Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ocena in vivo przerwania bariery krew-mózg w szczurzym modelu udaru niedokrwiennego

11.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57156

⸱

11 marca 2018

 ,  ,  , 
1Department of Physiology, Medical School, Ardabil University of Medical Sciences, 2Neurosciences Research Center, Tabriz University of Medical Sciences, 3Research Center for Pharmaceutical Nanotechnology, Faculty of Pharmacy, Tabriz University of Medical Sciences

W tym artykule

Podsumowanie

Ogólnym celem tej procedury jest dostarczenie wysoce powtarzalnej techniki oceny in vivo naruszenia bariery krew-mózg w szczurzych modelach udaru niedokrwiennego.

Streszczenie

Udar niedokrwienny prowadzi do wazopochodnego obrzęku mózgu i następującego po nim pierwotnego uszkodzenia mózgu, w którym pośredniczy zniszczenie bariery krew-mózg (BBB). Szczury z indukowanym udarem niedokrwiennym stworzono i wykorzystano jako modele in vivo do zbadania funkcjonalnej integralności bariery krew-mózg. Spektrofotometryczne wykrywanie błękitu Evansa (EB) w próbkach mózgu z uszkodzeniem niedokrwiennym może stanowić wiarygodne uzasadnienie dla badań i rozwoju nowych metod terapeutycznych. Metoda ta daje powtarzalne wyniki i ma zastosowanie w każdym laboratorium bez konieczności stosowania specjalnego sprzętu. W tym miejscu przedstawiamy zobrazowane i techniczne wytyczne dotyczące wykrywania wynaczynienia EB po indukcji udaru niedokrwiennego u szczurów.

Wprowadzenie

Naczyniopochodny obrzęk mózgu spowodowany zaburzeniem bariery krew-mózg (BBB) pozostaje ważnym powikłaniem udaru niedokrwiennego i głównym czynnikiem decydującym o przeżywalności u pacjentów po udarze1,2. Bariera krew-mózg (BBB), która jest tworzona przez komórki śródbłonka naczyń włosowatych mózgu (BCEC) i składa się z odrębnych składników nerwowo-naczyniowych (np. ścisłych połączeń między BCEC, perycytami, komórkami astroglejowymi i neuronalnymi3), zapewnia wyspecjalizowany i dynamiczny interfejs między ośrodkowym układem nerwowym (OUN) a obwodowym krążeniem krwi4,5. Urazy, takie jak urazy niedokrwienno-reperfuzyjne, mogą zakłócić funkcjonalną integralność BBB i prowadzić do późniejszej penetracji krążących leukocytów do miąższu mózgu, co ostatecznie wywołuje zapalenie mózgu i pierwotne uszkodzenia mózgu6,7. Modele zwierzęce są potrzebne do dokładnego wykrycia dysfunkcji bariery krew-mózg po wystąpieniu udaru. Takie modele mają ogromne znaczenie dla badania podstawowych mechanizmów patofizjologicznych i wprowadzania nowych strategii neuroprotekcyjnych. Modele hodowli komórkowych BBB oparte na in vitro zostały wysoko rozwinięte i wykorzystane do badań molekularnych fizjopatologii BBB8,9,10. Niemniej jednak modele zwierzęce in vivo, które powodują niedokrwienne uszkodzenie bariery krew-mózg podobne do ludzkich stanów klinicznych, są również bardzo wartościowe w tym względzie. Ilościowe wykrywanie wynaczynienia błękitu Evansa (EB) jest dobrze akceptowaną i czułą techniką, która została wykorzystana do oceny integralności i funkcji BBB w chorobach neurodegeneracyjnych, w tym udarze niedokrwiennym11,12,13,14. Metoda ta jest opłacalna, wykonalna, powtarzalna i w pełni możliwa do zastosowania w każdym laboratorium eksperymentalnym. Jego implementacja nie wymaga zaawansowanego sprzętu, takiego jak radioaktywne znaczniki15 lub obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI)16, które są warunkami wstępnymi dla innych metod. W tym artykule kompleksowo przedstawiono podstawowe procesy techniczne oceny BBB z wykorzystaniem wynaczynienia EB w szczurzych modelach udaru niedokrwiennego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Rady Badawczej Uniwersytetu Medycznego Ardabil dotyczącej prowadzenia badań na zwierzętach (Numer identyfikacyjny etyki: IR. ARUMS. REC.1394.08). W tym wizualizowanym badaniu wykorzystaliśmy dorosłe samce szczurów Sprague-Dawley (300-350g) uzyskane z Pasture Institute (Teheran, Iran).

