Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Analiza ilościowa złożoności neuronalnej arboryzacji dendrytycznej u Drosophila

14.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57139

⸱

7 stycznia 2019

 ,  , 
1Genetics and Aging Research Unit, Department of Neurology, Massachusetts General Hospital, Mass General Institute of Neurodegenerative Disease, 2Department of Geriatric Neurology, Nanlou Clinical Division, PLA General Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół skupia się na ilościowej analizie złożoności neuronalnej arboryzacji dendrytycznej (NDAC) u Drosophila, która może być wykorzystana do badań morfogenezy dendrytycznej.

Streszczenie

Dendryty są rozgałęzionymi wypustkami neuronu, a morfologia dendrytyczna odzwierciedla organizację synaptyczną podczas rozwoju układu nerwowego. Arboryzacja neuronalna neuronów dendrytycznych (da) larw Drosophila jest idealnym modelem do badania morfogenezy dendrytów nerwowych i funkcji genów w rozwoju układu nerwowego. Istnieją cztery klasy neuronów da. Klasa IV jest najbardziej złożona z rozgałęzionym wzorem, który obejmuje prawie całą powierzchnię ściany ciała larwy. Wcześniej scharakteryzowaliśmy wpływ wyciszenia ortologa Drosophila SOX5 na złożoność neuronalnej arboryzacji dendrytycznej klasy IV (NDAC) za pomocą czterech parametrów: długości dendrytów, powierzchni pokrycia dendrytami, całkowitej liczby gałęzi i struktury rozgałęzień. Protokół ten przedstawia przebieg analizy ilościowej NDAC, składający się z sekcji larw, mikroskopii konfokalnej i procedur analizy obrazu przy użyciu oprogramowania ImageJ. Dalsze badania nad rozwojem neuronalnym da i jego mechanizmami leżącymi u jego podstaw pozwolą lepiej zrozumieć funkcje neuronów i dostarczą wskazówek na temat podstawowych przyczyn zaburzeń neurologicznych i neurorozwojowych.

Wprowadzenie

Dendryty, które są rozgałęzionymi wypustkami neuronu, pokrywają pole, które obejmuje sensoryczne i synaptyczne wejścia neuronu od innych neuronów1,2. Dendryty są ważnym składnikiem tworzenia synaps i odgrywają kluczową rolę w integracji wejść synaptycznych, a także w propagowaniu stymulacji elektrochemicznej w neuronach. Arboryzacja dendrytyczna (da) to proces, w którym neurony tworzą nowe drzewa i gałęzie dendrytyczne, tworząc nowe synapsy. Rozwój i morfologia da, takie jak gęstość gałęzi i wzorce grupowania, wynikają z wieloetapowych procesów biologicznych i są silnie skorelowane z funkcją neuronów. Celem tego protokołu jest zapewnienie metody analizy ilościowej złożoności dendrytrycznej arboryzacji neuronalnej u Drosophila.

Złożoność dendrytów determinuje typy synaptyczne, połączenia i dane wejściowe z neuronów partnerskich. Wzorce rozgałęzień i gęstość dendrytów biorą udział w przetwarzaniu sygnałów, które zbiegają się w polu dendrytycznym3,4. Dendryty mają elastyczność w dostosowywaniu się w rozwoju. Na przykład sygnalizacja synaptyczna ma wpływ na organizację dendrytów w neuronach somatosensorycznych w fazie rozwojowej oraz w dojrzałym układzie nerwowym5. Ustanowienie połączeń neuronalnych opiera się na morfogenezie i dojrzewaniu dendrytów. Wady rozwojowe dendrytów są związane z upośledzeniem funkcji neuronów. Badania wykazały, że nieprawidłowość morfogenezy neuronów da może przyczyniać się do etiologii wielu chorób neurodegeneracyjnych, w tym choroby Alzheimera (AD), choroby Parkinsona (PD), choroby Huntingtona (HD) i choroby Lou Gehriga/stwardnienia zanikowego bocznego (ALS)6,7,8. Zmiany synaptyczne pojawiają się we wczesnym stadium choroby Alzheimera, w połączeniu ze spadkiem i upośledzeniem funkcji neuronów7,8. Jednak szczegóły dotyczące tego, w jaki sposób patologia dendrytów przyczynia się do patogenezy tych chorób neurodegeneracyjnych, pozostają nieuchwytne.

