Artykuł metodologiczny

Adaptacja wychwytywania hybrydyzacji białek związanych z chromatyną do proteomiki komórek ssaków

DOI:

10.3791/57140

⸱

1 czerwca 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Genetics, Texas Biomedical Research Institute, 2Department of Internal Medicine-Molecular Medicine, Wake Forest University School of Medicine, 3Department of Chemistry, University of Wisconsin

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To jest metoda identyfikacji nowych białek oddziałujących z DNA w określonych docelowych loci, polegająca na specyficznym dla sekwencji wychwytywaniu usieciowanej chromatyny do kolejnych analiz proteomicznych. Nie jest wymagana żadna wcześniejsza wiedza na temat potencjalnych białek wiążących ani modyfikacji komórek. Początkowo opracowana dla drożdży, technologia została obecnie zaadaptowana do komórek ssaków.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Technologia hybrydyzacji białek związanych z chromatyną dla proteomiki (HyCCAPP) została początkowo opracowana w celu odkrycia nowych interakcji DNA-białko u drożdży. Umożliwia analizę regionu docelowego będącego przedmiotem zainteresowania bez konieczności posiadania wcześniejszej wiedzy na temat prawdopodobnych białek związanych z regionem docelowym. Teoretycznie pozwala to na wykorzystanie HyCCAPP do analizy dowolnego regionu genomowego i zapewnia wystarczającą elastyczność do pracy w różnych systemach komórkowych. Metoda ta nie jest przeznaczona do badania miejsc wiązania znanych czynników transkrypcyjnych, co jest zadaniem lepiej nadającym się do immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) i metod podobnych do ChIP. Siła HyCCAPP polega na jego zdolności do badania regionów DNA, w przypadku których wiedza na temat białek z nim związanych jest ograniczona lub nie ma jej wcale. Może to być również wygodna metoda unikania błędów systematycznych (obecnych w metodach podobnych do ChIP) wprowadzanych przez wzbogacanie chromatyny na bazie białek za pomocą przeciwciał. Potencjalnie HyCCAPP może być potężnym narzędziem do odkrywania naprawdę nowych interakcji DNA-białko. Do tej pory technologia ta była stosowana głównie do komórek drożdży lub do sekwencji o dużej liczbie powtórzeń w komórkach ssaków. Aby stać się potężnym narzędziem, które przewidujemy, podejścia HyCCAPP muszą zostać zoptymalizowane w celu skutecznego wychwytywania pojedynczych kopii loci w komórkach ssaków. W tym miejscu przedstawiamy naszą adaptację początkowego protokołu wychwytywania drożdży HyCCAPP do ludzkich linii komórkowych i pokazujemy, że regiony chromatyny z pojedynczą kopią można skutecznie wyizolować za pomocą tego zmodyfikowanego protokołu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ciągu ostatniej dekady nastąpił dramatyczny postęp w technologiach sekwencjonowania, co pozwoliło na badanie szerokiego zakresu genomów w dużej liczbie próbek i z zadziwiającą rozdzielczością. Konsorcjum Encyklopedii Elementów DNA (ENCODE), zakrojone na szeroką skalę, wieloinstytucjonalne przedsięwzięcie zainicjowane przez National Human Genome Research Institute of the National Institutes of Health, dostarczyło informacji na temat tego, w jaki sposób poszczególne czynniki transkrypcyjne i inne białka regulatorowe wiążą się z genomem i wchodzą z nim w interakcje. Początkowe wysiłki scharakteryzowały specyficzne interakcje DNA-białko, oceniane za pomocą immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) dla ponad 100 znanych białek wiążących DNA1. Alternatywne metody, takie jak ślad DNazy2 i izolacja elementów regulatorowych wspomagana formaldehydem (FAIRE)3 zostały również wykorzystane do zlokalizowania określonych regionów genomu oddziałujących z białkami, ale z oczywistym ograniczeniem, że te eksperymentalne podejścia nie identyfikują oddziałujących białek. Pomimo szeroko zakrojonych wysiłków w ciągu ostatnich lat, nie pojawiła się żadna technologia, która skutecznie pozwoliłaby na kompleksową charakterystykę interakcji białko-DNA w chromatynie oraz identyfikację i kwantyfikację białek związanych z chromatyną.

