Artykuł metodologiczny

Analiza zachowania wzrostu Arabidopsis thaliana w różnych jakościach światła

DOI:

10.3791/57152

⸱

2 lutego 2018

 ,  , 
1Department Biologie I-Botanik, Ludwig-Maximilians-Universität

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół do badania zachowań związanych ze wzrostem roślin, a zwłaszcza fenotypów w powtarzalny sposób. Pokazujemy, jak zapewnić zmienne, a jednocześnie stabilne warunki oświetleniowe. Prawidłowe analizy zależą od wystarczającej liczby prób i prawidłowych ocen statystycznych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biolodzy roślin często muszą obserwować zachowanie wzrostu wybranych przez siebie gatunków. W tym celu rośliny potrzebują stałego środowiska i stabilnych warunków oświetleniowych, które są korzystnie zmienne pod względem ilości i jakości, aby można było prowadzić badania w różnych konfiguracjach. Wymagania te spełniają komory klimatyczne wyposażone w diody elektroluminescencyjne (LED), które – w przeciwieństwie do świetlówek – mogą być ustawione na różne długości fal. Diody LED są energooszczędne i praktycznie nie emitują ciepła nawet przy natężeniu światła, co często stanowi problem w przypadku innych źródeł światła. Prezentowany protokół zawiera wskazówki krok po kroku, jak zaprogramować komorę klimatyczną wyposażoną w zmienne oświetlenie LED, a także opisuje kilka podejść do dogłębnej analizy fenotypów wzrostu. W zależności od konfiguracji eksperymentalnej można obserwować i analizować różne cechy rosnących roślin. Tutaj opisujemy, jak określić świeżą masę, powierzchnię liści, aktywność fotosyntetyczną i gęstość aparatów szparkowych. Wykazujemy, że w celu uzyskania wiarygodnych danych i wyciągnięcia prawidłowych wniosków konieczne jest wykorzystanie wystarczającej liczby osób do oceny statystycznej. Pobranie zbyt małej liczby roślin do tego rodzaju analizy skutkuje dużymi błędami statystycznymi, a co za tym idzie, mniej jednoznacznymi interpretacjami danych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Arabidopsis thaliana od ponad dwóch dekad jest modelowym organizmem dla badaczy roślin ery molekularnej. Kilka cech sprawia, że ten mały przedstawiciel rodziny Brassica jest idealnym kandydatem do badań genetycznych i molekularnych: ma stosunkowo mały genom z zaledwie pięcioma chromosomami (w porównaniu np. z Nicotiana tabacum z 24 chromosomami), a jego genom został całkowicie zsekwencjonowany w 20001. A. thaliana może być łatwo modyfikowana genetycznie przez Agrobacterium infection2 i jest podatna nawet na najnowsze narzędzia genetyczne, takie jak CRISPR/Cas3. Chociaż jest niewielki, cykl wzrostu jest wystarczająco szybki, aby umożliwić eksperymenty biochemiczne, w których potrzebna jest większa ilość materiału. Rośliny rosną na płytkach agarowych lub na glebie i mogą być nawet uprawiane jako kultury płynne4. Arabidopsis może być uprawiany w kontrolowanych klimatycznie szafkach, np. firmy Percival, w komorach klimatycznych lub w szklarniach. Aby móc porównywać zachowania wzrostowe i analizować fenotypy mutantów, kluczowe znaczenie ma zapewnienie powtarzalnych i jednocześnie elastycznych warunków wzrostu5. W zależności od problemu naukowego, który ma być rozwiązany, mogą być potrzebne różne temperatury i stałe warunki oświetleniowe, różne natężenia światła lub różne jakości światła w tej samej temperaturze. Światło jest bardzo krytycznym parametrem we wzroście roślin, a jego wpływ jest często badany na różne sposoby6. Aby zapewnić odtwarzalność i porównywalność uzyskanych danych, kluczowe znaczenie ma zapewnienie stabilnej mocy wyjściowej i zastosowanie tego samego rodzaju źródeł światła.

Zwykłe źródła światła w szklarniach i komorach klimatycznych składają się z lamp sodowych lub fluorescencyjnych, które sprzyjają satysfakcjonującemu wzrostowi roślin, ale mają kilka wad. Po pierwsze, starzeją się z czasem, co zmienia wyjście widmowe nie tylko pod względem intensywności, ale także jakości (obserwacje własne). Jednak tylko intensywność jest zwykle monitorowana w sposób ciągły, dzięki czemu zmiana jakości światła może pozostać niezauważona, ale nadal mieć znaczące skutki. Po drugie, oba typy lamp wytwarzają ciepło przy wyższym natężeniu światła, co samo w sobie ma głęboki fizjologiczny wpływ na wzrost roślin i może maskować wszelkie efekty zależne od światła. Po trzecie, moc widmowa tych źródeł światła jest niezmienna i zupełnie niepodobna do naturalnego światła słonecznego7. Wszystkie te wady zostały przezwyciężone w przypadku diod LED)8,9,10,11. Mają długą żywotność przy prawie zerowej zmianie emisji, nie wytwarzają ciepła odpadowego nawet przy bardzo dużym natężeniu światła i są bardzo elastyczne pod względem mocy widmowej.

