podczas każdego etapu identyfikacji i walidacji biomarkerów muszą być wiarygodne i powtarzalne. Podstawą sukcesu badań translacyjnych jest prawidłowe przechowywanie próbek biologicznych, takich jak krew i surowica. Jest to pierwszy krok w kierunku uzyskania wysokiej jakości materiału biologicznego, który można wykorzystać do przeprowadzania eksperymentów biologii molekularnej lub testów białek.

Często potrzebne są wieloośrodkowe badania, aby zrekrutować wystarczającą liczbę pacjentów, aby uzyskać solidne dane. Nie wszystkie instytuty są w stanie przechowywać próbki w temperaturze -80 °C lub wysyłać je w suchym lodzie do innych międzynarodowych ośrodków. Użycie bibuły filtracyjnej do pobierania krwi jest prostą metodą przechowywania krwi i surowicy i nie wymaga natychmiastowego zamrażania próbek1,2. Na papierze można dostrzec kroplę krwi lub surowicy, pozostawić do wyschnięcia na noc, a następnie przechowywać do 14 dni w temperaturze pokojowej1,2. Daje to naukowcom czas na wysłanie próbek do innych laboratoriów. Wykorzystanie suszonych plam krwi (DBS) i suszonych plam surowicy (DSS) mogłoby zatem uprościć współpracę między instytutami w krajach rozwiniętych i rozwijających się.

Biorąc pod uwagę łatwość użycia, próbkowanie DBS jest szeroko stosowane w kilku rodzajach testów do dalszych analiz serologicznych lub genetycznych. Na przykład w przeszłości DBS były często używane do badań przesiewowych w kierunku HIV w krajach rozwijających się1,2,3,4,5. Kolejną zaletą tej metody przechowywania jest to, że próbki krwi mogą być pobierane z nakłuć palców, co umożliwia jej wykorzystanie do badań przesiewowych noworodków 6,7,8. Łatwa obsługa i transport próbek to kolejne zalety DBS, zwłaszcza w przypadku próbek pobieranych w odległych lokalizacjach, w których nie ma sprzętu laboratoryjnego. W poprzedniej publikacji użyliśmy DBS i DSS do przetestowania witaminy D i białka wiążącego witaminę D (DBP) u szeregu pacjentów rasy kaukaskiej i afrykańskiej9. Nasi afrykańscy koledzy nie byli w stanie uzyskać suchego lodu. Aby porównać markery biologiczne w celu zrozumienia różnic w szlaku witaminy D między dwiema populacjami etnicznymi, udoskonaliliśmy procedurę, wykorzystując dopasowane próbki przechowywane w standardowych warunkach i na bibule filtracyjnej. Po zoptymalizowaniu procedury DBS/DSS byliśmy w stanie przeanalizować DBP i witaminę D w surowicy pacjentów w obu kohortach. Oceniliśmy również szereg polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (SNP) po ekstrakcji DNA z krwi pełnej dla osób rasy kaukaskiej i z DBS dla Afrykanów9. Obecny protokół pozwala na przechowywanie wysokiej jakości próbek krwi w temperaturze pokojowej bez wpływu na różne rodzaje dalszych analiz, od biologii molekularnej po testy ELISA. Jest zalecany do stosowania do zarządzania materiałem biologicznym w badaniach wieloośrodkowych lub dla ośrodków, które nie posiadają zaplecza do standardowych warunków przechowywania. Poniższy protokół stanowi kulminację tych zoptymalizowanych procedur.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Krew obwodowa i surowica zostały pobrane i przechowywane od zdrowych dawców i pacjentów, którzy wyrazili pisemną świadomą zgodę na udział w badaniu. Protokół badania został zatwierdzony przez lokalną Komisję Etyki zgodnie ze standardami etycznymi określonymi w Deklaracji Helsińskiej z 1964 roku.