Aby zaspokoić tę potrzebę, opracowaliśmy nowatorskie podejście, które nazwaliśmy Hybrydyzacją Wychwytywania Białek Związanych z Chromatyną dla Proteomiki (HyCCAPP). Początkowo opracowane w yeast4,5,6, podejście to izoluje usieciowane regiony chromatyny (ze związanymi białkami) za pomocą przechwytywania hybrydyzacji specyficznej dla sekwencji. Po wyizolowaniu kompleksów białko-DNA można zastosować takie podejścia, jak spektrometria mas, aby scharakteryzować zestaw białek związanych z sekwencją będącą przedmiotem zainteresowania. W związku z tym HyCCAPP można uznać za bezstronne podejście do odkrywania nowych interakcji DNA-białko, w tym sensie, że nie opiera się na przeciwciałach i jest całkowicie niezależny co do białek, które można znaleźć. Istnieją inne podejścia zdolne do odkrycia nowych białek oddziałujących z DNA7, ale większość opiera się na metodach podobnych do ChIP8,9,10, insercje plazmidu11,12,13,14, lub regiony o dużej liczbie kopii15. W przeciwieństwie do tego, HyCCAPP może być stosowany do regionów wielo- i jednokopijnych i nie wymaga żadnych wcześniejszych informacji na temat białek w tym regionie. Ponadto, podczas gdy niektóre z wyżej wymienionych metod mają cenne cechy, w szczególności unikanie konieczności stosowania reakcji sieciowania DNA-białko, unikalną cechą HyCCAPP jest to, że można go zastosować do regionów z pojedynczą kopią w niezmodyfikowanych komórkach i bez wcześniejszej wiedzy na temat przypuszczalnych białek wiążących lub dostępnych przeciwciał.

W tym momencie HyCCAPP był głównie stosowany do analizy różnych regionów genomu w drożdżach4,5,6, a ostatnio był używany do analizy interakcji białko-DNA w alfa-satelitarnym DNA, powtarzającym się regionie w ludzkim genomie16. W ramach naszych bieżących prac dostosowaliśmy podejście do wychwytywania hybrydyzacji pierwotnie opracowane dla chromatyny drożdży, aby miało zastosowanie do analizy komórek ludzkich i przedstawiamy tutaj zmodyfikowany protokół, który pozwala na selektywne wychwytywanie pojedynczych kopii regionów docelowych w ludzkim genomie z wydajnością podobną do naszych początkowych badań na drożdżach. Ten nowy, zoptymalizowany protokół pozwala teraz na adaptację i wykorzystanie technologii do badania interakcji białko-DNA w całym ludzkim genomie przy użyciu spektrometrii mas lub innych podejść analitycznych.

Ważne jest, aby podkreślić, że metoda HyCCAPP jest przeznaczona do analizy konkretnych regionów docelowych i nie nadaje się jeszcze do analiz całego genomu. Technologia ta jest szczególnie przydatna w przypadku regionów, dla których istnieje niewiele informacji na temat oddziałujących białek lub gdy pożądana jest bardziej kompleksowa, dogłębna analiza oddziałujących białek w określonym locus genomu. HyCCAPP ma na celu odkrycie białek wiążących DNA, ale nie pozwala na dokładne scharakteryzowanie konkretnych miejsc wiązania białek w genomowym DNA. W obecnym wdrożeniu metodyka nie dostarcza informacji na temat sekwencji lub motywów wiążących DNA dla poszczególnych białek. W związku z tym stanowi on doskonałe uzupełnienie istniejących technologii, takich jak FAIRE, i może umożliwić identyfikację nowych białek wiążących w regionach genomowych zidentyfikowanych za pomocą wstępnej analizy FAIRE.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Projekt wychwytywania oligonukleotydów

