Method Article

Optymalizacja testu ekspresji opartego na multipleksowym RNA z wykorzystaniem materiału archiwalnego raka piersi

DOI:

10.3791/57148

⸱

August 1st, 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, Faculty of Medicine & Surgery, University of Malta, 2Centre for Molecular Medicine and Biobanking, University of Malta, 3Department of Physiology & Biochemistry, Faculty of Medicine and Surgery, University of Malta

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Degradacja kwasów nukleinowych w tkance archiwalnej, niejednorodność guzów i brak świeżo zamrożonych próbek tkanek mogą negatywnie wpłynąć na usługi diagnostyczne raka w laboratoriach patologicznych na całym świecie. Niniejszy manuskrypt opisuje optymalizację panelu biomarkerów przy użyciu multipleksowego testu kulek magnetycznych do klasyfikacji raka piersi.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Degradacja kwasów nukleinowych w tkance archiwalnej, niejednorodność guzów i brak świeżo zamrożonych próbek tkanek mogą negatywnie wpłynąć na usługi diagnostyczne raka w laboratoriach patologicznych na całym świecie. Testy diagnostyczne amplifikacji i ekspresji genów z wykorzystaniem materiałów archiwalnych lub materiałów, które wymagają transportu do laboratoriów serwisowych, wymagają bardziej solidnego i dokładnego testu dostosowanego do obecnych przepływów pracy klinicznej. Nasz zespół badawczy zoptymalizował wykorzystanie testu Invitrogen™ QuantiGene™ Plex Assay (Thermo Fisher Scientific) do ilościowego oznaczania RNA w materiale archiwalnym przy użyciu technologii rozgałęzionego DNA (bDNA) na kulkach magnetycznych Luminex xMAP®. Test ekspresji genów opisany w tym manuskrypsie jest nowatorską, szybką i multipleksową metodą, która może dokładnie sklasyfikować raka piersi do różnych podtypów molekularnych, pomijając subiektywność interpretacji nieodłącznie związaną z technikami obrazowania. Ponadto, ze względu na niewielki wymagany wkład materiału, heterogenne guzy mogą być mikropreparowane laserowo przy użyciu skrawków barwionych hematoksyliną i eozyną (H&E). Metoda ta ma szeroki zakres możliwych zastosowań, w tym klasyfikację nowotworów z potencjałem diagnostycznym oraz pomiar biomarkerów w płynnych biopsjach, co pozwoliłoby na lepsze zarządzanie pacjentem i monitorowanie choroby. Ponadto ilościowy pomiar biomarkerów w materiale archiwalnym jest przydatny w badaniach onkologicznych z dostępem do bibliotek materiałów z adnotacjami klinicznymi, w których badania retrospektywne mogą walidować potencjalne biomarkery i korelację ich wyników klinicznych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optymalizacja testów opartych na RNA przy użyciu archiwalnego materiału zatopionego w parafinie (FFPE) jest wyzwaniem ze względu na zmienność w przetwarzaniu tkanek chirurgicznych i degradację RNA spowodowaną przez formalinę używaną do zachowania integralności tkanki1,2. Aby przezwyciężyć ograniczenia związane z wykonywaniem dokładnych badań ekspresji genów z materiału archiwalnego, nasza grupa wykorzystała test kulek magnetycznych bDNA multiplex. Zamiast enzymatycznej amplifikacji matrycy docelowej, technologia bDNA wykorzystuje hybrydyzację określonych sond i amplifikację sygnału reporterowego3. Krótkie sekwencje rozpoznawania sond przechwytujących i detekcyjnych są zaprojektowane tak, aby hybrydyzować się z krótkimi fragmentami docelowego RNA4. Ponadto zastosowanie homogenatów tkankowych jako bezpośredniego materiału wyjściowego w tym teście pozwala przezwyciężyć nieuniknioną utratę RNA, która wynika z testów wymagających wcześniejszej ekstrakcji i oczyszczenia RNA. Wzmocnienie sygnału, zastosowanie krótkich sekwencji rozpoznawania i wykluczenie etapu oczyszczania przyczyniają się do zmniejszenia zmienności technicznej testu. Technologia ta daje możliwość multipleksowania testu (do 80 celów RNA) i pomiaru ekspresji panelu celów przy niskim wkładzie materiału. Protokół ten opisuje przygotowanie i barwienie próbek tkanek do mikrodysekcji laserowej. Barwienie na szkiełkach błonowych ułatwia obrazowanie guza i architektury histologicznej, aby zapewnić dokładną selekcję i profilowanie: (1) guza i prawidłowych przewodów w tkance piersi oraz (2) klonów komórek nowotworowych w heterogennych guzach.