Tutaj ilustrujemy, jak skonfigurować komorę klimatyczną z oddzielnymi diodami LED dla światła czerwonego, niebieskiego i białego oraz śledzić różne parametry wzrostu roślin w czasie. Mierzymy świeżą masę, powierzchnię liści, gęstość aparatów szparkowych i wydajność fotosyntezy. Jednocześnie pokazujemy, jak ważne jest prawidłowe tworzenie ocen statystycznych.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół zawiera kilka przykładów analizy zachowania wzrostu roślin A. thaliana.

1. Przygotowanie

  1. Przed rozpoczęciem należy dokładnie zaplanować, ile roślin będzie potrzebnych do przeprowadzenia wiarygodnej analizy statystycznej eksperymentów, a następnie przygotuj odpowiednie ilości doniczek.
    UWAGA: Zawsze dopuszczaj możliwość, że niektóre nasiona mogą nie wykiełkować.
  2. Użyj komory klimatycznej z różnymi indywidualnie programowalnymi poziomami diod LED, aby porównać wzrost roślin w tych samych ogólnych warunkach środowiskowych (tabela materiałów).

2. Wzrost roślin i ustawienie świateł LED

  1. Przygotuj odpowiednią liczbę (w zależności od różnych warunków i/lub mutantów, które mają być analizowane) doniczek o wymiarach 6 x 7 cm z ziemią i posadź pojedyncze nasiono w każdej z nich.
    UWAGA: W tym przypadku wysiano 36 roślin na warunki.
  2. Wernalizować przez dwa dni w temperaturze 4 °C.
  3. Ustaw wilgotność względną powietrza na 65%, a temperaturę na 22 °C/16 °C dla 16 godzin cyklu dziennego / 8 godzin nocnego. Dostosuj światło na wszystkich poziomach do intensywności 200 μM/cm2/s1. W tym celu należy wprowadzić odpowiednie wartości do programu za pomocą ekranu dotykowego z przodu komory klimatycznej. Aby porównać cztery różne jakości światła, ustaw diody LED na następujące parametry, jak podano w tabeli 1.
szt. szt. szt. szt. szt. szt. Rozdział szt.
Identyfikacja395 nm [%]440 nm [%]3 tys. [%]660 nm [%]770 nm [%]
"Światło słoneczne"1001110015100
Czerwony i niebieski (RB)100152510100
Niebieski (B)1001525cyfra arabska25
Czerwony (R)90cyfra arabska2510100

Tabela 1: Skład natężenia światła emitowanego przez diody LED

  1. Monitoruj wyjście spektralne w sposób ciągły, np. za pomocą wbudowanego skalibrowanego spektrometru.
  2. Umieść rośliny w komorze klimatycznej na różnych poziomach i przykryj je przezroczystą górą, aż pojawią się dobrze rozwinięte liścienie. Upewnij się, że rośliny są wystarczająco podlewane.
  3. Monitoruj i dokumentuj rośliny na oko i fotograficznie tak często, jak to konieczne, w zależności od tego, jak szybko rosną rośliny w wybranych warunkach, np. co dwa dni. Upewnij się, że używasz statywu do aparatu, aby zapewnić równą odległość między aparatem a obiektami dla wszystkich zdjęć, a tym samym umożliwić porównania. W razie potrzeby użyj podziałki liniowej.
    UWAGA: Termin DAS (dni po siewie) odnosi się do faktycznego sadzenia nasion, w tym wernalizacji.