  1. Zaprojektuj panel oligonukleotydów, który ma być używany podczas wychwytywania hybrydyzacji regionu docelowego / regionów.
    1. Staraj się zaprojektować 4–8 oligonukleotydów na region docelowy, ale jako minimum zaprojektuj co najmniej jeden oligonukleotyd ukierunkowany na każdy koniec regionu docelowego.
    2. Jeśli sekwencja docelowa jest długa (>500 par zasad), zaprojektuj oligonukleotydy tak rozłożone, jak to możliwe, aby zapewnić skuteczne wzbogacenie chromatyny w całym regionie docelowym.
      UWAGA: Zaobserwowaliśmy optymalne wychwyty z 4–8 oligonukleotydami. Mimo że proces ten może działać dobrze w przypadku większej liczby oligonukleotydów, nierzadko obserwuje się spadek wydajności wzbogacania, gdy stosuje się zbyt wiele oligonukleotydów.
  2. Zaprojektuj oligonukleotydy o podobnych temperaturach topnienia i upewnij się, że nie tworzą one silnych spinek do włosów ani nie mają silnych oddziaływań (biorąc pod uwagę, że hybrydyzacja będzie przeprowadzana w temperaturze 42 oC).
    UWAGA: Jeśli wybrano elucję na palcu u nogi (4.12.3), do oligonukleotydu należy dodać dodatkową sekwencję zewnętrznych 8 zasad i będzie to wymagało komplementarnych oligonukleotydów "uwalniających" w czasie elucji17. Do selekcji i analizy oligonukleotydów można użyć kilku komercyjnych narzędzi programowych. 25 MERS wykazało dobre wyniki, ale w zależności od wielkości i sekwencji genomu, oligonukleotydy wychwytujące mogą zawierać od 20 do 80 zasad. Zazwyczaj oligonukleotydy wychwytywane mają temperaturę topnienia bliską 62 oC, ale może się ona zmieniać w zależności od ich długości. Stałe temperatury topnienia i/lub długość oligonukleotydów w całej mieszance wychwytywania mogą pomóc w uniknięciu niepożądanych odchyleń we wzbogacaniu.
  3. Zaprojektuj oligonukleotydy wychwytujące z ugrupowaniem biotyny (najlepiej oddzielonym przekładką od sekwencji wychwytywania) na końcu 3'.

2. Hodowla komórkowa

  1. Hoduj ludzkie komórki limfoblastoidalne (takie jak GM12878 pokazane tutaj) lub inne linie komórkowe w pożywce RPMI 1640 uzupełnionej 1% penicyliną-streptomycyną, 2 mM L-glutaminą i 5% płodową surowicą bydlęcą (FBS), w temperaturze 37 oC i 5% CO2 .
    1. Wysiewać początkowe zamrożone podwielokrotności (2–5 x 105 komórek) w kolbie T-25 z 6 ml pożywki RPMI 1640 przygotowanej w 2.1.
    2. Monitoruj gęstość i żywotność komórek.
      1. Weź reprezentatywną porcję komórek i wybarwić je odpowiednim barwnikiem, takim jak błękit trypanowy.
      2. Zmierz gęstość komórek za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.
    3. Zanim komórka osiągnie gęstość 1 x 106 komórek/ml, wiruj komórki w temperaturze 100 x g przez 5 minut i przenieś komórki do kolby T-75 z 25 ml pożywki RPMI 1640 przygotowanej w 2.1. Hoduj komórki, aż gęstość komórek zbliży się do 1 x 106 komórek/ml.
    4. Przenieść komórki do kolby T-150 w 38 ml pożywki RPMI 1640 (2.1) i hodować komórki przez dodatkowe dwa dni.
      UWAGA: Komórki limfoblastoidalne rosną w zawiesinie. Ogólne wytyczne dotyczące hodowli komórek limfoblastoidalnych zalecają utrzymanie gęstości komórek w granicach 0,2–1 x 106 komórek/ml. Ze względu na dużą ilość materiału wymaganego w tej technologii, obecny protokół jest celowo napisany w celu wyhodowania komórek do gęstości komórek przekraczającej to, co jest powszechnie stosowane. Protokoły wzrostu komórek mogą być zmieniane i dostosowywane przez czytnik w zależności od typów komórek, które mają być używane.
    5. Obracać komórki w temperaturze 100 x g przez 5 minut, ponownie zawiesić komórki w 10 ml pożywki RPMI 1640 (2.1) i wlać zawiesinę do 850 cm2-rolkowej butelki zawierającej 500 ml pożywki. Inkubuj komórki w tych samych warunkach, co poprzednio, ale w tym momencie zacznij używać stałej rotacji (~0,5 rpm).
    6. Monitoruj wzrost komórek i zmieniaj pożywkę w razie potrzeby (zwykle co 3-4 dni). Pozwól komórkom urosnąć do gęstości jak najbardziej zbliżonej do 2 x 106 komórek/ml (łącznie 1 x 109 komórek).
    7. Po osiągnięciu pożądanej liczby komórek, należy je zbrać, obracając je w temperaturze 100 x g przez 5 minut, a następnie ponownie zawiesić komórki w 36 ml pożywki RPMI 1640 (2.1). Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Weź małe porcje do zliczania komórek i ekstrakcji DNA.
  2. Sieciowanie poprzez dodanie 1 ml 37% formaldehydu do uzyskania końcowego stężenia 1%.
    UWAGA: Formaldehyd jest substancją rakotwórczą i należy z nim obchodzić się pod wyciągiem.
    1. Inkubować komórki z rotacją (~30–60 obr./min) przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT).
    2. Ugasić reakcję sieciowania przez dodanie 2 ml 2,5 M roztworu glicyny, aby uzyskać końcowe stężenie 125 mM.
    3. Inkubować komórki z rotacją (~30–60 obr./min) przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Granulować komórki, wirując przy 100 x g przez 5 minut i dwukrotnie umyć komórki lodowatym 1x PBS.
  3. Przejdź do następnego kroku lub ponownie zawieś osad w 5 ml buforu do lizy komórek (5 mM Hepes, 85 mM KCl, 0,5% Igepal, inhibitory proteazy (PI)) i zamroź zawiesinę kropla po kropli w ciekłym azocie. Przechowywać próbki w temperaturze -80 oC.
    UWAGA: Przygotuj >25 ml buforu do lizy komórek bez Igepal i PI i dodaj te odczynniki świeże, gdy będą gotowe do użycia. Należy unikać długotrwałego przechowywania buforu do lizy komórek po dodaniu Igepal i PI. Bufor do lizy komórek należy przechowywać w temperaturze 4 oC przez okres do 3 miesięcy. Igepal jest niejonowym, niedenaturującym detergentem. NP-40 może być potencjalnie stosowany jako alternatywa dla Igepal, ale nie używaliśmy go w tym kontekście, ponieważ NP-40 nie jest zalecany, gdy próbki są ostatecznie analizowane za pomocą spektrometrii mas w celu scharakteryzowania białek wiążących DNA.

