Protokół opisany tutaj jest metodą pomiaru endoreduplikacji w bulwach ziemniaka (Solanum tuberosum). Obejmuje etapy plazmolizy i ekstrakcji protoplastów w celu zmniejszenia szumów i zanieczyszczeń w dalszej analizie cytometrycznej przepływowej.
Artykuł metodologiczny
Pomiar endoreduplikacji za pomocą cytometrii przepływowej izolowanych protoplastów bulw
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Endoreduplikacja, replikacja genomu jądrowego komórki bez późniejszej cytokinezy, daje komórki o zwiększonej zawartości DNA i jest związana ze specjalizacją, rozwojem i wzrostem wielkości komórki. U roślin endoreduplikacja wydaje się ułatwiać wzrost i ekspansję niektórych tkanek i narządów. Wśród nich jest bulwa ziemniaka (Solanum tuberosum), która ulega znacznej ekspansji komórkowej, spełniając swoją funkcję magazynowania węglowodanów. Tak więc endoreduplikacja może odgrywać ważną rolę w tym, jak bulwy są w stanie pomieścić tę obfitość węgla. Jednak szczątki komórkowe powstałe w wyniku prymitywnych metod izolacji jądrowej bulw, metod, które mogą być skutecznie stosowane w przypadku liści, uniemożliwiają oszacowanie wskaźnika endoreduplikacji bulw (EI). W artykule przedstawiono technikę oceny endoreduplikacji bulw poprzez izolację protoplastów, przy jednoczesnym wykazaniu reprezentatywnych wyników uzyskanych z różnych genotypów i podzielonych na przedziały tkanek bulw. Głównymi ograniczeniami protokołu są czas i koszty odczynników wymaganych do przygotowania próbki, a także stosunkowo krótka żywotność próbek po lizie protoplastów. Chociaż protokół jest wrażliwy na różnice techniczne, stanowi postęp w stosunku do tradycyjnych metod izolacji jądrowej od tych dużych, wyspecjalizowanych komórek. Zaproponowano możliwości ulepszenia protokołu, takie jak recykling enzymu, stosowanie utrwalaczy i inne zmiany.
Wprowadzenie
Endoreduplikacja to proces, w którym komórka rezygnuje z typowego cyklu komórkowego i przechodzi alternatywny przebieg rozwoju, składający się z powtarzających się rund replikacji DNA bez podziału komórkowego. Powstała komórka będzie miała zwiększoną zawartość DNA i rozmiar jądra, co uważa się za rolę w regulacji, ekspansji i specjalizacji komórek. Ogólnie rzecz biorąc, runda endoreduplikacji (określana jako endocykl) i odpowiadający jej wzrost zawartości DNA są związane z większą objętością komórki, obserwacją, która przyspieszyła "teorię karioplazmatyczną", że zwiększona zawartość DNA jest wymagana do prawidłowego regulowania większej, być może bardziej złożonej, komórki1. Zjawisko to jest powszechne u roślin wyższych, zaobserwowano je w wielu tkankach, w tym w tkankach o strukturze strukturalnej/obronnej (trichomy)2,3, odżywcze (bielmo kukurydzy)4,5, oraz zlew/magazyn (owocnia pomidora; bulwa ziemniaka)6,7,8 Funkcje. W przypadku owoców zasugerowano, że endoreduplikacja odgrywa rolę w ułatwianiu szybkiej ekspansji owocni, o czym świadczy negatywny związek między endoreduplikacją a okresem rozwoju owoców9. Na przykład komórki o zawartości DNA do 512C (512 razy większej niż genom haploidalny) zaobserwowano w klasie owocni pomidora8. Ponadto Chevalier i in. (2014) wykazali, że zmiany w ekspresji genów cyklu komórkowego mogą prowadzić do wzrostu poziomu endoreduplikacji w owocni, co z kolei skutkuje większymi owocami10. W związku z tym zmiana genów sprzyjająca endoreduplikacji stanowi potencjalny cel dla poprawy biomasy lub plonów poprzez hodowlę roślin lub manipulacje genetyczne. Jednak taka poprawa jest uzależniona od lepszego zrozumienia przyczyn i konsekwencji endoreduplikacji.
Endoreduplikacja jest najczęściej mierzona za pomocą cytometrii przepływowej, gdzie jądra, uwolnione w surowych preparatach tkankowych11, są inkubowane z fluoroforem wiążącym DNA, takim jak jodek propidyny12 (PI). Przefiltrowane próbki są następnie przepuszczane przez laser cytometru przepływowego, w którym można zaobserwować długości fal emisji specyficzne dla fluoroforu. Intensywność fluorescencji w każdym zdarzeniu (tj. jądrze) jest bezpośrednio skorelowana z zawartością DNA w cząstce. W ten sposób, porównując ze znanym wzorcem, można obliczyć względną i bezwzględną zawartość DNA komórek w danej próbce. Wskaźniki endoreduplikacji (EI) określa się, ustalając średnią liczbę endocykli na komórkę w próbce, obserwując zawartość DNA komórkowego (wartość C), gdzie 1C jest zawartością DNA komórki haploidalnej (wzór przedstawiony w kroku 6.7 protokołu). Na przykład w organizmie diploidalnym podstawowa zawartość DNA w komórkach somatycznych wynosi 2C. Jeśli próbka ma kilka komórek z 4C, co odpowiada pojedynczej rundzie endoreduplikacji, lub większą, będzie miała EI bliskie 0; jednak jeśli prawie wszystkie komórki mają 4C, EI wyniesie około 1. Jednakże, ponieważ wiele rund endoreduplikacji jest powszechnych u wyższych roślin, obserwowane wartości EI mogą być znacznie wyższe. O ile obliczenie wskaźników endoreduplikacji może być stosunkowo proste, o tyle wymaga wiarygodnego ustalenia względnej obfitości wartości C jąder, co jest wykluczone w przypadku niektórych gatunków i tkanek (w tym bulw ziemniaka). Jest prawdopodobne, że różnice w anatomii komórkowej, chemii lub składzie ściany komórkowej13 powodują, że próbki te są oporne na typowe preparaty wykorzystujące żyletkę do uwalniania jąder bezpośrednio do odpowiednich, które są powszechnie stosowane w przypadku tkanek takich jak owocnia pomidora, model do badań endoreduplikacyjnych8.