3. Określanie wydajności PSII

  1. Użyj fluorymetru z modulacją impulsów. Ustaw głowicę kamery w odpowiedniej odległości od rośliny, tak aby cała rozeta była widoczna na oknie na żywo.
  2. Po uruchomieniu oprogramowania pojawi się okno "wybierz jednostkę". Zaznacz "MINI", a następnie "ok." Wybierz kolor "niebieski" w następnym wyskakującym okienku. Kliknij "ok."
    UWAGA: Lampa pomiarowa fluorescencji modulowana impulsowo włącza się automatycznie. Na monitorze pojawi się okno Obraz pokazujące parametr fluorescencji Ft. Roślina umieszczona pod kamerą może być teraz widoczna jako pomarańczowy obraz.
  3. Aby ustawić ostrość obrazu i/lub wybrać określone obszary rośliny, przełącz się na Live Video, zaznaczając pole "wideo na żywo" i obróć pierścień regulacji soczewki obiektywu. Zamknij okno LIVE Video, klikając pole wyjścia w prawym górnym rogu.
  4. Aby zmierzyć parametry fotosyntezy, zdefiniuj obszar zainteresowania (AOI). Użyj do tego domyślnego ustawienia, którym jest okrąg, który automatycznie pojawia się na środku ekranu. Czerwone pole obok reprezentuje uśrednioną wartość Ft wszystkich pikseli w AOI. Zdefiniuj odpowiedni AOI, wybierając z pola AOI w prawym panelu, gdzie dostępne są różne formularze. Kliknij "dodaj" w zakładce AOI i umieść okrąg w obszarze liścia. Powtórz pięć razy na liść.
  5. Utrzymuj ustawienia (zakładka po prawej stronie) na wartościach domyślnych podanych przez producenta (Tabela 2).
szt. Rozdział szt.
Miara. ŚwiatłoInt.częstotliwość
11
Akt. ŚwiatłoInt.Szerokość
80
Korekcje obrazuMini
Transformacja obrazubateria
16,7 V
korzyść5
Tłumienia1
Puls satelitarnyInt.NieInterwały s
81Rozdział 30
Powolna indukcjaOpóźnienie sZegar sCzas trwania s
Rozdział 4020Rozdział 315
SortywencjaWzmocnienie czerwieniIntensywność czerwieniIntensywność NIR
3402513
wyświetlaćKolor
Limit PS50
Inh. Ref. AOI1
Współczynnik Fm (tick)1 030

Tabela 2: Domyślne ustawienia dla pomiarów PAM dostarczone przez producenta.

  1. Zastosuj błysk światła nasycającego, aby wykonać pomiar parametrów fotosyntezy za pomocą analizy wygaszania fluorescencyjnego (impuls nasycenia). Wcześniej należy określić współczynniki hartowania, mierząc minimalną i maksymalną wydajność fluorescencji rośliny przystosowanej do ciemności. W tym celu umieść roślinę w ciemności (np. w szufladzie lub ciemnym pudełku) na kilka minut. Następnie umieść roślinę pod głowicą kamery, zaznacz pola Pomiar i ML (światło pomiarowe), w rzędzie pod obrazem wybierz "Fv/Fm", taktując w kółko, i kliknij Fo,Fm u dołu ekranu.
    UWAGA: Fo/Fm reprezentuje plon PSII rośliny przystosowanej do ciemności. Jest to więc wartość, do której normalizowany jest pomiar po przyłożeniu światła. Bieżący pomiar Fo/Fm pozostanie do momentu aktywacji nowego rekordu. Wszystkie wartości F i Fm' określone przez impulsy nasycenia są powiązane z Fo / Fm i odpowiednio obliczane są parametry hartowania.
  2. Znajdź te wyniki na karcie raportu i zaznacz wszystkie pola po prawej stronie, które są związane z eksperymentem (np. Y(II), qP, qN itd.).
  3. Eksport wyników do oprogramowania analitycznego, np. Excel, klikając przycisk eksportu w lewym górnym rogu i zapisz pod odpowiednią nazwą pliku. Wygeneruj co najmniej pięć AOI na liść i zmierz kilka liści tej samej rośliny (nie zapomnij o krótkim przystosowaniu rośliny do ponownego zaciemnienia po każdym pomiarze), a także kilka roślin z jednego stanu, które można następnie ocenić statystycznie.
  4. Do analizy statystycznej wygeneruj wartości średnie i odchylenia standardowe ze wszystkich AOI i co najmniej trzech niezależnych roślin dla wszystkich punktów czasowych/warunków i wykonaj test t-studenta, aby ocenić, czy dane są istotne12. Dane są oceniane jako znacząco różne, gdy wartości p są niższe niż 0,05.

4. Oznaczanie gęstości aparatów szparkowych

  1. Zbierz trzy w pełni rozwinięte liście rozety z trzech pojedynczych roślin na każdy warunek do 70% etanolu na szklanej szalce Petriego i wyekstrahuj chlorofil. Inkubować w tym rozpuszczalniku przez noc w temperaturze pokojowej lub przechowywać w temperaturze 4 °C.
  2. Aby uzyskać pełne usunięcie pigmentów, inkubuj w roztworze wodzianu chloralu (hydrat chloralu: woda: glicerol = 8: 2: 1 w/v/w), aż liście staną się całkowicie białe.
  3. Wykonaj obrazy powierzchni odbytu za pomocą mikroskopii interferencyjnej (DIC) w powiększeniu 40x. Policz aparaty szparkowe w polu widzenia i ekstrapoluj za pomocą skali na aparaty szparkowe na mm². Powtórz tę procedurę dla co najmniej 4 liści na warunki. Przeprowadź analizę statystyczną, obliczając średnią wartość dla wszystkich liści jednego warunku i na tej podstawie oblicz średni błąd.