1. Przechowywanie krwi w DBS

  1. Pobieranie próbek krwi
    1. Zebrać 3 ml próbki krwi obwodowej w probówce o pojemności 3 ml z 5,4 mg kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA).
      UWAGA: Krew obwodową należy przechowywać w postaci DBS tak szybko, jak to możliwe i w ciągu 8 godzin.
    2. Wpisz numer kodu pacjenta w prawym dolnym rogu karty oszczędnościowej.
    3. Ostrożnie ponownie wymieszać krew za pomocą pipety o pojemności 5 ml.
  2. Plamienie krwi na DBS
    1. Odpipetować i przenieść jedną plamkę krwi (50 μl) na kartę oszczędnościową (tabela materiałów) za pomocą końcówki o pojemności 50–200 μl.
    2. Powtórz krok 1.2.1, aby uzyskać w sumie 3–5 plamek krwi. Wyrzuć starą końcówkę i weź nową dla każdej porcji krwi.
    3. Pozostaw DBS do wyschnięcia na noc w temperaturze pokojowej w pozycji poziomej na otwartej, niechłonnej powierzchni, unikając bezpośredniego światła słonecznego. Pozostaw otwartą pokrywę karty oszczędnościowej, aby ułatwić suszenie krwi.
      UWAGA: Wszelkie cząstki stałe w powietrzu lub kurzu podczas tego etapu suszenia nie mają wpływu na dalsze zastosowania.
    4. Przechowuj kartę w temperaturze pokojowej w plastikowej torbie ze środkiem osuszającym do czasu użycia.

2. Ekstrakcja DNA począwszy od DBS zgodnie z arkuszem danych zestawu do ekstrakcji DNA (sekcja dla suchych plam krwi)

  1. Przygotowanie próbki
    1. Użyj 3 zasuszonych plam krwi z karty. Wytnij każdą z wysuszonych plam krwi z karty i oddziel je od karty pęsetą. Pokrój oddzielone wysuszone plamy krwi na małe kawałki (średnica około 1 mm).
    2. Umieść małe kawałki w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml.
  2. Mineralizacja próbki
    1. Dodać 180 μl buforu do lizy 1 dostarczonego w zestawie (tabela materiałów) do probówki. Dodać 20 μl proteinazy K. Nie mieszać buforu do lizy 1 z proteinazą k przed pipetowaniem do probówki o pojemności 1,5 ml z kartą z plamami krwi. Wymieszaj przez wirowanie.
    2. Umieścić probówkę w termoinkubatorze i inkubować w temperaturze 56 °C przez 60 minut. Jeśli termoinkubator nie jest wyposażony w wytrząsarkę, należy mieszać próbkę co 10–15 minut przez co najmniej 10 sekund, uważając, aby nie dopuścić do spadku temperatury próbki. Krótko odwirować probówki, aby usunąć krople z pokrywki.
  3. Etap prania
    1. Dodać 200 μl buforu do lizy 2 (tabela materiałów) i wirować przez 10 s.
    2. Umieścić probówki w termomikserze lub podgrzewanym inkubatorze orbitalnym i inkubować w temperaturze 70 °C przez 10 minut. Jeżeli termoinkubator nie jest wyposażony w wytrząsarkę, należy wirować próbki raz przez co najmniej 10 sekund, uważając, aby nie dopuścić do spadku temperatury próbek.
    3. Powtórz krok 2.3.1. Przenieść 400 μl lizatu z probówki o pojemności 1,5 ml do kolumny elucyjnej (tabela materiałów). Odwirować kolumnę o stężeniu 6 000 x g przez 1 min.
    4. Umieścić kolumnę elucyjną w nowej probówce zbiorczej o pojemności 2 ml i wyrzucić starą.
    5. Dodać 500 μl buforu do przemywania 1 (tabela materiałów) i odwirowywać przy 6 000 x g przez 1 min.
    6. Umieścić kolumnę w nowej probówce zbiorczej o pojemności 2 ml i wyrzucić starą.
    7. Dodać 500 μl buforu do płukania 2 (tabela materiałów) i odwirować przy 6 000 x g przez 1 min.
    8. Umieścić kolumnę w nowej probówce zbiorczej o pojemności 2 ml i wyrzucić starą.
    9. Wirować przy 20 000 x g przez 3 minuty, aby wysuszyć membranę.
  4. Etap elucji
    1. Umieścić kolumnę w nowej probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml i wyrzucić probówkę zbiorczą.
    2. Umieść 50 μl wody destylowanej na środku membrany. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Odwirować probówkę o masie 20 000 x g przez 1 minutę. Zebrać eluat i ponownie umieścić go na środku membrany.
    4. Odwirować probówkę o stężeniu 20 000 x g przez 1 minutę. Wyrzucić membranę.
    5. Zmierzyć stężenie DNA za pomocą spektrofotometru.
    6. DNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
      UWAGA: DNA wyekstrahowane z DBS można wykorzystać do wykonania kilku analiz, takich jak ocena SNP metodą Real Time PCR lub sekwencjonowanie DNA Sangera.

