Pomiar endoreduplikacji za pomocą cytometrii przepływowej izolowanych protoplastów bulw

Summary

Protokół opisany tutaj jest metodą pomiaru endoreduplikacji w bulwach ziemniaka (Solanum tuberosum). Obejmuje etapy plazmolizy i ekstrakcji protoplastów w celu zmniejszenia szumów i zanieczyszczeń w dalszej analizie cytometrycznej przepływowej.

Abstract

Endoreduplikacja, replikacja genomu jądrowego komórki bez późniejszej cytokinezy, daje komórki o zwiększonej zawartości DNA i jest związana ze specjalizacją, rozwojem i wzrostem wielkości komórki. U roślin endoreduplikacja wydaje się ułatwiać wzrost i ekspansję niektórych tkanek i narządów. Wśród nich jest bulwa ziemniaka (Solanum tuberosum), która ulega znacznej ekspansji komórkowej, spełniając swoją funkcję magazynowania węglowodanów. Tak więc endoreduplikacja może odgrywać ważną rolę w tym, jak bulwy są w stanie pomieścić tę obfitość węgla. Jednak szczątki komórkowe powstałe w wyniku prymitywnych metod izolacji jądrowej bulw, metod, które mogą być skutecznie stosowane w przypadku liści, uniemożliwiają oszacowanie wskaźnika endoreduplikacji bulw (EI). W artykule przedstawiono technikę oceny endoreduplikacji bulw poprzez izolację protoplastów, przy jednoczesnym wykazaniu reprezentatywnych wyników uzyskanych z różnych genotypów i podzielonych na przedziały tkanek bulw. Głównymi ograniczeniami protokołu są czas i koszty odczynników wymaganych do przygotowania próbki, a także stosunkowo krótka żywotność próbek po lizie protoplastów. Chociaż protokół jest wrażliwy na różnice techniczne, stanowi postęp w stosunku do tradycyjnych metod izolacji jądrowej od tych dużych, wyspecjalizowanych komórek. Zaproponowano możliwości ulepszenia protokołu, takie jak recykling enzymu, stosowanie utrwalaczy i inne zmiany.

Introduction

Endoreduplikacja to proces, w którym komórka rezygnuje z typowego cyklu komórkowego i przechodzi alternatywny przebieg rozwoju, składający się z powtarzających się rund replikacji DNA bez podziału komórkowego. Powstała komórka będzie miała zwiększoną zawartość DNA i rozmiar jądra, co uważa się za rolę w regulacji, ekspansji i specjalizacji komórek. Ogólnie rzecz biorąc, runda endoreduplikacji (określana jako endocykl) i odpowiadający jej wzrost zawartości DNA są związane z większą objętością komórki, obserwacją, która przyspieszyła "teorię karioplazmatyczną", że zwiększona zawartość DNA jest wymagana do prawidłowego regulowania większej, być może bardziej złożonej, komórki¹. Zjawisko to jest powszechne u roślin wyższych, zaobserwowano je w wielu tkankach, w tym w tkankach o strukturze strukturalnej/obronnej (trichomy)^2,3, odżywcze (bielmo kukurydzy)^4,5, oraz zlew/magazyn (owocnia pomidora; bulwa ziemniaka)^6,7,8 Funkcje. W przypadku owoców zasugerowano, że endoreduplikacja odgrywa rolę w ułatwianiu szybkiej ekspansji owocni, o czym świadczy negatywny związek między endoreduplikacją a okresem rozwoju owoców⁹. Na przykład komórki o zawartości DNA do 512C (512 razy większej niż genom haploidalny) zaobserwowano w klasie owocni pomidora8. Ponadto Chevalier i in. (2014) wykazali, że zmiany w ekspresji genów cyklu komórkowego mogą prowadzić do wzrostu poziomu endoreduplikacji w owocni, co z kolei skutkuje większymi owocami¹⁰. W związku z tym zmiana genów sprzyjająca endoreduplikacji stanowi potencjalny cel dla poprawy biomasy lub plonów poprzez hodowlę roślin lub manipulacje genetyczne. Jednak taka poprawa jest uzależniona od lepszego zrozumienia przyczyn i konsekwencji endoreduplikacji.

