Artykuł metodologiczny

Mikrorozcieńczenie bulionu Badania przesiewowe in vitro: łatwa i szybka metoda wykrywania nowych związków przeciwgrzybiczych

DOI:

10.3791/57127

⸱

14 lutego 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Molecular Biology, Department of Cellular Biology, Institute of Biological Sciences, University of Brasília, 2Department of Microbiology and Immunology, Albert Einstein College of Medicine, 3Division of Infectious Diseases, Department of Medicine, Albert Einstein College of Medicine, 4Faculty of Ceilândia, University of Brasília

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Łatwa i elastyczna metoda mikrorozcieńczania bulionu do badania związków przeciwgrzybiczych i ekstraktów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Infekcje grzybicze stały się ważnym stanem chorobowym w ostatnich dziesięcioleciach, ale liczba dostępnych leków przeciwgrzybiczych jest ograniczona. W tym scenariuszu konieczne jest poszukiwanie nowych leków przeciwgrzybiczych. Przedstawiony tutaj protokół szczegółowo opisuje metodę badania peptydów pod kątem ich właściwości przeciwgrzybiczych. Opiera się na teście wrażliwości na mikrorozcieńczenie bulionu z wytycznych Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3 z modyfikacjami dostosowanymi do badań peptydów przeciwdrobnoustrojowych jako potencjalnych nowych środków przeciwgrzybiczych. Protokół ten opisuje funkcjonalny test do oceny aktywności związków przeciwgrzybiczych i może być łatwo zmodyfikowany w celu dopasowania do dowolnej klasy badanych cząsteczek. Ponieważ testy są wykonywane na 96-dołkowych płytkach przy użyciu małych objętości, badanie przesiewowe na dużą skalę można przeprowadzić w krótkim czasie, zwłaszcza jeśli przeprowadza się je w warunkach automatyzacji. Procedura ta ilustruje, w jaki sposób ustandaryzowany i regulowany protokół kliniczny może pomóc w poszukiwaniu nowych cząsteczek w celu poprawy terapii chorób grzybiczych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Infekcje grzybicze stały się ważnym problemem medycznym w ostatnich dziesięcioleciach, znacznie wzrosły, głównie z powodu wzrostu liczby osób z obniżoną odpornością, takich jak osoby poddawane leczeniu raka oraz osoby żyjące z HIV/AIDS lub przeszczepionymi organami1,2. Jednak bardzo ograniczony wachlarz dostępnych leków przeciwgrzybiczych i rosnąca liczba doniesień o oporności grzybów na nie przyczyniają się do poważnych problemów związanych z terapią grzybic układowych3.

Potencjalnym źródłem nowych związków przeciwgrzybiczych są peptydy przeciwbakteryjne (AMP), małe peptydy kationowe wytwarzane przez wiele organizmów jako część ich wrodzonej odpowiedzi immunologicznej na infekcję4. Niemniej jednak metoda przesiewowa mająca na celu przetestowanie tych związków pod kątem patogenów grzybowych nie jest ustandaryzowana. Do oceny aktywności przeciwgrzybiczej AMP zastosowano różne procedury, czasami dla tego samego mikroorganizmu modelowego5,6,7. Różnice te oraz brak szczegółów w niektórych protokołach komplikują porównania między związkami i utrudniają odtwarzalność.

Jednym ze sposobów standaryzacji testowania nowych kandydatów na leki jest przestrzeganie wytycznych używanych do definiowania podatności na leki przeciwgrzybicze w warunkach klinicznych, takich jak wytyczne Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3. Jednak te testy wrażliwości na leki przeciwgrzybicze są zbyt restrykcyjne i nie uwzględniają różnic w metabolizmie u różnych gatunków, ponieważ zostały ustalone tylko dla kilku wybranych środków. Na przykład nie uwzględniają potrzeb metabolicznych drożdży niefermentujących.