3. Przechowywanie surowicy dla DSS

  1. Pobieranie próbek krwi
    1. Zebrać 7 ml próbki krwi obwodowej w probówce o pojemności 7 ml bez EDTA. Pozostaw próbkę krwi do koagulacji na 30 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Wpisz numer kodu pacjenta w prawym dolnym rogu karty oszczędnościowej.
    3. Odwirować próbkę krwi o masie 980 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Przechowuj serum w DSS tak szybko, jak to możliwe, w ciągu 8 godzin.
    4. Ostrożnie usunąć sklarowany osad z probówki i przenieść go do nowej probówki o pojemności 15 ml. Ostrożnie ponownie wymieszać krew za pomocą pipety o pojemności 5 ml.
  2. Plamienie surowicy w DSS
    1. Odpipetować i przenieść jeden punkt surowicy (50 μl) na kartę oszczędnościową. Powtórz ten krok, aby uzyskać w sumie 3–5 plamek krwi.
      UWAGA: Zachowaj szczególną ostrożność, aby odpipetować dokładnie 50 μl surowicy do każdego miejsca. Surowica nie powinna wychodzić poza linię przerywaną karty.
    2. Pozostaw DSS do wyschnięcia na noc w temperaturze pokojowej. Pozostaw otwartą pokrywę karty oszczędnościowej, aby ułatwić suszenie krwi.
    3. Przechowuj kartę w temperaturze pokojowej w plastikowej torbie ze środkiem osuszającym do czasu użycia. Jeśli przechowywanie jest dłuższe niż 14 dni, przechowuj kartę w temperaturze -20 °C.

4. Test ELISA Począwszy od DSS

  1. Białko elute z DSS.
    1. W razie potrzeby rozmrozić DSS dla każdej próbki. Pokrój DSS na małe kawałki (o średnicy około 1 mm). Umieść kawałki w probówce o pojemności 1,5 ml z 400 μl PBS.
    2. Wytrząsać próbki przez noc w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Potrząśnij nimi z niską intensywnością. PBS nie powinien moczyć pokrywy probówki podczas potrząsania.
  2. Użyć eluatu białkowego jako próbki surowicy do analizy wydzielanego białka/czynnika wzrostu zgodnie z instrukcjami zestawu ELISA, po odpowiednich rozcieńczeniach.
    UWAGA: Ta procedura działa dobrze w przypadku wykrywania DBP9. W przypadku innych testów ELISA może być konieczny etap optymalizacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wykorzystaliśmy procedury DBS i DSS do przechowywania krwi i surowicy w temperaturze pokojowej bez wpływu na jakość materiału biologicznego. Rysunek 1 przedstawia przykład karty do przechowywania białek przed i po pobraniu krwi. Aby potwierdzić, że przechowywanie na papierze filtracyjnym oraz procedura elucji krwi nie wpływają na jakość próbek, przeprowadziliśmy porównanie ze standardowymi metodami przechowywania. Wyizolowaliśmy DNA z 3 dopasowanych próbek kr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W protokole tym bada się możliwość przechowywania krwi i surowicy na bibule filtracyjnej, gdy laboratoria nie dysponują personelem lub infrastrukturą potrzebną do prawidłowego obchodzenia się z próbkami krwi. W szczególności przy użyciu tej metody można przechowywać krew pełną lub surowicę pobraną w standardowych probówkach lub przez nakłucie palca i nie ma potrzeby zamrażania próbek w temperaturze -20 °C lub -80 °C bezpośrednio po pobraniu krwi. DBS/DSS może pozostawać w temperaturze pokojowej do 14 dni bez żadnych zmia...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Gráinne Tierney za pomoc redakcyjną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Karty oszczędnościowe Whatman Protein Card 903 Karta oszczędnościowa Protein Card, 100/pk‎SigmaZ761575Przydatny do przechowywania próbek w temperaturze pokojowej do dalszych analiz
Pipety serologiczne Falcon, 5 mLKomórka macierzysta#38003
50-200 &mikro; Końcówki LStar-LabS1120-8810
1,5 ml probówka wirówkowaEppendorf4036-3204
QIAamp DNA microkitQiagen56304Jest to zestaw do ekstrakcji DNA przeznaczony do izolowania małych ilości DNA   
Bufor ATL (zawarty w mikrozestawie QIAamp DNA)QiagenJest to zgłoszone jako Bufor do lizy 1 w tekście
Bufor AL (zawarty w mikrozestawie QIAamp DNA)QiagenJest to zgłoszone jako Bufor do lizy 2 w tekście
QIAamp mini kolumna elucyjnaQiagenJest to zgłaszane jako kolumna w tekście
AW1  (zawarte w mikrozestawie QIAamp DNA)QiagenJest to zgłaszane jako Bufor myjący 1 W TEKŚCIE
AW2  (zawarte w mikrozestawie QIAamp DNA)QiagenJest to zgłoszone jako Bufor płuczący 2 w tekście
Ludzka witamina D BP Quantikine ELISA KitR& D systemyDVDBP0