5. Oznaczanie świeżej masy

  1. Usuń wszystkie liście, w tym ogonki liściowe, z rozet z sześciu roślin na stan za pomocą żyletki. Natychmiast zważyć wszystkie liście i poddać dane analizom statystycznym opisanym powyżej.

6. Określenie obszaru liścia rozety

  1. Użyj zdjęć z ośmiu roślin w każdym stanie, aby graficznie przeanalizować obszar liści. Połącz obrazy dla jednego warunku na jednym obrazie i zapisz jako *.jpeg lub *.tiff.
  2. Pobierz odpowiednie oprogramowanie (Tabela materiałów).
    UWAGA: Oczywiście możliwe jest zastosowanie dowolnego innego programu zdolnego do wykonania tego zadania.
  3. Otwórz plik obrazu. Wybierz narzędzie "wybór z wolnej ręki". Otaczaj liście, w tym ogonki jednej rozety. Kliknij "Analizuj - ustaw pomiary" i zaznacz "Obszar", "Min & Max wartość szarości", "Zintegrowana gęstość" i "Średnia wartość szarości". Wybierz odpowiednie miejsca dziesiętne, najlepiej dwa lub trzy i kliknij "ok".
  4. Aby uzyskać mm2 zamiast pikseli, użyj polecenia "ustaw skalę". Zastosuj narzędzie do zaznaczania linii prostej, aby dokonać wyboru linii odpowiadającej znanej odległości, np. średnicy liścia, którą można łatwo obliczyć na podstawie paska skali obrazów, a następnie otwórz okno dialogowe Ustaw skalę i wprowadź zdefiniowaną odległość i jednostkę miary. Następnie wróć do "analizuj" i kliknij "zmierz".
  5. Pojawi się nowe okno zatytułowane "wyniki", które zawiera odpowiednie dane dla bieżącej rozety. Powtórz tę procedurę ze wszystkimi roślinami na obrazie i zainicjuj pomiary powierzchni dla każdej nowej rośliny za pomocą Ctrl + M.
    UWAGA: W przypadku mniejszych roślin z niezachodzącymi na siebie liśćmi można użyć "narzędzia różdżki", aby ułatwić i przyspieszyć proces. Gdy tylko liście zaczną się pokrywać, to narzędzie nie daje wiarygodnych wyników.
  6. Alternatywnie odetnij wszystkie liście i ustaw je w taki sposób, aby można było zrobić zdjęcie poglądowe, a następnie użyj narzędzia różdżki. Weź pod uwagę, że przy stosowaniu tej metody potrzeba więcej roślin.
  7. Wybierz "Plik" -"Zapisz jako" w oknie wyników i wygeneruj odpowiednią nazwę pliku oraz lokalizację w katalogu komputera. Plik zostanie automatycznie zapisany w formacie Excel.

7. Przygotowanie RNA

  1. Zbierz trzy próbki z dziesięciu pojedynczych roślin dla każdego stanu. Ekstrahuj całkowite RNA za pomocą zestawu do ekstrakcji roślinnego RNA zgodnie z instrukcjami producenta. Określ stężenie, czystość i integralność RNA za pomocą bioanalizatora. RNA może być następnie wykorzystane do dalszych zastosowań, takich jak qRT-PCR lub analiza ekspresji genów, np. RNASeq13.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obserwacja i analiza wzrostu roślin, a zwłaszcza fenotypów zmutowanych roślin, opiera się na stabilnych i powtarzalnych warunkach środowiskowych. Mogą one być dostarczane w komorach klimatycznych. Ilość, a zwłaszcza jakość światła, zależy przede wszystkim od zastosowanego źródła światła, które w tym badaniu zostało zapewnione przez lampy LED.