Rozwój dendrytów jest regulowany przez geny, które kodują złożoną sieć regulatorów, takich jak rodzina białek Wnt9,10, czynniki transkrypcyjne i ligandy na powierzchni komórki receptory11,12. Neurony Drosophila da składają się z czterech klas (klasa I, II, III, IV), z których neurony klasy IV da mają najbardziej złożone wzorce rozgałęzień i zostały wykorzystane jako potężny system eksperymentalny do lepszego zrozumienia morfogenezy13,14. Podczas wczesnej morfogenezy nadekspresja i/lub wyciszenie RNAi genów w neuronach da klasy IV powoduje zmiany we wzorcach rozgałęzień i przycinanie dendrytów13. Ważne jest opracowanie praktycznej metody analizy ilościowej neuronalnej arboryzacji dendrytycznej.

Wcześniej wykazaliśmy, że wyciszenie ortologa Drosophila SOX5, Sox102F, doprowadziło do skrócenia dendrytów neuronów da i zmniejszenia złożoności neuronów da klasy IV15. W niniejszym artykule przedstawiono procedurę analizy ilościowej złożoności neuronalnej arborycji dendrytycznej (NDAC) u Drosophila. Protokół ten, zaadaptowany z poprzednio opisanej metodologii, zapewnia krótką metodę oznaczania rozwoju neuronów czuciowych. Ilustruje solidne etykietowanie obrazu i neuron da w ścianie ciała larw trzeciego stadium rozwojowego16,17,18,19. Jest to cenny protokół dla badaczy, którzy chcą zbadać NDAC i różnice rozwojowe in vivo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie do eksperymentu

  1. Przygotować następujące odczynniki: sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (PBS); Tryton X-100; 0,2% PBST (PBS + 0,2% Triton X-100); 32% paraformaldehyd (PFA), rozcieńczony do 4% przed użyciem; baza z elastomeru silikonowego i utwardzacz; medium mocujące zapobiegające blaknięciu (np. ProLong Gold); i lakier do paznokci.
  2. Przygotuj następujący sprzęt: mikroskop preparacyjny, dwa ostre kleszcze i nożyczki do mikropreparacji, kilka szpilek do mikrodysekcji, szalkę Petriego do wykonania naczynia preparacyjnego, szkiełka mikroskopowe i szkiełka nakrywkowe, mikroskop konfokalny oraz komputer z zainstalowanym oprogramowaniem Fiji ImageJ.

2. Kolekcja larw

  1. Mate UAS-Sox102F-RNAi lata odpowiednio z muchami typu dzikiego UAS-GFP, ppk-GAL4 lub W1118. Hodowla leci w standardowych warunkach w temperaturze 25 °C.
  2. W ciągu ~ 5 - 6 dni zbierz larwy trzeciego stadium rozwojowego UAS-Sox102F-RNAi/ ppk-GAL4, UAS-GFP lub UAS-GFP i ppk-GAL4 /+ ostrożnie kontroluj kleszczami do sekcji.

3. Sekcja larw

UWAGA: Wszystkie procedury w tej sekcji są wykonywane pod mikroskopem mikrodyparacyjnym. Powiększenie zależy od badaczy. Spróbuj dostosować się do optymalnego widoku. Zalecane jest powiększenie ~4 - 6X.

  1. Umieścić larwę na naczyniu preparacyjnym wykonanym na bazie elastomeru silikonowego i szalce Petriego z kulturą tkankową.
  2. Przypnij haczyk do ust larwy, aby strona grzbietowa była skierowana do góry, a następnie przypnij ogon larwy. Umieść stronę grzbietową pośrodku tak bardzo, jak to możliwe, aby odsłonić linię środkową, która będzie znacznikiem otwartym.
  3. Dodaj 200 μl PBS do larwy, aby utrzymać wilgotność ciała.
  4. Wykonaj cięcie nożyczkami wzdłuż grzbietowej linii środkowej między dwiema tchawicami, od ogona do rostralu. Wykonaj małe nacięcie w każdym z czterech rogów ciała larwy.
  5. Umieść szpilkę w każdym z czterech rogów ciała, tak aby ciało leżało płasko.
  6. Umocuj ścianę ciała larwy w 4% PFA na 25 minut w temperaturze pokojowej.
  7. Myć w PBST przez 5 minut. Powtórz jeszcze dwa razy.
  8. Usuń szpilki z tkanki. Następnie przenieś chusteczkę na szkiełko podstawowe, przykryj medium mocującym zapobiegającym blaknięciu i zamocuj za pomocą szkiełka nakrywkowego. Suszyć na powietrzu przez 1 godzinę i uszczelnić krawędzie lakierem do paznokci.