Endoreduplikacja jest najczęściej mierzona za pomocą cytometrii przepływowej, gdzie jądra, uwolnione w surowych preparatach tkankowych¹¹, są inkubowane z fluoroforem wiążącym DNA, takim jak jodek propidyny¹² (PI). Przefiltrowane próbki są następnie przepuszczane przez laser cytometru przepływowego, w którym można zaobserwować długości fal emisji specyficzne dla fluoroforu. Intensywność fluorescencji w każdym zdarzeniu (tj. jądrze) jest bezpośrednio skorelowana z zawartością DNA w cząstce. W ten sposób, porównując ze znanym wzorcem, można obliczyć względną i bezwzględną zawartość DNA komórek w danej próbce. Wskaźniki endoreduplikacji (EI) określa się, ustalając średnią liczbę endocykli na komórkę w próbce, obserwując zawartość DNA komórkowego (wartość C), gdzie 1C jest zawartością DNA komórki haploidalnej (wzór przedstawiony w kroku 6.7 protokołu). Na przykład w organizmie diploidalnym podstawowa zawartość DNA w komórkach somatycznych wynosi 2C. Jeśli próbka ma kilka komórek z 4C, co odpowiada pojedynczej rundzie endoreduplikacji, lub większą, będzie miała EI bliskie 0; jednak jeśli prawie wszystkie komórki mają 4C, EI wyniesie około 1. Jednakże, ponieważ wiele rund endoreduplikacji jest powszechnych u wyższych roślin, obserwowane wartości EI mogą być znacznie wyższe. O ile obliczenie wskaźników endoreduplikacji może być stosunkowo proste, o tyle wymaga wiarygodnego ustalenia względnej obfitości wartości C jąder, co jest wykluczone w przypadku niektórych gatunków i tkanek (w tym bulw ziemniaka). Jest prawdopodobne, że różnice w anatomii komórkowej, chemii lub składzie ściany komórkowej¹³ powodują, że próbki te są oporne na typowe preparaty wykorzystujące żyletkę do uwalniania jąder bezpośrednio do odpowiednich, które są powszechnie stosowane w przypadku tkanek takich jak owocnia pomidora, model do badań endoreduplikacyjnych⁸.

W przypadku ziemniaka, badanie endoreduplikacji w bulwie ogranicza się tylko do kilku badań, być może częściowo z powodu braku wiarygodnego protokołu, ponieważ wyżej wymienione prymitywne preparaty dają niespójne wyniki. Podczas gdy takie metody działają dobrze w przypadku liści, próbki bulw doświadczają poważnej degradacji i obfitości hałasu w postaci zanieczyszczeń, co sprawia, że rozróżnienie pików składających się z jąder o różnych wartościach C jest prawie niemożliwe. Być może wynika to z różnic w składzie komórkowym i obfitości resztek komórkowych w komórkach bulw (np. amyloplastów magazynujących skrobię). Aby pokonać tę przeszkodę, opracowaliśmy niedawno bardziej niezawodny protokół uzyskiwania rozróżnialnych pików w cytometrii przepływowej bulw ziemniaka. Częstość komórek w obrębie każdego piku może być następnie wykorzystana do obliczenia dokładnych poziomów endoreduplikacji dla różnych genotypów lub różnych tkanek składających się na bulwę. Protokół, który wykorzystuje zmodyfikowaną metodę ekstrakcji protoplastów^14,15 poprzednik wcześniej opisanej cytometrii przepływowej¹¹, wykazał znaczne różnice wśród krewnych, odmian i tkanek ziemniaka¹⁶. W tym miejscu szczegółowo przedstawiamy protokół, oceniając EI w kontekście ploidalności, tkanki i wielkości bulw.

Protocol

UWAGA: Ważne jest, aby dołączyć odpowiednie kontrole, zwykle w postaci tkanki liściowej o tej samej ploidalności, co próbki eksperymentalne. Dzieje się tak, ponieważ pik 2C w próbkach bulw może być mały i trudny do zidentyfikowania.

1. Przygotowania

UWAGA: Wymienione tutaj roztwory mogą być przygotowane z wyprzedzeniem i przechowywane w temperaturze 4 °C, ale te przedstawione w kolejnych krokach muszą być świeże w dniu użycia.

1. Przygotować odpowiednią objętość roztworu do inkubacji plazmolizy (PIS) (15 ml / próbkę): 0,55 M mannitol, 2 mM CaCl₂, 1 mM KH₂PO₄, 1 mM MgCl₂, 50 mM Bufor Tris pH 7,5 (dostosowany HCl).
2. Przygotować odpowiednią objętość roztworu do płukania plazmolitycznego (PWS) (15 ml / próbkę), który jest identyczny z PIS, z wyjątkiem dodania 0,71 M mannitolu.
3. Przygotuj 250 ml zmodyfikowanego bufora do cytometrii przepływowej Galbraitha ¹¹ (FCB): 13,6 mM cytrynian sodu (trisód), 8 mM MOPS, 18 mM MgCl₂, 0,4% v/v Triton X-100. Mieszaj przez co najmniej 30 minut, aby rozprowadzić Triton X-100.
4. Filtruj roztwory PIS i PWS za pomocą asymetrycznego filtra polieterosulfonowego (aPES) 0,22 μm. Używaj jednostek filtrujących napędzanych podciśnieniem.
5. Przygotuj filtry siatkowe 106 μm dla zlizowanych protoplastów. Przygotować probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml, które mogą być bezpośrednio osadzone w probówkach zbiorczych, jednak można zastosować dowolną metodę przepuszczania zawiesin przez filtr 106 μm.
   UWAGA: Nie muszą być one sterylne.
   1. Jeśli używasz probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml, odetnij 1 cm końcówki każdej probówki do mikrowirówki. Za pomocą płyty grzejnej lub innego źródła ciepła podgrzej 1 cm 2-częściową stalową siatkę 106 μm na kawałku folii aluminiowej. Wciśnij odcięty koniec rurki w siatkę, aż się stopią.
6. Umyj ziemniaki, z których mają być pobrane próbki, usuwając całą ziemię i zanieczyszczenia.
   UWAGA: Wielkość i wiek bulw powinny być odpowiednie do celów eksperymentu, ale nie wydają się wpływać na jakość wyników. Z powodzeniem zastosowaliśmy ten protokół do bulw, które były przechowywane w chłodni (4 °C, 95% wilgotności względnej) do 8 miesięcy. Chociaż bulwy z wadami (np. zgnilizna końca bulw, puste serce, brązowe nekrotyczne obszary) mogą być wrażliwe, należy ich unikać, jeśli to możliwe.