Ten protokół pozwala na ocenę aktywności potencjalnych związków przeciwgrzybiczych i jest tutaj stosowany do poszukiwania peptydów przeciwgrzybiczych. Opiera się na teście wrażliwości na mikrorozcieńczenie bulionu z wytycznych CLSI M27-A3 z modyfikacjami optymalizującymi badania przesiewowe nowych związków8,9. Zmiany te pozwalają na użycie niewielkich ilości związku, zmian temperatury lub początkowego inokulum oraz różnych pożywek w celu optymalnego wzrostu przed testem, przy jednoczesnej standaryzacji wyników z użyciem referencyjnych leków przeciwgrzybiczych jako kontroli. Metoda ta, przy użyciu wielodołkowych płytek hodowlanych, umożliwia szybkie i niezawodne przesiewanie dużej liczby związków.

Ze względu na swoją nieodłączną elastyczność, ten protokół może być używany z różnymi klasami chemicznymi związków i przeciwko innym mikroorganizmom, z niewielkimi adaptacjami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Rozwiązania i media

  1. Przygotuj 2X pożywkę Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640, sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), bulion dekstrozy Sabouraud i agar dekstrozy Sabouraud zgodnie z tabelą 1.

2. Warunki wzrostu inokulum grzybów

  1. Przechowuj wszystkie szczepy grzybów jako zamrożone zapasy w 35% glicerolu w temperaturze -80 °C, aż będą potrzebne.
  2. Przed każdym eksperymentem wykonaj następujące czynności.
    1. Dla szczepów Candida albicans:
      1. Rozmrozić fiolkę podstawową i przenieść 200 μl do 10 ml bulionu z dekstrozy Sabouraud w sterylnej probówce polipropylenowej o pojemności 50 ml z nakrętką i hodować przez noc w temperaturze 30 °C z mieszaniem (200 obr./min). Pamiętaj, aby pochylić rurkę i pozostawić nakrętkę lekko uchyloną, aby lepiej napowietrzyć kulturę.
    2. Dla szczepów Cryptococcus neoformans:
      1. Zeskrobać zamrożoną powierzchnię fiolki z zapasem. Umieścić komórki na płytkach z agarem z dekstrozą Sabouraud i inkubować przez 48 godzin w temperaturze 30 °C. Po widocznym wzroście wyizolowanych kolonii należy przechowywać płytki w lodówce (4 °C) szczelnie zamkniętej folią parafinową do 15 dni.
      2. Zebrać średniej wielkości izolowaną kolonię z płytki za pomocą sterylnej wykałaczki lub sterylnej pętli do zaszczepiania i zaszczepić 10 ml bulionu dekstrozowego Sabouraud w sterylnej stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Inkubować przez około 24 godziny w temperaturze 30 °C przy mieszaniu (200 obr./min).
      3. Nie należy przekraczać 24 godzin inkubacji. Pamiętaj, aby pochylić rurkę i pozostawić nakrętkę lekko uchyloną, aby uzyskać lepszą wentylację. Zawsze dobrze jest ustandaryzować etap wzrostu komórek przed każdym badaniem, ponieważ jest to ważny czynnik wpływający na oporność na środki przeciwdrobnoustrojowe.
        UWAGA: Oba grzyby były hodowane w temperaturze 30 °C w celu szybkiego rozmnażania się w naszych eksperymentach, ale temperatura może być zmieniona, aby odzwierciedlić cele badania, na przykład leczenie kliniczne (37 °C). Co najważniejsze, ten początkowy czas inkubacji powinien być ustalony z wyprzedzeniem dla każdego izolatu grzyba i utrzymywany przez wszystkie testy, aby zapewnić odtwarzalność.
  3. Po wzroście grzybów zebrać komórki, odwirowując stożkowe probówki o stężeniu 1 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić sklarowany osad i dodać 10 ml PBS.
  4. Ponownie zawiesić komórki i ponownie odwirować przy 1 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Powtórzyć mycie PBS i odwirowanie jeszcze dwa razy. Po trzecim praniu ponownie zawieś komórki w 5 ml (w zależności od wielkości granulki) pożywki 2X RPMI-1640.
  6. Przygotować 1 ml rozcieńczenia 1:100 lub 1:1 000 w probówce mikrowirówkowej (w zależności od zmętnienia zawiesiny komórek).
  7. Pobrać 10 μl tego rozcieńczenia, umieścić je w komorze hemocytometru i policzyć całkowitą liczbę komórek w czterech rogowych kwadrantach pod mikroskopem. Obliczyć stężenie według wzoru: (całkowita liczba komórek/4) x współczynnik rozcieńczenia x 10,4 (stała rozcieńczenia komory).
    1. Rozważ 100% żywotności, jeśli liczba żywotności i warunki wzrostu były systematycznie skorelowane dla badanego izolatu.
      UWAGA: Standaryzacja i kontrola jakości liczby żywotności może być przeprowadzona poprzez powlekanie wsteczne zgodnie z metodą Europejskiego Komitetu ds. Badania Wrażliwości Na Środki Przeciwdrobnoustrojowe (EUCAST) Minimalne Stężenie Hamujące (MIC) dla drożdży10.
    2. Jeśli korelacja wzrostu/żywotności nie została ustalona dla badanego izolatu, zmierz żywotność grzyba, licząc żywe komórki w hemocytometrze za pomocą barwników, które selektywnie barwią martwe komórki, takich jak floksyna B11, trypan blue12, lub Janus Green13. Używaj komórek grzybów do tego protokołu tylko wtedy, gdy żywotność populacji w tym momencie wynosi 90% lub więcej.
      UWAGA: Martwe/żywe barwniki mogą nie działać dobrze z wybranym grzybem. Przetestuj je przed użyciem. Na przykład niebieski barwnik trypanowy nie działa dobrze z C. neoformans.
  8. Następnie przygotuj zawiesiny komórek w pożywce 2X RPMI-1640 (2X dostosowaną inokulum w pożywce RPMI-1640). W przypadku płytek 96-dołkowych należy rozważyć objętość 5 ml na każdą płytkę.
    1. Dla wszystkich szczepów C. albicans należy przygotować zawiesinę komórek podstawowych 4 x 103 komórek/ml. Stężenie to wynosi 2 razy więcej niż końcowe stężenie komórek w każdym dołku (2 x 103 komórki / ml).
    2. W przypadku szczepów C. neoformans należy przygotować podstawową hodowlę komórek 2 x 104 komórek/ml. Stężenie to jest dwukrotnie większe niż końcowe stężenie komórek w każdym dołku (1 x 104 komórek/ml).
    3. W przypadku innych grzybów należy przeprowadzić test ze znanym lekiem przeciwgrzybiczym, którego stężenie będzie idealne dla danego badania w odniesieniu do czasu inkubacji. Weź pod uwagę metabolizm i czas duplikacji grzyba.