Klasyfikacja molekularna raka piersi to proces, który bada markery molekularne w celu kategoryzacji guzów pacjentów do trzech klas molekularnych, tj. luminalnego, wzbogaconego w receptor ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu 2 (HER2) i podtypu podstawowego. Podtyp wzbogacony w HER2 jest dobrze zdefiniowany, z wysoką ekspresją receptora HER2, ze względu na amplifikację genu ERBB2, w połączeniu z niskim lub brakiem receptora estrogenowego (ER) i receptora progesteronowego (PgR). Podtyp luminalny jest na ogół dodatni dla ER, a podtyp podstawowy jest na ogół ujemny dla trzech receptorów (HER2, ER, PgR) i znacząco pokrywa się z podtypem diagnostycznym potrójnie ujemnego raka piersi (TNBC)5,6. Inne markery służą do określania cech nabłonkowych i mezenchymalnych. Fibronektyna (FN1) jest głównym składnikiem mezenchymalnego przedziału tkanki piersi. Zwiększonej ekspresji FN1 towarzyszy wysokie barwienie Ki67 i wskazuje na bardziej inwazyjny nowotwór7,8 i jest związane z przerzutami9. Co ciekawe, stwierdzono, że FN1 jest obecny w mikropęcherzykach pochodzących z komórek nowotworowych, które indukowały aktywację sygnałów mitogennych w fibroblastach biorcy10. W związku z tym krążące mikropęcherzyki, takie jak egzosomy, są potencjalnym markerem wczesnego wykrycia lub przerzutów i nawrotu11.

Wybór obszaru guza dla subtypowania transkrypcyjnego raka piersi był regularnie wykonywany przez makrodissection12,13. Aby przezwyciężyć niejednorodność tkanek i zwiększyć czułość, niezawodnie połączyliśmy klasyczne barwienie tkanek z metodami multipleksowego profilowania molekularnego. Jako dowód słuszności, dwa odrębne klony raka piersi zostały zdefiniowane na podstawie ich nabłonkowej sygnatury mezenchymalnej i potencjału przerzutowego. Przebieg opisanego protokołu można łatwo przełożyć na obecną konfigurację kliniczną i wykorzystać do selektywnej izolacji i charakterystyki podtypów tkanek za pomocą ukierunkowanego profilowania mRNA.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Etyczna zgoda na użycie materiału tkanki piersi w tym badaniu została uzyskana od Uniwersyteckiej Komisji Etyki Badań (UREC) Uniwersytetu Maltańskiego (Ref: 22/2012).

1. Przygotowanie tkanek

  1. Korzystając z odpowiednich procedur H&E14, przygotuj barwione skrawki tkanek referencyjnych i zeskanuj cyfrowo szkiełka w poszukiwaniu odniesienia podczas mikrosekcji.
  2. Za pomocą mikrotomu wyciąć skrawki tkanek o grubości 20 μm w łaźni wodnej wolnej od RNAzy w temperaturze 40 °C. Zebrać skrawki na szkiełkach membranowych do mikrodysekcji laserowej przy użyciu czystego, odkażonego RNaz sprzętu i materiałów.
  3. Szkiełka membranowe suszyć w temperaturze 37 °C w inkubatorze suszącym przez noc. Wybarwić przy użyciu odpowiedniej procedury H&E15 roztworami klasy biologii molekularnej i wydłużając czas barwienia Hematoxyliny do 6 min. W razie potrzeby wybarwić szkiełka membranowe odpowiednimi protokołami immunohistochemicznymi16.

2. Mikrodysekcja laserowa

  1. Ustaw limity suwaka i skalibruj ruch sceny.
    1. Przesuń widok lasera na pusty obszar szkiełka membranowego. Skalibruj ogniskowanie lasera, wystrzeliwując strzał laserowy w rosnących odstępach czasu (5%), aż laser zacznie przebijać się przez membranę. Narysuj i mikropreparuj dowolny kształt i dostosuj ostrość lasera, aby zmaksymalizować wydajność lasera podczas sekcji laserowej.
    2. Zwiększ prędkość ruchu sceny do punktu, w którym wydajność sekcji laserowej nie jest zagrożona. Skalibruj laser na wybranej soczewce obiektywu i ponownie skalibruj w przypadku zmiany obiektywu (prędkość lasera 1–15%, ostrość 70–75% i moc 90–100% w przypadku korzystania z obiektywu 4X).
  2. Zeskanuj poplamione szkiełka membranowe za pomocą obiektywu 4X.
  3. Wybierz i okrąż obszary docelowe do mikrodysekcji na szkiełku membranowym. Wypreparuj laserowo minimalną powierzchnię 42 mm2. Zanotować obszar poddany preparacji w celu określenia objętości buforu homogenizującego próbkę, który ma być użyty.
  4. Użyj mechanizmu podnoszenia nasadki, aby pobrać wypreparowaną część na nasadki dyfuzora oznakowanych rurek przymocowanych do odpowiedniego wyrostka. Jeśli wypreparowany fragment nie zostanie pobrany na nasadkę, powtórz laserową sekcję obszaru.

