Artykuł metodologiczny

Nowatorskie metody pasywnego oczyszczania do szybkiego wytwarzania przezroczystości optycznej w całej tkance OUN

DOI:

10.3791/57123

⸱

8 maja 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurosurgery, Gangnam Severance Hospital, Yonsei University College of Medicine, 2Brain Korea 21 PLUS Project for Medical Science, Yonsei University, 3The Spine and Spinal Cord Institute, Biomedical Center, Gangnam Severance Hospital, Yonsei University College of Medicine, 4Columbia University College of Physicians and Surgeons

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy dwie nowatorskie metodologie, psPACT i mPACT, do osiągnięcia maksymalnej przezroczystości optycznej i późniejszej mikroskopowej analizy unaczynienia tkanek w nienaruszonym całym OUN gryzonia.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Od czasu opracowania CLARITY, bioelektrochemicznej techniki oczyszczania, która pozwala na trójwymiarowe mapowanie fenotypów w przezroczystych tkankach, powstało wiele nowatorskich metodologii oczyszczania, w tym CUBIC (czyste, niezakłócone koktajle obrazowania mózgu i analiza obliczeniowa), SWITCH (ogólnosystemowa kontrola czasu interakcji i kinetyki substancji chemicznych), MAP (powiększona analiza proteomu) i PACT (technika pasywnej przejrzystości), aby dalej rozwijać Rozszerzenie istniejącego zestawu narzędzi do analizy mikroskopowej tkanek biologicznych. Niniejsze badanie ma na celu ulepszenie i optymalizację oryginalnej procedury PACT dla szeregu nienaruszonych tkanek gryzoni, w tym całego ośrodkowego układu nerwowego (OUN), nerek, śledziony i całych zarodków myszy. Te nowatorskie techniki, określane jako psPACT (process-separate PACT) i mPACT (modified PACT), zapewniają wysoce skuteczne metody mapowania obwodów komórkowych i wizualizacji struktur subkomórkowych w nienaruszonych normalnych i patologicznych tkankach. W poniższym protokole przedstawiamy szczegółowy zarys krok po kroku, w jaki sposób osiągnąć maksymalny klirens tkanek przy minimalnym naruszeniu ich integralności strukturalnej za pomocą psPACT i mPACT.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podstawowym celem badań naukowych i klinicznych jest osiągnięcie pełnego zrozumienia budowy i funkcji narządów; jednak niezwykle złożona natura organów ssaków często służy jako bariera do pełnego osiągnięcia tego celu1. CLARITY (Tisssue-hYdrogel, kompatybilny z przezroczystym lipidowym hybrydyzowanym akrylamidem, sztywnym obrazowaniem)2,3,4, który polega na zbudowaniu hybrydy hydrożelowej na bazie akrylamidu z nienaruszonych tkanek, osiąga optyczną klirens różnych narządów, w tym mózgu, wątroby i śledziony, zachowując jednocześnie ich integralność strukturalną5. W ten sposób projekt CLARITY umożliwił nie tylko wizualizację, ale także możliwość precyzyjnego przeanalizowania złożonych sieci komórkowych i morfologii tkanek bez konieczności przeprowadzania sekcji.

Aby osiągnąć klirens tkankowy, CLARITY wykorzystuje metody elektroforetyczne do usunięcia zawartości lipidów z dostępnej próbki. Podczas gdy w ramach projektu CLARITY zauważono, że wytwarza się fizycznie stabilne hybrydy tkankowo-hydrożelowe, badania wykazały, że zastosowanie metod elektroforetycznego oczyszczania tkanek (ETC) daje zmienne wyniki pod względem jakości tkanek, w tym brązowienia, uszkodzenia epitopów i utraty białka5,6. Aby rozwiązać te problemy, opracowano zmodyfikowane protokoły, takie jak PACT (PAssive Clarity Technique), który zastępuje leczenie ETC pasywną techniką delipidacji opartą na jonowym depilencie7,8,9. Pomimo osiągnięcia większej spójności wyników, PACT wymaga więcej czasu na uzyskanie maksymalnego klirensu. Co więcej, żadna z tych technik nie została jeszcze zastosowana do całej formy OUN lub w większych modelach gryzoni, takich jak szczury i świnki morskie.