4. Przetwarzanie obrazowania

UWAGA: Zdjęcia zostały wykonane za pomocą systemu odwróconego mikroskopu konfokalnego. Użytkownik może sfotografować próbkę za pomocą obiektywu 20X (zalecane).

  1. Przechwytywanie obrazów z serii Z. Otwórz okno dialogowe "Przechwyć serię Z" w oprogramowaniu mikroskopu konfokalnego. Określ zakres przechwytywania obrazów z serii Z.
    1. Kliknij przycisk "Góra i dół". Określ górną i dolną pozycję, a następnie wprowadź wartości w polach "Dół:" i "Góra:". Ustaw "Krok" w oknie dialogowym "Przechwyć serię Z" na 0,5 μm. Następnie kliknij przycisk "Uruchom teraz", aby pobrać obrazy z serii Z.
  2. Uzyskane obrazy zapisujemy jako pliki *.tiff lub *.nd2.
  3. Po obrazowaniu preparaty należy przechowywać w ciemnym uchwycie w temperaturze 4 °C.

5. Ocena dendrytu

Uwaga: białko GFP uległo nadekspresji u muszek UAS-GFP i ppk-GAL4 w neuronach da do analizy obrazowania fluorescencji GFP. Określono ilościowo długość, rozgałęzienie i strukturę neuronów da u larw trzeciego stadium rozwojowego. Parametry analizy obejmują długość dendrytów (μm), pole powierzchni (μm2), całkowitą liczbę rozgałęzień i strukturę rozgałęzień (%). Rysunek 1 pokazuje szczegółowo parametry analizy.

  1. Długość dendrytów
    UWAGA: Długość dendrytów jest sumą wszystkich dendrytów oznaczonych we wtyczce tracer.
    1. Zainstaluj i uruchom oprogramowanie Fiji ImageJ (https://fiji.sc/)20. Następnie podziel obrazy na osobne kanały, jeśli jest kilka kanałów images.
      UWAGA: Obraz w tym protokole ma tylko jeden kanał GFP.
    2. Uruchom "Obraz | Stosy | Projekt Z", aby uzyskać rzut Z; pojawi się nowe okno o nazwie "Projekcja Z". Kliknij "maksymalna intensywność" dla typu projekcji i uporządkuj liczby między wycinkiem początkowym i końcowym w zależności od indywidualnych preferencji. Kliknij "OK". Pojawi się obraz projekcji Z, który wyraźnie przedstawia projekcję dendrytów.
    3. Śledź neuryty.
      1. Wybierz "Wtyczki | Segmentacja | Simple Neurites Tracer" w oknie, aby prześledzić dendryty. Znajdź neuron soma, a następnie kliknij jeden punkt na dendrycie, zaczynając od ciała komórki, a drugi punkt na końcu tego dendrytu.
        UWAGA: Program połączy oba punkty niebieską linią.
      2. Naciśnij "Y" w oknie wtyczki, jeśli ścieżka jest czysta; ścieżka dendrytowa jest śledzona aż do punktów końcowych wybranej ścieżki na widocznych obrazach. Kliknij "pełna ścieżka" w tym samym oknie wtyczki; segment jest zakończony (Rysunek 2).
        UWAGA: Niektóre dendryty kończyły się dalej od punktów początkowych, w których ścieżka była podzielona na mniejsze segmenty. Segmenty zostały połączone, aby zapewnić kompletną ścieżkę dla znacznika.
    4. Po utworzeniu ścieżki wróć do nowego punktu, w którym znajdują się gałęzie. Na nowej ścieżce można budować; w oknie "Wszystkie ścieżki" pojawią się wartości długości wszystkich ścieżek (Rysunek 3). Zapisz plik śledzenia i kontynuuj z niedokończonymi śladami, jak pokazano na rysunku Rysunek 2.
    5. Wyeksportuj dane o długości dendrytów, klikając "Plik | Eksportuj jako *.cvs" w oknie "Wtyczka". Następnie zsumuj wszystkie długości ścieżek i wyeksportuj dane do oprogramowania do analizy danych/arkusza kalkulacyjnego. (Rysunek 3).
  2. Powierzchnia neuronów da
    1. Wybierz narzędzie do rysowania odręcznego w oknie "Fiji ImageJ". Prześledź ścieżkę, a następnie połącz punkty końcowe. Z menu "Analizuj" wybierz "Ustaw pomiary | Obszar." Kliknij "zmierz" w menu "Analizuj". Wynik pojawi się w nowym polu z wartością dla wybranego obszaru (Rysunek 4). Skopiuj go do oprogramowania do analizy danych.
  3. Całkowita liczba rozgałęzień i struktura rozgałęzień neuronów da
    1. Oblicz całkowitą liczbę gałęzi, otwierając "Analiza", a następnie "Renderuj | Analyze Skeletonized Paths" w oknie śledzenia wtyczki (Rysunek 5).
      UWAGA: Struktura altany jest sumą poziomów gałęzi. Ścieżka została zdefiniowana między ciałem komórki a końcówkami dendrytów, a jedna ścieżka może zawierać wiele rozgałęzień, takich jak pierwotne altany to dendryty z ciała komórki neuronu. Altany drugorzędne są gałęziami od altany pierwszorzędowej i tak dalej z altanami trzeciorzędowymi, czwartorzędowymi i pięciorzędowymi. Struktura rozgałęzień dendrytowych jest oddzielona w zależności od poziomów rozgałęzień. Na przykład podstawowy % to liczba gałęzi podzielona przez całkowitą liczbę rozgałęzień i tak dalej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Dendryty neuronów da oznakowano poprzez koekspresję GFP (UAS-GFP; ppk-GAL4) w somach i drzewach dendrytycznych neuronów da w celu analizy obrazowania fluorescencyjnego GFP. Morfologię dendrytów neuronów da obrazowano za pomocą odwróconego mikroskopu konfokalnego (Rysunek 2).