Rysunek 1 przedstawia przykład komory klimatycznej wyposażonej w panele LED. Rysunek 1A pokazuje zrzut ekranu panelu sterowania, gdzie można dostosować wszystkie warunki klimatyczne i oświetleniowe. W ciągu 24 godzin można ustawić dwadzieścia różnych ram czasowych. W tym przykładzie zaprogramowano warunki długiego dnia z 16 światłami/8 godzinami ciemności. Komora ta posiada cztery poziomy, które można oddzielnie zaprogramować, dzięki czemu wzrost roślin przy czterech różnych ustawieniach światła może być badany w dokładnie tych samych warunkach środowiskowych. Lewy górny poziom jest ustawiony na wyjście spektralne naśladujące światło słoneczne tak bardzo, jak jest to technicznie możliwe, prawy górny poziom reprezentuje podwyższone światło czerwone (660 nm) i niebieskie (440 nm) ze zredukowanym światłem białym (3K). Lewy dolny poziom został ustawiony na podwyższone światło niebieskie, a prawy dolny poziom na głównie światło czerwone. Rysunek 1B ilustruje diody LED w różnych ustawieniach jako przegląd (środkowy panel) i odpowiednie zbliżenia (zewnętrzne małe panele). Różnica w jakości światła jest łatwo widoczna gołym okiem.

Wbudowany spektrometr stale mierzy, monitoruje i dostosowuje wyjście spektralne. Rysunek 2 pokazuje widmo od lewego górnego poziomu 1.1, który został ustawiony tak, aby naśladować światło słoneczne. W porównaniu ze standardową żarówką fluorescencyjną udział światła UV i niebieskiego jest znacznie wyższy7.

W Rysunek 3 przedstawia przykład roślin A. thaliana ze wszystkich czterech stanów, odpowiednio 10, 13 i 17 dni po wysiewie. Wszystkie rośliny zostały sfotografowane z tej samej odległości poprzez zamontowanie aparatu na statywie. Podziałka reprezentuje 1 cm. Po 10 dniach nie można zauważyć dużej różnicy w wielkości ani kolorze, ale po 17 dniach szybszy wzrost w czerwonym świetle jest oczywisty. Oprócz tej analizy wizualnej przeprowadzono szereg analiz fizjologicznych.

Rysunek 4 przedstawia różne etapy pomiarów PAM, które analizują np. zdolność fotosyntetyczną. W Rysunek 4A pokazany jest zrzut ekranu z wideo na żywo, które jest ustawieniem do skupienia rośliny w celu zapewnienia optymalnej jakości pomiarów. Zamiast skupiać się na całej roślinie, można również wybrać pojedynczy liść do analizy. Rysunek 4B pokazuje aktualny uzysk fluorescencji Ft rośliny przystosowanej do ciemności przed rozpoczęciem właściwego pomiaru. W tym przypadku wybrano pięć cyrkularnych obszarów zainteresowania (AOI). Liczby w czerwonych polach obok każdego AOI bezpośrednio dają wynik liczbowy, który można również zapisać w formie tabeli. Aby rozpocząć pomiar parametrów fotosyntezy, należy ustawić Fo,Fm. Zrzut ekranu Ft po wykonaniu tej czynności jest pokazany w Rysunek 4C. Zauważ, że teraz przycisk "Fo,Fm" nie jest już aktywny. Aby rozpocząć nowy pomiar, należy kliknąć "Nowy rekord", aby usunąć poprzednią normalizację. Na koniec, Rysunek 4D pokazuje efektywną wydajność kwantową PSII Y(II) po podaniu nasyconego impulsu świetlnego ("SAT-Pulse"). Kwantyfikacja przykładowych danych jest pokazana w Rysunek 5. Rośliny uprawiane w świetle słonecznym w temperaturze 200 μM/cm2/s1 (Rysunek 5A) analizowano odpowiednio 12, 21 i 28 dni po siewie. Z naszych danych wynika, że plon PSII jest znacznie wyższy w liściach roślin uprawianych przez trzy tygodnie niż przez 12 dni. Różnica między 28 a 12 dniami jest nadal znacząca, ale wartość p jest wyższa. W Rysunek 4B, porównano plony PSII z roślin uprawianych przez dwa tygodnie o różnych właściwościach świetlnych. Co ciekawe, stały wzrost w świetle zawierającym dużą ilość światła niebieskiego prowadzi do znacznie większej wydajności PSII. Podobny efekt zaobserwowano w przypadku roślin uprawianych pod wzbogaconym światłem czerwonym, ale wzrost był nieco niższy.

Wykazano, że różne właściwości światła wpływają na rozwój aparatów szparkowych14. W związku z tym zbadano gęstość aparatów szparkowych. Rysunek 6 pokazuje, jak wygląda liść po ekstrakcji pigmentu. Pojedyncze komórki naskórka można dobrze rozróżnić, a stomię można łatwo policzyć. Na rysunku poszczególne aparaty szparkowe są oznaczone gwiazdką. Szczegółowe dane na temat gęstości aparatów szparkowych roślin z różnych ustawień światła można znaleźć gdzie indziej9.