Niniejsze badanie ma na celu rozwiązanie tych ograniczeń poprzez zaproponowanie nowych metodologii, psPACT (process-separate PACT) i mPACT (modified PACT), ułatwiających szybkie usuwanie całego OUN i narządów wewnętrznych zarówno w modelach mysich, jak i szczurzych10. W szczególności psPACT przetwarza tkanki w 4% akrylamidu i 0,25% VA-044 w dwóch oddzielnych etapach podczas tworzenia hydrożelu; mPACT zasadniczo obejmuje te same kroki, ale uzupełnia roztwór czyszczący na bazie SDS o 0,5% α-tioglicerolu jako kluczowy odczynnik. Obie techniki wykorzystują endogenny układ krążenia układowego i mózgowo-rdzeniowego, aby znacznie skrócić czas potrzebny do wytworzenia klirensu optycznego. Jako dowód słuszności zasady, demonstrujemy zastosowanie mikroskopii konfokalnej do analizy wzorców naczyń krwionośnych w oczyszczonych tkankach10.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez odpowiednią komisję etyki badań w Yonsei University College of Medicine. Wszystkie zwierzęta doświadczalne są uśmiercane zgodnie z wytycznymi komitetu ds. opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi w Yonsei University College of Medicine.

1. Przygotowanie odczynników

Uwaga: Paraformaldehyd (PFA), akryloamid i siarczan dodecylu sodu (SDS) są toksycznymi substancjami drażniącymi i dlatego powinny być używane w dygestoriach z odpowiednim sprzętem ochrony osobistej (PPE; fartuch laboratoryjny, rękawice, okulary ochronne).

  1. 4% roztwór akryloamidu (AA) (A4P0): Dodać 20 ml 40% roztworu akryloamidu do 180 ml 0,1 M soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS).
  2. 0,25% roztwór VA-044: Dodać 0,5 g proszku dichlorowodorku dichlorowodorku 2,2'-Azobis[2-(2-imidazolin-2-ylo)propanu] (VA-044) do 200 ml 0,1 M soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS). Podczas gdy proszek VA-044 może być przechowywany w temperaturze pokojowej, po rozpuszczeniu w PBS musi być przechowywany w temperaturze 4 °C. Aby uzyskać najlepsze wyniki, przygotuj tylko taką ilość roztworu, jaka jest potrzebna do eksperymentu.
  3. Roztwór koktajlu PACT: Dodać 10 g akrylamidu do 225 ml 4% roztworu paraformaldehydu (PFA) i dostosować objętość do 200 ml z 4% PFA. Przed użyciem dodać 100 mg proszku VA-044 do 40 ml mieszaniny w stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
  4. Bufor roztworu oczyszczającego PACT: Dodać 40 g dodecylosiarczanu sodu (SDS) do 350 ml 0,1 M PBS i dostosować objętość do 500 ml za pomocą 0,1 M PBS. W przypadku roztworu czyszczącego mPACT dodać 0,5% α-tioglicerolu do buforu roztworu czyszczącego PACT.
  5. Myszy użyte w tym badaniu były 2-tygodniowymi samcami myszy BALB; szczury użyte w tym badaniu były 2-tygodniowymi samcami szczurów SD.

2. Znieczulenie i chirurgia perfuzji

Uwaga: PFA i akryloamid są toksycznymi substancjami drażniącymi i dlatego powinny być używane w dygestorii z odpowiednimi środkami ochrony osobistej.

