Metoda optogenetyczna do kontroli i analizy wzorców ekspresji genów w interakcjach międzykomórkowych

Summary

Tutaj prezentujemy protokół do analizy transferu informacji oscylacyjnych między komórkami za pomocą kontroli optogenetycznej i monitorowania ekspresji genów na żywo. Podejście to stanowi unikalną platformę do testowania funkcjonalnego znaczenia programów dynamicznej ekspresji genów w systemach wielokomórkowych.

Abstract

Komórki powinny prawidłowo reagować na czasowo zmieniające się środowisko, na które wpływ mają różne czynniki pochodzące z otaczających komórek. Szlak sygnałowy Notch jest jedną z takich podstawowych maszynerii molekularnych do komunikacji międzykomórkowej, która odgrywa kluczową rolę w prawidłowym rozwoju zarodków. Szlak ten obejmuje transfer informacji oscylacyjnych z komórki do komórki z rytmami ultradowymi, ale pomimo postępu w technikach biologii molekularnej wyjaśnienie wpływu interakcji wielokomórkowych na dynamikę genów oscylacyjnych było wyzwaniem. W tym miejscu przedstawiamy protokół, który pozwala na kontrolę optogenetyczną i monitorowanie na żywo wzorców ekspresji genów w precyzyjny sposób czasowy. Metoda ta z powodzeniem ujawniła, że wewnątrzkomórkowe i międzykomórkowe okresowe wejścia sygnalizacji Notch pociągają wewnętrzne oscylacje poprzez dostrojenie częstotliwości i przesunięcie fazowe w rozdzielczości pojedynczej komórki. Podejście to ma zastosowanie do analizy dynamicznych cech różnych szlaków sygnałowych, zapewniając unikalną platformę do testowania funkcjonalnego znaczenia dynamicznych programów ekspresji genów w systemach wielokomórkowych.

Introduction

Komunikacja między komórkami odgrywa kluczową rolę w tworzeniu się embrionalnych wzorców w procesach rozwojowych. W zarodkach kręgowców struktury metameryczne zwane somitami tworzą się wzdłuż osi przednio-tylnej ciała z precyzyjną dokładnością czasową pod kontrolą zegara odmierzającego czas, zwanego zegarem segmentacyjnym¹. Podczas tego procesu grupa komórek mezodermy presomitycznej (PSM) jest okresowo przekształcana w somity w sposób synchroniczny. Proces ten obejmuje zsynchronizowaną oscylacyjną ekspresję genów i komórki PSM, które oscylują w fazie, tworząc te same somity. Okres oscylacyjnej ekspresji genów wynosi około 2 do 3 godzin u myszy i około 30 minut u danio pręgowanego. Po dysocjacji komórki PSM tracą synchrony^2,3, ale po ponownym zagregowaniu mogą się samoorganizować i odzyskiwać populację synchrony⁴, co sugeruje, że sprzężenie komórka-komórka jest kluczem do zsynchronizowanych oscylacji.

Szeroko zakrojone wysiłki wykazały, że cząsteczki sygnałowe w szlaku Delta-Notch są ściśle powiązane z zsynchronizowanymi oscylacjami genów zegara segmentacji. Albo inhibitory farmakologiczne, albo mutacje genetyczne sygnalizacji Notch desynchronizują populację oscylatorów. U danio pręgowanego mutanty komponentów sygnalizacyjnych Notch, takich jak DeltaC, DeltaD i Notch1a, wyświetlają oscylacje asynchroniczne^5,6. W zarodkach piskląt lub myszy do zsynchronizowanych oscylacji wymagany jest nie tylko ligand Notch Delta-like1 (Dll1), ale także Obrzeża Lunatic Modulator Notch (Lfng)^7,8,9. Trudno było jednak przetestować funkcjonalną zdolność takich cząsteczek do dynamicznego przekazywania informacji z komórki do komórki, ponieważ czasowe rozdzielczości konwencjonalnych zaburzeń dynamiki regulacji genów nie były wystarczające do zbadania procesów w skalach czasowych 2-3 h (rytmy ultradobowe).