Oprócz oględzin (Rysunek 3) świeża waga stanowi dobrą miarę postępu wzrostu. W tym przykładzie zważono liście roślin uprawianych w "słońcu" odpowiednio po 8, 10 i 12 dniach od siewu. Statystyczną ocenę tych danych można zobaczyć w Rysunek 7. Zgodnie z oczekiwaniami świeża waga rośnie z czasem.

Oprócz świeżej masy, obszar liści jest dobrym miernikiem wzrostu. W tym przypadku rozwój roślin obserwowano od 10, 13 i 17 dni po wysiewie (Rysunek 8A). Co najmniej sześć pojedynczych roślin zostało rutynowo ocenionych w celu uzyskania wiarygodnych danych statystycznych. Aby zademonstrować znaczenie dużej wielkości próby, obliczono procentowy błąd wartości średniej, wynikający z analizy odpowiednio dwóch i sześciu roślin (Rysunek 8B). Oznacza to, że wyznaczono procent odchylenia standardowego w odniesieniu do wartości średniej. Jest bardzo jasne, że w przypadku małej próby błąd jest o 5 - 10% wyższy niż w przypadku większej wielkości próby. Zwiększając liczbę ocenianych roślin, można zminimalizować błąd, co sprawia, że interpretacja danych jest znacznie bardziej przejrzysta.

figure-results-1
Ilustracja 1: diody LED zapewniają różne jakości światła. A) Zrzut ekranu z panelu sterowania komory LED. Długość dnia jest ustawiona na 16 godzin (prawy górny róg), a natężenie światła jest ustawione na 200 μmol cm-2 s-1. Jakość światła jest różna na wszystkich czterech poziomach: 1,1 reprezentuje widmo tak podobne do światła słonecznego, jak to technicznie możliwe, 1,2 reprezentuje wysoki procent światła czerwonego i niebieskiego (RB), 2,1 jest głównie ustawione na niebieskie (B), 2,2 reprezentuje głównie światło czerwone (R). B) Środkowy panel pokazuje przegląd wszystkich poziomów; Zewnętrzne panele pokazują poszczególne poziomy w większym powiększeniu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Widmo długości fali z symulowanych ustawień światła słonecznego. Pokazany jest zrzut ekranu z wbudowanego spektrometru w komorze LED, który został umieszczony na poziomie 1.1. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Rozwój roślin w ciągu tygodnia. Reprezentatywne rośliny A. thaliana ze wszystkich czterech warunków świetlnych z 10, 13 i 17 DAS. Rośliny zostały sfotografowane lustrzanką cyfrową umieszczoną na statywie. Pasek skali reprezentuje 1 cm dla wszystkich obrazów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Zrzuty ekranu z reprezentatywnych etapów pomiarów PAM roślin A. thaliana. A) Zrzut ekranu z widoku "Wideo na żywo", w którym można dostosować ostrość obrazu. B) Aktualna wydajność fluorescencji Ft przed zastosowaniem jakichkolwiek impulsów świetlnych. C) Aktualna wydajność fluorescencji Ft po ustawieniu Fo / Fm. D) Wpływająca na wydajność kwantową PSII po ustawieniu nasyconego impulsu świetlnego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Graficzne przedstawienie efektu wydajności kwantowej PSII (YII). A) Dane z roślin 12, 21 i 28 dni po wysiewie i uprawianych w temperaturze poniżej 200 μmol/cm2/s1 w symulowanym świetle słonecznym ("światło słoneczne") poddanych analizie PAM poddano analizie PAM. Pokazano średnie wartości pięciu roślin i pięciu AOI na dzień. Jedna gwiazdka oznacza istotną różnicę z wartością p <0,05 w porównaniu z dniem 12, a dwie gwiazdki wskazują na bardzo istotne różnice z wartością p <0,02 zgodnie z testem t uczniów. B) Dane z roślin uprawianych w tempie 200 μmol/cm2 /s1 w symulowanym świetle słonecznym (SL), odpowiednio wzbogaconym niebieskim (B) lub czerwonym (R) światło były oceniane statystycznie. Pokazano średnie wartości pięciu roślin i pięciu AOI na dzień. Obliczono istotne różnice w porównaniu ze "światłem słonecznym".