W przypadku ziemniaka, badanie endoreduplikacji w bulwie ogranicza się tylko do kilku badań, być może częściowo z powodu braku wiarygodnego protokołu, ponieważ wyżej wymienione prymitywne preparaty dają niespójne wyniki. Podczas gdy takie metody działają dobrze w przypadku liści, próbki bulw doświadczają poważnej degradacji i obfitości hałasu w postaci zanieczyszczeń, co sprawia, że rozróżnienie pików składających się z jąder o różnych wartościach C jest prawie niemożliwe. Być może wynika to z różnic w składzie komórkowym i obfitości resztek komórkowych w komórkach bulw (np. amyloplastów magazynujących skrobię). Aby pokonać tę przeszkodę, opracowaliśmy niedawno bardziej niezawodny protokół uzyskiwania rozróżnialnych pików w cytometrii przepływowej bulw ziemniaka. Częstość komórek w obrębie każdego piku może być następnie wykorzystana do obliczenia dokładnych poziomów endoreduplikacji dla różnych genotypów lub różnych tkanek składających się na bulwę. Protokół, który wykorzystuje zmodyfikowaną metodę ekstrakcji protoplastów14,15 poprzednik wcześniej opisanej cytometrii przepływowej11, wykazał znaczne różnice wśród krewnych, odmian i tkanek ziemniaka16. W tym miejscu szczegółowo przedstawiamy protokół, oceniając EI w kontekście ploidalności, tkanki i wielkości bulw.
Protokół
UWAGA: Ważne jest zastosowanie odpowiednich kontroli, zazwyczaj w postaci tkanki liściowej o tej samej ploidii co próbki eksperymentalne. Wynika to z faktu, że pik 2C w próbkach bulw może być niewielki i trudny do zidentyfikowania.
1. Przygotowania
UWAGA: Roztwory wymienione w tym miejscu mogą zostać przygotowane wcześniej i przechowywane w temperaturze 4 °C, natomiast roztwory przedstawione w kolejnych krokach muszą zostać przygotowane na świeżo w dniu użycia.
- Przygotować odpowiednią objętość roztworu do inkubacji plazmolitycznej (PIS) (15 mL/próbkę): 0,55 M mannitolu, 2 mM CaCl2, 1 mM KH2PO4, 1 mM MgCl2, 50 mM buforu Tris pH 7,5 (skorygowanego HCl).
- Przygotować odpowiednią objętość roztworu do przemywania plazmolitycznego (PWS) (15 mL/próbkę), który jest identyczny z PIS, z wyjątkiem dodania 0,71 M mannitolu.
- Przygotować 250 mL zmodyfikowanego buforu do cytometrii przepływowej wg Galbraitha11 (FCB): 13,6 mM cytrynianu sodu (trisodowego), 8 mM MOPS, 18 mM MgCl2, 0,4% v/v Triton X-100. Mieszać przez co najmniej 30 min, aby równomiernie rozprowadzić Triton X-100.
- Przefiltrować roztwory PIS i PWS w celu sterylizacji, używając filtra z asymetrycznego polietersulfonu (aPES) o rozmiarze porów 0,22 µm. Należy zastosować jednostki filtracji próżniowej.
- Przygotować filtry z siatki 106 µm dla lizowanych protoplastów. Przygotować probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL, które można bezpośrednio umieścić w probówkach zbiorczych, choć dopuszczalna jest każda metoda przepuszczania zawiesin przez filtr 106 µm.
UWAGA: Filtry te nie muszą być sterylne.- W przypadku użycia probówek do mikrocentryfugi 1,5 mL, należy odciąć 1 cm końcówki każdej probówki. Używając płyty grzejnej lub innego źródła ciepła, podgrzać fragment stalowej siatki 106 µm o wymiarach 1 cm2 na kawałku folii aluminiowej. Docisnąć odcięty koniec probówki do siatki, aż ulegną one stopieniu.
- Umyć ziemniaki przeznaczone do pobrania próbek, usuwając całą ziemię i zanieczyszczenia.
UWAGA: Wielkość i wiek bulw powinny być dostosowane do celów eksperymentu, jednak nie wydają się one wpływać na jakość wyników. Pomyślnie zastosowaliśmy ten protokół do bulw przechowywanych w chłodni (4 °C, 95% RH) do 8 miesięcy. Choć bulwy z defektami (np. zgnilizna końca bulwy, pusta serce, brązowe obszary nekrotyczne) mogą wykazywać odpowiedź, należy ich w miarę możliwości unikać.
2. Dzień 1: Plasmoliza tkanki bulwy
UWAGA: W tym miejscu można uwzględnić kontrolne próbki liści w celu wytworzenia protoplastów lub zrobić to w kroku 5.2, jeśli preferowane są preparaty surowe. Czynność tę należy przeprowadzić za pomocą sterylnych narzędzi w środowisku aseptycznym, takim jak komora z laminarnym przepływem powietrza.
- Przeprowadzić sterylizację powierzchniową bulw ziemniaka poprzez zanurzenie w 75% etanolu na co najmniej 5 min.