2. Dzień 1: Plazmoliza tkanki bulw

UWAGA: Próbki liści kontrolnych mogą być dołączone tutaj do produkcji protoplastów lub w kroku 5.2, jeśli preferowane są surowe przygotowania. Należy to zrobić za pomocą sterylnych narzędzi w aseptycznym środowisku, takim jak okap z przepływem laminarnym.

1. Powierzchnię bulw ziemniaka sterylizować przez zanurzenie w 75% etanolu na co najmniej 5 minut.
2. Usuń bulwy z etanolu i wysusz na powietrzu. Zwykle trwa to ~5 minut, dłużej, jeśli bulwa jest większa niż 100 g.
3. Przygotować i oznaczyć sterylne stożkowe probówki o pojemności 50 ml dla każdej próbki i wlać do każdej z nich 15 ml wysterylizowanego filtrem PIS.
4. Pobrać próbkę około 1^cm3 pożądanej tkanki ze wysterylizowanych bulw za pomocą wysterylizowanego skalpela lub świdra korkowego.
   UWAGA: W zależności od pobieranej tkanki można użyć wysterylizowanego świdra korkowego lub noża/skalpela. Na przykład, jeżeli pożądany jest rdzeń, można użyć omacnicy korkowej do pobrania rdzenia od wierzchołka do dystalnego końca bulwy i pobrania próbki z centralnej frakcji rdzenia. Jednak ze względu na asymetryczną morfologię wewnętrzną bulw ziemniaka bardziej precyzyjne może być pobranie próbki miąższu lub kory poprzez przepołowienie bulwy i wycięcie pożądanej tkanki. Zobacz Rysunek 1 przedstawia wewnętrzną morfologię bulw.
   1. Za pomocą wysterylizowanego skalpela grubo posiekać tkankę na ok. 3 mm³ kawałki i przenieść tkankę do stożkowej probówki zawierającej PIS. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Ma to na celu maksymalizację powierzchni, tak aby PIS, a później roztwór enzymu, mógł w pełni przeniknąć do tkanki, co skutkuje pełniejszym trawieniem.

Rysunek 1: Wewnętrzna morfologia bulwy ziemniaka. Separacja między rdzeniem (P) a miąższem okołoszpikowym (PM) jest zilustrowana czarnymi liniami. Pierścień naczyniowy, który oddziela miąższ od kory (C), jest oznaczony czarną strzałką. Koniec rozłogowy (S) i oczka bulw (E) są również oznaczone. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Dzień 2: Generowanie protoplastów ziemniaczanych

UWAGA: To musi być wykonane za pomocą sterylnych narzędzi w aseptycznym środowisku, takim jak okap z przepływem laminarnym.

1. Przygotować i przefiltrować (0,45 μm filtr aPES) odpowiednią ilość roztworu enzymatycznego (ES) (10 ml / próbkę): 0,71 M mannitol, 3 mM CaCl₂, 1 mM KH₂PO₄, 1 mM MgCl₂, 4% celulazy Onozuka R-10, 0,8% macerozymu R-10, 1% hemikululazy, 10 mM buforu MES, pH 5,8. Upewnij się, że na tym etapie używane są odpowiednie filtry; Filtry o wielkości porów mniejszej niż 0,45 μm są podatne na zapychanie, podczas gdy membrana o niskim poziomie wiązania białek, taka jak aPES, minimalizuje utratę enzymu podczas filtracji.
2. Odessać PIS z próbek w stożkowych probówkach za pomocą sterylnej pipety serologicznej.
3. Dodaj 10 ml ES do każdej próbki i odwróć 2-3 razy.
4. Próbki inkubować przez noc w temperaturze 29 °C z wytrząsaniem poziomym z prędkością 180 obr./min. Próbki należy inkubować przez co najmniej 16 godzin.

4. Dzień 3: Zbieranie protoplastów i mycie protoplastów

UWAGA: W tym momencie warunki aseptyczne nie są już konieczne.