3. Liza tkanek

Uwaga: Kilka rozwiązań i materiałów jest dostarczanych wraz z zestawami wymienionymi w Tabeli Materiałów.

  1. Przygotować wymaganą objętość mieszaniny homogenizującej do lizy próbki, używając roztworu homogenizującego i proteinazy K w stosunku 60:1.
  2. Pobrać pipetą 2,4 μl roztworu homogenizującego do każdej probówki na każdy 1mm2 powierzchni tkanki, wirować przez 10 s z maksymalną prędkością i wirować w temperaturze pokojowej przez 5 s przy 2 500 x g.
  3. Inkubować w bloku grzewczym w temperaturze 65 °C przez 12–18 godzin z wytrząsaniem przy 600 obr./min.
  4. Odwirować lizaty przy 21 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Za pomocą pipety ostrożnie odessać przezroczysty supernatant i przelać go do oznaczonej świeżej probówki. Należy unikać zasysania fragmentów tkanki/błony, ponieważ może to obniżyć jakość wyników.
  6. Klarowny supernatant należy przechowywać w zamrażarce o temperaturze -80 °C.

4. Test oparty na hybrydyzacji

  1. Wykonaj następujące przygotowania.
    1. Mieszaninę do lizy należy wstępnie ogrzać, umieszczając butelkę z odczynnikiem w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 30 minut i delikatnie wymieszać przez odwrócenie.
    2. Jeżeli homogenaty tkankowe są zamrożone, rozmrozić je w temperaturze pokojowej i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Po inkubacji próbki
      3. należy przetrząsnąć z maksymalną prędkością.
    3. Ustawić inkubator z wytrząsaniem na temperaturę 54 °C i umieścić sondę zestawu do walidacji temperatury w pustej studzience na 96-dołkowej płytce. Po 2 godzinach sprawdź temperaturę na termometrze cyfrowym i ustaw temperaturę delta inkubatora z wytrząsaniem, aby skorygować różnicę temperatur.
    4. Rozmrażać i wirować zestaw sondy i odczynnik blokujący przez 10 s, odwirować w temperaturze pokojowej przez 5 s przy 2,500 x g i trzymać na lodzie.
    5. Podczas użycia fiolkę z proteinazą K należy przechowywać na lodzie.
    6. Wykonaj sonikę kulek wychwytujących o częstotliwości 46 kHz przez 3 minuty, a następnie wiruj z maksymalną prędkością przez kolejne 3 minuty.
  2. Przygotuj 25 μl roboczej mieszanki kulek na studzienkę, odpowiednio zwiększając następujące odczynniki: 4,25 μl wody wolnej od nukleaz, 16,65 μl mieszaniny do lizy, 1,00 μl odczynnika blokującego, 0,10 μl proteinazy K, 0,50 μl kulek wychwytujących, 2,50 μl zestawu sond.
  3. Wirować roboczą mieszankę kulek przez 10 s z maksymalną prędkością, a następnie pipetować 25 μl/studzienkę do magnetycznej płytki separacyjnej.
  4. Odpipetować 25 μl homogenatu tkankowego do rozdzielającej magnetycznie płytki 96-dołkowej i 25 μl roztworu homogenizującego do 3 dołków jako ślepe próby.
  5. Uszczelnić płytkę separacji magnetycznej za pomocą przezroczystej plastikowej uszczelki ciśnieniowej i umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 54 ± 1 °C na 18–22 godzin, wytrząsając z prędkością 600 obr./min.
  6. Przygotuj 1X roztwór buforowy do płukania dla 24 studzienek, mieszając 31,5 ml wody wolnej od RNaz z 0,1 ml składnika buforu płuczącego 1 i 1,67 ml składnika buforu płuczącego 2.
  7. Wyjąć płytkę z inkubatora. Ustawić temperaturę inkubatora z wytrząsaniem na 50 ± 1 °C.
  8. Zamontuj magnetyczną płytkę separacyjną na ręcznej magnetycznej podkładce do płyt i zablokuj na miejscu. Zdejmij uszczelkę ciśnieniową i odczekaj 1 minutę, aż kulki magnetyczne osiądą.
  9. Etap mycia: Odwróć magnetyczną płytkę separacyjną zamontowaną na płycie nad zlewem i delikatnie osusz bibułkę, aby usunąć resztki roztworu. Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 100 μl 1X roztworu buforowego do każdej studzienki i odczekaj 15 sekund. Powtórz ten krok, aby umyć płytkę 3 razy.
  10. Odpipetować 50 μl odczynnika przedwzmacniacza do każdej studzienki. Uszczelnij płytkę aluminiową uszczelką płytową i potrząsaj płytką z prędkością 800 obr./min przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 50 ± 1 °C, wytrząsając z prędkością 600 obr./min.
  11. Powtórz krok 4.9 (Krok prania).
  12. Odpipetować 50 μl odczynnika wzmacniacza do każdego dołka. Uszczelnij płytkę aluminiową uszczelką płytową i potrząśnij płytką jak w kroku 4.10.