- Wyjąć bulwy z etanolu i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu. Zazwyczaj trwa to ~5 min, a dłużej w przypadku bulw o masie powyżej 100 g.
- Przygotować i opisać sterylne stożkowe probówki o pojemności 50 mL dla każdej próbki i odmierzyć do każdej z nich 15 mL sterylizowanego przez filtr roztworu PIS.
- Pobrać próbkę około 1 cm3 pożądanej tkanki ze sterylizowanych bulw, używając sterylnego skalpela lub wycinaka do korka.
UWAGA: W zależności od pobieranej tkanki można zastosować sterylny wycinak do korka lub nóż/skalpel. Na przykład, jeśli pobierany jest rdzeń, można użyć wycinaka do korka w celu pobrania rdzenia od końca apikalnego do dystalnego bulwy, a następnie pobrać środkową część rdzenia. Jednak ze względu na asymetryczną morfologię wewnętrzną bulw ziemniaka, pobranie miąższu lub kory może być bardziej precyzyjne poprzez przekrojenie bulwy na pół i wycięcie pożądanej tkanki. Przedstawienie wewnętrznej morfologii bulwy znajduje się na Rysunku 1.- Grubo posiekać tkankę za pomocą sterylnego skalpela na kawałki o wielkości ok. 3 mm3 i przenieść ją do probówki stożkowej zawierającej PIS. Inkubować przez noc w 4 °C.
UWAGA: Ma to na celu maksymalizację powierzchni kontaktu, aby PIS, a później roztwór enzymu, mogły w pełni przeniknąć do tkanki, co zapewni bardziej całkowite trawienie.
- Grubo posiekać tkankę za pomocą sterylnego skalpela na kawałki o wielkości ok. 3 mm3 i przenieść ją do probówki stożkowej zawierającej PIS. Inkubować przez noc w 4 °C.
Rycina 1: Morfologia wewnętrzna bulwy ziemniaka. Rozdzielenie rdzenia (P) i miąższu perymedularnego (PM) zaznaczono czarnymi liniami. Pierścień przewodzący, który oddziela miąższ od kory (C), oznaczono czarną strzałką. Oznaczono również koniec rozłogu (S) oraz oczka bulwy (E). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
3. Dzień 2: Generowanie protoplastów ziemniaka
UWAGA: Procedurę tę należy przeprowadzić przy użyciu sterylnych narzędzi w środowisku aseptycznym, takim jak komora z laminarnym przepływem powietrza.
- Przygotować i przefiltrować (filtr aPES 0.45 µm) odpowiednią ilość roztworu enzymatycznego (ES) (10 mL/próbkę): 0.71 M mannitolu, 3 mM CaCl2, 1 mM KH2PO4, 1 mM MgCl2, 4% celulazy Onozuka R-10, 0.8% macerozymu R-10, 1% hemicelulazy oraz 10 mM buforu MES, pH 5.8. Na tym etapie należy użyć odpowiednich filtrów; filtry o rozmiarze porów mniejszym niż 0.45 µm są podatne na zapychanie, natomiast membrana o niskim wiązaniu białek, taka jak aPES, minimalizuje straty enzymu podczas filtracji.
- Odessać PIS z próbek w probówkach stożkowych za pomocą sterylnej pipety serologicznej.
- Dodać 10 mL ES do każdej próbki i odwrócić probówki 2–3 razy.
- Inkubować próbki przez noc w temperaturze 29 °C przy poziomym wytrząsaniu z prędkością 180 rpm. Inkubację prowadzić przez co najmniej 16 h.
4. Dzień 3: Pozyskiwanie i płukanie protoplastów
UWAGA: Na tym etapie warunki aseptyczne nie są już wymagane.
- Wyjąć próbki z wytrząsarki i pozostawić je do odstania przez około 10 min.
- Odssać jak największą ilość roztworu ES.
- Usunąć za pomocą pipety serologicznej jak największą ilość roztworu ES, uważając, aby nie usunąć strawionej tkanki.
- Za pomocą mikropipety należy usunąć pozostały roztwór ES, ponownie unikając kontaktu z trawioną tkanką. Najłatwiej zrobić to, trzymając probówkę pod kątem tak, aby roztwór ES spływał w stronę zakrętki, podczas gdy trawiona tkanka pozostanie na dnie.
- Do każdej próbki należy dodać 15 ml PWS i delikatnie odwrócić naczynie 2–3 razy. Pozostawić protoplasty do osadzenia na 10 min.
- Usunąć PWS za pomocą pipety serologicznej. Pozostałą ciecz usunąć za pomocą mikropipety.
UWAGA: Ten krok jest absolutnie kluczowy dla zapewnienia integralności jąder w próbce podczas cytometrii przepływowej. W ramach rozwiązywania problemów ustalono, że krok ten jest najczęstszym źródłem niepowodzenia w analizie próbki.
5. Dzień 3: Przygotowanie próbek do cytometrii przepływowej
UWAGA: Od tego momentu próbki należy przechowywać w lodzie, chyba że zaznaczono inaczej.
- Przygotować roztwory jodku propidyny (0,4 mg jodku propidyny/mL FCB) i RNazy (0,8 mg RNazy A/mL FCB), rozpuszczając odpowiednio każdą z substancji w buforze FCB.
OSTRZEŻENIE: Jodek propidyny jest wysoce toksyczny. Należy unikać kontaktu ze skórą lub oczami. Należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE). - Do każdej próbki dodać 1,5 mL lodowatego buforu FCB. Każdą próbkę krótko wstrząsnąć lub wymieszać na wirówce typu vortex, aby rozbić agregaty tkanki. Ważne jest rozbicie grudek tkanki bulwy, aby FCB mógł w pełni przeniknąć do komórek i uwolnić jądra. Różne próbki mogą wymagać silniejszego lub słabszego mieszania, w zależności od tkanki i genotypu.