1. Wyjmij próbki z wytrząsarki i pozostaw na ~10 minut, aby osiadły.
2. Odessać jak najwięcej roztworu ES.
   1. Usunąć jak najwięcej roztworu ES za pomocą pipety serologicznej, uważając, aby nie usunąć strawionej tkanki.
   2. Za pomocą mikropipety usuń pozostały roztwór ES, ponownie unikając strawionej tkanki. Najłatwiej to zrobić, trzymając probówkę pod kątem, tak aby roztwór ES płynął w kierunku pokrywy, podczas gdy strawiona tkanka pozostaje na dnie.
3. Dodaj 15 ml PWS do każdej próbki i delikatnie odwróć 2-3 razy. Pozostawić protoplasty do osiadania na 10 minut.
4. Usunąć PWS za pomocą pipety serologicznej. Użyj mikropipety, aby usunąć pozostały płyn.
   UWAGA: Ten krok jest absolutnie krytyczny dla zapewnienia integralności jąder próbki podczas cytometrii przepływowej. Podczas rozwiązywania problemów ten krok okazał się najbardziej prawdopodobnym źródłem niepowodzenia w próbce.

5. Dzień 3: Przygotowanie próbek do cytometrii przepływowej

UWAGA: Próbki powinny być od tej pory trzymane na lodzie, chyba że zaznaczono inaczej.

1. Przygotować roztwory jodku propidyny (0,4 mg jodku propidyny/ml FCB) i RNazy (0,8 mg RNazy A/ml FCB), rozpuszczając je w FCB.
   UWAGA: Jodek propidyny jest wysoce toksyczny. Unikać kontaktu ze skórą lub oczami. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej.
2. Do każdej próbki dodać 1,5 ml lodowatego FCB. Krótko wstrząsnąć lub zwirować każdą próbkę, aby rozbić zagregowaną tkankę. Ważne jest, aby rozbić grudki tkanki bulw, aby FCB mógł w pełni przeniknąć do komórek i uwolnić jądra. Różne próbki mogą wymagać większego lub mniejszego mieszania w zależności od tkanki i genotypu.
   UWAGA: FCB lizuje protoplasty, uwalniając jądra. Stąd konieczność trzymania próbek na lodzie, aby zapobiec degradacji.
   1. Jeśli próbki kontrolnej cytometrii przepływowej nie zostały uwzględnione w etapie generowania protoplastów, mogą zostać włączone tutaj. Jeśli ma być dodana kontrola, drobno posiekaj mały liść (~3 cm²) w 1,5 ml lodowatego FCB za pomocą żyletki. Próbki kontrolne powinny być tej samej ploidalności co próbki doświadczalne, najlepiej o tym samym genotypie. Sadzonki in vitro mają tendencję do dawania czystszych szczytów niż rośliny uprawiane w szklarniach lub na polu.
3. Przepuścić 1 ml zawiesiny FCB/tkankowej przez filtr siatkowy 106 μm. Użyj probówki do mikrowirówki o pojemności 1.5 ml z odciętą końcówką i metalową siatką stopioną do dna, jak opisano w kroku 1.5.1. Probówkę do mikrowirówek można umieścić bezpośrednio w probówce do mikrowirówek o pojemności 2 ml, a następnie przepuścić przez nią próbkę. W przypadku zastosowania innej metody filtracji, filtrat można zebrać na lodowatej płytce Petriego, a następnie przenieść do probówki o pojemności 2 ml.
   UWAGA: czasami pozostałe agregaty i zanieczyszczenia komórkowe mogą zatkać filtr siatkowy. W takim przypadku wystarczy kilkakrotnie stuknąć w dwie zagnieżdżone probówki wirówkowe, aby usunąć zanieczyszczenia.
4. Do każdej próbki dodać 250 μl roztworu RNazy. Odwrócić i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT).
   UWAGA: Ten etap ma na celu usunięcie RNA z próbek, co prowadzi do zmniejszenia szumów podczas cytometrii przepływowej. Ponieważ jednak jądra są krótkotrwałe, naukowcy mogą zdecydować się na skrócenie czasu inkubacji lub przeprowadzenie jej na lodzie, jeśli doświadczają poważnej degradacji swoich próbek.
5. Do każdej próbki dodać 125 μl roztworu jodku propidyny. Odwrócić i inkubować na lodzie przez 30 min.
   UWAGA: Próbki należy wykorzystać do cytometrii przepływowej tak szybko, jak to możliwe, ponieważ degradacja jest widoczna w ciągu 2 godzin, nawet na lodzie.

6. Dzień 3: Cytometria przepływowa jąder bulw ziemniaka

UWAGA: Działanie cytometru przepływowego i oprogramowanie będą się różnić w zależności od urządzenia i producenta. Szczegółowe instrukcje dotyczące konkretnej obsługi cytometru przepływowego znajdują się w Podręczniku użytkownika przyrządu.

