Tutaj prezentujemy protokół do badania zachowań związanych ze wzrostem roślin, a zwłaszcza fenotypów w powtarzalny sposób. Pokazujemy, jak zapewnić zmienne, a jednocześnie stabilne warunki oświetleniowe. Prawidłowe analizy zależą od wystarczającej liczby prób i prawidłowych ocen statystycznych.
Artykuł metodologiczny
Analiza zachowania wzrostu Arabidopsis thaliana w różnych jakościach światła
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Biolodzy roślin często muszą obserwować zachowanie wzrostu wybranych przez siebie gatunków. W tym celu rośliny potrzebują stałego środowiska i stabilnych warunków oświetleniowych, które są korzystnie zmienne pod względem ilości i jakości, aby można było prowadzić badania w różnych konfiguracjach. Wymagania te spełniają komory klimatyczne wyposażone w diody elektroluminescencyjne (LED), które – w przeciwieństwie do świetlówek – mogą być ustawione na różne długości fal. Diody LED są energooszczędne i praktycznie nie emitują ciepła nawet przy natężeniu światła, co często stanowi problem w przypadku innych źródeł światła. Prezentowany protokół zawiera wskazówki krok po kroku, jak zaprogramować komorę klimatyczną wyposażoną w zmienne oświetlenie LED, a także opisuje kilka podejść do dogłębnej analizy fenotypów wzrostu. W zależności od konfiguracji eksperymentalnej można obserwować i analizować różne cechy rosnących roślin. Tutaj opisujemy, jak określić świeżą masę, powierzchnię liści, aktywność fotosyntetyczną i gęstość aparatów szparkowych. Wykazujemy, że w celu uzyskania wiarygodnych danych i wyciągnięcia prawidłowych wniosków konieczne jest wykorzystanie wystarczającej liczby osób do oceny statystycznej. Pobranie zbyt małej liczby roślin do tego rodzaju analizy skutkuje dużymi błędami statystycznymi, a co za tym idzie, mniej jednoznacznymi interpretacjami danych.
Wprowadzenie
Arabidopsis thaliana od ponad dwóch dekad jest modelowym organizmem dla badaczy roślin ery molekularnej. Kilka cech sprawia, że ten mały przedstawiciel rodziny Brassica jest idealnym kandydatem do badań genetycznych i molekularnych: ma stosunkowo mały genom z zaledwie pięcioma chromosomami (w porównaniu np. z Nicotiana tabacum z 24 chromosomami), a jego genom został całkowicie zsekwencjonowany w 20001. A. thaliana może być łatwo modyfikowana genetycznie przez Agrobacterium infection2 i jest podatna nawet na najnowsze narzędzia genetyczne, takie jak CRISPR/Cas3. Chociaż jest niewielki, cykl wzrostu jest wystarczająco szybki, aby umożliwić eksperymenty biochemiczne, w których potrzebna jest większa ilość materiału. Rośliny rosną na płytkach agarowych lub na glebie i mogą być nawet uprawiane jako kultury płynne4. Arabidopsis może być uprawiany w kontrolowanych klimatycznie szafkach, np. firmy Percival, w komorach klimatycznych lub w szklarniach. Aby móc porównywać zachowania wzrostowe i analizować fenotypy mutantów, kluczowe znaczenie ma zapewnienie powtarzalnych i jednocześnie elastycznych warunków wzrostu5. W zależności od problemu naukowego, który ma być rozwiązany, mogą być potrzebne różne temperatury i stałe warunki oświetleniowe, różne natężenia światła lub różne jakości światła w tej samej temperaturze. Światło jest bardzo krytycznym parametrem we wzroście roślin, a jego wpływ jest często badany na różne sposoby6. Aby zapewnić odtwarzalność i porównywalność uzyskanych danych, kluczowe znaczenie ma zapewnienie stabilnej mocy wyjściowej i zastosowanie tego samego rodzaju źródeł światła.
Zwykłe źródła światła w szklarniach i komorach klimatycznych składają się z lamp sodowych lub fluorescencyjnych, które sprzyjają satysfakcjonującemu wzrostowi roślin, ale mają kilka wad. Po pierwsze, starzeją się z czasem, co zmienia wyjście widmowe nie tylko pod względem intensywności, ale także jakości (obserwacje własne). Jednak tylko intensywność jest zwykle monitorowana w sposób ciągły, dzięki czemu zmiana jakości światła może pozostać niezauważona, ale nadal mieć znaczące skutki. Po drugie, oba typy lamp wytwarzają ciepło przy wyższym natężeniu światła, co samo w sobie ma głęboki fizjologiczny wpływ na wzrost roślin i może maskować wszelkie efekty zależne od światła. Po trzecie, moc widmowa tych źródeł światła jest niezmienna i zupełnie niepodobna do naturalnego światła słonecznego7. Wszystkie te wady zostały przezwyciężone w przypadku diod LED)8,9,10,11. Mają długą żywotność przy prawie zerowej zmianie emisji, nie wytwarzają ciepła odpadowego nawet przy bardzo dużym natężeniu światła i są bardzo elastyczne pod względem mocy widmowej.