3. Peptydy (nieznany czynnik)

  1. Przechowuj liofilizowane peptydy w temperaturze -20 °C i rozpuszczaj je w wodzie dejonizowanej przed każdym eksperymentem. Maksymalny czas przechowywania po rozpuszczeniu w wodzie będzie zależał od charakteru każdego peptydu.
  2. Przygotować podwielokrotności dwukrotnie wyższe od najwyższego stężenia końcowego badanego w teście (2X). Najlepiej przygotować niewielką liczbę porcji z wystarczającą ilością peptydu do jednorazowego użycia, aby uniknąć cykli zamrażania i rozmrażania.
    UWAGA: Wybór stężenia powinien opierać się na literaturze i właściwościach peptydu. Zaleca się rozpoczęcie seryjnych rozcieńczeń od około 100 μM peptydu, a następnie zmniejszanie lub zwiększanie tego zakresu stężeń w zależności od uzyskanych wyników.

4. Referencyjne leki przeciwgrzybicze (kontrole pozytywne)

  1. Dla osób rozcieńczonych w wodzie: przygotować 2X roztwór o najwyższym stężeniu w analizie (patrz sekcja 5: Test przeciwgrzybiczy dla etapów rozcieńczania).
    1. W przypadku szczepów C. albicans należy przygotować roztwór 128 μg/ml flukonazolu lub 128 μg/ml kaspofunginy. Stężenie w płytce dla obu wyniesie 64 μg/ml.
    2. W przypadku szczepów C. neoformans należy przygotować roztwór 32 μg/ml amfoterycyny B (roztwór rozpuszczalny w wodzie). Stężenie w płytce wyniesie 16 μg/ml.
      UWAGA: Zwykle amfoterycyna B jest rozcieńczana w dimetylosulfotlenku (DMSO), ponieważ ten środek przeciwgrzybiczy jest słabo rozpuszczalny w wodzie. Jednak na rynku dostępne są rozpuszczalne w wodzie preparaty amfoterycyny B.
  2. W przypadku leków przeciwgrzybiczych rozcieńczonych w rozpuszczalniku organicznym: przygotuj 100-krotny roztwór podstawowy w DMSO, a następnie rozcieńcz go do 10-krotnego roztworu w wodzie do użycia.
    UWAGA: Tak więc w studni końcowe stężenie DMSO nie przekroczy 1%. Studnia, w której grzyb będzie rósł w pożywce zawierającej 1% DMSO, ponieważ wymagana jest kontrola, biorąc pod uwagę, że niektóre grzyby nie tolerują dobrze tego stężenia rozpuszczalnika. Pamiętaj, że DMSO jest światłoczułe, dlatego przykryj płytkę folią lub umieść ją w ciemnej komorze na czas trwania inkubacji.