1. Utwórz dwa wykresy punktowe, używając skali logarytmicznej rozproszenia do przodu i rozrzutu bocznego oraz jodku propidyny (PI) i rozrzutu bocznego. Utwórz również histogram z liczbą liczbę punktów określonych na osi x. Skala logarytmiczna jest wymagana, aby upewnić się, że wszystkie zdarzenia mieszczą się w skali, ponieważ jądra mogą znacznie różnić się fluorescencją.
2. Załaduj znaną probówkę kontrolną i dostosuj napięcie tak, aby wszystkie zdarzenia były na dużą skalę. Wykorzystujemy tkankę liścia in vitro z próbnego genotypu. Jeżeli ma być przeprowadzone badanie próbek różnych ploidii, należy dołączyć próbkę kontrolną dla każdej z nich.
   1. Zwrócić uwagę na kanał piku 2C w próbce kontrolnej. Piki 2C w próbkach doświadczalnych powinny przypadać w tym samym miejscu.
3. Załaduj próbkę eksperymentalną (bulwową) i ponownie upewnij się, że wszystkie zdarzenia są na dużą skalę. Jeśli wymagana jest regulacja, powtórz krok 6.2, aby zidentyfikować kanał pików 2C.
4. Ręcznie zabramkować jądra protoplastów za pomocą wykresu rozproszenia bocznego w funkcji PI.
5. Ustaw histogram PI tak, aby pokazywał tylko bramkowany obszar jąder protoplastów.
6. Zbierz żądaną liczbę zdarzeń z każdej próbki. Często badacze używają 10 000 zdarzeń bramkowanych do cytometrii przepływowej; Używamy jednak 2,000 zdarzeń dla próbek protoplastów bulw, aby pomieścić więcej próbek i próbek o niskich stężeniach.
7. Oblicz EI każdej próbki na podstawie histogramów liczby przecinków, korzystając z następującego wzoru:
   EI =
   gdzie 4C jest procentem jąder, które są 4C (reprezentującymi pojedynczą rundę endoreduplikacji), 8C jest procentem, który wynosi 8C i tak dalej. Zobacz Rysunek 4 dla przykładów histogramów i wartości C szczytów.

Results

Produkcja protoplastów

Generowanie protoplastów jest niezbędne do uzyskania powtarzalnych wyników cytometrii przepływowej z bulw ziemniaka, których ogólna morfologia jest wyświetlana w Rysunek 1. Badacze mogą chcieć upewnić się, że przed dodaniem FCP wyprodukowano wysokiej jakości protoplasty, zwłaszcza w przypadku, gdy wymagane jest rozwiązywanie problemów. Większość protoplastów powinna być kulista z minimalnymi wypukłościami (Rysunek 2) i może znacznie różnić się rozmiarem, co być może odzwierciedla różnice w EI.

Rysunek 2: Reprezentatywne protoplasty liści i bulw uzyskane na etapie 4.4 protokołu. Wyizolowane protoplasty powinny być kuliste i symetryczne z nienaruszoną błoną plazmatyczną. Zwróć uwagę na różnicę w wielkości między protoplastami liści (A-C) i bulw (D, E), a także różnice w wielkości w tkance, które mogą wskazywać na różne poziomy endoreduplikacji. Protoplasty liściowe zawierają chloroplasty, podczas gdy amyloplasty są widoczne w protoplastach bulw. Podziałka = 1,000 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ocena wyników cytometrii przepływowej

Powodzenie lub porażkę eksperymentu można ocenić na podstawie szerokości pików i ich separacji na histogramach cytometrii przepływowej. Ponieważ pomiar endoreduplikacji wymaga obliczenia względnej obfitości jąder w każdym piku, sama obecność lub brak pików jest niewystarczająca, jeśli jest zbyt dużo szumu, aby wyznaczyć znaczące granice między nimi. Rysunek 3 pokazuje różnice w wynikach, które badacze mogą napotkać zarówno na wykresach punktowych cytometrii przepływowej, jak i na histogramach. W dyskusji przedstawiono potencjalne przyczyny nieudanych próbek.

Rysunek 3: Reprezentatywne wyniki uzyskane za pomocą cytometrii przepływowej jąder protoplastów nienaruszonych i zdegradowanych próbek rdzeniowych. Nienaruszone jądra (A) wykazują czystą separację między pikami w celu ilościowego określenia względnej obfitości komórek w każdym z nich przy użyciu odpowiedniego oprogramowania, podczas gdy piki w zdegradowanych próbkach (B) pokazują przesunięte, szerokie i nakładające się zasady. Na wykresach rozrzutu próbek nienaruszonych (C) i zdegradowanych (D) czarne pola wskazują bramkowanie zdarzeń jądrowych dla histogramów, a grupowanie zdarzeń znajduje odzwierciedlenie w szerokości pików histogramu. Zdarzenia poza bramkami wskazują na szczątki, poważnie zdegradowane jądra lub inne agregaty. PI-H odpowiada intensywności fluorescencji, która jest mierzona w dowolnych jednostkach. W tekście omówiono metody rozwiązywania problemów zapobiegające degradacji próbki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Różnice endoreduplikacji między tkankami