1. Anestezjologia i przepływometria

  1. Wywołać znieczulenie za pomocą 4% izofrubanu i utrzymywać je za pomocą izofluranu (1-1,5%) w mieszaninie podtlenku azotu (70% v/v) i tlenu (30% v/v) przez cały czas trwania zabiegu.
  2. Umieść znieczulone zwierzę w pozycji leżącej na kocu grzewczym ze sterowaniem zwrotnym i utrzymuj temperaturę ciała na poziomie 37±0,5 °C za pomocą sondy doodbytniczej podłączonej do tego urządzenia grzewczego.
  3. Nałóż niewielką ilość maści okulistycznej na oba oczy, aby zapobiec wysuszeniu.
  4. Ogol obszar chirurgiczny po lewej stronie czaszki za pomocą elektrycznych maszynek do strzyżenia. Użyj roztworu betadyny z gazikiem do dezynfekcji skóry. Przepłucz ten obszar sterylnym wacikiem zawierającym 70% etanolu i powtórz oba kroki przez trzy cykle17.
  5. W przypadku analgezji wstrzyknąć 0,2 ml 0,5% bupiwakainy podskórnie w obszar operacyjny17.
  6. Wykonaj nacięcie skóry na czaszce o długości 1 cm (rozciągające się od bocznej kantu lewego oka do podstawy lewego ucha) i wypreparuj lewy mięsień skroniowy, aby odsłonić czaszkę. Następnie utwórz mały otwór w kształcie zadzioru 5 mm z boku i 1 mm z tyłu bregma18, aby ułatwić umieszczenie końcówki sondy ołówkowej przepływomierza Dopplera.
  7. Obróć szczura z pozycji leżącej na leżąco, a następnie umieść laserową sondę ołówkową w wcześniej wywierconym otworze ślepym na czaszkę, aby monitorować regionalny przepływ krwi w mózgu (rCBF).
  8. Zapisz podstawowy rCBF każdego zwierzęcia i uznaj to za 100%. Warto zauważyć, że niedrożność tętnicy środkowej mózgu (MCAO) rozpoczyna się za każdym razem, gdy wykryty zostanie spadek rCBF o więcej niż 80%19,20.

2. Indukcja ogniskowego niedokrwienia mózgu

  1. Ogol okolice szyi i zdezynfekuj skórę roztworem betadyny i 70% etanolem. Wstrzyknąć 0,2 ml 0,5% bupiwakainy podskórnie w miejsce operacji w celu znieczulenia17.
  2. Wykonaj 2-centymetrowe nacięcie chirurgiczne na brzusznej powierzchni szyi, aby uzyskać dostęp do lewej tętnicy szyjnej wspólnej (LCCA). Odizoluj LCCA od sąsiedniej powięzi i nerwu błędnego, aby uzyskać dostęp do rozwidlenia tętnicy szyjnej zewnętrznej (ECA) i tętnicy szyjnej wewnętrznej (ICA).
  3. Podwiązać na stałe LCCA lub ECA za pomocą szwu jedwabnego 5-0 i wypreparować ICA swobodnie do poziomu tętnicy skrzydłowo-podniebiennej.
  4. Luźno umieść krawat jedwabnego szwu 5-0 wokół LCCA, a następnie tymczasowo zacisk ICA z mikroklipsem naczyniowym.
  5. Wykonaj małe nacięcie na LCCA przed wcześniej umieszczonym luźnym krawatem, a następnie włóż nylonowy szew pokryty silikonem 4-0 do przestrzeni świetlnej ICA i zaciśnij szew wokół LCCA, aby zabezpieczyć nylonowy szew i zapobiec wyciekowi krwi.
  6. Usuń mikroklips naczyniowy z ICA. Następnie przesuwaj pokryte silikonem włókno śródświetlne, aż zaobserwujesz wyraźny spadek rCBF, który wskazuje na okluzję pochodzenia MCA. Pod koniec okresu niedokrwienia (90 min) rozpocznij reperfuzję, wycofując szew śródświetlny21.