Tutaj ilustrujemy, jak skonfigurować komorę klimatyczną z oddzielnymi diodami LED dla światła czerwonego, niebieskiego i białego oraz śledzić różne parametry wzrostu roślin w czasie. Mierzymy świeżą masę, powierzchnię liści, gęstość aparatów szparkowych i wydajność fotosyntezy. Jednocześnie pokazujemy, jak ważne jest prawidłowe tworzenie ocen statystycznych.
Protokół
Ten protokół zawiera kilka przykładów analizy zachowania wzrostu roślin A. thaliana.
1. Przygotowanie
- Przed rozpoczęciem należy dokładnie zaplanować, ile roślin będzie potrzebnych do przeprowadzenia wiarygodnej analizy statystycznej eksperymentów, a następnie przygotuj odpowiednie ilości doniczek.
UWAGA: Zawsze dopuszczaj możliwość, że niektóre nasiona mogą nie wykiełkować. - Użyj komory klimatycznej z różnymi indywidualnie programowalnymi poziomami diod LED, aby porównać wzrost roślin w tych samych ogólnych warunkach środowiskowych (tabela materiałów).
2. Wzrost roślin i ustawienie świateł LED
- Przygotuj odpowiednią liczbę (w zależności od różnych warunków i/lub mutantów, które mają być analizowane) doniczek o wymiarach 6 x 7 cm z ziemią i posadź pojedyncze nasiono w każdej z nich.
UWAGA: W tym przypadku wysiano 36 roślin na warunki. - Wernalizować przez dwa dni w temperaturze 4 °C.
- Ustaw wilgotność względną powietrza na 65%, a temperaturę na 22 °C/16 °C dla 16 godzin cyklu dziennego / 8 godzin nocnego. Dostosuj światło na wszystkich poziomach do intensywności 200 μM/cm2/s1. W tym celu należy wprowadzić odpowiednie wartości do programu za pomocą ekranu dotykowego z przodu komory klimatycznej. Aby porównać cztery różne jakości światła, ustaw diody LED na następujące parametry, jak podano w tabeli 1.
| Identyfikacja | 395 nm [%] | 440 nm [%] | 3 tys. [%] | 660 nm [%] | 770 nm [%] |
| "Światło słoneczne" | 100 | 11 | 100 | 15 | 100 |
| Czerwony i niebieski (RB) | 100 | 15 | 25 | 10 | 100 |
| Niebieski (B) | 100 | 15 | 25 | cyfra arabska | 25 |
| Czerwony (R) | 90 | cyfra arabska | 25 | 10 | 100 |
Tabela 1: Skład natężenia światła emitowanego przez diody LED
- Monitoruj wyjście spektralne w sposób ciągły, np. za pomocą wbudowanego skalibrowanego spektrometru.
- Umieść rośliny w komorze klimatycznej na różnych poziomach i przykryj je przezroczystą górą, aż pojawią się dobrze rozwinięte liścienie. Upewnij się, że rośliny są wystarczająco podlewane.
- Monitoruj i dokumentuj rośliny na oko i fotograficznie tak często, jak to konieczne, w zależności od tego, jak szybko rosną rośliny w wybranych warunkach, np. co dwa dni. Upewnij się, że używasz statywu do aparatu, aby zapewnić równą odległość między aparatem a obiektami dla wszystkich zdjęć, a tym samym umożliwić porównania. W razie potrzeby użyj podziałki liniowej.
UWAGA: Termin DAS (dni po siewie) odnosi się do faktycznego sadzenia nasion, w tym wernalizacji.
3. Określanie wydajności PSII
- Użyj fluorymetru z modulacją impulsów. Ustaw głowicę kamery w odpowiedniej odległości od rośliny, tak aby cała rozeta była widoczna na oknie na żywo.
- Po uruchomieniu oprogramowania pojawi się okno "wybierz jednostkę". Zaznacz "MINI", a następnie "ok." Wybierz kolor "niebieski" w następnym wyskakującym okienku. Kliknij "ok."