Poprzednio informowaliśmy, że tkanka rdzenia bulwy ma znacznie wyższy poziom endoreduplikacji niż tkanka kory mózgowej¹⁶. Aby to potwierdzić i rozwinąć, przyjrzeliśmy się poziomom endoreduplikacji trzech różnych tkanek w CV. Nadrzędne: rdzeń, miąższ okołoszpikowy i kora, replikowane w trzech egzemplarzach z 2,000 bramkowanych zdarzeń na próbkę. Nasze wyniki potwierdziły naszą wcześniejszą obserwację, że tkanka rdzeniowa ma znacznie większe EI niż tkanka korowa ze średnimi odpowiednio 1,79 i 1,12 endocykli na komórkę (p = 0,018; Test t-Studenta). Nieco zaskakujące jest to, że tkanka miąższu wykazywała profil podobny do kory mózgowej, a także istotnie różniła się od tkanki rdzeniowej (średnia = 1,14; p = 0,013; Test t-Studenta). Wyniki te są podsumowane w Rysunek 4.

Rycina 4: Endoreduplikacja w trzech tkankach układu krążenia Superior. Histogramy tkanek liścia (A), kory bulw (B), miąższu (C) i rdzenia (D) są pokazane wraz z wartością EI obliczoną na podstawie tych histogramów. Różnice we względnej obfitości jąder składających się na każdy pik są łatwo widoczne, zwłaszcza między tkankami liści i bulw. Wyświetlane są również wartości C dla każdego piku. PI-H odpowiada intensywności fluorescencji, która jest mierzona w dowolnych jednostkach. Średnie porównania EI tkanek bulw są wyświetlane w E, gdzie gwiazdka oznacza istotną różnicę (p <0,05), a słupki błędu pokazują odchylenie standardowe. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wpływ wielkości bulw i ploidalności

Wcześniej informowaliśmy, że dla danego genotypu, bulwy o różnej wielkości, ale podobnej dojrzałości, nie wykazywały odpowiedniej różnicy w EI¹⁶. Naszym celem było potwierdzenie tego wyniku, a także ocena związku między ploidalnością a endoreduplikacją. W tym eksperymencie wykorzystano trzy powtórzenia tkanki miąższowej z trzech różnych genotypów: cv. Superior (4x), VT_SUP_19 (2x), który jest dihaploidem wyekstrahowanym z cv. Lepszy pod względem kolczastego zapylenia¹⁷, a VT_SUP_19 4x, który jest podwojonym dihaploidem^{18 izogenicznym} do VT_SUP_19. Dołączyliśmy zestaw powtórzeń dla dużych (90–130 g) i małych (<35 g) bulw dla odmiany . Superior, podczas gdy bulwy dla pozostałych dwóch genotypów wynosiły 90–130 g. Wszystkie bulwy zostały zebrane z roślin uprawianych w szklarni w osiągnięciu pełnej dojrzałości, tj. w momencie, gdy wierzchołki roślin uległy starości. Zaobserwowaliśmy istotną różnicę między VT_SUP_19 a jego protoplastą Superior (p = 0,04); Nie stwierdzono jednak istotnej różnicy między VT_SUP_19 a VT_SUP_19 4x (p = 0,69). Wskazuje to, że chociaż istnieje prawdopodobny komponent genetyczny endoreduplikacji, który został zdemaskowany przez redukcję genomu, nie jest on podyktowany ploidalnością, przynajmniej w tym tle. Wreszcie, po raz kolejny nie zaobserwowaliśmy istotnych różnic między dużym a małym CV. Doskonałe bulwy, jak pokazano na Rysunek 5.

Rycina 5: Endoreduplikacja w dwóch rozmiarach bulw odmiany Superior i jej pochodnych diploidalnych (VT_Sup_19) i tetraploidalnych (VT_Sup_19 4x). Wykres słupkowy przedstawia średnią dla małych (<35 g) i dużych (90–130 g) CV. Bulwy lepsze oraz duże (90–130 g) bulwy VT_SUP_19 dihaploidów i izogeniczne dwuskrzydłowe VT_SUP_19 4x. Istotne różnice (p <0,05) są wskazane w raporcie z listu łączącego. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

Przedstawiony w niniejszym dokumencie protokół dostarcza naukowcom środków do oceny endoreduplikacji w bulwach ziemniaka, których zmodyfikowana zawartość komórkowa i zwiększony rozmiar komórek wydają się wykluczać inne preparaty cytometrii przepływowej. Protokół opiera się na wytwarzaniu protoplastów jako sposobie na zmniejszenie hałasu i zanieczyszczeń przy jednoczesnym zachowaniu integralności jądrowej. Wcześniej naukowcy opisywali podobne preparaty dla szczególnie opornych próbek cytometrii przepływowej, a także wykorzystywali protoplasty bulw do badania różnych tematów, takich jak patogeneza^19,20. Jednak, o ile nam wiadomo, żaden z nich nie połączył zastosowania takich protoplastów bulw z cytometrią przepływową w celu zbadania endoreduplikacji. Ponadto stwierdziliśmy, że stosowanie protoplastów jest bardziej wiarygodne niż typowe surowe preparaty, a także technika zastosowana w dwóch innych badaniach do oceny endoreduplikacji bulw ^6,7. W tym miejscu omawiamy niedociągnięcia protokołu, potencjalne pułapki w jego wykonaniu i przygotowaniu próbki oraz wyniki typowego eksperymentu, w którym go wykorzystano.