3. Kanituacja żyły szyjnej i wstrzyknięcie Evans Blue (EB)

  1. Wykonaj 1 cm podłużne nacięcie w szyi po lewej stronie linii środkowej, a następnie tępo odetnij powięź powierzchowną, aby uzyskać dostęp do zewnętrznej gałęzi lewej żyły szyjnej (LGV). Następnie trwale podwiąż czaszkowy koniec LGV za pomocą jedwabnego szwu 5-0. Luźno umieść dwie opaski wokół żyły, a następnie tymczasowo zaciśnij sercowy koniec LGV za pomocą mikrozacisku naczyniowego.
  2. Wykonaj małe nacięcie na LGV między dwoma szwami, a następnie wprowadź cewnik wypełniony heparyną wypełnioną surowicą do przestrzeni świetlnej LGV i przesuń go o około 10 mm. Następnie zaciśnij ligatury wokół żyły, aby zabezpieczyć cewnik i zapobiec krwawieniu. Wstrzyknąć niewielkie ilości surowicy, aby uniknąć zapadnięcia się żyły.
  3. Na początku okresu reperfuzji powoli wstrzykiwać barwnik EB (1 ml/kg 2% roztworu EB w soli fizjologicznej) przez okres 5 minut. Następnie umyj kaniulę przez wstrzyknięcie 0,5 ml soli fizjologicznej i wyjmij kaniulę iniekcyjną z żyły12,22.
  4. Na koniec zszyj nacięcia szyi i głowy i wstrzyknij 0,05 mg/kg buprenorfiny dootrzewnowo (IP) i powtarzaj wstrzyknięcie co 6-8 godzin w okresie reperfuzji w celu znieczulenia pooperacyjnego17.
  5. Wstrzyknij 5 ml wstępnie podgrzanej soli fizjologicznej (IP), aby zapewnić nawodnienie w klatce regeneracyjnej17.
  6. Umieść zwierzę w specjalnej klatce regeneracyjnej wyposażonej w kontrolę temperatury i klimatyzacji oraz monitoruj powrót zwierzęcia do zdrowia po znieczuleniu.

4. Ocena przepuszczalności bariery krew-mózg

  1. Po 24 godzinach reperfuzji należy głęboko znieczulić zwierzę tiopentalem sodu. Następnie otwórz klatkę piersiową, robiąc mały otwór pod mostkiem.
  2. Zrób mały otwór w prawym przedsionku i wstrzyknij 250 ml wstępnie podgrzanej 0,9% soli fizjologicznej (37 °C) pod ciśnieniem 110 mmHg przez lewą komorę przez 15 minut, aby wypłukać EB z krążenia, aż normalna sól fizjologiczna wydostaje się z przedsionka i stanie się bezbarwna23.
  3. Natychmiast usuń mózg z czaszki i umieść go w macierzy mózgowej. Wypreparuj opuszkę węchową i móżdżek, a następnie za pomocą czystej żyletki oddziel prawą półkulę mózgu od lewej (lesioned) wzdłuż linii środkowej.
  4. Zważyć każdą półkulę i homogenizować je oddzielnie w 2,5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem, a następnie wymieszać z 2,5 ml kwasu trichlorooctowego (60%) przez 2 minuty za pomocą maszyny wirowej.
  5. Odwirować próbki mózgu przez 30 minut przy 1,322 x g i pozostawić próbki do ostygnięcia w lodówce o temperaturze 4 °C przez 10 minut.
  6. Użyj supernatantów, aby oszacować absorbancję EB za pomocą spektrofotometru przy 610 nm23.
  7. Obliczyć stężenia EB w stosunku do krzywej wzorcowej i wyrazić wyniki jako μg/g tkanki mózgowej.