Bibliografia

  1. Bertagnolio, S., et al. HIV-1 drug resistance surveillance using dried whole blood spots. Antivir Ther. 12 (1), 107-113 (2007).
  2. Mei, J. V., Alexander, J. R., Adam, B. W., Hannon, W. H. Use of filter paper for the collection and analysis of human whole blood specimens. J Nutr. 131 (5), 1631S-1636S (2001).
  3. Garrido, C., et al. Subtype variability, virological response and drug resistance assessed on dried blood spots collected from HIV patients on antiretroviral therapy in Angola. J Antimicrob Chemoth. 61 (3), 694-698 (2008).
  4. Steegen, K., et al. Feasibility of detecting human immunodeficiency virus type 1 drug resistance in DNA extracted from whole blood or dried blood spots. J Clin Microbiol. 45 (10), 3342-3351 (2007).
  5. Costenaro, P., et al. Viral load detection using dried blood spots in a cohort of HIV-1-infected children in Uganda: correlations with clinical and immunological criteria for treatment failure. J Clin Microbiol. 52 (7), 2665-2667 (2014).
  6. Gong, Z. H., Tian, G. L., Huang, Q. W., Wang, Y. M., Xu, H. P. Reduced glutathione and glutathione disulfide in the blood of glucose-6-phosphate dehydrogenase-deficient newborns. BMC Pediatr. 20 (17), 172(2017).
  7. Lukacs, Z., Barr, M., Hamilton, J. Best practice in the measurement and interpretation of lysosomal acid lipase in dried blood spots using the inhibitor Lalistat 2. Clin Chim Acta. 471, 201-205 (2017).
  8. Skogstrand, P. T., Bent, N. P., Schendel, D. E., Sørensen, L. C., Hougaard, D. M. Simultaneous measurement of 25 inflammatory markers and neurotrophins in neonatal dried blood spots by immunoassay with xMAP technology. Clin Chem. 51 (10), 1854-1866 (2005).
  9. Amadori, D., et al. Vitamin D receptor polymorphisms or serum levels as key drivers of breast cancer development? The question of the vitamin D pathway. Oncotarget. 8 (8), 13142-13156 (2017).
  10. Gupta, B. P., Jayasuryan, N., Jameel, S. Direct detection of hepatitis B virus from dried blood spots by polymerase chain reaction amplification. J Clin Microbiol. 30 (8), 1913-1916 (1992).
  11. Colson, K. E., Potter, A., Conde-Glez, C., Hernandez, B., RíosZertuche, D., Zúñiga-Brenes, P. Use of a commercial ELISA for the detection of measles-specific immunoglobulin G (IgG) in dried blood spots collected from children living in low-resource settings. J Med Virol. 87 (9), 1491-1499 (2015).
  12. Drabe, C. H., Blauenfeldt, T., Ruhwald, M. ELISA-based assay for IP-10 detection from filter paper samples. Methods Mol Biol. 1172, 27-37 (2014).
  13. St Julien, K. R., et al. High quality genome-wide genotyping from archived dried blood spots without DNA amplification. PLoS One. 8 (5), e64710(2013).
  14. Shaner, R. L., Schulze, N. D., Seymour, C., Hamelin, E. I., Thomas, J. D., Johnson, R. C. Quantitation of fentanyl analogs in dried blood spots by flow-through desorption coupled to online solid phase extraction tandem mass spectrometry. Anal Methods. 9, 3876-3883 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

wysuszone plamki krwiwysuszone plamki surowicyekstrakcja DNAtest ELISApobieranie krwiseparacja surowicypapier filtracyjnyprzechowywanie w temperaturze pokojowejanaliza biomarker w

Powiązane artykuły