Pomimo użyteczności i powtarzalności protokołu cytometrii przepływowej bulw, ma on kilka słabych punktów, które należy omówić. Po pierwsze, protokół jest czasochłonny i wymaga dwóch nocnych inkubacji. Ponadto protokół wymaga pewnych drogich odczynników, zwłaszcza celulazy i macerozymu. Dodatkowo preparaty są bardzo wrażliwe na czas, rozkładają się w ciągu kilku godzin, co może ograniczyć przepustowość w ciągu jednego dnia, zwłaszcza jeśli pożądanych jest wiele wydarzeń. Wreszcie, protokół, choć wiarygodny, jest wrażliwy na błędy w przygotowaniu próbek, z których wszystkie wydają się skutkować uszkodzeniem jąder i niższą jakością wyników. Na przykład zanieczyszczenie mikrobiologiczne może wystąpić na etapach plazmolizy i generowania protoplastów (1–3.4) z powodu niewłaściwej techniki aseptycznej. Zanieczyszczenie próbki, choć nie zawsze wyklucza sukces próbki, wydaje się dramatycznie obniżać jakość uzyskanych histogramów, co również jest prawdopodobne z powodu uszkodzenia jąder.

Jak wspomniano wcześniej, głównymi wadami protokołu są koszty, czas i wrażliwość na błędy. Badacze mogą chcieć podjąć kroki w celu złagodzenia każdego z nich. Jeśli chodzi o koszty, naukowcy zamierzający zastosować protokół do wielu próbek mogą rozważyć modyfikację stężeń enzymów i/lub czasu trwania etapu trawienia, ponieważ różne tkanki i genotypy mogą różnić się reakcją. Obejmuje to możliwość filtrowania i recyklingu ES, która została wcześniej zademonstrowana, ale nie została w tym przypadku wykorzystana²¹. Jeśli chodzi o czas, z naszych obserwacji wynika, że można zrezygnować z pierwszej inkubacji (etap plazmolizy) i nadal ekstrahować protoplasty; Jednak ucierpi na tym ich integralność i obfitość, co negatywnie wpłynie na wyniki. Aby zmniejszyć pogorszenie jakości próbek, badacze mogą wziąć pod uwagę, że niektóre podejścia cytometrii przepływowej obejmują użycie utrwalaczy (np. formaldehydu) w celu zachowania integralności próbki²². Może to być użyteczny sposób zarówno zapobiegania pogorszeniu jakości, jak i umożliwienia przechowywania próbki, zamiast ekstrakcji protoplastów i cytometrii przepływowej występującej w tym samym dniu, w którym przedstawiono tę metodę. Innym sposobem zapobiegania ścieraniu jąder może być włączenie inhibitora nukleazy do ES i/lub FBC; Podczas gdy 2-merkaptoetanol nie spowodował zauważalnych zmian podczas opracowywania, inne inhibitory nie zostały przetestowane w tym artykule.

Z naszych obserwacji wynika, że najbardziej krytycznym krokiem jest krok 4.4, czyli usunięcie całego roztworu do płukania plazmolitycznego przed dodaniem buforu cytometrii przepływowej (FCB). Jeśli pozostanie nawet niewielka objętość (<10 μl), istnieje znacznie większe prawdopodobieństwo, że próbki ulegną degradacji, co może prowadzić do złej jakości lub nawet nieudanej próbki. Jest to prawdopodobnie spowodowane zanieczyszczeniami w roztworze enzymatycznym (np. nukleazy, proteazy)^23,24, które szybko rozkładają jądra w okresach inkubacji i w czasie między seriami próbek, nawet przy niskich stężeniach. Inną ważną kwestią jest czas trwania etapów inkubacji PI i RNazy. Jak zauważono w protokole, próbki nie pozostają stabilne dłużej niż kilka godzin po dodaniu FCB, więc naukowcy mogą zdecydować się na skrócenie czasu trwania tych etapów, aby pomieścić więcej próbek lub długie przebiegi cytometrii przepływowej wynikające z niskich stężeń jąder. Wymaga to również od badacza rozważenia kompromisu między liczbą zdarzeń na próbkę a całkowitą liczbą próbek, które mają być przeprowadzone, lub rozważenia użycia utrwalaczy, jak wspomniano wcześniej.