figure-results-6
Ryc. 6: Reprezentatywny obraz aparatów szparkowych po stronie abaksjalnej liścia A. thaliana. Liście przygotowane zgodnie z powyższym opisem i poddane analizie wizualnej pod mikroskopem świetlnym z ustawieniami DIC przy 40-krotnym powiększeniu. Aparaty szparkowe są liczone w widocznym obszarze co najmniej 4 liści na warunek. Zdjęcie zostało wykonane aparatem cyfrowym podłączonym do tubusa mikroskopu. Liczbę aparatów szparkowych na mm² oblicza się za pomocą podziałki. Gwiazdki oznaczają pojedynczą stomię. Podziałka reprezentuje 200 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rysunek 7: Graficzne przedstawienie świeżej masy z roślin A. thaliana uprawianych w symulowanym świetle słonecznym/200 μmol/cm2/s1. Liście rozety zostały wycięte z roślin osiem, dziesięć i dwanaście dni po siewie. Przedstawiono średnie wartości w mg z sześciu roślin na dzień. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-8
Rysunek 8: Ocena statystyczna powierzchni liści A. thaliana z roślin uprawianych w różnych warunkach oświetleniowych. A) Powierzchnię liści A. thaliana uprawianej przez 10, 13 i 17 dni określono graficznie za pomocą ImageJ, a dane z n = 6 roślin oceniono statystycznie. Powierzchnia liści ze wszystkich sześciu rozet z każdego warunku została zsumowana i podzielona przez sześć, aby uzyskać wartość średnią. Na podstawie tej wartości obliczono odchylenie standardowe, które jest reprezentowane przez słupki błędów. B) Powierzchnię liści określono graficznie za pomocą ImageJ, a dane odpowiednio z n = 2 lub n = 6 roślin przeanalizowano statystycznie zgodnie z opisem dla panelu A. Następnie obliczono błąd w procentach wartości średniej i przedstawiono go graficznie. Zielone słupki pokazują procentowy błąd z analizy n = 6, niebieskie słupki z n = 2 roślin. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pierwszym krokiem w badaniu wzrostu roślin jest ustawienie komory klimatycznej zgodnie z pożądanymi warunkami. Można to łatwo zrobić, wpisując wszystkie zmienne do maski programu odpowiedniego oprogramowania (Rysunek 1A). Na tym etapie można wprowadzić wiele modyfikacji, zmieniając reżim oświetlenia i/lub temperaturę. Upewnij się, że stale monitorujesz temperaturę, wilgotność i warunki oświetleniowe (Rysunek 2), aby awaria techniczna nie zrujnowała eksperymentu. Jest to punkt krytyczny dla uzyskania powtarzalnych wyników. Chociaż ta konfiguracja oferuje wiele zmiennych i może być elastycznie dostosowywana, ma swoje ograniczenia. Obecnie dostępne światła LED nie są w stanie w stu procentach naśladować światła słonecznego, a warunki klimatyczne wewnątrz komory klimatycznej nigdy nie mogą w pełni odzwierciedlić tego, co dzieje się na zewnątrz15.

W porównaniu z powszechnie stosowanymi żarówkami fluorescencyjnymi lampy LED są bardziej wszechstronne, zużywają mniej energii i praktycznie nie emitują promieniowania cieplnego. Te zalety skłoniły duży przemysł rolnictwa wewnętrznego do wyposażenia komór klimatycznych i szklarni w diody LED16. Biorąc pod uwagę ogromne sukcesy odnotowane w tej dziedzinie, technika LED z pewnością znajdzie o wiele więcej zastosowań.

Obserwując fenotyp, a zwłaszcza w celu określenia powierzchni liści, ważne jest, aby wziąć pod uwagę, że w starszych roślinach liście zachodzą na siebie (ryc. 3). W związku z tym graficzna ocena całych rozet bywa nieprecyzyjna. W takim przypadku znacznie dokładniejsze jest odcięcie wszystkich liści i odejście stamtąd.

Ocena zachowań wzrostowych, a zwłaszcza różnic we wzroście i rozwoju w różnych warunkach, zależy od wystarczającej wielkości próby. W tym badaniu wykorzystano co najmniej sześć roślin do określenia np. plonu fotosyntezy (Ryc. 5), świeżej masy (Ryc. 7) i powierzchni liści (Ryc. 8A), ale na początku badania posadzono 30 pojedynczych nasion, aby zapewnić, że po pierwsze, wykiełkuje wystarczająca ilość nasion, a po drugie, można dokonać wyboru "typowych" roślin. Nawet w obrębie tej samej populacji, tj. rośliny w pojedynczych doniczkach na tej samej tacy, w dokładnie tych samych warunkach, wykazywały różne fenotypy. Jest to oczywiście odzwierciedlone w odchyleniu standardowym podczas analizy statystycznej, ale interpretacja danych jest na ogół bardziej wiarygodna, gdy obserwuje się niewielkie błędy statystyczne (rysunek 8B).