  13. Powtórz krok 4.9 (Krok prania).
  14. Obracaj sondę etykiety przez 10 sekund z maksymalną prędkością. Dodać 50 μl sondy do etykietowania do każdej studzienki. Uszczelnić i wstrząsnąć płytką (krok 4.10).
  15. Powtórz krok 4.9 (Krok prania).
  16. Wirować fikoerytrynę streptawidyny (SAPE) przez 10 s z maksymalną prędkością. Dodać 50 μl SAPE do każdej studzienki. Uszczelnić i wstrząsnąć płytką (krok 4.10).
  17. Powtórz krok 4.9 (Krok mycia), z wyjątkiem użycia buforu do płukania SAPE zamiast roztworu buforu do mycia.
  18. Dodać 130 μl buforu płuczącego SAPE do każdej studzienki i uszczelnić płytkę aluminiową uszczelką. Potrząsaj płytką z prędkością 800 obr./min w temperaturze pokojowej przez 3 minuty.
  19. Uruchom analizator kulek magnetycznych. Wykonaj procedurę kalibracji i weryfikacji, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
  20. Skonfiguruj protokół w analizatorze kulek magnetycznych, używając następujących parametrów: Wielkość próbki: 100 μL; Brama DD: 5 000–25 000; Limit czasu: 90 s; Zdarzenie koralika/region koralika: 100; i kliknij Dalej. Wybierz odpowiednie numery koralików w panelu i zdefiniuj regiony koralików z odpowiednimi genami docelowymi, zgodnie ze wskazaniami producenta.
  21. Dodaj nową analizę, wybierając opcję "Utwórz partię przy użyciu istniejącego protokołu" na karcie Partie. W układzie płyt oznacz studzienki odpowiednio jako nieznane lub puste i podaj etykietę dla każdej próbki w panelu Próbki.
  22. Zdejmij aluminiową uszczelkę płytki z 96-dołkowej płytki reakcyjnej. Wysuń tackę na płytki, klikając przycisk Wysuń, załaduj płytkę do analizatora kulek magnetycznych. Kliknij przycisk Wycofaj| Uruchom usługę Batch, aby zainicjować analizator. Po odczytaniu wysuń i wyjmij płytkę 96-dołkową. Wyczyść i wyłącz analizator kulek magnetycznych zgodnie z zaleceniami producenta.

5. Analiza danych

  1. W wsadzie | Wyniki, wybierz odpowiedni plik analizy i kliknij przycisk eksportuj to.csv. Otwórz plik the.csv za pomocą arkusza kalkulacyjnego.
  2. Obserwuj liczbę ściegów i pomiń wszelkie wyniki, mając < 40 koralików/region.
  3. Uśrednić wartości studzienek ślepej próby i obliczyć odchylenie standardowe (SD) i granicę wykrywalności (LOD) (średnia ślepej próby + (3xSD)) dla każdego genu docelowego. Ustaw wartości niższe niż poziom szczegółu jako niewykryte.
    Uwaga: Jeśli którakolwiek z wartości wyrażenia normalizującego nie zostanie wykryta, należy uznać przykładowe dane za nieodpowiednie. Wartości wyrażeń powyżej 20 000 należy uznać za przekroczenie górnego limitu poufności. Lizaty tych próbek należy rozcieńczyć i ponownie przeanalizować.
  4. Odejmij ślepą średnią od surowych danych dla każdego genu.
  5. Oblicz średnią geometryczną wybranych genów normalizujących na próbkę. Znormalizuj dane poszczególnych próbek do odpowiedniej średniej geometrycznej.
  6. Analizuj dane na platformach data science lub przy użyciu zdefiniowanych algorytmów.
    1. Zaimportuj dane do platformy nauki o danych, klikając pozycję Dodaj dane. Przeciągnij plik danych do obszaru roboczego procesu i połącz się z operatorem [Wybierz atrybuty], następnie z operatorem analizy głównych składowych (PCA), a następnie z portem pomocniczym.
    2. W operatorze Wybierz atrybut wybierz podzbiór znormalizowanych danych genów i zmienną nominalną, taką jak podtyp raka piersi. Uruchom proces, klikając przycisk Odtwórz. Na karcie Wykresy wybierz opcję "Scatter 3D Color" w stylu wykresu i zmienną nominalną w polu Color. Oceń zmienność danych PCA na wykresie 3-wymiarowym.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisana metoda została zastosowana do jednoczesnego pomiaru 40 transkryptów w wysoce zdegradowanym materiale FFPE wybarwionym H&E (Rysunek 1), mikrorozciętym (Rysunek 2). Korzystając z tej metody, pokazujemy dokładną charakterystykę statusu receptora (Figura 3A), klasyfikację nowotworów na podtypy molekularne luminalne i bazalne 17 oraz różnicową ekspresję markera mezenchymalnego, FN1, porównując guz i dopasowaną tkankę kontrolną (Figura 3B), w różnych podtypach receptorów dodatnich i ujemnych.