Dendryty neuronów da śledzono przy użyciu oprogramowania Fiji ImageJ. Plik ten posłużył do oszacowania długości dendrytów (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Dendryty, które unerwiają naskórek, są regionami wejściowymi neuronów, a ich morfologie określają, w jaki sposób informacje są odbierane i przetwarzane przez poszczególne neurony. Rozwój morfologii dendrytów odzwierciedla modulację genów organizacji dendrytów. Larwy Drosophila da neuron obwodowego układu nerwowego są ważnym modelem do badania rozwoju dendrytów ze względu na: 1) funkcjonalne podobieństwo do ssaków 11,12; 2) cztery wyróżnienia klasowe opar...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Williamowi A. Eimerowi za pomoc techniczną w zakresie obrazowania. Praca ta była wspierana przez Cure Alzheimer's Fund [do R.E.T], National Institute of Health [R01AG014713 i R01MH60009 do R.E.T.; R03AR063271 i R15EB019704 do A.L.] oraz National Science Foundation [NSF1455613 do A.L.].

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Gibco Life Sciences10010-023
TritonX-100Fisher Scientific9002-93-1
Paraformaldehyd (PFA)Mikroskopia elektronowa Sciences15714-S
Sylgard 184 baza i utwardzacz z elastomeru silikonowegoDow Corning Corportation3097366-0516; 3097358-1004
ProLong Gold Antifade MountantThermo Fisher ScientificP36931
Lakier do paznokci CVS72180
Mikroskop stereoskopowyNikonSMZ800
Mikroskop konfokalnyNikonEclipse Ti-E
szalka PetriegoFalcon353001
KleszczeDumont11255-20
Nożyczki Roboz Surgical Instrument CoRS-5611
Szpilki do owadów Roboz Surgical Instrument CoRS-6082-25
Szkiełka mikroskopowe i szkiełka nakrywkoweFisher Scientific15-188-52

