Method Article

Analiza ilościowa złożoności neuronalnej arboryzacji dendrytycznej u Drosophila

DOI:

10.3791/57139

⸱

January 7th, 2019

 ,  , 
1Genetics and Aging Research Unit, Department of Neurology, Massachusetts General Hospital, Mass General Institute of Neurodegenerative Disease, 2Department of Geriatric Neurology, Nanlou Clinical Division, PLA General Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół skupia się na ilościowej analizie złożoności neuronalnej arboryzacji dendrytycznej (NDAC) u Drosophila, która może być wykorzystana do badań morfogenezy dendrytycznej.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dendryty są rozgałęzionymi wypustkami neuronu, a morfologia dendrytyczna odzwierciedla organizację synaptyczną podczas rozwoju układu nerwowego. Arboryzacja neuronalna neuronów dendrytycznych (da) larw Drosophila jest idealnym modelem do badania morfogenezy dendrytów nerwowych i funkcji genów w rozwoju układu nerwowego. Istnieją cztery klasy neuronów da. Klasa IV jest najbardziej złożona z rozgałęzionym wzorem, który obejmuje prawie całą powierzchnię ściany ciała larwy. Wcześniej scharakteryzowaliśmy wpływ wyciszenia ortologa Drosophila SOX5 na złożoność neuronalnej arboryzacji dendrytycznej klasy IV (NDAC) za pomocą czterech parametrów: długości dendrytów, powierzchni pokrycia dendrytami, całkowitej liczby gałęzi i struktury rozgałęzień. Protokół ten przedstawia przebieg analizy ilościowej NDAC, składający się z sekcji larw, mikroskopii konfokalnej i procedur analizy obrazu przy użyciu oprogramowania ImageJ. Dalsze badania nad rozwojem neuronalnym da i jego mechanizmami leżącymi u jego podstaw pozwolą lepiej zrozumieć funkcje neuronów i dostarczą wskazówek na temat podstawowych przyczyn zaburzeń neurologicznych i neurorozwojowych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dendryty, które są rozgałęzionymi wypustkami neuronu, pokrywają pole, które obejmuje sensoryczne i synaptyczne wejścia neuronu od innych neuronów1,2. Dendryty są ważnym składnikiem tworzenia synaps i odgrywają kluczową rolę w integracji wejść synaptycznych, a także w propagowaniu stymulacji elektrochemicznej w neuronach. Arboryzacja dendrytyczna (da) to proces, w którym neurony tworzą nowe drzewa i gałęzie dendrytyczne, tworząc nowe synapsy. Rozwój i morfologia da, takie jak gęstość gałęzi i wzorce grupowania, wynikają z wieloetapowych procesów biologicznych i są silnie skorelowane z funkcją neuronów. Celem te....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie do eksperymentu

  1. Przygotować następujące odczynniki: sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (PBS); Tryton X-100; 0,2% PBST (PBS + 0,2% Triton X-100); 32% paraformaldehyd (PFA), rozcieńczony do 4% przed użyciem; baza z elastomeru silikonowego i utwardzacz; medium mocujące zapobiegające blaknięciu (np. ProLong Gold); i lakier do paznokci.
  2. Przygotuj następujący sprzęt: mikroskop preparacyjny, dwa ostre kleszcze i nożyczki do mikropreparacji, kilka szpilek do mikrodysekcji, szalkę Petriego do wykonania naczynia preparacyjnego, szkiełka mikroskopowe i szkiełka nakrywkowe, mikroskop konfokalny oraz komputer z zainstal....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dendryty neuronów da zostały oznaczone przez współnadekspresję GFP (UAS-GFP; ppk-GAL4) w somie neuronalnej da i arborach dendrytycznych do analizy obrazowania fluorescencyjnego GFP. Morfologia dendrytów neuronów da została zobrazowana za pomocą odwróconego mikroskopu konfokalnego (Ryc. 2).

Dendryty neuronów da zostały prześledzone za pomocą oprogramowania Fiji ImageJ. Plik został wykorzystany do oszac.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dendryty, które unerwiają naskórek, są regionami wejściowymi neuronów, a ich morfologie określają, w jaki sposób informacje są odbierane i przetwarzane przez poszczególne neurony. Rozwój morfologii dendrytów odzwierciedla modulację genów organizacji dendrytów. Larwy Drosophila da neuron obwodowego układu nerwowego są ważnym modelem do badania rozwoju dendrytów ze względu na: 1) funkcjonalne podobieństwo do ssaków 11,12; 2) cztery wyróżnienia klasowe opar.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Williamowi A. Eimerowi za pomoc techniczną w zakresie obrazowania. Praca ta była wspierana przez Cure Alzheimer's Fund [do R.E.T], National Institute of Health [R01AG014713 i R01MH60009 do R.E.T.; R03AR063271 i R15EB019704 do A.L.] oraz National Science Foundation [NSF1455613 do A.L.].

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Gibco Life Sciences10010-023
TritonX-100Fisher Scientific9002-93-1
Paraformaldehyd (PFA)Mikroskopia elektronowa Sciences15714-S
Sylgard 184 baza i utwardzacz z elastomeru silikonowegoDow Corning Corportation3097366-0516; 3097358-1004
ProLong Gold Antifade MountantThermo Fisher ScientificP36931
Lakier do paznokci CVS72180
Mikroskop stereoskopowyNikonSMZ800
Mikroskop konfokalnyNikonEclipse Ti-E
szalka PetriegoFalcon353001
KleszczeDumont11255-20
Nożyczki Roboz Surgical Instrument CoRS-5611
Szpilki do owadów Roboz Surgical Instrument CoRS-6082-25
Szkiełka mikroskopowe i szkiełka nakrywkoweFisher Scientific15-188-52

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wassle, H., Boycott, B. B. Functional architecture of the mammalian retina. Physiol Rev. 71 (2), 447-480 (1991).
  2. MacNeil, M. A., Masland, R. H. Extreme diversity among amacrine cells: implications for function. Neuron. 20 (5), 971-982 (1998).
  3. Losonczy, A., Makara, J. K.,....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Dendritic ArborizationNeuronal MorphologyDrosophila LarvaeConfocal MicroscopyImageJ AnalysisDendrite Length MeasurementSurface Area CalculationBranching Structure AnalysisSOX5 Gene SilencingZ series Imaging

Related Articles