figure-results-1
Rysunek 1: Ekspresja genów przy użyciu materiału barwionego H&E. Korelacja między profilem ekspresji pochodzącym z niebarwionego wycinka guza w porównaniu z barwionym wycinkiem guza. [Wartość p korelacji Pearsona = 5,34E-26]. Powielane za zgodą17. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rycina 2: Mikrodysekcja laserowa tkanek FFPE. (A) szkiełko barwione H&E; (B) Barwienie immunohistochemiczne w celu ekspresji ER; (C) barwienie immunohistochemiczne HER2; (D) Niebarwiony przekrój 20 μm na laserowych szkiełkach membranowych do mikrodysekcji. Żółta strzałka wskazuje obszar inwazyjnego guza, który nie jest wyraźnie odgraniczony z powodu braku barwienia. (E) Przekrój o grubości 20 μm barwiony materiałem H&E w celu lepszego wyznaczenia obszarów zainteresowania. Białe strzałki wskazują ślad sekcji laserowej, podczas gdy czerwona strzałka pokazuje ognisko lasera podczas sekcji. Wszystkie ilustracje zostały wykonane w 10-krotnym powiększeniu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rycina 3: Ekspresja (A) statusu receptora i (B) mezenchymalnego markera FN1 w guzie piersi w porównaniu z dopasowaną normą. Klasyczne podtypy diagnostyczne raka piersi są definiowane zgodnie z wynikiem diagnostycznym przy użyciu immunohistochemii i fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) dla niejednoznacznego barwienia immunohistochemicznego HER2. Znormalizowana ekspresja (A) HER2 i ER, (B) FN1 mierzona testem opartym na hybrydyzacji jest zilustrowana w przypadkach HER2-dodatnich, ER dodatnich i TNBC w porównaniu z normalną tkanką piersi dopasowaną do pacjenta. Statystyka testu Kruskala Wallisa (KW χ2) pokazuje, że ekspresja HER2 jest znacznie (p < 0,05) wyższa w tkance nowotworowej w przeciwieństwie do dopasowanej normalnej tkanki w kohorcie HER2-dodatniej i znacznie niższa w kohorcie TNBC. Nie stwierdzono, aby ekspresja ER była znacząco wyższa w tkance nowotworowej w przeciwieństwie do dopasowanej normy w kohortach ER dodatnich i TNBC. FN1 jest znacznie wyższy w tkance nowotworowej w podtypach HER2 i ER dodatnich i wykazuje tendencję do znacznego wzrostu w tkance nowotworowej również w kohorcie TNBC. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rycina 4: Studium przypadku: niejednorodność guza. Morfologicznie odrębne guzy poddano mikrodysekcji i potraktowano jako odrębne próbki. (A) Skan wzorcowy sekcji BHP. (B, C) Powiększenie 10x i 40x, odpowiednio dla każdej zidentyfikowanej morfologii guza. (D) Barwienie immunohistochemiczne dla ER przy 10-krotnym powiększeniu. (E) Barwienie immunohistochemiczne dla Ki67 przy 10-krotnym powiększeniu wykazujące wyższą aktywność mitotyczną w guzie 1. (F) Znormalizowane poziomy ekspresji genu ESR1 w każdym guzie wykazujące stosunkowo wysoką i równą ekspresję między guzami, zgodnie z oczekiwaniami na podstawie wyniku immunohistochemicznego. (G) Znormalizowane poziomy ekspresji FN1, markera mezenchymalnego, w którym zwiększonej ekspresji FN1 towarzyszy wysokie barwienie Ki67 wskazujące na sygnaturę bardziej inwazyjnego guza. Odwrotność obserwuje się w guzie 2, który wydaje się być wolniej rozwijającym się guzem o niższym potencjale złośliwym reprezentowanym przez zmniejszoną ekspresję FN1. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Test multipleksowego bDNA oparty na koralikach został zoptymalizowany w celu ilościowego określenia ekspresji genów na zdegradowanym RNA pochodzącym z tkanki raka piersi FFPE i prawidłowych przewodów piersi. Optymalizacja testu polegała na opracowaniu algorytmu klasyfikacji guzów raka piersi w podtypach luminalnych i podstawnych, wykorzystując 8 dobrze znanych biomarkerów i 5 potencjalnych genów normalizujących. Normalizacji danych dokonano przy użyciu permutacji genów normalizujących. Wybór genów normalizujących opierał się na najlepszym przewidywaniu statusu receptora przy użyciu genów klasyfikatora Luminal/Basal. Aby sklasyfikować podtypy Luminal/Basal z tkanek FFPE, wybrano geny normalizujące Beta-aktyna (ACTB), dehydrogenaza 3-fosforanowa aldehydu glicerynowego (GAPDH) i fosforybozylotransferaza hipoksantynowa 1 (HPRT1).