UWAGA: Lampa pomiarowa fluorescencji modulowana impulsowo włącza się automatycznie. Na monitorze pojawi się okno Obraz pokazujące parametr fluorescencji Ft. Roślina umieszczona pod kamerą może być teraz widoczna jako pomarańczowy obraz. - Aby ustawić ostrość obrazu i/lub wybrać określone obszary rośliny, przełącz się na Live Video, zaznaczając pole "wideo na żywo" i obróć pierścień regulacji soczewki obiektywu. Zamknij okno LIVE Video, klikając pole wyjścia w prawym górnym rogu.
- Aby zmierzyć parametry fotosyntezy, zdefiniuj obszar zainteresowania (AOI). Użyj do tego domyślnego ustawienia, którym jest okrąg, który automatycznie pojawia się na środku ekranu. Czerwone pole obok reprezentuje uśrednioną wartość Ft wszystkich pikseli w AOI. Zdefiniuj odpowiedni AOI, wybierając z pola AOI w prawym panelu, gdzie dostępne są różne formularze. Kliknij "dodaj" w zakładce AOI i umieść okrąg w obszarze liścia. Powtórz pięć razy na liść.
- Utrzymuj ustawienia (zakładka po prawej stronie) na wartościach domyślnych podanych przez producenta (Tabela 2).
| Miara. Światło | Int. | częstotliwość | |
| 1 | 1 | ||
| Akt. Światło | Int. | Szerokość | |
| 8 | 0 | ||
| Korekcje obrazu | Mini | ||
| Transformacja obrazu | bateria | ||
| 16,7 V | |||
| korzyść | 5 | ||
| Tłumienia | 1 | ||
| Puls satelitarny | Int. | Nie | Interwały s |
| 8 | 1 | Rozdział 30 | |
| Powolna indukcja | Opóźnienie s | Zegar s | Czas trwania s |
| Rozdział 40 | 20 | Rozdział 315 | |
| Sortywencja | Wzmocnienie czerwieni | Intensywność czerwieni | Intensywność NIR |
| 340 | 25 | 13 | |
| wyświetlać | Kolor | ||
| Limit PS | 50 | ||
| Inh. Ref. AOI | 1 | ||
| Współczynnik Fm (tick) | 1 030 |
Tabela 2: Domyślne ustawienia dla pomiarów PAM dostarczone przez producenta.
- Zastosuj błysk światła nasycającego, aby wykonać pomiar parametrów fotosyntezy za pomocą analizy wygaszania fluorescencyjnego (impuls nasycenia). Wcześniej należy określić współczynniki hartowania, mierząc minimalną i maksymalną wydajność fluorescencji rośliny przystosowanej do ciemności. W tym celu umieść roślinę w ciemności (np. w szufladzie lub ciemnym pudełku) na kilka minut. Następnie umieść roślinę pod głowicą kamery, zaznacz pola Pomiar i ML (światło pomiarowe), w rzędzie pod obrazem wybierz "Fv/Fm", taktując w kółko, i kliknij Fo,Fm u dołu ekranu.
UWAGA: Fo/Fm reprezentuje plon PSII rośliny przystosowanej do ciemności. Jest to więc wartość, do której normalizowany jest pomiar po przyłożeniu światła. Bieżący pomiar Fo/Fm pozostanie do momentu aktywacji nowego rekordu. Wszystkie wartości F i Fm' określone przez impulsy nasycenia są powiązane z Fo / Fm i odpowiednio obliczane są parametry hartowania. - Znajdź te wyniki na karcie raportu i zaznacz wszystkie pola po prawej stronie, które są związane z eksperymentem (np. Y(II), qP, qN itd.).
- Eksport wyników do oprogramowania analitycznego, np. Excel, klikając przycisk eksportu w lewym górnym rogu i zapisz pod odpowiednią nazwą pliku. Wygeneruj co najmniej pięć AOI na liść i zmierz kilka liści tej samej rośliny (nie zapomnij o krótkim przystosowaniu rośliny do ponownego zaciemnienia po każdym pomiarze), a także kilka roślin z jednego stanu, które można następnie ocenić statystycznie.
- Do analizy statystycznej wygeneruj wartości średnie i odchylenia standardowe ze wszystkich AOI i co najmniej trzech niezależnych roślin dla wszystkich punktów czasowych/warunków i wykonaj test t-studenta, aby ocenić, czy dane są istotne12. Dane są oceniane jako znacząco różne, gdy wartości p są niższe niż 0,05.
4. Oznaczanie gęstości aparatów szparkowych
- Zbierz trzy w pełni rozwinięte liście rozety z trzech pojedynczych roślin na każdy warunek do 70% etanolu na szklanej szalce Petriego i wyekstrahuj chlorofil. Inkubować w tym rozpuszczalniku przez noc w temperaturze pokojowej lub przechowywać w temperaturze 4 °C.