UWAGA: FCB lizuje protoplasty, uwalniając jądra. Stąd konieczność utrzymywania próbek w lodzie, aby zapobiec degradacji.- Jeśli próbki kontrolne do cytometrii przepływowej nie zostały uwzględnione na etapie generowania protoplastów, można je dodać teraz. W przypadku dodawania kontroli, należy drobno posiekać mały liść (~3 cm2) w 1,5 mL lodowatego FCB za pomocą żyletki. Próbki kontrolne powinny mieć tę samą ploidię co próbki eksperymentalne, najlepiej ten sam genotyp. Sadzonki in vitro mają tendencję do generowania czystszych pików niż rośliny z cieplarni lub z upraw polowych.
- Przepuścić 1 mL zawiesiny FCB/tkanka przez filtr siatkowy o oczkach 106 µm. Należy użyć probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 mL z odciętym końcem i wtopioną w dno metalową siatką, zgodnie z opisem w kroku 1.5.1. Tę probówkę można umieścić bezpośrednio w probówce do mikrowirówki o pojemności 2 mL i przepuścić przez nią próbkę. W przypadku zastosowania innej metody filtracji, filtrat można zebrać na lodowatej płytce Petriego, a następnie przenieść do probówki 2 mL.
UWAGA: pozostałe agregaty i szczątki komórkowe mogą czasami zapchać filtr siatkowy. W takim przypadku należy kilka razy stuknąć dwiema włożonymi jedna w drugą probówkami, aby usunąć zatory. - Do każdej próbki dodać 250 µL roztworu RNazy. Odwrócić probówki i inkubować przez 30 min w temperaturze pokojowej (RT).
UWAGA: Ten krok ma na celu usunięcie RNA z próbek, co prowadzi do zmniejszenia poziomu szumów podczas cytometrii przepływowej. Jednak ze względu na krótką żywotność jąder, badacze mogą zdecydować o skróceniu czasu inkubacji lub przeprowadzeniu jej w lodzie, jeśli zauważą silną degradację swoich próbek. - Do każdej próbki dodać 125 µL roztworu jodku propidyny. Odwrócić probówki i inkubować w lodzie przez 30 min.
UWAGA: Próbki należy poddać cytometrii przepływowej jak najszybciej, ponieważ degradacja jest widoczna w ciągu 2 h, nawet w lodzie.
6. Dzień 3: Cytometria przepływowa jąder komórkowych bulw ziemniaka
UWAGA: Obsługa i oprogramowanie cytometru przepływowego różnią się w zależności od instrumentu i producenta. Szczegółowe instrukcje dotyczące konkretnej obsługi cytometru przepływowego zostaną przedstawione w instrukcji obsługi urządzenia.
- Utwórz dwa wykresy kropkowe z wykorzystaniem skali logarytmicznej dla rozpraszania w przód względem rozpraszania bocznego oraz jodku propidyny (PI) względem rozpraszania bocznego. Utwórz również histogram z PI na osi x. Skala logarytmiczna jest wymagana, aby upewnić się, że wszystkie zdarzenia mieszczą się w skali, ponieważ jądra mogą wykazywać bardzo duże różnice w fluorescencji.
- Załaduj probówkę z próbką kontrolną o znanej wartości i dostosuj napięcie tak, aby wszystkie zdarzenia mieściły się w skali. Używamy tkanki liściowej in vitro z próbki genotypu. Jeśli analizowane mają być próbki o różnej ploidii, należy dołączyć próbkę kontrolną dla każdej z nich.
- Zanotuj kanał piku 2C w próbce kontrolnej. Piki 2C próbek badawczych powinny znajdować się w tym samym miejscu.
- Załaduj próbkę badawczą (bulwy) i ponownie upewnij się, że wszystkie zdarzenia mieszczą się w skali. Jeśli wymagane są korekty, powtórz krok 6.2, aby zidentyfikować kanał pików 2C.
- Ręcznie wyznacz bramkę (gate) dla jąder protoplastów, korzystając z wykresu rozpraszania bocznego względem PI.
- Ustaw histogram PI tak, aby wyświetlał tylko region bramkowanych jąder protoplastów.
- Zbierz pożądaną liczbę zdarzeń z każdej próbki. Badacze często wykorzystują 10 000 bramkowanych zdarzeń w cytometrii przepływowej; jednak w przypadku próbek protoplastów z bulw używamy 2 000 zdarzeń, aby umożliwić analizę większej liczby próbek oraz próbek o niskich stężeniach.
- Oblicz EI dla każdej próbki z histogramów PI, korzystając z następującego wzoru:
EI =
gdzie 4C to procent jąder, które są 4C (reprezentujących jedną rundę endoreduplikacji), 8C to procent jąder, które są 8C, i tak dalej. Przykłady histogramów i wartości C pików przedstawiono na Rysunku 4.
Wyniki
Izolacja protoplastów
Generowanie protoplastów jest niezbędne do uzyskania powtarzalnych wyników cytometrii przepływowej z bulw ziemniaka, których ogólna morfologia została przedstawiona na Rysunku 1. Badacze mogą chcieć upewnić się, że uzyskano wysokiej jakości protoplasty przed dodaniem FCP, szczególnie w przypadku konieczności rozwiązania problemów technicznych. Większość protoplastów powinna mieć kształt sferyczny z minimalną liczbą wypustek (Rysunek 2) i mogą one znacznie różnić się rozmiarem, co prawdopodobnie odzwierciedla różnice w EI.