5. Test przeciwgrzybiczy

UWAGA: Testy przeciwgrzybicze in vitro są przeprowadzane na podstawie testu wrażliwości na mikrorozcieńczenie bulionu według wytycznych Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3 z pewnymi modyfikacjami.

  1. Przygotować dwukrotne seryjne rozcieńczenie każdego peptydu i kontrolować działanie przeciwgrzybicze w 96-dołkowych mikropłytkach polistyrenowych do końcowej objętości 50 μl.
    1. Za pomocą pipety dodać 100 μl środka przeciwgrzybiczego/peptydu o stężeniu 2X najwyższego pożądanego stężenia końcowego w kolumnach 1-3, w wierszu A.
    2. Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 50 μl sterylnej wody do pozostałych studzienek, w rzędach od B do H.
    3. Usunąć 50 μl studzienek o najwyższym stężeniu (rząd A), przenieść do następnego dołka o następnym stężeniu (rząd B) i homogenizować.
    4. Powtarzaj powyższe kroki, aż studzienka będzie miała najniższe stężenie i wyrzuć 50 μl tej studzienki (rząd H). Pozostawić kolumny 11 i 12 (rzędy A, B, C) tylko z wodą do ślepej próby lub kontroli ujemnej/wzrostu.
    5. Dodać 50 μl 2X dostosowanego inokulum w pożywce RPMI-1640 do każdej studzienki (kolumny 1-3 plus kolumna 11 (ujemna/kontrola wzrostu)); końcowe stężenie dla C. albicans wyniesie 2 x 103 komórki/ml, a końcowe stężenie dla szczepów C. neoformans wyniesie 10-4 komórki/ml.
    6. Przygotować ślepą próbę kontrolną (50 μl wody + 50 μl 2X pożywki RPMI-1640 bez komórek) i kontrolę ujemną/wzrostu (50 μl wody + 50 μl dostosowanego inokulum 2X pożywki RPMI-1640 bez środka przeciwgrzybiczego) i załadować do płytki studzienki, jak opisano powyżej.
  2. Powtórzyć procedurę dla każdego badanego związku i wybranego środka przeciwgrzybiczego (kolumny 4-10).
    UWAGA: Seryjne rozcieńczenia można wykonać pionowo, jak w eksperymencie poniżej, lub poziomo na płytce (tj. jeśli liczba rozcieńczeń danego związku/ekstraktu, który należy przebadać, wynosi osiem lub więcej).
    1. Jeśli związki, leki referencyjne lub którykolwiek z ich składników są światłoczułe, należy przeprowadzić test w ograniczonym świetle, przykryć płytki folią lub umieścić w ciemnej komorze podczas inkubacji.
  3. Rozważ następujące opcjonalne zalecenia.
    1. Uszczelnij płytę przezroczystą pokrywą, która umożliwia wymianę gazu, ponieważ pomaga to zmniejszyć parowanie.
    2. Umieść płytkę w wilgotnej komorze, co również pomoże zmniejszyć parowanie.
  4. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 24 godziny lub 48 godzin w przypadku wszystkich szczepów C. albicans i przez 48 godzin z otrząsaniem 200 obr./min w przypadku C. neoformans. Dolna objętość końcowa (100 μl) zapewnia, że nie dochodzi do rozlania.
    UWAGA: Nie zaobserwowano istotnej różnicy między odczytami MIC po 24 i 48 godzinach dla szczepów C. albicans. Niemniej jednak odczyty po 48 godzinach są łatwiejsze do wizualizacji.
  5. Obserwuj wszystkie studzienki, za pomocą odwróconego mikroskopu optycznego, przed okresem inkubacji i po nim, aby sprawdzić zmiany w morfologii, a także sprawdzić, czy nie ma oznak zanieczyszczenia.