- Aby uzyskać pełne usunięcie pigmentów, inkubuj w roztworze wodzianu chloralu (hydrat chloralu: woda: glicerol = 8: 2: 1 w/v/w), aż liście staną się całkowicie białe.
- Wykonaj obrazy powierzchni odbytu za pomocą mikroskopii interferencyjnej (DIC) w powiększeniu 40x. Policz aparaty szparkowe w polu widzenia i ekstrapoluj za pomocą skali na aparaty szparkowe na mm². Powtórz tę procedurę dla co najmniej 4 liści na warunki. Przeprowadź analizę statystyczną, obliczając średnią wartość dla wszystkich liści jednego warunku i na tej podstawie oblicz średni błąd.
5. Oznaczanie świeżej masy
- Usuń wszystkie liście, w tym ogonki liściowe, z rozet z sześciu roślin na stan za pomocą żyletki. Natychmiast zważyć wszystkie liście i poddać dane analizom statystycznym opisanym powyżej.
6. Określenie obszaru liścia rozety
- Użyj zdjęć z ośmiu roślin w każdym stanie, aby graficznie przeanalizować obszar liści. Połącz obrazy dla jednego warunku na jednym obrazie i zapisz jako *.jpeg lub *.tiff.
- Pobierz odpowiednie oprogramowanie (Tabela materiałów).
UWAGA: Oczywiście możliwe jest zastosowanie dowolnego innego programu zdolnego do wykonania tego zadania. - Otwórz plik obrazu. Wybierz narzędzie "wybór z wolnej ręki". Otaczaj liście, w tym ogonki jednej rozety. Kliknij "Analizuj - ustaw pomiary" i zaznacz "Obszar", "Min & Max wartość szarości", "Zintegrowana gęstość" i "Średnia wartość szarości". Wybierz odpowiednie miejsca dziesiętne, najlepiej dwa lub trzy i kliknij "ok".
- Aby uzyskać mm2 zamiast pikseli, użyj polecenia "ustaw skalę". Zastosuj narzędzie do zaznaczania linii prostej, aby dokonać wyboru linii odpowiadającej znanej odległości, np. średnicy liścia, którą można łatwo obliczyć na podstawie paska skali obrazów, a następnie otwórz okno dialogowe Ustaw skalę i wprowadź zdefiniowaną odległość i jednostkę miary. Następnie wróć do "analizuj" i kliknij "zmierz".
- Pojawi się nowe okno zatytułowane "wyniki", które zawiera odpowiednie dane dla bieżącej rozety. Powtórz tę procedurę ze wszystkimi roślinami na obrazie i zainicjuj pomiary powierzchni dla każdej nowej rośliny za pomocą Ctrl + M.
UWAGA: W przypadku mniejszych roślin z niezachodzącymi na siebie liśćmi można użyć "narzędzia różdżki", aby ułatwić i przyspieszyć proces. Gdy tylko liście zaczną się pokrywać, to narzędzie nie daje wiarygodnych wyników. - Alternatywnie odetnij wszystkie liście i ustaw je w taki sposób, aby można było zrobić zdjęcie poglądowe, a następnie użyj narzędzia różdżki. Weź pod uwagę, że przy stosowaniu tej metody potrzeba więcej roślin.
- Wybierz "Plik" -"Zapisz jako" w oknie wyników i wygeneruj odpowiednią nazwę pliku oraz lokalizację w katalogu komputera. Plik zostanie automatycznie zapisany w formacie Excel.
7. Przygotowanie RNA
- Zbierz trzy próbki z dziesięciu pojedynczych roślin dla każdego stanu. Ekstrahuj całkowite RNA za pomocą zestawu do ekstrakcji roślinnego RNA zgodnie z instrukcjami producenta. Określ stężenie, czystość i integralność RNA za pomocą bioanalizatora. RNA może być następnie wykorzystane do dalszych zastosowań, takich jak qRT-PCR lub analiza ekspresji genów, np. RNASeq13.
Wyniki
Obserwacja i analiza wzrostu roślin, a w szczególności fenotypów roślin mutantów, opierają się na stabilnych i powtarzalnych warunkach środowiskowych. Można je zapewnić w komorach klimatycznych. Ilość, a zwłaszcza jakość światła, krytycznie zależy od zastosowanego źródła światła, którym w niniejszym badaniu były lampy LED.