Rysunek 2: Reprezentatywne protoplasty liści i bulw uzyskane w kroku 4.4 protokołu. Wyizolowane protoplasty powinny być sferyczne i symetryczne, z nienaruszoną błoną plazmatyczną. Należy zwrócić uwagę na różnicę w wielkości między protoplastami liści (A-C) a protoplastami bulw (D, E), a także na różnice w wielkości w obrębie jednej tkanki, co może wskazywać na różne poziomy endoreduplikacji. Protoplasty liści zawierają chloroplasty, natomiast w protoplastach bulw widoczne są amyloplasty. Paski skali = 1,000 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Ocena wyników cytometrii przepływowej
Sukces lub niepowodzenie eksperymentu można ocenić na podstawie szerokości pików oraz ich rozdzielenia na histogramach cytometrii przepływowej. Ponieważ pomiar endoreduplikacji wymaga obliczenia względnej liczby jąder w każdym piku, sama obecność lub brak pików jest niewystarczająca, jeśli poziom szumu jest zbyt wysoki, aby wyznaczyć między nimi znaczące granice. Rysunek 3 przedstawia warianty wyników, z jakimi badacze mogą się spotkać zarówno na wykresach kropkowych, jak i histogramach cytometrii przepływowej. Potencjalne przyczyny niepowodzenia analizy próbek zostały omówione w sekcji dyskusji.
Rycina 3: Reprezentatywne wyniki uzyskane z cytometrii przepływowej jąder protoplastów z nieuszkodzonych i zdegradowanych próbek rdzenia. Nieuszkodzone jądra (A) wykazują wyraźne oddzielenie pików, co pozwala na ilościowe określenie względnej liczby komórek w każdej populacji przy użyciu odpowiedniego oprogramowania, podczas gdy piki w próbkach zdegradowanych (B) wykazują przesunięte, szerokie i nakładające się podstawy. Na wykresach kropkowych próbek nieuszkodzonych (C) i zdegradowanych (D) czarne ramki wskazują bramkowanie zdarzeń jądrowych dla histogramów, a grupowanie zdarzeń odzwierciedlone jest w szerokości pików histogramu. Zdarzenia poza bramkami wskazują na zanieczyszczenia, silnie zdegradowane jądra lub inne agregaty. PI-H odpowiada intensywności fluorescencji mierzonej w jednostkach umownych. Metody rozwiązywania problemów w celu zapobiegania degradacji próbek zostały omówione w tekście. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Różnice w endoreduplikacji między tkankami
Wcześniej zgłosiliśmy, że tkanka rdzenia bulwy wykazuje znacznie wyższy poziom endoreduplikacji niż tkanka kory16. Aby potwierdzić i rozszerzyć te dane, zbadaliśmy poziomy endoreduplikacji w trzech różnych tkankach odmiany Superior: rdzeniu, parenchymie perymedularnej oraz korze, powtarzając pomiary w trzech powtórzeniach przy 2 000 bramkowanych zdarzeń na próbkę. Nasze wyniki potwierdziły wcześniejszą obserwację, że tkanka rdzenia ma znacznie wyższy EI niż tkanka kory, z wartościami średnimi odpowiednio 1,79 i 1,12 endocykli na komórkę (p = 0,018; test t Studenta). Co nieco zaskakujące, tkanka parenchymatyczna wykazała profil podobny do kory i była również istotnie różna od tkanki rdzenia (średnia = 1,14; p = 0,013; test t Studenta). Wyniki te zostały podsumowane na Rysunku 4.
Rycina 4: Endoreduplikacja w trzech tkankach odmiany cv. Superior. Przedstawiono histogramy tkanek liścia (A), kory bulwy (B), miąższu (C) oraz rdzenia (D) wraz z wartością EI obliczoną na podstawie tych histogramów. Różnice w względnej liczebności jąder tworzących każdy pik są wyraźnie widoczne, zwłaszcza pomiędzy tkankami liścia i bulwy. Wyświetlono również wartości C dla każdego piku. PI-H odpowiada intensywności fluorescencji mierzonej w jednostkach arbitralnych. Porównania średnich EI tkanek bulwy przedstawiono w części E, gdzie gwiazdka oznacza istotną różnicę (p <0.05), a słupki błędów oznaczają odchylenie standardowe. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.
Wpływ wielkości bulwy i ploidalności
Wcześniej zgłaszaliśmy, że w przypadku danego genotypu bulwy o różnej wielkości, lecz podobnym stopniu dojrzałości, nie wykazywały odpowiadającej im różnicy w EI16Naszym celem było potwierdzenie tego wyniku, a także ocena zależności między ploidalnością a endoreduplikacją. Do tego doświadczenia wykorzystaliśmy trzy powtórzenia tkanki miąższowej z trzech różnych genotypów: cv. Superior (4x) oraz VT_SUP_19 (2x), który jest dihaploidem uzyskanym z cv. Superior poprzez zapylenie kolcem.17oraz VT_SUP_19 4x, który jest podwojonym dihaploidem18 izogeniczne względem VT_SUP_19. Uwzględniono zestaw powtórzeń dla osobników dużych (90–130 g) i małych (<35 g dla odmiany Superior, natomiast bulwy dla dwóch pozostałych genotypów ważyły 90–130 g. Wszystkie bulwy zebrano z roślin hodowanych w szklarni w fazie pełnej dojrzałości, t. j. nadziemne części roślin uległy starzeniu. Zaobserwowaliśmy istotną różnicę między VT_SUP_19 a jego progenitorem Superior (p = 0,04); jednak nie stwierdzono istotnej różnicy między VT_SUP_19 a VT_SUP_19 4x (p = 0,69). Wskazuje to na to, że choć endoreduplikacja prawdopodobnie posiada komponent genetyczny, który został odsłonięty w wyniku redukcji genomowej, nie jest ona determinowana przez ploidalność, przynajmniej w tym tle genetycznym. Na koniec ponownie nie odnotowaliśmy istotnych różnic między dużymi a małymi bulwami odmiany Superior, co wykazano w Rycina 5.