Metoda może być zaadaptowana do stosowania w innych obszarach diagnostycznych i badawczych po odpowiednim doborze zestawu genów normalizujących. Jednym z ważnych zastosowań tej metody w sektorze badawczym jest pomiar biomarkerów w materiałach archiwalnych, które są dobrze oznaczone wynikami klinicznymi. Mogłoby to szybko i dokładnie zweryfikować potencjalne markery predykcyjne w badaniach retrospektywnych oraz uniknąć długoterminowych badań prospektywnych w oczekiwaniu na dane dotyczące przeżycia wolnego od choroby i przeżycia całkowitego. Obecnie nasza grupa bada zastosowanie testu do wykrywania egzosomów receptorowo-dodatnich, co wymaga opracowania nowego algorytmu wykorzystującego alternatywne geny normalizujące do normalizacji danych. Zastosowanie płynnych biopsji i solidnych testów ekspresji genów pozwoli na wysokoprzepustowe testy multipleksowe dostosowane do postępowania z pacjentem podczas leczenia i zapewnią środki do śledzenia skuteczności leczenia, potencjalnego nawrotu z powodu oporności na terapię oraz zdolności guzaka do przerzutów.

Metoda ta ma również szeroki zakres możliwych zastosowań w diagnostyce nowotworów i jest dostosowana do obecnego przebiegu diagnostyki. Do głównych zalet tej metody w diagnostyce należą: (1) implementacja testów o wysokiej przepustowości, (2) wykluczenie subiektywności i niejednoznacznych wyników pochodzących z pomiarów obrazowych, (3) dokładne wykrywanie wielu celów jednocześnie, co zwiększa dokładność i minimalizuje użycie cennych próbek pacjentów, oraz (4) brak konieczności stosowania wysoce wyspecjalizowanych obiektów i zasobów ludzkich. Zoptymalizowany proces pobierania próbek, wraz z niskim wkładem materiału wymaganego do testu multipleksowego opartego na koralikach, pozwala na dalsze badanie niejednorodności guza; dzięki zastosowaniu mikrodysekcji laserowej do dokładnego oddzielenia wielu ognisk tkanki złośliwej od tego samego wycinka pacjenta, możliwe jest porównanie ekspresji wielu genów między nimi, a także z dopasowaną normalną tkanką (ryc. 4). Niski wkład materiału ma kluczowe znaczenie dla zastosowań diagnostycznych w biopsjach guza, które zapewniają ograniczoną tkankę nowotworową. Zdolność testu do pomiaru ekspresji genów ze zdegradowanych próbek RNA pozwala na łatwy transport próbek do analizy w instytucji lub do laboratoriów serwisowych. Ponadto możliwa była również analiza całego przekroju przy użyciu materiału barwionego H&E (rysunek 1).