5. Produkcja krzywej standardowej EB

  1. Przygotować 10 roztworów próbek EB o stężeniach 1-10 μg EB w 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami.
  2. Zmierzyć wartości absorbancji każdej próbki przy długości fali 610 nm za pomocą spektrofotometru.
  3. Zrób wykres punktowy za pomocą arkusza kalkulacyjnego i przedstaw stężenia EB na osi X oraz wartości absorbancji na osi Y (Rysunek 1).
  4. Zdefiniuj liniową linię trendu dla krzywej wraz z jej równaniem. Następnie użyj go do uzyskania stężenia EB w próbkach.
  5. Ostateczne wyniki wynaczynienia EB należy podać w μg/g masy tkanki mózgowej.

6. Operacja pozorowana

  1. Wykonaj ten sam proces chirurgiczny na szczurach w grupie pozorowanej (w tym wykonanie nacięcia w okolicy szyi i wstrzyknięcie EB), ale z wyłączeniem MCAO.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Nie stwierdzono istotnej różnicy w poziomach EB w prawej półkuli w porównaniu z lewą półkulą u szczurów z grupy pozorowanej (odpowiednio 1,06 ± 0,1 µg/g i 1,1 ± 0,09 µg/g). Jak pokazano na Rysunkach 2A-2B, wywołanie przejściowego niedokrwienia (90 min niedokrwienia/ 24 h reperfuzji) spowodowało istotną różnicę w poziomach EB (10,41 ± 0,84 µg/g, p <0,001) w lewej półkuli szczurów z niedokrwieniem, w porównaniu z odpowiadającą jej półkulą u szczurów z grupy pozo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Do tej pory do oceny uszkodzenia bariery krew-mózg stosowano różne metody, takie jak autoradiografia i wykrywanie znaczników radioaktywnych24,25, mikroskopia immunofluorescencyjna26,27 i technika wynaczynienia EB20,23. Barwnik EB jest silnie zdolny do wiązania się z albuminą surowicy i jest używany jako znacznik do wykrywania przecieków naczyniowy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy są wdzięczni Wicekanclerzowi ds. Badań Uniwersytetu Medycznego Ardabil (Ardabil, Iran) za wsparcie finansowe (grant nr: 9607).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
IzofluranPiramalAWN 3404110020 - 25 ° C
Chlorek 2,3,5-trifenylotetrazolu (TTC)Molekula312163684 lata
Sprague– Szczury Dawley Instytut Pastwisk (Teheran, Iran)300-350g
Evans Blue Sigma-Aldrich 314-13-6
Kwas trichlorooctowy Sigma-Aldrich 76-03-92 lata
Bupiwakaina HCl (0,5%)Delpharm Wycieczkiponiżej  25 ° C
BupernorfinaExir (Iran)
Węglan soduSigma-Aldrich 497-19-8
Chlorek sodu Sigma-Aldrich 7647-14-5
Di-Wodorofosforan soduEMD Milipore 231-448-7
Chlorek potasuSigma-Aldrich   7447-40-7
Alkohol etylowy Sigma-Aldrich 64-17-5
silikon(Xantopren)HeraeusEN ISO 4823
Aktywator uniwersalny plusHeraeus66037445
Kleszcze do mikropreparacjiStoelting52100-41
Nożyczki sprężynoweStoelting52130-00
Operacyjne  NożyczkiRoboz52140-70
Macierz mózgu Stoelting51390
Aparat do znieczulenia dla małych zwierząt |  System Power Lab Kent ScientificSS-01
AD InstrumentsML880
Laserowy przepływomierz dopplerowskiAD InstrumentsML191
System sprzężenia zwrotnego ogrzewaniaHarvard Appratus72-7560
Mikrozacisk naczyniowyFineScience Tools18055-03
Nić do szwów Silk 5-0Ethicon682G
Nić do szwów Ethilon 4-0 EthiconEH6740G