  1. Znieczulić zwierzę w pomieszczeniu wolnym od patogenów za pomocą 30 mg/kg zoletilu za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z igłą o rozmiarze 26. Monitoruj zwierzę przez 5 -10 minut.
  2. Gdy zwierzę osiągnie chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia, użyj metody reakcji na uszczypnięcie palca, aby określić głębokość znieczulenia. Potwierdź brak odpowiedzi.
    UWAGA: Poniższe kroki obejmujące operację na myszach i szczurach są zgodne z podobnym protokołem użytym w poprzednim badaniu11.
  3. Wykonaj 5-6 cm nacięcie pod klatką piersiową, przez powłokę i ścianę brzucha.
  4. Użyj zakrzywionych, nożyczek, aby wykonać nacięcie w przeponie, dotykając okolicy klatki piersiowej, aby wcześniej zlokalizować miejsce nacięcia.
  5. Przedłuż nacięcie na całej długości klatki piersiowej, aby odsłonić jamę opłucnej.
  6. Ostrożnie przemieszcz płuca. Wykonaj przecięcie przez klatkę piersiową aż do obojczyka. Za pomocą nożyczek do tęczówki wykonaj małe nacięcie na tylnym końcu lewej komory. Włóż igłę perfuzyjną o rozmiarze 18 rozmiarów lub oliwkową do aorty wstępującej, przechodząc przez przeciętą komorę.
  7. Zabezpiecz igłę i zapobiegnij wyciekowi, zaciskając serce hemostatem. Alternatywnie, użyj zmodyfikowanego hemostatu, aby zacisnąć aortę wokół końcówki igły.
  8. Wykonaj duże nacięcie w prawym przedsionku, uważając, aby zminimalizować uszkodzenie aorty zstępującej. Szczur jest teraz gotowy do perfuzji.

3. Cała perfuzja i sekcja szczura

Uwaga: PFA i akryloamid są toksycznymi substancjami drażniącymi i dlatego powinny być używane w dygestorii z odpowiednimi środkami ochrony osobistej.

UWAGA: Następujące pełne etapy perfuzji są podobne do protokołu użytego w poprzednim badaniu przez Woo et al. (2016)10,11.

  1. Przymocuj prawe przedsionek serca do igły o rozmiarze 18, uważając, aby nie wprowadzić żadnych pęcherzyków powietrza.
  2. Za pomocą strzykawki o pojemności 50 ml szybko i równomiernie przepompuj 50 ml zimnego 0,1 M PBS roztworu zawierającego heparynę (10 jednostek/ml).
  3. Podłącz igłę o rozmiarze 18 do rurki pompy perystaltycznej.
  4. Przemyć 200 ml zimnego 0,1 M PBS roztworu zawierającego heparynę (10 jednostek/ml) z prędkością krążenia 10 ml/min.
  5. Utrwalić za pomocą 250 ml zimnego 4% roztworu PFA przy prędkości cyrkulacji 10 ml/min. Na tym etapie szczur powinien być sztywny.
  6. Zebrać i przechowywać pozostały roztwór PFA do usunięcia.
  7. W przypadku PACT należy przetopić tkanki schłodzonym roztworem koktajlu PACT zawierającym 4% PFA, 4% akryloamidu i 0,25% proszku VA-044 za pomocą igły o rozmiarze 18, a następnie usunąć głowę i kręgosłup. Odsłoń czaszkę, wykonując nacięcie w linii środkowej od szyi do nosa. Ten dodatkowy etap perfuzji nie jest konieczny w przypadku metod psPACT i mPACT; Po fiksacji natychmiast odizoluj głowę i kręgosłup oraz odsłoń czaszkę.
  8. Odsłoń podstawę czaszki, usuwając wszelkie resztki mięśni szyi i kręgosłupa.
  9. Użyj rongeurów i nożyczek, aby oderwać czaszkę. Usuń mózg i rdzeń kręgowy.
  10. Tkankę należy przechowywać w 4% PFA w temperaturze 4 °C; tkanki można przechowywać do 1 tygodnia.

4. Infuzja monomeru hydrożelowego i polimeryzacja ośrodkowego układu nerwowego szczura i myszy

Uwaga: Akrylamid, SDS, α-tioglicerol i PFA są substancjami drażniącymi i dlatego powinny być używane w dygestorium i z odpowiednim PEE.