Rysunek 1 przedstawia przykład komory klimatycznej wyposażonej w panele LED. Rysunek 1A pokazuje zrzut ekranu panelu sterowania, w którym można dostosować wszystkie warunki klimatyczne i oświetleniowe. W ciągu 24 h można ustawić dwadzieścia różnych przedziałów czasowych. W tym przykładzie zaprogramowano warunki długiego dnia z 16 h światła i 8 h ciemności. Komora ta posiada cztery poziomy, które można programować oddzielnie, co pozwala na badanie wzrostu roślin przy czterech różnych ustawieniach oświetlenia w dokładnie tych samych warunkach środowiskowych. Górny lewy poziom został ustawiony na emisję spektralną naśladującą światło słoneczne w stopniu maksymalnie możliwym technicznie; górny prawy poziom reprezentuje zwiększone światło czerwone (660 nm) i niebieskie (440 nm) przy zredukowanym świetle białym (3K). Dolny lewy poziom ustawiono na zwiększone światło niebieskie, a dolny prawy na światło głównie czerwone. Rysunek 1B ilustruje diody LED przy różnych ustawieniach w formie przejrzystego zestawienia (panel środkowy) oraz odpowiednich powiększeń (zewnętrzne małe panele). Różnice w jakości światła są łatwo dostrzegalne gołym okiem.
Wbudowany spektrometr stale mierzy, monitoruje i koryguje emisję widmową. Rycina 2 przedstawia widmo z górnego lewego poziomu 1.1, który został ustawiony tak, aby naśladować światło słoneczne. W porównaniu ze standardową żarówką fluorescencyjną udział promieniowania UV i światła niebieskiego jest znacznie wyższy7.
Na Rysunku 3 przedstawiono przykład roślin A. thaliana z wszystkich czterech warunków, odpowiednio 10, 13 i 17 dni po wysiewie. Wszystkie rośliny zostały sfotografowane z tej samej odległości przy użyciu kamery zamontowanej na statywie. Pasek skali reprezentuje 1 cm. Po 10 dniach nie można dostrzec większych różnic w wielkości lub kolorze, jednak po 17 dniach ewidentny jest szybszy wzrost pod wpływem czerwonego światła. Oprócz tej analizy wizualnej przeprowadzono kilka analiz fizjologicznych.
Rysunek 4 przedstawia kolejne etapy pomiarów PAM, które służą do analizy np. wydajności fotosyntetycznej. Na Rysunku 4A widoczny jest zrzut ekranu z podglądu na żywo, który służy do ustawienia ostrości na roślinie w celu zapewnienia optymalnej jakości pomiarów. Zamiast ustawiania ostrości na całej roślinie, można wybrać do analizy pojedynczy liść. Rysunek 4B obrazuje aktualną wydajność fluorescencji Ft rośliny zaadaptowanej do ciemności przed rozpoczęciem właściwego pomiaru. W tym przypadku wybrano pięć okrągłych obszarów zainteresowania (AOI). Liczby w czerwonych polach obok każdego AOI przedstawiają bezpośrednio wynik liczbowy, który można również zapisać w formie tabeli. Aby rozpocząć pomiar parametrów fotosyntetycznych, należy ustawić Fo,Fm. Zrzut ekranu Ft po wykonaniu tej czynności przedstawiono na Rysunku 4C. Należy zauważyć, że przycisk „Fo,Fm” nie jest już teraz aktywny. Aby rozpocząć nowy pomiar, należy kliknąć „New Record”, aby usunąć poprzednią normalizację. Wreszcie Rysunek 4D pokazuje efektywną wydajność kwantową PSII Y(II) po podaniu nasycającego impulsu światła („SAT-Pulse”). Ilościowe zestawienie przykładowych danych przedstawiono na Rysunku 5. Rośliny hodowane w świetle słonecznym o natężeniu 200 µM/cm2/s1 (Rysunek 5A) analizowano odpowiednio 12, 21 i 28 dni po wysiewie. Nasze dane wykazują, że wydajność PSII jest istotnie wyższa w liściach roślin hodowanych przez trzy tygodnie niż w tych hodowanych przez 12 dni. Różnica między 28 a 12 dniami jest nadal istotna, ale wartość p jest wyższa. Na Rysunku 4B porównano wydajność PSII roślin hodowanych przez dwa tygodnie przy różnej jakości światła. Co ciekawe, stała hodowla pod światłem zawierającym wysoką proporcję światła niebieskiego prowadzi do istotnie większej wydajności PSII. Podobny efekt zaobserwowano u roślin hodowanych pod wzbogaconym światłem czerwonym, jednak wzrost był nieco niższy.
Wykazano, że różne jakości światła wpływają na rozwój aparatów szparkowych14. W związku z tym zbadano gęstość szparek. Rycina 6 przedstawia wygląd liścia po ekstrakcji pigmentów. Poszczególne komórki epidermy są wyraźnie rozróżnialne, a szparki można łatwo policzyć. Na rysunku poszczególne aparaty szparkowe oznaczone są gwiazdką. Szczegółowe dane dotyczące gęstości szparek roślin z różnych ustawień oświetleniowych można znaleźć w innym opracowaniu9.