3. Liza i strzyżenie

  1. Przygotować >15 ml buforu do lizy jąder (10 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8,0, 1 % SDS, PI).
    UWAGA: Dodaj PI na świeżo, tylko do ilości, które mają być użyte. Należy unikać długotrwałego przechowywania buforu do lizy jąder po dodaniu PI. Bufor do lizy jąder może być przechowywany w RT przez okres do 1 miesiąca.
  2. Zawiesić osad w 20 ml buforu do lizy komórek (zawierającego Igepal i PI). Pozwól granulkom rozmrozić się na lodzie i dobrze wymieszaj po rozmrożeniu. Pozostaw próbki na lodzie przez dodatkowe 10 minut. Odwirować komórki w temperaturze 400 x g w temperaturze 4 oC przez 5 minut.
  3. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 6 ml buforu do lizy jąder z PI (objętość można zwiększyć, jeśli komórki nie tworzą zawiesiny).
  4. Przygotowując się do sonikacji, podziel próbkę równomiernie na ~6–8 probówek do mikrofuge (od 600 do 1,000 μl na każdą probówkę).
    1. Umieść próbki na lodzie lub zimnym ruszcie i poddaj próbkę sonikacji za pomocą sonikatora z mikrokońcówką. Użyj 65% amplitudy ze stałymi impulsami 5 x 20 s, co pozwala zawiesinie schładzać się przez co najmniej 40 s między impulsami.
      UWAGA: Jeśli objętość wzrośnie o >10 ml na próbkę, można zamiast tego użyć szklanej celi chłodzącej. Wymagałoby to wtedy więcej i dłuższych serii. Sonikatory znacznie się od siebie różnią. Warunki mogą wymagać optymalizacji przez czytnik. Można również zastosować inne alternatywy sonikacji.
  5. Odwirować komórki przy 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 oC, przenieść supernatant do nowej probówki i wyrzucić granulki.
  6. Oszacuj całkowity odzysk za pomocą metody fluorometrycznej.
  7. Przejść do następnego kroku lub zamknąć i przechowywać próbkę w temperaturze -80 oC.
  8. Opcjonalnie: Weź podwielokrotność, odwróć sieciowanie, inkubując ją przez noc w temperaturze 67 oC w 0,3 M NaCl. Oczyść DNA i uruchom je w Bioanalyzerze, aby określić długości fragmentów. Większość fragmentów powinna mieć od 500 do 1 000 bp.
    UWAGA: W tym momencie można się zatrzymać i przechowywać próbki w temperaturze -80 oC.