Aby ten protokół zakończył się sukcesem, konieczne jest: (1) zapewnienie prawidłowego pobierania próbek z miejsca lub miejsc guza, które są poddawane lizie do testu oraz (2) opracowanie dobrze zoptymalizowanych i zwalidowanych algorytmów normalizacji danych dla każdego panelu ekspresji genów i/lub indywidualnych biomarkerów prognostycznych lub predykcyjnych. Pierwsza z tych czynności zależy od doświadczenia technicznego technika/naukowca dokonującego pobierania próbek. Zaleca się pobranie dodatkowego rdzenia i przygotowanie mikromacierzy tkankowej (TMA) w tym samym formacie, co multipleksowy test kulek magnetycznych (format 96-dołkowy). Zapewni to archiwum miejsc nowotworowych jako replikę próbek używanych do testu opartego na RNA. TMA mogą być również oceniane za pomocą innych technik w celu przeprowadzenia badań uzupełniających lub walidacji wyników. Rozwój algorytmów normalizacyjnych jest zależny od badanego materiału i genów normalizujących wybranych do normalizacji. Różne panele genów normalizujących są wybierane na podstawie poziomu i zmienności ekspresji w analizowanej próbce, a to różni się w zależności od tkanek rakowych o różnym pochodzeniu, egzosomów z osocza lub krążących komórek nowotworowych. Walidacja testu obejmuje przetwarzanie próbki, ponieważ różne preparaty będą również skutkować różnymi algorytmami normalizacji.

Podsumowując, zastosowanie technologii bDNA w połączeniu z technologią kulek magnetycznych i dobór odpowiedniego panelu genów docelowych zapewni dodatkową zaletę pomiaru ekspresji genów bezpośrednio w lizatach tkankowych pochodzących z niewielkich ilości materiału pacjenta, w tym materiału mikropreparowanego, egzosomów i krążących komórek nowotworowych. Oprócz wykrywania niejednorodności guza, właściwe stosowanie paneli może potencjalnie wykrywać egzosomy pochodzące z guza w celu wczesnej diagnostyki i wczesnego wykrywania nawrotów. Ponieważ nie ma potrzeby przeprowadzania etapu amplifikacji kwasu nukleinowego, amplifikacja sygnału przy użyciu technologii bDNA, w połączeniu z multipleksem opartym na koralikach, mierzy ekspresję wielu genów w klinicznie anotowanym materiale archiwalnym i stanowi źródło do walidacji biomarkerów.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Test Invitrogen™ QuantiGene™ Plex jest własnością firmy Thermo Fisher Scientific. Produkcja i publikacja tego artykułu w otwartym dostępie była sponsorowana przez Luminex Corporation

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca była wspierana przez (1) stypendium Breast Cancer Project (2014-2016) ufundowane przez Fundację Action for Breast Cancer oraz ALIVE 2013 przez Research, Innovation & Development Trust (RIDT) Uniwersytetu Maltańskiego, (2) Faculty of Medicine & Surgery, University of Malta oraz (3) Project ACT finansowany przez Malta Council for Science & Technology poprzez FUSION: Program Rozwoju Technologii Badań Naukowych i Innowacji 2016. Publikacja tego manuskryptu jest wspierana przez grant Jove-Luminex.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
MicrotomeLeicaRM2235
Heamatoxylin Mayer'sSigmaMHS16-500mL
Eozyna Y Wodny roztwórSigmaHT110216-500mL
Normalna surowica króliczaMonosanMONX10963Rozcieńczenie robocze: 1/40
Biotynylowany królik anty-myszDakoE0354Rozcieńczenie robocze: 1/200
Przeciwciało ER (6F11)Vector LaboratoriesVPE614Rozcieńczenie robocze: 1/45
Przeciwciało HER2 (CB11)NovocastraCB11-L-CERozcieńczenie robocze: 1/325
Przeciwciało Ki67 (MIB-1)DakoM7240Rozcieńczenie robocze: 1/500
Zestaw Avidin Biotyna ComplexVector LaboratoriesPK-6100
Nikon Eclipse Ti-E MikroskopodwróconyObiektywy NikonTi-E4x, 10x, 20x i 40x
Laserowe membrany do mikrodysekcjiMaszyny molekularne i BranżeS0103
mmi CellCamera 1.4Maszyny molekularne i BranżeMX4285c-ACK07
mmi Cellcut PlusMaszyny molekularne i Branże
Nasadki dyfuzorówMaszyny molekularne i Branże50210
mmi Oprogramowanie Celltools v.4.01rclMaszyny molekularne i Branże
Eppendorf Thermomixer comfortEppendorf5355000038
1,5 ml blok grzewczy do Eppendorf ThermomixerEppendorf22670522
96-dołkowy płytowy blok grzewczy do Eppendorf ThermomixerEppendorf22670565
Labnet Vortemp 56 Inkubator z wytrząsaniemLabnet52056A-220
LX200 Analizator magnetyczny 100/200Luminex
Zestaw do przetwarzania próbek Invitrogen QuantiGene - Chusteczki FFPEThermoFisher ScientificQS0109
Invitrogen QuantiGene Plex 2.0 (separacja magnetyczna)ThermoFisher ScientificQP1011
Folia uszczelniająca Thermaseal RTSRęczna
ThermoFisher ScientificQP1011
Invitrogen QuantiGene Inkubator Zestaw do walidacji temperaturyAffymetrix/PanomicsQS0517
Proteinaza K (50&mikro; g/&mikro; L)ThermoFisher Scientific14622
Invitrogen QuantiGene Plex 2.0 ZestawyThermoFisher ScientificVarious
Multi Speed VortexKisker BiotechMSV-3500
SonicatorSilvercrest
RNASEZAPSigmaR2020-250ML
Aluminiowa 96-dołkowa uszczelkapłytkowa SigmaZestaw do walidacji temperatury Z721549-100EA
ThermoFisher ScientificQS0517
Społeczność RapidMiner Studio 7.1.001Platforma nauki o danychRapidMiner
Piec hybrydyzacyjnyHybaid (Thermo Scientific)
Zestaw testowy magnetyczna podkładka do płyt Thermaseal 765246