Niedawno opracowaliśmy zintegrowaną metodę kontroli i monitorowania wzorców ekspresji genów w komórkach ssaków¹⁰. Technologia ta umożliwia indukcję impulsów ekspresji genów poprzez okresowe oświetlenie światłem w ultradobowych skalach czasowych. Protokół ten reprezentuje metody ustanawiania światłoczułych linii komórkowych i obserwacji dynamicznych odpowiedzi komórek reporterowych poprzez monitorowanie luminescencji żywych komórek w kontekście komunikacji między komórkami. Metoda ta ma zastosowanie do analizy wielu innych szlaków sygnałowych.

Protocol

1. Generowanie stabilnych linii komórkowych przez system Tol2

1. Transfekcyjne wektory plazmidowe (Rysunek 1A) modułów optogenetycznych opartych na Tol2 wraz z wektorem ekspresyjnym transpozazy (Tol2) (pCAGGS-mT2TP) do komórek C2C12. Na wszystkich etapach hodowle komórek z pożywką DMEM uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i penicyliną-streptomycyną w temperaturze 37 °C (Tabela 1), w obecności 5% CO₂ oznaczone inaczej.
   1. Policz trypsynizowane komórki za pomocą licznika komórek i umieść 5 x 10⁴ komórek C2C12 na studzienkę na 12-dołkowej płytce na dzień przed transfekcją.
   2. Kotransfekcja 0,375 μg wektorów optogenetycznych na bazie Tol2 (pAI177 lub pAI218), 0,125 μg wektora selekcji leków (pAI170) i 0,5 μg wektora pCAGGS-mT2TP przy użyciu odczynnika do lipofekcji.
   3. Trypsynizuj transfekowane komórki i umieść je w 100-milimetrowych szalkach hodowlanych jeden dzień po transfekcji.
   4. Zamiana pożywki hodowlanej dla transfekowanych komórek na pożywkę hodowlaną uzupełnioną 100 mg/ml higromycyny.
   5. Hoduj komórki przez 3 dni w celu wyeliminowania komórek nietransfekowanych. Należy pamiętać, że zmiana medium nie jest konieczna.
2. Trypsynizuj transfekowane komórki i oczyszczaj populację komórek wyrażających białka fluorescencyjne do selekcji. W przypadku komórek odbiorczych przenoszących pAI177 należy ustawić bramkę sortującą na kanał Green-PE w celu oczyszczenia populacji komórek mCherry-dodatnich. W przypadku światłoczułych komórek nadawczych przenoszących pAI218 należy ustawić bramkę sortującą na kanał APC w celu oczyszczenia populacji komórek iRFP713-dodatnich.
3. (opcjonalnie) Ustalić populację komórek klonalnych za pomocą standardowych metod, takich jak ograniczone rozcieńczenie lub sortowanie pojedynczych komórek za pomocą FACS.

2. Ocena wrażliwości na światło komórek zmodyfikowanych na poziomie populacji

UWAGA: Ta część opisuje protokół sprawdzania dynamicznej indukcji białek ligandu Dll1 przy oświetleniu światłem niebieskim za pomocą testów biochemicznych, takich jak qPCR i Western blotting.

1. Skonfiguruj dwa typy inkubatorów ze źródłami światła lub bez, odpowiednio dla stanu wywołanego światłem lub stanu ciemności. Ustaw natężenie światła w niebieskim trans-iluminatorze LED, jak pokazano na Rysunek 1B, za pomocą światłomierza. Zaprogramuj czasy i czas trwania oświetlenia świetlnego, ładując skrypt sterujący do jednopłytkowego mikrokontrolera, który umożliwia programowalne harmonogramy oświetlenia (Rysunek 1C).
2. Policz trypsynizowane komórki za pomocą licznika komórek i płytki 1,0 x 10⁵ światłoczułych komórek nadawczych zawierających pAI218 i pAI170 na plastikowych szalkach hodowlanych o średnicy 35 mm (więcej niż 12 szalek dla warunków jasnych i 1 szalka dla warunków ciemnych) i umieść szalki w oddzielnych inkubatorach dla warunków ciemnych/jasnych. Po ustawieniu szalek należy trzymać drzwi inkubatorów zamknięte do momentu zebrania lizatów komórkowych.
3. Półtora dnia po posiewie rozpocznij oświetlenie światłem (oczekuje się, że komórki będą zlewać się w ponad 80%). Nie wystawiaj komórek na działanie światła, aby uniknąć niepożądanej fotostymulacji.
   UWAGA: Harmonogramy oświetlenia zależą od celu eksperymentów. Należy pamiętać, że warunki stałego oświetlenia (np. 1-minutowy czas trwania i 10-minutowe interwały o natężeniu światła 40 μmol/^m2/s) są wystarczające do prostego sprawdzenia fotoindukcji, a silne oświetlenie światłem jest szkodliwe dla komórek. Dlatego upewnij się, że wybrane są nieszkodliwe parametry oświetlenia.
4. Około 2 dni po posiewie przygotuj lizat komórkowy w 30-minutowych odstępach. Przenieś szalki z próbek z inkubatorów na lód i zacznij przygotowywać lizaty komórkowe do dalszej analizy.