Bibliografia

  1. Jin, G., et al. Protecting against cerebrovascular injury: contributions of 12/15-lipoxygenase to edema formation after transient focal ischemia. Stroke. 39 (9), 2538-2543 (2008).
  2. Lo, E. H., Dalkara, T., Moskowitz, M. A. Mechanisms, challenges and opportunities in stroke. Nat Rev Neurosci. 4 (5), 399-415 (2003).
  3. Tam, S. J., Watts, R. J. Connecting vascular and nervous system development: angiogenesis and the blood-brain barrier. Annu Rev Neurosci. 33, 379-408 (2010).
  4. Zhang, C., et al. The potential use of H102 peptide-loaded dual-functional nanoparticles in the treatment of Alzheimer's disease. J Control Release. , (2014).
  5. Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nat Med. 19 (12), 1584-1596 (2013).
  6. Fang, W., et al. Attenuated Blood-Brain Barrier Dysfunction by XQ-1H Following Ischemic Stroke in Hyperlipidemic Rats. Mol Neurobiol. 52 (1), 162-175 (2015).
  7. Huang, J., et al. CXCR4 antagonist AMD3100 protects blood-brain barrier integrity and reduces inflammatory response after focal ischemia in mice. Stroke. 44 (1), 190-197 (2013).
  8. Omidi, Y., Barar, J. Impacts of blood-brain barrier in drug delivery and targeting of brain tumors. Bioimpacts. 2 (1), 5-22 (2012).
  9. Cho, H., et al. Three-dimensional blood-brain barrier model for in vitro studies of neurovascular pathology. Sci Rep. 5, (2015).
  10. Barar, J., Rafi, M. A., Pourseif, M. M., Omidi, Y. Blood-brain barrier transport machineries and targeted therapy of brain diseases. Bioimpacts. 6 (4), 225-248 (2016).
  11. Kaya, M., et al. Magnesium sulfate attenuates increased blood-brain barrier permeability during insulin-induced hypoglycemia in rats. Can J Physiol Pharmacol. 79 (9), 793-798 (2001).
  12. Pasban, E., Panahpour, H., Vahdati, A. Early oxygen therapy does not protect the brain from vasogenic edema following acute ischemic stroke in adult male rats. Sci Rep. 7 (1), 3221(2017).
  13. Haghnejad Azar, A., Oryan, S., Bohlooli, S., Panahpour, H. Alpha-Tocopherol Reduces Brain Edema and Protects Blood-Brain Barrier Integrity following Focal Cerebral Ischemia in Rats. Med Princ Pract. 26 (1), 17-22 (2017).
  14. Belayev, L., Busto, R., Zhao, W., Ginsberg, M. D. Quantitative evaluation of blood-brain barrier permeability following middle cerebral artery occlusion in rats. Brain Res. 739 (1-2), 88-96 (1996).
  15. Bodsch, W., Hossmann, K. A. 125I-antibody autoradiography and peptide fragments of albumin in cerebral edema. J Neurochem. 41 (1), 239-243 (1983).
  16. Jiang, Q., et al. Quantitative evaluation of BBB permeability after embolic stroke in rat using MRI. J Cereb Blood FlowMetab. 25 (5), 583-592 (2005).
  17. Uluç, K., Miranpuri, A., Kujoth, G. C., Aktüre, E., Başkaya, M. K. Focal cerebral ischemia model by endovascular suture occlusion of the middle cerebral artery in the rat. J Vis Exp. (48), (2011).
  18. Hungerhuber, E., Zausinger, S., Westermaier, T., Plesnila, N., Schmid-Elsaesser, R. Simultaneous bilateral laser Doppler fluxmetry and electrophysiological recording during middle cerebral artery occlusion in rats. J Neurosci Methods. 154 (1-2), 109-115 (2006).
  19. Panahpour, H., Nouri, M. Post-Ischemic Treatment with candesartan protect from cerebral ischemic/reperfusioninjury in normotensive rats. Int J Pharm Pharm Sci. 4 (4), 286-289 (2012).