Różnice między tkankami a genotypami

Aby zapewnić wyniki reprezentatywne dla protokołu, zaprojektowaliśmy dwa proste eksperymenty, aby potwierdzić wcześniej zgłoszoną zmienność w zależności od tkanki i zbadać wpływ ploidalności i genotypu. Wyniki eksperymentu tkankowego pokazują, że protokół daje powtarzalne wyniki, ponieważ po raz kolejny stwierdzono, że tkanka rdzeniowa ma najwyższe EI. Nieco zaskakujące jest to, że tkanka miąższowa, która nie była wcześniej oceniana, miała wartość EI zbliżoną do tkanki korowej i znacznie niższą niż rdzeń. Nie było to przewidziane, ponieważ komórki miąższowe są zazwyczaj większe niż komórki rdzeniowe lub korowe, przynajmniej w okresie dojrzałości. Jednym z możliwych wyjaśnień jest to, że bulwy (90–130 g) były zbyt niedojrzałe, aby komórki miękiszowe, które w momencie osiągnięcia dojrzałości stanowią większość objętości bulw, mogły w pełni się rozwinąć i osiągnąć maksymalne wartości C²⁵. Może to również wyjaśniać, dlaczego dihaploid (VT_SUP_19) i podwojony dihaploid (VT_SUP_19 4x) wykazywały znacznie większe EI niż CV. Doskonałe bulwy; Podczas gdy z każdego genotypu pobrano próbki bulw o mniej więcej równej wielkości, maksymalny rozmiar bulw z VT_SUP_19 lub tetraploidalnego izogenicznego jest znacznie mniejszy niż w przypadku genetypu. Tak więc może się zdarzyć, że wykazywały one większe EI po prostu dlatego, że były większe w stosunku do ich maksymalnego osiągalnego rozmiaru. Alternatywnie, różnica może być konsekwencją genetycznego dopełniacza, VT_SUP_19 otrzymany od jego tetraploidalnego przodka. Inną możliwością jest to, że redukcja genomu, która nastąpiła podczas ekstrakcji dihaploidu z tetraploidalnego, mogła ujawnić zamaskowane szkodliwe allele, powodując stres w całej roślinie, który, jak wykazano, również przyczynia się do podwyższonego EI²⁶. Niemniej jednak świadczy to o starannym rozważeniu, jakie naukowcy muszą zachować przy wyborze bulw i tkanek, które mają być wykorzystane do porównania wartości EI, zwłaszcza między genotypami.

Przyszłe zastosowania

Protokół opisany w tym artykule dostarcza naukowcom ważnego narzędzia do zrozumienia endoreduplikacji u ziemniaków. Może to pozwolić na prowadzenie badań nad genetycznymi i środowiskowymi składnikami endoreduplikacji, przebiegiem rozwoju w tkankach bulw oraz oceną naturalnej zmienności. W ostatecznym rozrachunku, endoreduplikacja może stanowić obiecujący cel w zakresie poprawy jakości ziemniaka, co będzie wymagało wiarygodnych metod oceny.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pipeta serologiczna	Fisher	13-676-10k	(sterylna)
Pipet Aid XP (autopipettor)	Drummond Scientific	4-000-101
Probówki stożkowe (50 mL)	Thermo Fisher Scientific	339652	(sterylne)
Probówki do mikrowirówek (1,5 mL)	Globe Scientific	111558
Probówki do mikrowirówek (2 mL)	Globe Scientific
Jednostka filtracji próżniowej (0,22 &mikro; m)(aPES)	Thermo Fisher Scientific	564-0020	(sterylne)
Jednostka filtracji próżniowej (0,45 &mikro; m)(aPES)	Thermo Fisher Scientific	168-0045	(sterylne)
Celulaza "Onozuka R-10"	Yakult		kontakt firma
Macerozyme "Onozuka R-10"	Firma kontaktowa	Yakult
Hemicellulaza	Sigma	H2125
Tris base
	Acros Organics	172590250
Triton X-100	MP Biochemikalia	194854
Chlorek magnezu (sześciowodny)	Fisher Scientific	M35-500
Chlorek wapnia (dwuwodny)	Fisher Scientific	C79-500
D-mannitol	Acros Organics	423922500
MOPS	Acros Organics	17263-0250
Fosforan potasu (jednozasadowy, bezwodny)	Sigma-Aldrich	P-5379
Jodek propidyny	Sigma-Aldrich	P4170	Do preparatów cytometrii przepływowej
Rybonukleaza A	Sigma-Aldrich	R5000	Do preparatów cytometrii przepływowej
Świdry korkowe z dziurkaczem	American Scientific	2093-02	Do pobierania próbek pożądanej tkanki
Kleszcze	Thermo Fisher Scientific	16-31	Do mapowania pożądanej tkanki
Skalpel	Thermo Fisher Scientific	08-920B	Do mapowania pożądanej
tkanki 106 µ m siatka ze stali nierdzewnej lub inna siatka o tym samym rozmiarze porów	New Jersey Wire Mesh Co.		Skontaktuj się z firmą