3. Dynamiczny test nadawczo-odbiorczy na poziomie populacji: monitorowanie w czasie rzeczywistym odpowiedzi komórkowych na stymulację optyczną przez PMT

1. Trypsynizuj i policz liczby komórek nadawczych i odbiorczych standardowymi metodami. Przygotować 1 ml całkowitej objętości zawiesiny mieszającej 2,5 x 10⁴ komórek odbiornika i 1,25 x 10⁵ komórek nadawczych (stosunek 1:5).
   UWAGA: Proporcje nadawca-odbiorca 2:1, 1:1 lub 1:2 działają również z całkowitą liczbą komórek 1,5 x 10⁵. ¹⁰
2. Płytki z mieszanymi komórkami w każdym dołku z 24-dołkowych czarnych płytek z pożywką hodowlaną zawierającą 1 mM lucyferynę.
3. Przeanalizuj komórki na czytniku płytek pod kątem testu lucyferazy i upewnij się, że sygnały wyjściowe nie są zbyt wysokie dla systemu rejestrującego.
   UWAGA: Jeśli sygnały wyjściowe są wyższe niż 1 x 10⁶ zliczeń/s fotonów, mogą być nasycone. W takim przypadku należy zmniejszyć stężenie lucyferyny do optymalnych wartości, tak aby sygnały wyjściowe były niższe niż 1 x 10⁶ zliczeń fotonów/s.
4. Ustaw płytkę w systemie nagrywania i uruchom program do nagrywania (Rysunek 1D). Dla example, rozpocznij oświetlenie światłem po 18 h po ustawieniu nagrywania.
   UWAGA: Filtrowanie czasowe, takie jak sygnały detrendingu z ruchomym uśrednianiem i filtrowanie Savitzky'ego-Golaya, są przydatne do wizualizacji kształtów fal i detekcji pików.

4. Dynamiczny test nadawczo-odbiorczy na poziomie pojedynczej komórki: obrazowanie w czasie rzeczywistym odpowiedzi pojedynczych komórek pod kontrolą perturbacji optogenetycznych