Rycina 5: Endoreduplikacja w bulwach dwóch rozmiarów odmiany Superior oraz jej pochodnych diploidalnych (VT_Sup_19) i tetraploidalnych (VT_Sup_19 4x). Wykres słupkowy przedstawia wartości średnie dla małych (<35 g) i dużych (90–130 g) bulw odmiany Superior, a także dla dużych (90–130 g) bulw dihaploidu VT_SUP_19 oraz izogenicznego podwojonego dihaploidu VT_SUP_19 4x. Istotne różnice (p <0.05) są oznaczone za pomocą liter. Słupki błędu przedstawiają odchylenie standardowe. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Dyskusja
Przedstawiony w niniejszym dokumencie protokół dostarcza naukowcom środków do oceny endoreduplikacji w bulwach ziemniaka, których zmodyfikowana zawartość komórkowa i zwiększony rozmiar komórek wydają się wykluczać inne preparaty cytometrii przepływowej. Protokół opiera się na wytwarzaniu protoplastów jako sposobie na zmniejszenie hałasu i zanieczyszczeń przy jednoczesnym zachowaniu integralności jądrowej. Wcześniej naukowcy opisywali podobne preparaty dla szczególnie opornych próbek cytometrii przepływowej, a także wykorzystywali protoplasty bulw do badania różnych tematów, takich jak patogeneza19,20. Jednak, o ile nam wiadomo, żaden z nich nie połączył zastosowania takich protoplastów bulw z cytometrią przepływową w celu zbadania endoreduplikacji. Ponadto stwierdziliśmy, że stosowanie protoplastów jest bardziej wiarygodne niż typowe surowe preparaty, a także technika zastosowana w dwóch innych badaniach do oceny endoreduplikacji bulw 6,7. W tym miejscu omawiamy niedociągnięcia protokołu, potencjalne pułapki w jego wykonaniu i przygotowaniu próbki oraz wyniki typowego eksperymentu, w którym go wykorzystano.
Pomimo użyteczności i powtarzalności protokołu cytometrii przepływowej bulw, ma on kilka słabych punktów, które należy omówić. Po pierwsze, protokół jest czasochłonny i wymaga dwóch nocnych inkubacji. Ponadto protokół wymaga pewnych drogich odczynników, zwłaszcza celulazy i macerozymu. Dodatkowo preparaty są bardzo wrażliwe na czas, rozkładają się w ciągu kilku godzin, co może ograniczyć przepustowość w ciągu jednego dnia, zwłaszcza jeśli pożądanych jest wiele wydarzeń. Wreszcie, protokół, choć wiarygodny, jest wrażliwy na błędy w przygotowaniu próbek, z których wszystkie wydają się skutkować uszkodzeniem jąder i niższą jakością wyników. Na przykład zanieczyszczenie mikrobiologiczne może wystąpić na etapach plazmolizy i generowania protoplastów (1–3.4) z powodu niewłaściwej techniki aseptycznej. Zanieczyszczenie próbki, choć nie zawsze wyklucza sukces próbki, wydaje się dramatycznie obniżać jakość uzyskanych histogramów, co również jest prawdopodobne z powodu uszkodzenia jąder.
Jak wspomniano wcześniej, głównymi wadami protokołu są koszty, czas i wrażliwość na błędy. Badacze mogą chcieć podjąć kroki w celu złagodzenia każdego z nich. Jeśli chodzi o koszty, naukowcy zamierzający zastosować protokół do wielu próbek mogą rozważyć modyfikację stężeń enzymów i/lub czasu trwania etapu trawienia, ponieważ różne tkanki i genotypy mogą różnić się reakcją. Obejmuje to możliwość filtrowania i recyklingu ES, która została wcześniej zademonstrowana, ale nie została w tym przypadku wykorzystana21. Jeśli chodzi o czas, z naszych obserwacji wynika, że można zrezygnować z pierwszej inkubacji (etap plazmolizy) i nadal ekstrahować protoplasty; Jednak ucierpi na tym ich integralność i obfitość, co negatywnie wpłynie na wyniki. Aby zmniejszyć pogorszenie jakości próbek, badacze mogą wziąć pod uwagę, że niektóre podejścia cytometrii przepływowej obejmują użycie utrwalaczy (np. formaldehydu) w celu zachowania integralności próbki22. Może to być użyteczny sposób zarówno zapobiegania pogorszeniu jakości, jak i umożliwienia przechowywania próbki, zamiast ekstrakcji protoplastów i cytometrii przepływowej występującej w tym samym dniu, w którym przedstawiono tę metodę. Innym sposobem zapobiegania ścieraniu jąder może być włączenie inhibitora nukleazy do ES i/lub FBC; Podczas gdy 2-merkaptoetanol nie spowodował zauważalnych zmian podczas opracowywania, inne inhibitory nie zostały przetestowane w tym artykule.