  1. PACT (Technika Pasywnego Oczyszczania)
    1. Wyizolować i wyhodować cały OUN (mózg i rdzeń kręgowy) od myszy i szczurów do probówki o pojemności 50 ml zawierającej schłodzony roztwór koktajlu PACT zawierający 4% PFA, 4% akrylamid i 0,25% VA-044 w proszku i przechowywać w temperaturze 4 °C przez 24 godziny. Upewnij się, że tkanka jest całkowicie zanurzona w roztworze.
    2. Zanurzyć próbkę w gazowym azocie na 10 minut za pomocą systemu hybrydyzacji żelu tkankowego podłączonego do zbiornika azotu: Ustawić system na 37 °C. Przenieść tkanki do 50 ml probówki zawierającej świeży zimny (4 °C) roztwór koktajlu PACT i połączyć z nakrętką probówki, a następnie włączyć próżnię.
    3. Aby spolimeryzować hydrożel, należy umieścić probówkę zawierającą próbkę w inkubatorze z wytrząsaniem (150 obr./min, 37 °C) na 3 godziny lub do zakończenia polimeryzacji.
    4. Za pomocą bibuły (patrz Tabela materiałów) usuń pozostały spolimeryzowany hydrożel otaczający tkanki.
    5. Przenieść tkankę do probówki o pojemności 50 ml zawierającej roztwór klarujący (8% SDS w 0,1 M PBS, pH 8,0).
    6. Umieścić próbkę w inkubatorze z wytrząsaniem ustawionym na temperaturę 37 °C i prędkość obrotową 150 obr./min, aż tkanka zostanie usunięta. Średnio potrzeba około 20 dni, aby OUN myszy osiągnął pełną klarowność.
  2. psPACT (Technika Pasywnego Oczyszczania Oddzielnego od Procesu)
    1. Odizoluj cały OUN (mózg i rdzeń kręgowy) za pomocą noża do kości i nożyczek od myszy i szczurów z utrwalonym PFA na czystej ławce.
    2. Przenieść tkanki do probówki o pojemności 50 ml zawierającej 4% PFA i przechowywać w temperaturze 4 °C przez 24 godziny. Upewnij się, że tkanka jest całkowicie zanurzona w utrwalaczu.
    3. Myć utrwaloną tkankę przez 1 godzinę w 0,1 M PBS, a następnie przenieść do roztworu A4P0 (4% akryloamid w 0,1 M PBS). Przechowywać w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.
    4. Myj chusteczkę przez 5 minut w 0,1 M PBS.
    5. Zanurz tkankę w 0,25% VA-044 w 0,1 M PBS. Przechowywać w temperaturze 37 °C przez 6-24 godziny, a następnie przenieść do świeżego 0,25% roztworu VA-044/PBS.
    6. Osadź próbkę w gazowym azocie na 10 minut za pomocą systemu hybrydyzacji żelu tkankowego (patrz tabela materiałów) podłączonego do zbiornika azotu: Przenieś tkanki do probówki o pojemności 50 ml zawierającej świeży zimny (4 °C) 0,25% roztwór VA-044/PBS i połącz z nakrętką probówki. Włącz odkurzacz.
    7. Przenieść tkankę do roztworu oczyszczającego (8% SDS w 0,1 M PBS, pH 8,0).
    8. Inkubować próbkę w inkubatorze z wytrząsaniem ustawionym na temperaturę 37 °C i prędkość obrotową 150 obr./min, aż tkanka zostanie usunięta. Średnio potrzeba około 17 dni, aby OUN myszy osiągnął pełną klarowność.
  3. mPACT (zmodyfikowana technika pasywnego oczyszczania)
    1. Odizoluj cały OUN (mózg i rdzeń kręgowy) za pomocą noża do kości i nożyczek od myszy i szczurów z utrwalonym PFA na czystej ławce.
    2. Wykonaj kroki 4.2.2 - 4.2.8 protokołu psPACT.
    3. Przenieś tkankę do roztworu czyszczącego. Należy zauważyć, że w przeciwieństwie do protokołów PACT i psPACT, mPACT wymaga roztworu oczyszczającego składającego się z 0,5% α-tioglicerolu oprócz 8% SDS w 0,1 M PBS, pH 8,0. α-tioglicerol jest środkiem niebrązowiejącym, który pomaga szybciej i skuteczniej oczyszczać tkanki. Upewnij się, że tkanka jest całkowicie zanurzona w roztworze.
    4. Umieścić próbkę w inkubatorze z wytrząsaniem ustawionym na temperaturę 37 °C i prędkość obrotową 150 obr./min, aż tkanka zostanie usunięta. Średnio potrzeba około 2 tygodni, aby OUN myszy osiągnął pełną klarowność.