4. Przechwytywanie hybrydyzacji

  1. Przygotuj 500 ml 2x buforu hybrydyzacyjnego (Hyb) (200 mM MES, 2M NaCl, 40 mM EDTA, 0,02% Tween-20) i 500 ml buforu do przemywania (200 mM NaCl, 0,2% SDS, 50 mM Tris pH 8). Hyb i Wash należy przechowywać odpowiednio w temperaturze 4 oC i temperaturze pokojowej przez okres do 3 miesięcy. Użyj połowy bufora 2x Hyb, aby przygotować 1x bufor hybrydyzacyjny. Przechowywać go również w temperaturze 4 oC przez okres do 3 miesięcy.
    UWAGA: Całkowita objętość wychwytu hybrydyzacji będzie dwukrotnie większa niż objętość otrzymanej próbki w poprzednim kroku (jak opisano do tej pory, objętość próbki wynosiłaby około 6 ml, a zatem całkowita objętość hybrydyzacji wynosiłaby 12 ml).
  2. Odłożyć na bok kulki równe 5 % całkowitej objętości wychwytywania hybrydyzacji (w tym przypadku 600 μl). Do pracy z koralikami w kolejnych krokach potrzebny jest odpowiedni i odpowiedni magnes
    3. .
  3. Umyj kulki trzykrotnie za pomocą 1x Hyb Buffer, używając podwójnej objętości kulek (1200 μL). Ponownie zawiesić kulki w 1 200 μl 2x Hyb Buffer. Umieść rurki na magnesie, aż roztwór się oczyści i usuń bufor.
  4. Przeprowadzić reakcje wstępnego oczyszczania w probówkach do mikrofug o pojemności 1,5 ml z maksymalnie 700 μl próbki na probówkę. Dodaj wystarczającą ilość kulek (5%) i 2x bufor Hyb, aby rozcieńczyć bufor Hyb do 1x (10 probówek z 600 μl próbki, 120 μl przemytych kulek zawieszonych w 2x Hyb Buffer i 480 μL 2x Hyb Buffer). Inkubować je przez 10 minut w temperaturze 31 oC z obrotem od końca do końca (~30–60 obr./min).
  5. Umieść probówki na magnesie, aż koraliki zostaną unieruchomione i przenieś próbki do nowych probówek. Wyrzuć koraliki.
    UWAGA: Od tego momentu zalecane są tuby o niskim wiązaniu.
  6. Zawiesić wychwytywane oligonukleotydy w roztworze roboczym o stężeniu 10 pmol/μl i dodać 4 μl tego roztworu do każdej probówki.
    UWAGA: Różne regiony mogą działać jako kontrola dla siebie nawzajem, ale zaleca się dołączenie wychwytywanego oligonukleotydu z zaszyfrowaną sekwencją tak, aby służyła jako prawdziwa kontrola ujemna.
  7. Inkubować probówki przez 40 minut w temperaturze 42 oC z obrotem od końca do końca (~30–60 obr./min).
  8. Podczas inkubacji należy odłożyć na bok potrzebne kulki (0,3 μL/pmol wychwytywanego oligonukleotydu). Umyj koraliki trzy razy, jak opisano w kroku 4.3, ale ponownie zawieś komórki w 1 x Hyb Buffer.
  9. Dodać umyte kulki do próbki i inkubować próbki przez 30 minut w temperaturze pokojowej z obrotem od końca do końca (~30–60 obr./min). Umieść rurki na magnesie i usuń supernatant po unieruchomieniu kulek.
  10. Mycie koralików
    1. Dodać 1,2 ml buforu do przemywania i inkubować próbkę przez 5 minut z obrotem od końca do końca (~30–60 obr./min) w temperaturze pokojowej. Umieść probówki na magnesie i odczekaj kilka minut, aż roztwór się klaruje. Usuń bufor i powtórz ten krok.