    UWAGA: Odczyty można wykonać wizualnie i sfotografować pod koniec eksperymentu. Przed każdym odczytem należy lekko zhomogenizować płytkę. Odczyty można również wykonać, mierząc jego OD przy 600 nm, jeśli nie obserwuje się zagęszczenia komórek lub filamentacji.
  6. Eksperymenty należy przeprowadzić co najmniej trzy razy w różnych terminach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MIC jest zdefiniowany jako najniższe stężenie związku przeciwdrobnoustrojowego, które całkowicie hamuje widoczny wzrost grzybów pod koniec okresu inkubacji. Ponieważ celem tego protokołu jest posiadanie szybkiej metody badania przesiewowego potencjalnych środków przeciwgrzybiczych, każda studzienka z przezroczystym podłożem podobnym do studzienek ślepych jest uważana za wynik pozytywny, podczas gdy każda studzienka o zmętnieniu analogicznym do studzienek ujemnych/kontrolnych wzrostu jest ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Testy mikrorozcieńczeń mogą analizować potencjalną aktywność przeciwgrzybiczą związku docelowego przy użyciu niewielkich ilości związku, a jednocześnie testować go w zakresie stężeń. W związku z tym protokół ten jest zalecany jako pierwszy krok w badaniach przesiewowych pod kątem potencjalnych nowych związków przeciwgrzybiczych. Przedstawiony tutaj protokół opiera się na protokole M27-A3, początkowo zaprojektowanym w celu pomocy w wyborze terapii przeciwgrzybiczej w klinikach i może być dostosowany do wielu nowych związk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy CAPES-Brazil, CNPq-Brazil, FAP/DF za wsparcie finansowe. Jesteśmy wdzięczni dr Hugo Costacie Paesowi za korektę manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pożywki i odczynniki
RPMI 1640 pożywka z l-glutaminą, bez wodorowęglanu soduThermo Fisher31800-022
Kwas 3-(N-morfolino)propanosulfonowy (MOPS) (o que a gente usa tem um só dio, completa o nome dele please)Sigma-AldrichUżyj do buforowania 2X RPMI medium
Chlorek sodu (NaCl)Dinâ mika1528-1137 mM do soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS)
Chlorek potasu (KCl)J.T.Baker3040-012,7 mM do soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS)
Fosforan sodu dwuzasadowy (Na2HPO4)Sigma-AldrichV00012910 mM do soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS)
Diwodorofosforan potasu (KH2PO4)Sigma-Aldrich602302 mM do soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS)
BD Difco Sabouraud bulion dekstrozowyBD238230
BD Difco Sabouraud Agar dekstrozowyBD210950
GlicerolSigma-AldrichV00012335% dla (soluç ã o de estoque? Criopreservaç ã o?)
Sterylna wodaPara diluiç ã o das drogas na diluiç ã o seriada
Leki przeciwgrzybicze
Amphotericin BSigma-AldrichA2942
FlukonazolSigma-AldrichF8929
CaspofunginSigma-AldrichPHR1160
Plastics
50 mL probówkastożkowaSarstedt62.547.254
Naczynie PetriJ.Prolab0304-5
96 dołkowa płytkaCorning3595
Zbiornik na sterylny roztwórKASVIK30-208Służy do pipetowania roztworów za pomocą wielokanałowego pipetu
Sprzęt i inne materiały
Mikroskop optycznyNikonE200MV
WirówkaThermo FisherMegaFuge 16R
InkubatorEthik Technology403-3D Zestawna 37°
C ShakerNew Brunswick ScientificExcella E25Ustawiony na 37° C, 200 RPM
Komora zliczania komórek, NeubauerBOECO NiemcyBOE 13
Pipeta wielokanałowaHTL5123