Z naszych obserwacji wynika, że najbardziej krytycznym krokiem jest krok 4.4, czyli usunięcie całego roztworu do płukania plazmolitycznego przed dodaniem buforu cytometrii przepływowej (FCB). Jeśli pozostanie nawet niewielka objętość (<10 μl), istnieje znacznie większe prawdopodobieństwo, że próbki ulegną degradacji, co może prowadzić do złej jakości lub nawet nieudanej próbki. Jest to prawdopodobnie spowodowane zanieczyszczeniami w roztworze enzymatycznym (np. nukleazy, proteazy)23,24, które szybko rozkładają jądra w okresach inkubacji i w czasie między seriami próbek, nawet przy niskich stężeniach. Inną ważną kwestią jest czas trwania etapów inkubacji PI i RNazy. Jak zauważono w protokole, próbki nie pozostają stabilne dłużej niż kilka godzin po dodaniu FCB, więc naukowcy mogą zdecydować się na skrócenie czasu trwania tych etapów, aby pomieścić więcej próbek lub długie przebiegi cytometrii przepływowej wynikające z niskich stężeń jąder. Wymaga to również od badacza rozważenia kompromisu między liczbą zdarzeń na próbkę a całkowitą liczbą próbek, które mają być przeprowadzone, lub rozważenia użycia utrwalaczy, jak wspomniano wcześniej.
Różnice między tkankami a genotypami
Aby zapewnić wyniki reprezentatywne dla protokołu, zaprojektowaliśmy dwa proste eksperymenty, aby potwierdzić wcześniej zgłoszoną zmienność w zależności od tkanki i zbadać wpływ ploidalności i genotypu. Wyniki eksperymentu tkankowego pokazują, że protokół daje powtarzalne wyniki, ponieważ po raz kolejny stwierdzono, że tkanka rdzeniowa ma najwyższe EI. Nieco zaskakujące jest to, że tkanka miąższowa, która nie była wcześniej oceniana, miała wartość EI zbliżoną do tkanki korowej i znacznie niższą niż rdzeń. Nie było to przewidziane, ponieważ komórki miąższowe są zazwyczaj większe niż komórki rdzeniowe lub korowe, przynajmniej w okresie dojrzałości. Jednym z możliwych wyjaśnień jest to, że bulwy (90–130 g) były zbyt niedojrzałe, aby komórki miękiszowe, które w momencie osiągnięcia dojrzałości stanowią większość objętości bulw, mogły w pełni się rozwinąć i osiągnąć maksymalne wartości C25. Może to również wyjaśniać, dlaczego dihaploid (VT_SUP_19) i podwojony dihaploid (VT_SUP_19 4x) wykazywały znacznie większe EI niż CV. Doskonałe bulwy; Podczas gdy z każdego genotypu pobrano próbki bulw o mniej więcej równej wielkości, maksymalny rozmiar bulw z VT_SUP_19 lub tetraploidalnego izogenicznego jest znacznie mniejszy niż w przypadku genetypu. Tak więc może się zdarzyć, że wykazywały one większe EI po prostu dlatego, że były większe w stosunku do ich maksymalnego osiągalnego rozmiaru. Alternatywnie, różnica może być konsekwencją genetycznego dopełniacza, VT_SUP_19 otrzymany od jego tetraploidalnego przodka. Inną możliwością jest to, że redukcja genomu, która nastąpiła podczas ekstrakcji dihaploidu z tetraploidalnego, mogła ujawnić zamaskowane szkodliwe allele, powodując stres w całej roślinie, który, jak wykazano, również przyczynia się do podwyższonego EI26. Niemniej jednak świadczy to o starannym rozważeniu, jakie naukowcy muszą zachować przy wyborze bulw i tkanek, które mają być wykorzystane do porównania wartości EI, zwłaszcza między genotypami.
Przyszłe zastosowania
Protokół opisany w tym artykule dostarcza naukowcom ważnego narzędzia do zrozumienia endoreduplikacji u ziemniaków. Może to pozwolić na prowadzenie badań nad genetycznymi i środowiskowymi składnikami endoreduplikacji, przebiegiem rozwoju w tkankach bulw oraz oceną naturalnej zmienności. W ostatecznym rozrachunku, endoreduplikacja może stanowić obiecujący cel w zakresie poprawy jakości ziemniaka, co będzie wymagało wiarygodnych metod oceny.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
To badanie zostało sfinansowane przez National Science Foundation Award numer 1237969, "Unraveling the Heterozygosity, Allelic Composition, and Copy Number Variation of Potato" oraz USDA Special Grant 2014-34141-22266 (University of Maine) dla RV.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Pipeta serologiczna | Fisher | 13-676-10k | (sterylna) |
| Pipet Aid XP (autopipettor) | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
| Probówki stożkowe (50 mL) | Thermo Fisher Scientific | 339652 | (sterylne) |
| Probówki do mikrowirówek (1,5 mL) | Globe Scientific | 111558 | |
| Probówki do mikrowirówek (2 mL) | Globe Scientific | ||
| Jednostka filtracji próżniowej (0,22 &mikro; m)(aPES) | Thermo Fisher Scientific | 564-0020 | (sterylne) |
| Jednostka filtracji próżniowej (0,45 &mikro; m)(aPES) | Thermo Fisher Scientific | 168-0045 | (sterylne) |
| Celulaza "Onozuka R-10" | Yakult | kontakt firma | |
| Macerozyme "Onozuka R-10" | Firma kontaktowa | Yakult | |
| Hemicellulaza | Sigma | H2125 | |
| Tris base | |||
| Acros Organics | 172590250 | ||
| Triton X-100 | MP Biochemikalia | 194854 | |
| Chlorek magnezu (sześciowodny) | Fisher Scientific | M35-500 | |
| Chlorek wapnia (dwuwodny) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| D-mannitol | Acros Organics | 423922500 | |
| MOPS | Acros Organics | 17263-0250 | |
| Fosforan potasu (jednozasadowy, bezwodny) | Sigma-Aldrich | P-5379 | |
| Jodek propidyny | Sigma-Aldrich | P4170 | Do preparatów cytometrii przepływowej |
| Rybonukleaza A | Sigma-Aldrich | R5000 | Do preparatów cytometrii przepływowej |
| Świdry korkowe z dziurkaczem | American Scientific | 2093-02 | Do pobierania próbek pożądanej tkanki |
| Kleszcze | Thermo Fisher Scientific | 16-31 | Do mapowania pożądanej tkanki |
| Skalpel | Thermo Fisher Scientific | 08-920B | Do mapowania pożądanej |
| tkanki 106 µ m siatka ze stali nierdzewnej lub inna siatka o tym samym rozmiarze porów | New Jersey Wire Mesh Co. | Skontaktuj się z firmą |
Bibliografia
- Wilson, E. The karyoplasmic ratio. 727, 3rd edn, The Macmillan Company. (1925).