    2. Dodaj 1,2 ml buforu do przemywania i inkubuj go przez 1 godzinę z obrotem od końca do końca (~30-60 obr./min) w temperaturze pokojowej. Umieść probówki na magnesie i odczekaj kilka minut, aż roztwór się klaruje. Usunąć bufor i powtórzyć ten krok, skracając czas inkubacji do 30 minut po raz drugi.
    3. Dodać 200 μl buforu do przemywania i inkubować przez 15 minut z obrotem od końca do końca (~30–60 obr./min) w temperaturze 31 oC. Umieść probówki na magnesie i odczekaj kilka minut, aż roztwór się klaruje. Usuń bufor.
    4. Dodaj 200 μl PBS i inkubuj przez 5 minut z obrotem od końca do końca (~30–60 obr./min) w temperaturze pokojowej. Umieść probówki na magnesie i odczekaj kilka minut, aż roztwór się klaruje. Usuń bufor i powtórz ten krok.
  11. Prosta elucja
    1. Dodać 40 μl wody molekularnej do kulek i inkubować w temperaturze 94 oC przez 5 minut.
    2. Umieść rurki na magnesie i odczekaj kilka minut, aż roztwór się przejrzy.
    3. Przenieść supernatant do nowej probówki. Wyrzuć koraliki.
    4. Przystąpić do analizy proteomicznej lub przechowywać próbkę w temperaturze -80 oC.
      UWAGA: Ten rodzaj elucji działa dobrze w późniejszej analizie qPCR i niektórych pomiarach proteomicznych, ale w innych przypadkach dwa alternatywne podejścia opisane poniżej dają "czystsze" eluaty.
  12. Elucja DNazy.
    1. Dodaj 40 μL 1x buforu DNazy i 2 U DNazy do każdej probówki.
    2. Inkubować probówki przez 15 minut w temperaturze 37 oC.
    3. Umieść rurki na magnesie i odczekaj kilka minut, aż roztwór się usunie.
    4. Usunąć eluowane próbki z kulek i umieścić je w nowej probówce o niskim stopniu wiązania.
    5. Inkubować probówkę w temperaturze 94 oC przez 7 minut w celu dezaktywacji enzymu i przejść do analiz proteomicznych.
      UWAGA: Niższe stężenia DNazy mogą być stosowane w przypadku zaobserwowania zakłóceń w analizach proteomicznych. Nie będzie możliwe obliczenie wzbogacenia wychwytu za pomocą qPCR, jeśli ta metoda elucji jest stosowana, ponieważ traktowanie DNazą całkowicie niszczy materiał DNA w próbce.
    6. Przystąpić do analizy proteomicznej lub przechowywać próbkę w temperaturze -80 oC.
  13. Toehold elution17.
    UWAGA: Ta metoda nie jest zalecana dla dłuższych oligonukleotydów (>40 zasad). Metoda ta wymaga, aby wychwytywane oligonukleotydy zawierały dodatkowe 8 zasad, które nie pokrywają się z sekwencją genomową i oligonukleotydami o komplementarnym uwalnianiu, w celu przemieszczenia celu z wychwytywanych oligonukleotydów.
    1. Rozcieńczyć 2 nanomole oligonukleotydów o uwolnieniu w 40 μl buforu SSC.
    2. Inkubuj go przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Umieść rurki na magnesie i odczekaj kilka minut, aż roztwór się usunie.
    4. Usuń roztwór z koralików.
    5. Przystąpić do analizy proteomicznej lub przechowywać próbkę w temperaturze -80 oC.