Pomiar wydajności fotosyntezy za pomocą PAM (Rysunek 4, Rysunek 5) można przeprowadzić dla kilku parametrów. W tym przypadku skupiono się na przykładzie wydajności PSII Y(II), ale możliwe jest również określenie np . hartowania niefotochemicznego, wydajności kwantowej regulowanego i nieregulowanego rozpraszania energii lub remisji światła. Ważne jest, aby wybrać co najmniej pięć AOI na liść równomiernie rozmieszczonych na powierzchni liścia, a następnie zmierzyć co najmniej sześć liści z różnych roślin. Wadą tej metody jest to, że nie można wykryć żadnego wpływu na PSI; W tym celu potrzebny jest inny sprzęt.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

F.S. dziękuje za wsparcie ze strony Rhenac Green Tec AG poprzez część tego badania. J.S. i B.B. otrzymali dofinansowanie z DFG (SFB TR175).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Komora klimatyczna wyposażona w panele LEDRhenac Green Tec AGKomory te są wykonywane na zamówienie.
Spektrometr OceanOpticsUSB-650
Imaging PAMWalzIMAGING-PAM M-SeriesIstnieje kilka odpowiednich modeli w zależności od szerszego zastosowania.
Mikroskop+ 40-krotny obiektywLeica DM1000Inne firmy również produkują odpowiednie mikroskopy.
Oprogramowanie ImageJBezpłatne pobieranie ze strony internetowej
Zestaw do ekstrakcji roślinnego RNAQiagen74903
BioanalizatorAgilentG2939BAPotrzebuje dodatkowego komputera

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Arabidopsis Genome Initiative. Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana. Nature. 408 (6814), 796-815 (2000).
  2. An, G., Watson, B. D., Chiang, C. C. Transformation of Tobacco, Tomato, Potato, and Arabidopsis thaliana Using a Binary Ti Vector System. Plant Physiology. 81 (1), 301-305 (1986).
  3. Schiml, S., Fauser, F., Puchta, H. Chromosome and Genomic Engineering in Plants: Methods and Protocols. Murata, M. , Springer New York. New York, NY. 111-122 (2016).
  4. Rivero, L., et al. Arabidopsis Protocols. Sanchez-Serrano, J. J., Salinas, J. , Humana Press. Totowa, NJ. 3-25 (2014).
  5. Ubbens, J. R., Stavness, I. Deep Plant Phenomics: A Deep Learning Platform for Complex Plant Phenotyping Tasks. Frontiers in Plant Science. 8 (1190), (2017).
  6. Cosgrove, D. J. Rapid Suppression of Growth by Blue Light: OCCURRENCE, TIME COURSE, AND GENERAL CHARACTERISTICS. Plant Physiology. 67 (3), 584-590 (1981).
  7. Seiler, F., Soll, J., Bölter, B. Comparative Phenotypical and Molecular Analyses of Arabidopsis Grown under Fluorescent and LED Light. Plants. 6 (2), 24(2017).
  8. Janda, M., et al. Growth and stress response in Arabidopsis thaliana, Nicotiana benthamiana, Glycine max, Solanum tuberosum and Brassica napus cultivated under polychromatic LEDs. Plant Methods. 11 (1), 31(2015).
  9. Olle, M., Viršile, A. The effects of light-emitting diode lighting on greenhouse plant growth and quality. Agricultural and food science. 22 (2), 12(2013).
  10. Lin, K. -H., et al. The effects of red, blue, and white light-emitting diodes on the growth, development, and edible quality of hydroponically grown lettuce (Lactuca sativa L. var. capitata). Scientia Horticulturae. 150, 86-91 (2013).
  11. Castronuovo, D., et al. Light spectrum affects growth and gas exchange of common dandelion and purple coneflower seedlings. International Journal of Plant Biology. , (2016).
  12. Student, THE PROBABLE ERROR OF A MEAN. Biometrika. 6 (1), 1-25 (1908).
  13. Database, J. S. E. Essentials of Genetics. RNA-Seq. JoVE. , (2017).
  14. Klermund, C., et al. LLM-Domain B-GATA Transcription Factors Promote Stomatal Development Downstream of Light Signaling Pathways in Arabidopsis thaliana Hypocotyls. The Plant Cell. 28 (3), 646-660 (2016).
  15. Annunziata, M. G., et al. Getting back to nature: a reality check for experiments in controlled environments. J Exp Bot. 68 (16), 4463-4477 (2017).
  16. Palus, S. Japan's Massive Indoor Farm Produces 10,000 Heads of Fresh Lettuce Every Day. Smithonian.com. , (2014).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza jako ci wiat azachowanie wzrostu ro linprogramowanie o wietlenia LEDkonfiguracja komory klimatycznejpomiar aktywno ci fotosyntetycznejanaliza g sto ci aparat w szparkowychoznaczanie masy wie ejocena powierzchni li ciaimpulsowo modulowana fluorometria

Powiązane artykuły