  20. Panahpour, H., Dehghani, G. A., Bohlooli, S. Enalapril attenuates ischaemic brain oedema and protects the blood-brain barrier in rats via an anti-oxidant action. Clin Exp Pharmacol Physiol. 41 (3), 220-226 (2014).
  21. Panahpour, H., Nekooeian, A. A., Dehghani, G. A. Blockade of Central Angiotensin II AT1 Receptor Protects the Brain from Ischemia/Reperfusion Injury in Normotensive Rats. Iran J Med Sci. 39 (6), 536-542 (2014).
  22. Panahpour, H., Nekooeian, A. A., Dehghani, G. A. Candesartan attenuates ischemic brain edema and protects the blood-brain barrier integrity from ischemia/reperfusion injury in rats. Iran Biomed J. 18 (4), 232-238 (2014).
  23. Kaya, M., et al. The effects of magnesium sulfate on blood-brain barrier disruption caused by intracarotid injection of hyperosmolar mannitol in rats. Life sci. 76 (2), 201-212 (2004).
  24. Schöller, K., et al. Characterization of microvascular basal lamina damage and blood-brain barrier dysfunction following subarachnoid hemorrhage in rats. Brain Res. 1142, 237-246 (2007).
  25. Bodsch, W., Hossmann, K. A. 125I-Antibody Autoradiography and Peptide Fragments of Albumin in Cerebral Edema. J Neurochem. 41 (1), 239-243 (1983).
  26. Sandoval, K. E., Witt, K. A. Blood-brain barrier tight junction permeability and ischemic stroke. Neurobiol Dis. 32 (2), 200-219 (2008).
  27. Zhu, H., et al. Baicalin reduces the permeability of the blood-brain barrier during hypoxia in vitro by increasing the expression of tight junction proteins in brain microvascular endothelial cells. J Ethnopharmacol. 141 (2), 714-720 (2012).
  28. Kucuk, M., et al. Effects of losartan on the blood-brain barrier permeability in long-term nitric oxide blockade-induced hypertensive rats. Life Sci. 71 (8), 937-946 (2002).
  29. Uyama, O., et al. Quantitative evaluation of vascular permeability in the gerbil brain after transient ischemia using Evans blue fluorescence. J Cereb Blood Flow Metab. 8 (2), 282-284 (1988).
  30. Kleinig, T. J., Vink, R. Suppression of inflammation in ischemic and hemorrhagic stroke: therapeutic options. Curr Opin Neurol. 22 (3), 294-301 (2009).
  31. Del Zoppo, G. J., Mabuchi, T. Cerebral microvessel responses to focal ischemia. J Cereb Blood Flow Metab. 23 (8), 879-894 (2003).
  32. Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Des Devel Ther. 9, 3445-3454 (2015).
  33. Noor, R., Wang, C. X., Shuaib, A. Effects of hyperthermia on infarct volume in focal embolic model of cerebral ischemia in rats. Neurosci Lett. 349 (2), 130-132 (2003).
  34. Shin, H. K., et al. Mild induced hypertension improves blood flow and oxygen metabolism in transient focal cerebral ischemia. Stroke. 39 (5), 1548-1555 (2008).
  35. Bottiger, B. W., et al. Global cerebral ischemia due to cardiocirculatory arrest in mice causes neuronal degeneration and early induction of transcription factor genes in the hippocampus. Brain Res Mol Brain Res. 65 (2), 135-142 (1999).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Błękit Evansazamknięcie tętnicy środkowej mózguregionalny przepływ krwi w mózgudetekcja spektrofotometrycznakaniulacja żyły szyjnejhomogenizacja tkanki mózgowejlaserowy miernik przepływu (Laser Doppler Flowmeter)okres reperfuzji
Ocena in vivo przerwania bariery krew-mózg w szczurzym modelu udaru niedokrwiennego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.