Poza inspekcją wizualną (Rysunek 3) masa świeża stanowi dobrą miarę postępów w wzroście. W tym przykładzie zważono liście roślin hodowanych w „świetle słonecznym”, odpowiednio 8, 10 i 12 dni po wysiewie. Ewaluację statystyczną tych danych przedstawiono na Rysunku 7. Zgodnie z oczekiwaniami masa świeża zwiększa się wraz z upływem czasu.
Oprócz masy świeżej, powierzchnia liści jest dobrym miernikiem wzrostu. W tym przypadku rozwój roślin śledzono w 10., 13. i 17. dniu po wysiewie (Ryc. 8A). W celu uzyskania wiarygodnych danych statystycznych rutynowo oceniano co najmniej sześć poszczególnych roślin. Aby wykazać znaczenie dużej liczby próbek, obliczono błąd procentowy wartości średniej przy analizie odpowiednio dwóch i sześciu roślin (Ryc. 8B). Oznacza to, że wyznaczono procent odchylenia standardowego w stosunku do wartości średniej. Wyraźnie widać, że w przypadku małej liczby próbek błąd jest o 5–10% wyższy niż w przypadku większej liczby próbek. Zwiększenie liczby ocenianych roślin pozwala zminimalizować błąd, co znacznie ułatwia interpretację danych.
Rycina 1: Różne jakości światła dostarczane przez diody LED. A) Zrzut ekranu z panelu sterowania komorą LED. Długość dnia jest ustawiona na 16 h (prawy górny róg), a natężenie światła na 200 µmol cm-2 s-1. Jakość światła różni się na wszystkich czterech poziomach: 1.1 reprezentuje widmo jak najbardziej zbliżone do światła słonecznego, 1.2 reprezentuje światło z wysokim udziałem długości fal czerwonych i niebieskich (RB), 2.1 jest ustawione głównie na niebieskie (B), 2.2 reprezentuje głównie światło czerwone (R). B) Środkowy panel przedstawia przegląd wszystkich poziomów; panele zewnętrzne pokazują poszczególne poziomy w większym powiększeniu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 2: Widmo długości fali z symulowanych ustawień światła słonecznego. Przedstawiono zrzut ekranu z wbudowanego spektrometru w komorze LED, który został umieszczony na poziomie 1.1. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 3: Rozwój roślin w ciągu tygodnia. Reprezentatywne rośliny A. thaliana ze wszystkich czterech warunków oświetlenia w dniach 10, 13 i 17 DAS. Rośliny zostały sfotografowane cyfrowym aparatem refleksowym na statywie. Pasek skali na wszystkich obrazach reprezentuje 1 cm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 4: Zrzuty ekranu z reprezentatywnych etapów pomiarów PAM roślin A. thaliana. A) Zrzut ekranu z widoku „Live video”, w którym można dostosować ostrość obrazu. B) Bieżąca wydajność fluorescencji Ft przed zastosowaniem jakichkolwiek impulsów światła. C) Bieżąca wydajność fluorescencji Ft po wyznaczeniu Fo/Fm. D) Efektywna wydajność kwantowa PSII po zastosowaniu nasycającego impulsu światła. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 5: Graficzna reprezentacja wpływu na wydajność kwantową PSII (YII). A) Statystycznie oceniono dane z roślin 12, 21 i 28 dni po wysiewie, hodowanych przy 200 µmol/cm2/s1 w symulowanym świetle słonecznym („sunlight”), poddanych analizie PAM. Przedstawiono wartości średnie dla pięciu roślin i pięciu obszarów zainteresowania (AOI) na dzień. Jeden asterisk oznacza istotną różnicę przy wartości p <0,05 w porównaniu z dniem 12., a dwa asteriski oznaczają bardzo istotne różnice przy wartości p <0,02 zgodnie z testem t-Studenta. B) Statystycznie oceniono dane z roślin hodowanych przy 200 µmol/cm2/s1 odpowiednio w symulowanym świetle słonecznym (SL), świetle wzbogaconym w barwę niebieską (B) lub czerwoną (R). Przedstawiono wartości średnie dla pięciu roślin i pięciu AOI na dzień. Istotne różnice obliczono w porównaniu do „sunlight”.
