Method Article

Metoda optogenetyczna do kontroli i analizy wzorców ekspresji genów w interakcjach międzykomórkowych

DOI:

10.3791/57149

⸱

March 22nd, 2018

 , 
1Institute for Frontier Life and Medical Sciences, Kyoto University, 2Japan Science and Technology Agency, PRESTO, 3Institute for Integrated Cell-Material Sciences, Kyoto University, 4Graduate School of Medicine, Kyoto University, 5Graduate School of Biostudies, Kyoto University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół do analizy transferu informacji oscylacyjnych między komórkami za pomocą kontroli optogenetycznej i monitorowania ekspresji genów na żywo. Podejście to stanowi unikalną platformę do testowania funkcjonalnego znaczenia programów dynamicznej ekspresji genów w systemach wielokomórkowych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki powinny prawidłowo reagować na czasowo zmieniające się środowisko, na które wpływ mają różne czynniki pochodzące z otaczających komórek. Szlak sygnałowy Notch jest jedną z takich podstawowych maszynerii molekularnych do komunikacji międzykomórkowej, która odgrywa kluczową rolę w prawidłowym rozwoju zarodków. Szlak ten obejmuje transfer informacji oscylacyjnych z komórki do komórki z rytmami ultradowymi, ale pomimo postępu w technikach biologii molekularnej wyjaśnienie wpływu interakcji wielokomórkowych na dynamikę genów oscylacyjnych było wyzwaniem. W tym miejscu przedstawiamy protokół, który pozwala na kontrolę optogenetyczną i monitorowanie na żywo wzorców ekspresji genów w precyzyjny sposób czasowy. Metoda ta z powodzeniem ujawniła, że wewnątrzkomórkowe i międzykomórkowe okresowe wejścia sygnalizacji Notch pociągają wewnętrzne oscylacje poprzez dostrojenie częstotliwości i przesunięcie fazowe w rozdzielczości pojedynczej komórki. Podejście to ma zastosowanie do analizy dynamicznych cech różnych szlaków sygnałowych, zapewniając unikalną platformę do testowania funkcjonalnego znaczenia dynamicznych programów ekspresji genów w systemach wielokomórkowych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komunikacja między komórkami odgrywa kluczową rolę w tworzeniu się embrionalnych wzorców w procesach rozwojowych. W zarodkach kręgowców struktury metameryczne zwane somitami tworzą się wzdłuż osi przednio-tylnej ciała z precyzyjną dokładnością czasową pod kontrolą zegara odmierzającego czas, zwanego zegarem segmentacyjnym1. Podczas tego procesu grupa komórek mezodermy presomitycznej (PSM) jest okresowo przekształcana w somity w sposób synchroniczny. Proces ten obejmuje zsynchronizowaną oscylacyjną ekspresję genów i komórki PSM, które oscylują w fazie, tworząc te same somity. Okres oscylacyjnej ekspresji genów wynosi około 2 do 3 godzin u myszy ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Generowanie stabilnych linii komórkowych przez system Tol2

  1. Transfekcyjne wektory plazmidowe (Rysunek 1A) modułów optogenetycznych opartych na Tol2 wraz z wektorem ekspresyjnym transpozazy (Tol2) (pCAGGS-mT2TP) do komórek C2C12. Na wszystkich etapach hodowle komórek z pożywką DMEM uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i penicyliną-streptomycyną w temperaturze 37 °C (Tabela 1), w obecności 5% CO2 oznaczone inaczej.
    1. Policz trypsynizowane komórki za pomocą licznika komórek i umieść 5 x 104 komórek C2C12 na studzienkę na 12-dołkowej płytce na dzień przed transfekcją.<....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dostosowaliśmy system LightOn11,12, który umożliwia fotoindukowaną ekspresję genów w komórkach ssaków, do badania oscylatorów genetycznych o częstotliwości od 2 do 3 godzin. System ten składa się z dwóch części: fotoindukcyjnego aktywatora transkrypcji hGAVPO i kasety promotora UAS do sterowania transkrypcją dowolnych genów będących przedmiotem zainteresowania. Aby przyspieszyć pulsacyjną kinetykę fotoindukowanej ekspresji genów, .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pokazaliśmy metodę kontrolowania dynamiki ekspresji genów z okresowością od 2 do 3 godzin. Ta skala czasowa jest znacznie krótsza niż w innych konwencjonalnych systemach, w tym w systemie Tet-On i oryginalnym systemie LightOn. Kluczowymi parametrami, które pozwalają osiągnąć ultradobowe skale czasowe, są okresy półtrwania produktów molekularnych indukowanych światłem, mRNA i białek. Te parametry kinetyczne mogą zależeć od typów i gatunków komórek. W celu dostrojenia kinetyki zastąpienie sekwencji Hes1 3'UTR innymi jest p.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez JST, PRESTO (A.I.), Core Research for Evolutional Science and Technology (JPMJCR12W2 (R.K.)), Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Ministerstwo Edukacji, Kultury, Sportu, Nauki i Technologii (MEXT), Japan 26119708 (A.I.) i 16H06480 (R.K.)), Scientific Research (A) (Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) 24240049 (R.K.)), i Młodych Naukowców (A) (JSPS 15H05326 (A.I.)) oraz grant na badania naukowe w innowacyjnych obszarach "Obrazowanie na żywo fluorescencji" MEXT w Japonii oraz Platformę Dynamicznych Podejść do Żywego Systemu z MEXT w Japonii.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
FACSBecton, Dickinson and CompanyFACSAriaII SORP
KameraAndoriKon M-934
MikroskopOlympusIX-81 ZDC
PMT urządzenieChuritsu eletric corp.CL24B-LIC/B
Niebieski oświetlacz LEDOptoCodeLEDB-SBOXH
DMEMNacalai08459-35
Penicylina-streptomycynaNacalai26253-84
Płodowa surowica bydlęcaSigma172012
KRYSTAL24 (płytka 24-dołkowa)Hi-tech303012
D-Lucyferyna Potas SólNacalai20028-24
ŚwiatłomierzLI-COR BiosciencesLI-250A przeciwciało
anty-HA-peroksydazyRoche3F10
Przeciwciało anty-aktyno-peroksydazyWakoklon 2F3
Klon

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hubaud, A., Pourquie, O. Signalling dynamics in vertebrate segmentation. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15, 709-721 (2014).
  2. Maroto, M., Dale, J. K., Dequeant, M. L., Petit, A. C., Pourquié, O. Synchronised cycling gene oscillations in presomitic mesoderm cells requi....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Optogenetic ControlGene ExpressionCell to cell InteractionsNotch Signaling PathwayLive MonitoringBlue light IlluminationSingle cell ResolutionFluorescence ImagingLuciferase AssayTime lapse Recording

Related Articles