5. Ocena wydajności przechwytywania za pomocą qPCR z starterami dla docelowego regionu przechwytywania

  1. Użyj odpowiedniego oprogramowania lub narzędzia online, aby zaprojektować startery i sondy dla regionu docelowego.
    UWAGA: W tym eksperymencie celem był region promotorowy DUSP3 i DUSP5. Stosowane startery i sondy są następujące. DUSP3: Podkład 1 - GTG TTT AGG TTC CCT GAT CC, podkład 2 - CGG AAT GTC TGC CTT CG, sonda z oznaczeniem FAM - TCC ATG CCC GAA TTG TGA CGT CGG; DUSP5: Podkład 1 - TGA GAA AGC CCT GAT GTG TC, podkład 2 - GCC TTC AGA AAC CCC AAA AG, sonda z oznaczeniem fam, TGC ATT TAG, AGC AGC CAG ATG AGG TT.
  2. Pobrać podwielokrotność eluatu (nie więcej niż 10 μl) i rozcieńczyć w stosunku 1:10 o czystości cząsteczkowejH2O.
  3. Ekstrahować DNA jednej z podwielokrotności pobranych w kroku 2.1.7 i użyć tej próbki DNA do wytworzenia krzywej wzorcowej, wykonując pięć seryjnych rozcieńczeń w stosunku 1:10 w stopniu cząsteczkowymH2O.
  4. Przygotować główną mieszankę qPCR (szeroka gama komercyjnych alternatyw), dodać startery i sondy i dozować odpowiednią ilość (15 μl, jeśli przeprowadza się reakcję 20 μl) do każdej studzienki.
  5. Dodać 5 μl albo: a) rozcieńczonej próbki, b) krzywej wzorcowej lub c) klasy cząsteczkowejH2O(aby służyła jako kontrola bez matrycy) do każdej studzienki.
  6. Uszczelnij płytkę i odwiruj ją przy 100 x g przez 1 min.
  7. Uruchomić w systemie qPCR o następujących parametrach: 5 min w temperaturze 95 oC, następnie 40 cykli po 95 oC przez 20 s, 59 oC przez 20 s i 72 oC przez 25 s.
  8. Użyj krzywej standardowej do oceny plonów i zakodowanego chwytania, aby ocenić swoistość chwytania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ze względu na zapotrzebowanie na duże ilości chromatyny, aby HyCCAPP odniósł sukces, komórki są hodowane do stosunkowo wysokiego poziomu konfluencji. Barwienie błękitem trypanowym stosuje się w celu potwierdzenia, że śmiertelność komórek jest umiarkowana (<10%). W eksperymentach z pojedynczą kopią zawartość chromatyny przed wychwytem hybrydyzacji musi mieścić się w zakresie femtomolowym, co zwykle wymaga co najmniej 10-9 komórek jako materiału wyjściowego. Przed eksperymenta...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisana tutaj metoda HyCCAPP ma wiele unikalnych cech, które sprawiają, że jest to potężne podejście do odkrywania interakcji DNA, które w przeciwnym razie pozostałyby nieuchwytne. Charakter tego procesu daje HyCCAPP elastyczność w pracy z różnymi organizmami i regionami genomu. Jest to jednak metoda, która ma kilka ograniczeń, które należy wziąć pod uwagę.

HyCCAPP to metoda, która pozwala uniknąć jakichkolwiek modyfikacji komórek, dzięki czemu może być potencjalnie stosowana w komórkach pierw...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie ma żadnych konfliktów interesów, które można by ujawnić.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez NIH Grants P50HG004952 i R01GM109099 MO.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Narzędzie PrimerQuestIDT
OligoAnalyzer 3.1IDTAnalyze wychwytywanie oligonukleotydów
PairFoldUBCAnaliza interakcji
RPMI 1640 mediaThermo Fisher11875093
Penicylina-streptomycynaThermo Fisher15140122
L-glutamina Thermo Fisher25030081
Płodowa surowica bydlęcaThermo Fisher26140079
Countess automatyczny licznik komórekThermo Fisher
850 cm2 butelka na kółkach Greiner Bio-one680058
System rolkowyWheaton22-288-525
37 % formaldehydu Sigma-AldrichF8775
GlicynaSigma-Aldrich
Igepal CA-630Sigma-AldrichI3021
Koktajl inhibitorów proteazySigma-AldrichP4380
HEPESThermo Fisher15630080
Branson sonifier cyfrowy SFX 150Emerson
Qubit 3.0 fluorometrZestaw
Qubit dsDNA BRBioanalizator Thermo FisherQ32850
2100Zestaw Agilent
Agilent DNA 1000Agilent5067-1504
MESSigma-AldrichM3885
NaCl 5MThermo FisherAM9760G
EDTAMagnes Sigma-Aldrich
DynaMag-2Thermo Fisher12321D
Magnes DynaMag-15Thermo Fisher12301D
Dynabeads M-280 atreptawidynaThermo Fisher60210
Rurki o niskim poziomie wiązaniaEppendorf22431081
Piec do hybrydyzacjiSciGene
Wytrząsarka rurowa i rotatorThermo Fisher415110Q
DNase I (bez RNaz)New England BioLabsM0303
Bufor SSC 20 razy i koncentratSigma-AldrichS6639
do oznaczania Thermo Fisher Sól sodowa