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Abrahamsen, H. N., Steiniche, T., Nexo, E., Hamilton-Dutoit, S. J., Sorensen, B. S. Towards quantitative mRNA analysis in paraffin-embedded tissues using real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction: a methodological study on lymph nodes from melanoma patients. J Mol Diagn. 5 (1), 34-41 (2003).
  2. Macabeo-Ong, M., et al. Effect of duration of fixation on quantitative reverse transcription polymerase chain reaction analyses. Mod Pathol. 15 (9), 979-987 (2002).
  3. Yang, W., et al. Direct quantification of gene expression in homogenates of formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Biotechniques. 40 (4), 481-486 (2006).
  4. Flagella, M., et al. A multiplex branched DNA assay for parallel quantitative gene expression profiling. Anal Biochem. 352 (1), 50-60 (2006).
  5. Goldhirsch, A., et al. Strategies for subtypes--dealing with the diversity of breast cancer: highlights of the St. Gallen International Expert Consensus on the Primary Therapy of Early Breast Cancer 2011. Ann Oncol. 22 (8), 1736-1747 (2011).
  6. Schnitt, S. J. Classification and prognosis of invasive breast cancer: from morphology to molecular taxonomy. Mod Pathol. 23, Suppl 2. S60-S64 (2010).
  7. Bae, Y. K., et al. Fibronectin expression in carcinoma cells correlates with tumor aggressiveness and poor clinical outcome in patients with invasive breast cancer. Hum Pathol. 44 (10), 2028-2037 (2013).
  8. Park, J., Schwarzbauer, J. E. Mammary epithelial cell interactions with fibronectin stimulate epithelial-mesenchymal transition. Oncogene. 33 (13), 1649-1657 (2014).
  9. Zhou, Z., et al. MRI detection of breast cancer micrometastases with a fibronectin-targeting contrast agent. Nat Commun. 6, 7984(2015).
  10. Antonyak, M. A., et al. Cancer cell-derived microvesicles induce transformation by transferring tissue transglutaminase and fibronectin to recipient cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (12), 4852-4857 (2011).
  11. Moon, P. G., et al. Fibronectin on circulating extracellular vesicles as a liquid biopsy to detect breast cancer. Oncotarget. 7 (26), 40189-40199 (2016).
  12. Parker, J. S., et al. Supervised risk predictor of breast cancer based on intrinsic subtypes. J Clin Oncol. 27, (2009).
  13. Nielsen, T., et al. Analytical validation of the PAM50-based Prosigna Breast Cancer Prognostic Gene Signature Assay and nCounter Analysis System using formalin-fixed paraffin-embedded breast tumor specimens. BMC Cancer. 14, 177-177 (2014).
  14. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and Eosin Staining of Tissue and Cell Sections. Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2008).
  15. Molecular Machines and Industries. H&E Staining Kit Plus for Laser Microdissection and more, Prod. No 70302. , Available from: http://www.molecular-machines.com/single_cell_sorting_products/consumables/mmi_he_staining_kit_plus (2018).
  16. Lin, F., Prichard, J. Handbook of Practical Immunohistochemistry: Frequently asked questions. , Springer. (2011).
  17. Grech, G., et al. Molecular Classification of Breast Cancer Patients Using Formalin-fixed Paraffin-embedded Derived RNA Samples. Journal of Molecular Biomarkers & Diagnosis. 7 (S8), (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multiplex RNA AssayBreast Cancer SubtypingFFPE Tissue AnalysisLaser MicrodissectionQuantiGene Plex AssayLuminex xMAP TechnologyBranched DNA TechnologyRNA Expression QuantificationBiomarker ValidationClinical Workflow Adaptation

Related Articles