Rysunek 6: Reprezentatywny obraz aparatów szparkowych na stronie abaksjalnej liścia A. thaliana. Liście przygotowano zgodnie z powyższym opisem i poddano analizie wizualnej pod mikroskopem świetlnym z ustawieniami DIC przy powiększeniu 40X. Aparaty szparkowe policzono w widocznym obszarze co najmniej 4 liści dla każdego wariantu. Zdjęcie wykonano za pomocą kamery cyfrowej podłączonej do tubusu mikroskopu. Liczbę aparatów szparkowych na mm² obliczono przy pomocy paska skali. Gwiazdki wskazują pojedynczy aparat szparkowy. Pasek skali reprezentuje 200 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Rycina 7: Graficzna reprezentacja masy świeżej roślin A. thaliana hodowanych przy symulowanym świetle słonecznym/200 µmol/cm2/s1. Liście rozety odcinano od roślin w ósmym, dziesiątym i dwunastym dniu po wysiewie. Przedstawiono wartości średnie w mg dla sześciu roślin na dzień. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 8: Ocena statystyczna A. thaliana powierzchnia liści roślin hodowanych w różnych warunkach oświetleniowych. A) Powierzchnię liści roślin A. thaliana hodowanych przez 10, 13 i 17 dni wyznaczono graficznie za pomocą programu ImageJ, a dane z n Statystycznie oceniono 6 roślin. Powierzchnię liści wszystkich sześciu rozet z każdego wariantu zsumowano i podzielono przez sześć, aby uzyskać wartość średnią. Na podstawie tej wartości obliczono odchylenie standardowe, które przedstawiono za pomocą słupków błędu. B) Powierzchnię liści wyznaczono graficznie za pomocą programu ImageJ, a dane pochodziły z jednej z dwóch n = 2 lub n = odpowiednio 6 roślin, przeanalizowano statystycznie zgodnie z opisem dla panelu A. Następnie obliczono błąd procentowy wartości średniej i przedstawiono go graficznie. Zielone słupki przedstawiają błąd procentowy z analizy n = 6, niebieskie słupki z n = 2 rośliny. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ilustracji.
Dyskusja
Pierwszym krokiem w badaniu wzrostu roślin jest ustawienie komory klimatycznej zgodnie z pożądanymi warunkami. Można to łatwo zrobić, wpisując wszystkie zmienne do maski programu odpowiedniego oprogramowania (Rysunek 1A). Na tym etapie można wprowadzić wiele modyfikacji, zmieniając reżim oświetlenia i/lub temperaturę. Upewnij się, że stale monitorujesz temperaturę, wilgotność i warunki oświetleniowe (Rysunek 2), aby awaria techniczna nie zrujnowała eksperymentu. Jest to punkt krytyczny dla uzyskania powtarzalnych wyników. Chociaż ta konfiguracja oferuje wiele zmiennych i może być elastycznie dostosowywana, ma swoje ograniczenia. Obecnie dostępne światła LED nie są w stanie w stu procentach naśladować światła słonecznego, a warunki klimatyczne wewnątrz komory klimatycznej nigdy nie mogą w pełni odzwierciedlić tego, co dzieje się na zewnątrz15.
W porównaniu z powszechnie stosowanymi żarówkami fluorescencyjnymi lampy LED są bardziej wszechstronne, zużywają mniej energii i praktycznie nie emitują promieniowania cieplnego. Te zalety skłoniły duży przemysł rolnictwa wewnętrznego do wyposażenia komór klimatycznych i szklarni w diody LED16. Biorąc pod uwagę ogromne sukcesy odnotowane w tej dziedzinie, technika LED z pewnością znajdzie o wiele więcej zastosowań.
Obserwując fenotyp, a zwłaszcza w celu określenia powierzchni liści, ważne jest, aby wziąć pod uwagę, że w starszych roślinach liście zachodzą na siebie (ryc. 3). W związku z tym graficzna ocena całych rozet bywa nieprecyzyjna. W takim przypadku znacznie dokładniejsze jest odcięcie wszystkich liści i odejście stamtąd.
Ocena zachowań wzrostowych, a zwłaszcza różnic we wzroście i rozwoju w różnych warunkach, zależy od wystarczającej wielkości próby. W tym badaniu wykorzystano co najmniej sześć roślin do określenia np. plonu fotosyntezy (Ryc. 5), świeżej masy (Ryc. 7) i powierzchni liści (Ryc. 8A), ale na początku badania posadzono 30 pojedynczych nasion, aby zapewnić, że po pierwsze, wykiełkuje wystarczająca ilość nasion, a po drugie, można dokonać wyboru "typowych" roślin. Nawet w obrębie tej samej populacji, tj. rośliny w pojedynczych doniczkach na tej samej tacy, w dokładnie tych samych warunkach, wykazywały różne fenotypy. Jest to oczywiście odzwierciedlone w odchyleniu standardowym podczas analizy statystycznej, ale interpretacja danych jest na ogół bardziej wiarygodna, gdy obserwuje się niewielkie błędy statystyczne (rysunek 8B).