1. Płytka 0,5 x 10⁵ odbiorników i 2,5 x 10⁵ komórek nadawczych na naczyniach o średnicy szklanej o średnicy 27 mm i średnicy 35 mm. Upewnij się, że proporcje mieszania i całkowita liczba komórek (gęstość komórek) są prawidłowo dostosowane.
2. Jednego dnia po posiewie wymienić pożywkę na 2 ml pożywki rejestrującej (pożywka DMEM wolna od czerwieni fenolowej uzupełniona 5% FBS, penicylina-streptomycyna i 1 mM lucyferyna) i umieścić szklaną pożywkę na mikroskopie. W razie potrzeby wypłukać resztki martwych komórek za pomocą PBS (-).
   UWAGA: Lepiej jest wykonać ten krok w ciemności.
3. Ustawić mikroskop odwrócony wyposażony w komorę środowiskową o temperaturze 37 °C i 5% CO_{2 .}
4. Skonfiguruj chłodzoną kamerę CCD. Upewnij się, że temperatura czujnika CCD jest schłodzona do wartości docelowej (zwykle -90 °C).
5. Ustaw parametry okna "Multi-Dimensional Timelapse" w oprogramowaniu do automatycznej akwizycji, aby przechwytywać obrazy w odstępach 5-minutowych i więcej niż 288 razy (więcej niż jedno nagranie w nocy).
   1. Otwórz okno "Multi-Dimensional Timelapse", wybierz kanał luminescencji i tryb wolnego odczytu 50 kHz z menu rozwijanego i ustaw binning 4 x 4 z 4-minutową ekspozycją. Upewnij się, że tryb odczytu jest ustawiony na wolny tryb 50 kHz, co ma kluczowe znaczenie dla redukcji szumów odczytu w celu wykrycia słabo emitującego światła bioluminescencyjnego.
   2. Otwórz okno "Multi-Dimensional Timelapse", wybierz kanały fluorescencji i szybki tryb odczytu 1 MHz z menu rozwijanego i ustaw binning 2 x 2 z ekspozycją 400 ms. Upewnij się, że tryb odczytu jest ustawiony na szybki tryb 1 MHz, aby skrócić czas potrzebny na obrazowanie fluorescencyjne.
   3. Rozpocznij nagrywanie poklatkowe, klikając przycisk "Pobierz".
6. Wyodrębnij jednokomórkowe ślady kanałów luminescencyjnych z filmów poklatkowych za pomocą oprogramowania do analizy obrazu w następujący sposób. Najpierw utwórz obrazy stosu luminescencji i fluorescencji, importując dane obrazu do oprogramowania do analizy obrazu. W przypadku obrazów luminescencyjnych należy usunąć gorące piksele pochodzące z promieniowania kosmicznego, porównując intensywność pikseli na czasowo sąsiadujących obrazach, zastępując wartości pikseli średnią czasową poprzedniej i następnej klatki (zaimplementowane jako "filtr SpikeNoise"), zastosuj te przetworzone obrazy do filtra wygładzającego przestrzennie i odejmij wartości pikseli tła widoków zewnętrznego pola od każdej klatki. Następnie określ "obszar zainteresowania" (ROI) dla każdej komórki na obrazie fluorescencyjnym w każdym punkcie czasowym, zastosuj ROI do obrazów luminescencyjnych i zmierz intensywność luminescencji każdego ROI.

Results

Dostosowaliśmy system LightOn^11,12, który umożliwia fotoindukowaną ekspresję genów w komórkach ssaków, do badania oscylatorów genetycznych o częstotliwości od 2 do 3 godzin. System ten składa się z dwóch części: fotoindukcyjnego aktywatora transkrypcji hGAVPO i kasety promotora UAS do sterowania transkrypcją dowolnych genów będących przedmiotem zainteresowania. Aby przyspieszyć pulsacyjną kinetykę fotoindukowanej ekspresji genów, ...

Discussion

Pokazaliśmy metodę kontrolowania dynamiki ekspresji genów z okresowością od 2 do 3 godzin. Ta skala czasowa jest znacznie krótsza niż w innych konwencjonalnych systemach, w tym w systemie Tet-On i oryginalnym systemie LightOn. Kluczowymi parametrami, które pozwalają osiągnąć ultradobowe skale czasowe, są okresy półtrwania produktów molekularnych indukowanych światłem, mRNA i białek. Te parametry kinetyczne mogą zależeć od typów i gatunków komórek. W celu dostrojenia kinetyki zastąpienie sekwencji Hes1 3'UTR innymi jest p...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
FACS	Becton, Dickinson and Company	FACSAriaII SORP
Kamera	Andor	iKon M-934
Mikroskop	Olympus	IX-81 ZDC
PMT urządzenie	Churitsu eletric corp.	CL24B-LIC/B
Niebieski oświetlacz LED	OptoCode	LEDB-SBOXH
DMEM	Nacalai	08459-35
Penicylina-streptomycyna	Nacalai	26253-84
Płodowa surowica bydlęca	Sigma	172012
KRYSTAL24 (płytka 24-dołkowa)	Hi-tech	303012
D-Lucyferyna Potas Sól	Nacalai	20028-24
Światłomierz	LI-COR Biosciences	LI-250A przeciwciało
anty-HA-peroksydazy	Roche	3F10
Przeciwciało anty-aktyno-peroksydazy	Wako	klon 2F3