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Armstrong-James, D., Meintjes, G., Brown, G. D. A neglected epidemic: fungal infections in HIV/AIDS. Trends Microbiol. 22 (3), 120-127 (2014).
  2. Romani, L. Immunity to fungal infections. Nat Rev Immunol. 11 (4), 275-288 (2011).
  3. Pfaller, M. A. Antifungal drug resistance: mechanisms, epidemiology, and consequences for treatment. Am J Med. 125 (1 Suppl), S3-S13 (2012).
  4. Hancock, R. E., Diamond, G. The role of cationic antimicrobial peptides in innate host defences. Trends Microbiol. 8 (9), 402-410 (2000).
  5. Wang, Y., et al. Snake cathelicidin from Bungarus fasciatus is a potent peptide antibiotics. PLoS One. 3 (9), e3217(2008).
  6. Du, Q., et al. AaeAP1 and AaeAP2: novel antimicrobial peptides from the venom of the scorpion, Androctonus aeneas: structural characterisation, molecular cloning of biosynthetic precursor-encoding cDNAs and engineering of analogues with enhanced antimicrobial and anticancer activities. Toxins (Basel). 7 (2), 219-237 (2015).
  7. Benincasa, M., et al. Fungicidal activity of five cathelicidin peptides against clinically isolated yeasts. J Antimicrob Chemother. 58 (5), 950-959 (2006).
  8. CLSI. Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibiliy Testing of Yeasts; Approved Standard -Third Edition. CLSI document M27-A3. , Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2008).
  9. Guilhelmelli, F., et al. Activity of Scorpion Venom-Derived Antifungal Peptides against Planktonic Cells of Candida spp. and Cryptococcus neoformans and Candida albicans Biofilms. Front Microbiol. 7, 1844(2016).
  10. The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Method for the determination of broth dilution minimum inhibitory concentrations of antifungal agents for yeasts, version, 7.3.1 2017. , Available from: http://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/AFST/Files/EUCAST_E_Def_7_3_1_Yeast_testing__definitive.pdf (2017).
  11. Roongruangsree, U. T., Kjerulf-Jensen, C., Olson, L. W., Lange, L. Viability Tests for Thick Walled Fungal Spores (ex: Oospores of Peronospora manshurica). Journal of Phytopathology. 123 (3), 244-252 (1988).
  12. Boedijn, K. B. Trypan blue as stain for fungi. Stain Technol. 31 (3), 115-116 (1956).
  13. Goihman-Yahr, M., et al. Studies on plating efficiency and estimation of viability of suspensions of Paracoccidioides brasiliensis yeast cells. Mycopathologia. 71 (2), 73-83 (1980).
  14. Tati, S., et al. Histatin 5-spermidine conjugates have enhanced fungicidal activity and efficacy as a topical therapeutic for oral candidiasis. Antimicrob Agents Chemother. 58 (2), 756-766 (2014).
  15. Petrou, M. A., Shanson, D. C. Susceptibility of Cryptococcus neoformans by the NCCLS microdilution and Etest methods using five defined media. J Antimicrob Chemother. 46 (5), 815-818 (2000).
  16. Zaragoza, O., et al. Process analysis of variables for standardization of antifungal susceptibility testing of nonfermentative yeasts. Antimicrob Agents Chemother. 55 (4), 1563-1570 (2011).
  17. Rodriguez-Tudela, J. L., et al. Influence of shaking on antifungal susceptibility testing of Cryptococcus neoformans: a comparison of the NCCLS standard M27A medium, buffered yeast nitrogen base, and RPMI-2% glucose. Antimicrob Agents Chemother. 44 (2), 400-404 (2000).
  18. Beggs, W. H. Growth phase in relation to ketoconazole and miconazole susceptibilities of Candida albicans. Antimicrob Agents Chemother. 25 (3), 316-318 (1984).
  19. Alcouloumre, M. S., Ghannoum, M. A., Ibrahim, A. S., Selsted, M. E., Edwards, J. E. Jr Fungicidal properties of defensin NP-1 and activity against Cryptococcus neoformans in vitro. Antimicrob Agents Chemother. 37 (12), 2628-2632 (1993).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Przesiew przeciwgrzybiczyrozcie czenia seryjnewra liwo grzyb wminimalne st enie hamuj cepeptydy przeciwdrobnoustrojoweCLSI M27 A3p ytki 96 do kowehodowla grzyb wliczenie kom rek

Powiązane artykuły