5. Dopasowanie współczynnika załamania światła i barwienie immunologiczne oczyszczonego ośrodkowego układu nerwowego

UWAGA: nRIMS (Nycodenz-based Refractive Index Matching Solution) składa się z 0,8 g/ml proszku Nycodenz rozpuszczonego w 30 ml buforze zasadowym (0,01% azydku sodu i Tween-20 w 0,1 M PBS, pH 8,0). Zaleca się, aby roztwór umieścić w inkubatorze z wytrząsaniem o temperaturze 37 °C, aby umożliwić prawidłowe rozsolwatowanie proszku.

  1. Inkubować tkanki w 0,1% Triton X-100 w 0,1 M PBS przez 2 godziny, a następnie blokować 2% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) w 0,1 M PBS przez 6 godzin.
  2. Przemyj skrawki trzykrotnie w PBST (0,1% Tween-20 w 0,1 M PBS) przez 2 godziny. Wybarwiaj skrawki pierwotnymi przeciwciałami (w tym przypadku przeciwciałem anty-króliczym PECAM-CD31, które barwi naczynia krwionośne) przez 2 dni.
  3. Wybarwić skrawki przeciwciałami drugorzędowymi (w tym przypadku koniugatem fluorescencyjnym kozy anty-króliczej IgG Cy3) w 2% BSA przez 2 dni.
  4. Oznakowane chusteczki należy myć trzykrotnie w PBST przez 2 godziny i przechowywać w 15 ml nRIMS przez 2 - 10 dni.
  5. Przed obrazowaniem przenieś znakowane tkanki do niewielkiej ilości nRIMS na 35- lub 60-milimetrowych szalkach do hodowli tkankowych. Przymocuj silikonem wokół dolnej krawędzi naczynia.
  6. Dodaj 1,5 - 2 ml świeżych felg.

6. Przetwarzanie obrazu

  1. Uzyskanie obrazów oczyszczonych tkanek za pomocą skanowania płytek za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego z 10-krotnym powiększeniem (patrz tabela materiałów). W przypadku tkanki znakowanej Cy3 należy stosować długości fal 550-600 nm.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Generowanie przezroczystego modelu całego OUN przy użyciu zoptymalizowanych technik pasywnego czyszczenia