- Szymanski, D. B., Marks, M. D. GLABROUS1 overexpression and TRIPTYCHON alter the cell cycle and trichome cell fate in Arabidopsis. Plant Cell. 10 (12), 2047-2062 (1998).
- Melaragno, J. E., Mehrotra, B., Coleman, A. W. Relationship between endopolyploidy and cell size in epidermal tissue of Arabidopsis. Plant Cell. 5 (11), 1661-1668 (1993).
- Grafi, G., Larkins, B. A. Endoreduplication in maize endosperm: involvement of M phase--promoting factor inhibition and induction of S phase--related kinases. Science. 269 (5228), 1262-1264 (1995).
- Schweizer, L., Yerk-Davis, G., Phillips, R., Srienc, F., Jones, R. Dynamics of maize endosperm development and DNA endoreduplication. Proc Natl Acad Sci. 92 (15), 7070-7074 (1995).
- Chen, C. T., Setter, T. L. Response of potato tuber cell division and growth to shade and elevated CO2. Ann Bot. 91 (3), 373-381 (2003).
- Chen, C. T., Setter, T. L. Response of potato dry matter assimilation and partitioning to elevated CO2 at various stages of tuber initiation and growth. Environ Exp Bot. 80, 27-34 (2012).
- Cheniclet, C., et al. Cell expansion and endoreduplication show a large genetic variability in pericarp and contribute strongly to tomato fruit growth. Plant Physiol. 139 (4), 1984-1994 (2005).
- Pirrello, J., et al. How fruit developmental biology makes use of flow cytometry approaches. Cytometry Part A. 85 (2), 115-125 (2014).
- Chevalier, C., et al. Endoreduplication and fruit growth in tomato: evidence in favour of the karyoplasmic ratio theory. J Exp Bot. 65 (10), 2731-2746 (2014).
- Galbraith, D. W., et al. Rapid flow cytometric analysis of the cell cycle in intact plant tissues. Science. 220 (4601), 1049-1051 (1983).
- Doležel, J., Greilhuber, J., Suda, J. Flow Cytometry with Plants: An Overview. Flow Cytometry with Plant Cells. , Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. 41-65 (2007).
- Doležel, J., Bartoš, J. A. N. Plant DNA flow cytometry and estimation of nuclear genome size. Ann Bot. 95 (1), 99-110 (2005).
- Doke, N., Tomiyama, K. Effect of hyphal wall components from Phytophthora infestans on protoplasts of potato tuber tissues. Phys Plant Path. 16 (2), 169-176 (1980).
- Davis, D. A., Currier, W. W. The effect of the phytoalexin elicitors, arachidonic and eicosapentaenoic acids, and other unsaturated fatty acids on potato tuber protoplasts. Physiol Mol Plant Pathol. 28 (3), 431-441 (1986).
- Laimbeer, F. P. E., et al. Protoplast isolation prior to flow cytometry reveals clear patterns of endoreduplication in potato tubers, related species, and some starchy root crops. Plant Methods. 13 (1), 27(2017).
- Uijtewaal, B. A., Huigen, D. J., Hermsen, J. G. Production of potato monohaploids (2n=x=12) through prickle pollination. Theor Appl Genet. 73 (5), 751-758 (1987).
- Karp, A., Risiott, R., Jones, M. G. K., Bright, S. W. J. Chromosome doubling in monohaploid and dihaploid potatoes by regeneration from cultured leaf explants. Plant Cell Tiss Org Cult. 3 (4), 363-373 (1984).
- Doke, N. Generation of superoxide anion by potato tuber protoplasts during the hypersensitive response to hyphal wall components of Phytophthora infestans and specific inhibition of the reaction by suppressors of hypersensitivity. Phys Plant Path. 23 (3), 359-367 (1983).
- Doke, N., Tomiyama, K. Suppression of the hypersensitive response of potato tuber protoplasts to hyphal wall components by water soluble glucans isolated from Phytophthora infestans. Phys Plant Path. 16 (2), 177-186 (1980).
- Saxena, P. K., King, J. Reuse of enzymes for isolation of protoplasts. Plant Cell Rep. 4 (6), 319-320 (1985).
- Sgorbati, S., Levi, M., Sparvoli, E., Trezzi, F., Lucchini, G. Cytometry and flow cytometry of 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)-stained suspensions of nuclei released from fresh and fixed tissues of plants. Physiol Plant. 68 (3), 471-476 (1986).
- Bhojwani, S. S., Dantu, P. K. Tissue and cell culture. Plant Tissue Culture: An Introductory Text. , Springer. 39-50 (2013).
- Flores, H. E., Kaur-Sawhney, R., Galston, A. W. Protoplasts as Vehicles for Plant Propagation and Improvement. Advances in Cell Culture. Maramorosch, K. 1, Elsevier. 241-279 (1981).
- Reeve, R. M., Timm, H., Weaver, M. L. Parenchyma cell growth in potato tubers I. Different tuber regions. Am Potato J. 50 (2), 49-57 (1973).
- Scholes, D. R., Paige, K. N. Plasticity in ploidy: a generalized response to stress. Trends Plant Sci. 20 (3), 165-175 (2015).
Przedruki i uprawnienia