Pomiar wydajności fotosyntezy za pomocą PAM (Rysunek 4, Rysunek 5) można przeprowadzić dla kilku parametrów. W tym przypadku skupiono się na przykładzie wydajności PSII Y(II), ale możliwe jest również określenie np . hartowania niefotochemicznego, wydajności kwantowej regulowanego i nieregulowanego rozpraszania energii lub remisji światła. Ważne jest, aby wybrać co najmniej pięć AOI na liść równomiernie rozmieszczonych na powierzchni liścia, a następnie zmierzyć co najmniej sześć liści z różnych roślin. Wadą tej metody jest to, że nie można wykryć żadnego wpływu na PSI; W tym celu potrzebny jest inny sprzęt.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
F.S. dziękuje za wsparcie ze strony Rhenac Green Tec AG poprzez część tego badania. J.S. i B.B. otrzymali dofinansowanie z DFG (SFB TR175).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Komora klimatyczna wyposażona w panele LED | Rhenac Green Tec AG | Komory te są wykonywane na zamówienie. | |
| Spektrometr | OceanOptics | USB-650 | |
| Imaging PAM | Walz | IMAGING-PAM M-Series | Istnieje kilka odpowiednich modeli w zależności od szerszego zastosowania. |
| Mikroskop+ 40-krotny obiektyw | Leica | DM1000 | Inne firmy również produkują odpowiednie mikroskopy. |
| Oprogramowanie ImageJ | Bezpłatne pobieranie ze strony internetowej | ||
| Zestaw do ekstrakcji roślinnego RNA | Qiagen | 74903 | |
| Bioanalizator | Agilent | G2939BA | Potrzebuje dodatkowego komputera |
Bibliografia
- Arabidopsis Genome Initiative. Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana. Nature. 408 (6814), 796-815 (2000).
- An, G., Watson, B. D., Chiang, C. C. Transformation of Tobacco, Tomato, Potato, and Arabidopsis thaliana Using a Binary Ti Vector System. Plant Physiology. 81 (1), 301-305 (1986).
- Schiml, S., Fauser, F., Puchta, H. Chromosome and Genomic Engineering in Plants: Methods and Protocols. Murata, M. , Springer New York. New York, NY. 111-122 (2016).
- Rivero, L., et al. Arabidopsis Protocols. Sanchez-Serrano, J. J., Salinas, J. , Humana Press. Totowa, NJ. 3-25 (2014).
- Ubbens, J. R., Stavness, I. Deep Plant Phenomics: A Deep Learning Platform for Complex Plant Phenotyping Tasks. Frontiers in Plant Science. 8 (1190), (2017).
- Cosgrove, D. J. Rapid Suppression of Growth by Blue Light: OCCURRENCE, TIME COURSE, AND GENERAL CHARACTERISTICS. Plant Physiology. 67 (3), 584-590 (1981).
- Seiler, F., Soll, J., Bölter, B. Comparative Phenotypical and Molecular Analyses of Arabidopsis Grown under Fluorescent and LED Light. Plants. 6 (2), 24(2017).
- Janda, M., et al. Growth and stress response in Arabidopsis thaliana, Nicotiana benthamiana, Glycine max, Solanum tuberosum and Brassica napus cultivated under polychromatic LEDs. Plant Methods. 11 (1), 31(2015).
- Olle, M., Viršile, A. The effects of light-emitting diode lighting on greenhouse plant growth and quality. Agricultural and food science. 22 (2), 12(2013).
- Lin, K. -H., et al. The effects of red, blue, and white light-emitting diodes on the growth, development, and edible quality of hydroponically grown lettuce (Lactuca sativa L. var. capitata). Scientia Horticulturae. 150, 86-91 (2013).
- Castronuovo, D., et al. Light spectrum affects growth and gas exchange of common dandelion and purple coneflower seedlings. International Journal of Plant Biology. , (2016).
- Student, THE PROBABLE ERROR OF A MEAN. Biometrika. 6 (1), 1-25 (1908).
- Database, J. S. E. Essentials of Genetics. RNA-Seq. JoVE. , (2017).
- Klermund, C., et al. LLM-Domain B-GATA Transcription Factors Promote Stomatal Development Downstream of Light Signaling Pathways in Arabidopsis thaliana Hypocotyls. The Plant Cell. 28 (3), 646-660 (2016).
- Annunziata, M. G., et al. Getting back to nature: a reality check for experiments in controlled environments. J Exp Bot. 68 (16), 4463-4477 (2017).
- Palus, S. Japan's Massive Indoor Farm Produces 10,000 Heads of Fresh Lettuce Every Day. Smithonian.com. , (2014).
Przedruki i uprawnienia