Optyczne usuwanie całych tkanek OUN myszy i szczurów zostało szybko osiągnięte przy użyciu różnych technik pasywnego oczyszczania (Rysunek 1). Schemat oczyszczania tkanek w czasie jest pokazany w Rysunek 2A. W przeciwieństwie do oryginalnej metody PACT, psPACT (process...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podczas gdy pasywne, nieelektroforetyczne metody ekstrakcji zastosowane w PACT znacznie poprawiły spójność osiągniętą z poprzednimi metodami oczyszczania tkanek, takimi jak CLARITY 2,3,4,7,8, technika ta nadal ma kilka wad, z których najbardziej palącą jest czas wymagany do osiągnięcia maksymalnej przejrzystości tkanek 12. W niniejszym...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Brain Korea 21 PLUS Project for Medical Science, Yonsei University. Ponadto prace te były wspierane przez grant z National Research Foundation of Korea (NRF-2017R1D1A1B03030315).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Dodecylosiarczan sodu (SDS)Affymetrix, Inc.75819Roztwór czyszczący
NycodenzAxia-Shield1002424roztwór nRIMS
40% roztwór akryloamidu BioRad Laboratories, Inc.161-0140Polimeryzacja (A4P0)
2,2&ostrego;-azobis[2-(2-imidazolin-2-ylo)propanu] DichlorowodorekWako Pure Chemical Industries, Ltd.017-19362Polimeryzacja (VA-044)
1-TioglycerolSigma-AldrichM1753-100MLRoztwór czyszczący (mPACT)
Tween-20Georgiachem9005-64-5Roztwór nRIMS
Triton X-100Sigma-AldrichT8787-50MLBarwienie immunologiczne
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)BovogenBSA100Heparyna barwienia immunologicznego
Merck Millipore375095Perfusion (PBS)
Roztwór azydku soduSigma-AldrichS2002-25GnRIMS
przeciwciało PECAM-CD31Cruz Biotechnology Inc.sc-28188Immuno Staining
Goat anty-króliczo-IgG Cy3 fluorescencyjny koniugatJackson ImmunoResearch Inc.111-165-003Barwienie immunologiczne
4% paraformaldehydTech & InnowacjaBPP-9004Perfuzja, polimeryzacja
20X sól fizjologiczna buforowana fosforanem (pH 7,4)Tech & InnowacjaBPB-9121Perfuzja, bufor
10 ml striptizerkaCoatar4488Probówka do przenoszenia roztworu
50 mlFalcon352070Probówka czyszcząca
35 mm Naczynie do hodowli komórkowychSPL20035Obrazowanie
Naczynie konfokalneSPL211350Obrazowanie
1 ml strzykawkaKorea vaccine Co., Ltd26G 1/2Znieczulenie 
Strzykawka 50 mlKorea vaccine Co., Ltd21G1 1/4Perfusion
AkrylamidSigma-AldrichA3553Polimeryzacja (A4P0)
Papier Whatman 3MMSigma-AldrichZ270849Bibuła do usuwania żelu
Mikroskop konfokalnyObrazowanie ZeissLSM780
Oprogramowanie ZEN liteObrazowanie ZeissZEN 2012
Pompa perystaltycznaLongerpumpBT100-1FPerfusion
EasyGelLifecanvas TechnologiesEasyGelSystem hybrydyzacji żelu tkankowego
Santa

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhu, X., Xia, Y., Wang, X., Si, K., Gong, W. Optical brain imaging: A powerful tool for neuroscience. Neurosci Bull. 33 (1), 95-102 (2017).
  2. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  3. Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
  4. Feng, Y., et al. CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions. Sci Rep. 7, 44810(2017).
  5. Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Dev Biol. 14, 48(2014).
  6. Jensen, K. H. R., Berg, R. W. Advances and perspectives in tissue clearing using CLARITY. J Chem Neuroanat. 86, 19-34 (2017).
  7. Treweek, J. B., et al. Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nat Protoc. 10 (11), 1860-1896 (2015).
  8. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
  9. Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Just, L., Mack, A. F. Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluation and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure. Sci Rep. 6, 34331(2016).
  10. Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing. Exp Mol Med. 48 (12), 274(2016).
  11. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
  12. Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. Optical clearing of the mouse central nervous system using passive CLARITY. J Vis Exp. (112), (2016).
  13. Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: A simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
  14. Choi, B. R., et al. Increased expression of the receptor for advanced glycation end products in neurons and astrocytes in a triple transgenic mouse model of Alzheimer's disease. Exp Mol Med. 46, 75(2014).
  15. Chang, D. J., et al. Contralaterally transplanted human embryonic stem cell-derived neural precursor cells (ENStem-A) migrate and improve brain functions in stroke-damaged rats. Exp Mol Med. 45, 53(2013).
  16. Kim, T. K., et al. Analysis of differential plaque depositions in the brains of Tg2576 and Tg-APPswe/PS1dE9 transgenic mouse models of Alzheimer disease. Exp Mol Med. 44 (8), 492-502 (2012).
  17. Kinameri, E., et al. Prdm proto-oncogene transcription factor family expression and interaction with the Notch-Hes pathway in mouse neurogenesis. PLoS One. 3 (12), e3859(2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Przezroczysto tkanekmetoda psPACTmetoda mPACTpolimeryzacja hydro eluroztw r do klarowaniaprzygotowanie tkanki

Powiązane artykuły