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Consortium, E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2013).
  2. Galas, D. J., Schmitz, A. DNAse footprinting: a simple method for the detection of protein-DNA binding specificity. Nucleic Acids Res. 5 (9), 3157-3170 (1978).
  3. Simon, J. M., Giresi, P. G., Davis, I. J., Lieb, J. D. Using formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE) to isolate active regulatory DNA. Nat. Protoc. 7 (2), 256-267 (2012).
  4. Dai, Y., Kennedy-Darling, J., Shortreed, M. R., Scalf, M., Gasch, A. P., Smith, L. M. Multiplexed Sequence-Specific Capture of Chromatin and Mass Spectrometric Discovery of Associated Proteins. Anal. Chem. 89 (15), 7841-7846 (2017).
  5. Guillen-Ahlers, H., et al. HyCCAPP as a tool to characterize promoter DNA-protein interactions in Saccharomyces cerevisiae. Genomics. 107 (6), (2016).
  6. Kennedy-Darling, J., et al. Discovery of Chromatin-Associated Proteins via Sequence-Specific Capture and Mass Spectrometric Protein Identification in Saccharomyces cerevisiae. J Proteome Res. 13 (8), 3810-3825 (2014).
  7. Guillen-Ahlers, H., Shortreed, M. R. R., Smith, L. M. M., Olivier, M. Advanced methods for the analysis of chromatin-associated proteins. Physiol Genomics. 46 (13), 441-447 (2014).
  8. Lambert, J. -P., Fillingham, J., Siahbazi, M., Greenblatt, J., Baetz, K., Figeys, D. Defining the budding yeast chromatin-associated interactome. Mol Syst Biol. 6, 448(2010).
  9. Soldi, M., Bonaldi, T. The Proteomic Investigation of Chromatin Functional Domains Reveals Novel Synergisms among Distinct Heterochromatin Components. Mol Cell Proteomics. 12 (3), 764-780 (2013).
  10. Wang, C. I., et al. Chromatin proteins captured by ChIP-mass spectrometry are linked to dosage compensation in Drosophila. Nat Struct Mol Biol. 20 (2), 202-209 (2013).
  11. Byrum, S. D., Raman, A., Taverna, S. D., Tackett, A. J. ChAP-MS: A Method for Identification of Proteins and Histone Posttranslational Modifications at a Single Genomic Locus. Cell Rep. 2 (1), 198-205 (2012).
  12. Fujita, T., Fujii, H. Efficient isolation of specific genomic regions and identification of associated immunoprecipitation ( eChIP ) using CRISPR. Biochem. Bioph. Res. Co. 439 (1), 132-136 (2013).
  13. Liu, X., et al. In Situ Capture of Chromatin Interactions by Biotinylated dCas9. Cell. 170 (5), 1028-1043 (2017).
  14. Myers, S. A., Wright, J., Zhang, F., Carr, S. A. CRISPR/Cas9-APEX-mediated proximity labeling enables discovery of proteins associated with a predefined genomic locus in living cells. bioRxiv. , (2017).
  15. Déjardin, J., Kingston, R. E. Purification of Proteins Associated with Specific Genomic Loci. Cell. 136 (1), 175-186 (2009).
  16. Buxton, K. E., et al. Elucidating Protein-DNA Interactions in Human Alphoid Chromatin via Hybridization Capture and Mass Spectrometry. J. Proteome Res. 16 (9), 3433-3442 (2017).
  17. Kennedy-Darling, J., Holden, M. T., Shortreed, M. R., Smith, L. M. Multiplexed programmable release of captured DNA. Chembiochem. 15 (16), 2353-2356 (2014).
  18. Fujita, T., Fujii, H. Isolation of specific genomic regions and identification of associated molecules by engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) using CRISPR. Chromatin Protoc. Third Ed. , 43-52 (2015).
  19. Lambert, J. -P., Mitchell, L., Rudner, A., Baetz, K., Figeys, D. A Novel Proteomics Approach for the Discovery of Chromatin-associated Protein Networks. Mol Cell Proteomics. 8 (4), 870-882 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Protok HyCCAPPloci jednokopioweprojektowanie oligonukleotyd wsieciowanie kom reklizy j der kom rkowychsonikacjawychwyt oparty na kuleczkachanaliza qPCRoddzia ywania DNA bia kowzbogacanie region w genomowychwarianty niekoduj ce

Powiązane artykuły