Bibliografia

  1. Wassle, H., Boycott, B. B. Functional architecture of the mammalian retina. Physiol Rev. 71 (2), 447-480 (1991).
  2. MacNeil, M. A., Masland, R. H. Extreme diversity among amacrine cells: implications for function. Neuron. 20 (5), 971-982 (1998).
  3. Losonczy, A., Makara, J. K., Magee, J. C. Compartmentalized dendritic plasticity and input feature storage in neurons. Nature. 452 (7186), 436-441 (2008).
  4. Spruston, N. Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration. Nat Rev Neurosci. 9 (3), 206-221 (2008).
  5. Jaworski, J., et al. Dynamic microtubules regulate dendritic spine morphology and synaptic plasticity. Neuron. 61 (1), 85-100 (2009).
  6. Kweon, J. H., Kim, S., Lee, S. B. The cellular basis of dendrite pathology in neurodegenerative diseases. BMB Rep. 50 (1), 5-11 (2016).
  7. Baloyannis, S. J. Dendritic pathology in Alzheimer's disease. J Neurol Sci. 283 (1-2), 153-157 (2009).
  8. Masliah, E., Terry, R. D., Alford, M., DeTeresa, R., Hansen, L. A. Cortical and subcortical patterns of synaptophysinlike immunoreactivity in Alzheimer's disease. Am J Pathol. 138 (1), 235-246 (1991).
  9. Wayman, G. A., et al. Activity-dependent dendritic arborization mediated by CaM-kinase I activation and enhanced CREB-dependent transcription of Wnt-2. Neuron. 50 (6), 897-909 (2006).
  10. Rosso, S. B., Sussman, D., Wynshaw-Boris, A., Salinas, P. C. Wnt signaling through Dishevelled, Rac and JNK regulates dendritic development. Nat Neurosci. 8 (1), 34-42 (2005).
  11. Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Different levels of the homeodomain protein cut regulate distinct dendrite branching patterns of Drosophila multidendritic neurons. Cell. 112 (6), 805-818 (2003).
  12. Sugimura, K., Satoh, D., Estes, P., Crews, S., Uemura, T. Development of morphological diversity of dendrites in Drosophila by the BTB-zinc finger protein abrupt. Neuron. 43 (6), 809-822 (2004).
  13. Jan, Y. N., Jan, L. Y. Branching out: mechanisms of dendritic arborization. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).
  14. Sears, J. C., Broihier, H. T. FoxO regulates microtubule dynamics and polarity to promote dendrite branching in Drosophila sensory neurons. Dev Biol. 418 (1), 40-54 (2016).
  15. Li, A., et al. Silencing of the Drosophila ortholog of SOX5 leads to abnormal neuronal development and behavioral impairment. Hum Mol Genet. 26 (8), 1472-1482 (2017).
  16. Misra, M., et al. A Genome-Wide Screen for Dendritically Localized RNAs Identifies Genes Required for Dendrite Morphogenesis. G3 (Bethesda). 6 (8), 2397-2405 (2016).
  17. Emoto, K., et al. Control of dendritic branching and tiling by the Tricornered-kinase/Furry signaling pathway in Drosophila sensory neurons. Cell. 119 (2), 245-256 (2004).
  18. Olesnicky, E. C., et al. Extensive use of RNA-binding proteins in Drosophila sensory neuron dendrite morphogenesis. G3 (Bethesda). 4 (2), 297-306 (2014).
  19. Parrish, J. Z., Xu, P., Kim, C. C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. The microRNA bantam functions in epithelial cells to regulate scaling growth of dendrite arbors in drosophila sensory neurons. Neuron. 63 (6), 788-802 (2009).
  20. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  21. Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136 (7), 1049-1061 (2009).
  22. Jinushi-Nakao, S., et al. Knot/Collier and cut control different aspects of dendrite cytoskeleton and synergize to define final arbor shape. Neuron. 56 (6), 963-978 (2007).
  23. Crozatier, M., Vincent, A. Control of multidendritic neuron differentiation in Drosophila: the role of Collier. Dev Biol. 315 (1), 232-242 (2008).
  24. Copf, T. Importance of gene dosage in controlling dendritic arbor formation during development. Eur J Neurosci. 42 (6), 2234-2249 (2015).
  25. Rosso, S. B., Inestrosa, N. C. WNT signaling in neuronal maturation and synaptogenesis. Front Cell Neurosci. 7, 103(2013).
  26. Engel, T., Hernandez, F., Avila, J., Lucas, J. J. Full reversal of Alzheimer's disease-like phenotype in a mouse model with conditional overexpression of glycogen synthase kinase-3. J Neurosci. 26 (19), 5083-5090 (2006).
  27. Longair, M. H., Baker, D. A., Armstrong, J. D. Simple Neurite Tracer: open source software for reconstruction, visualization and analysis of neuronal processes. Bioinformatics. 27 (17), 2453-2454 (2011).
  28. Pool, M., Thiemann, J., Bar-Or, A., Fournier, A. E. NeuriteTracer: a novel ImageJ plugin for automated quantification of neurite outgrowth. J Neurosci Methods. 168 (1), 134-139 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

morfologia neuron wlarwy Drosophilamikroskopia konfokalnaanaliza w programie ImageJpomiar d ugo ci dendryt wobliczanie powierzchnianaliza struktury rozga ziewyciszanie genu SOX5obrazowanie serii Z
Analiza ilościowa złożoności neuronalnej arboryzacji dendrytycznej u Drosophila
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.