Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Trójwymiarowe zapalne odpowiedniki tkanek ludzkich dziąsła

9.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57157

⸱

3 kwietnia 2018

 ,  , 
1Department of Pharmacology, The Nippon Dental University, 2Department of Oral and Maxillofacial Surgery, The Nippon Dental University Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

Celem protokołu jest zbudowanie modelu zapalenia ludzkiego dziąsła in vitro. Ten model tkankowy współhoduje trzy typy komórek ludzkich, keratynocyty HaCaT, fibroblasty dziąseł i makrofagi THP-1, w warunkach trójwymiarowych. Model ten można zastosować do badania chorób przyzębia, takich jak zapalenie dziąseł i przyzębia.

Streszczenie

Choroby przyzębia (takie jak zapalenie dziąseł i przyzębia) są głównymi przyczynami utraty zębów u dorosłych. Stan zapalny dziąseł jest podstawową fizjopatologią chorób przyzębia. Obecne eksperymentalne modele chorób przyzębia zostały ustalone u różnych typów zwierząt. Jednak fizjopatologia modeli zwierzęcych różni się od ludzkiej, co utrudnia analizę mechanizmów komórkowych i molekularnych oraz ocenę nowych leków na choroby przyzębia. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół rekonstrukcji ludzkich odpowiedników tkanki zapalnej dziąsła (iGTE) in vitro. Najpierw budujemy ludzkie tkankowe odpowiedniki dziąseł (GTE), wykorzystując dwa rodzaje komórek ludzkich, w tym ludzkie fibroblasty dziąseł (HGF) i keratynocyty naskórka ludzkiej skóry (HaCaT), w warunkach trójwymiarowych. Tworzymy model rany, używając dziurkacza do tkanek do wybicia w GTE. Następnie ludzkie monocyty THP-1 zmieszane z żelem kolagenowym są wstrzykiwane do otworu w GTE. Poprzez adimistrację 10 ng / ml 12-mirystynianu 13-octanu forbolu (PMA) przez 72 godziny, komórki THP-1 różnicują się w makrofagi, tworząc ogniska zapalne w GTE (iGTE) (IGTE można również stymulować 2 μg / ml lipopolisacharydów (LPS) przez 48 godzin, aby zainicjować stan zapalny). IGTE to pierwszy model zapalenia dziąseł in vitro wykorzystujący ludzkie komórki o trójwymiarowej architekturze. IGTE odzwierciedla główne zmiany patologiczne (aktywność immunocytów, interakcje wewnątrzkomórkowe między fibryoblastami, komórkami nabłonkowymi, monocytami i makrofagami) w chorobach przyzębia. GTE, wounded GTE i iGTE mogą być wykorzystywane jako wszechstronne narzędzia do badania gojenia się ran, regeneracji tkanek, stanów zapalnych, interakcji komórka-komórka i badań przesiewowych potencjalnych leków na choroby przyzębia.

Wprowadzenie

Choroby przyzębia są główną przyczyną utraty zębów u dorosłych. Zapalenie dziąseł i przyzębia to najczęstsze choroby przyzębia. W obu przypadkach występują ostre lub przewlekłe zmiany zapalne dziąseł wywołane biofilmem. Zapalenie dziąseł charakteryzuje się ostrym stanem zapalnym, podczas gdy zapalenie przyzębia zwykle objawia się przewlekłym stanem zapalnym. Na poziomie histologicznym składniki bakteryjne wyzwalają aktywację komórek odpornościowych, takich jak makrofagi, limfocyty, komórki plazmatyczne i komórki tuczne1,2. Te komórki odpornościowe, zwłaszcza makrofagi, oddziałują z komórkami lokalnymi (w tym komórkami nabłonka dziąseł, fibroblastami, komórkami śródbłonka i osteoblastami), powodując zmiany zapalne w tkance przyzębia3,4. Eksperymentalne modele chorób przyzębia zostały ustalone u różnych typów zwierząt, takich jak szczury, chomiki, króliki, fretki, psy i naczelne. Jednak fizjopatologia modeli zwierzęcych różni się od ludzkiej, co utrudnia analizę mechanizmów komórkowych i molekularnych oraz ocenę nowych leków na choroby przyzębia5. Do zbadania mechanizmu infekcji przyzębia wykorzystano komisję bakterii przyzębia i jednowarstwowych ludzkich komórek nabłonka jamy ustnej6. Niemniej jednak jednowarstwowe hodowle komórek jamy ustnej nie mają trójwymiarowej (3D) architektury komórkowej nienaruszonej tkanki; W związku z tym nie mogą naśladować sytuacji in vitro.

Tutaj, 3D zapalne odpowiedniki tkanek ludzkich dziąseł (iGTE) są ustalane do reprezentowania chorób przyzębia in vitro. Ten model 3D chorób przyzębia zajmuje pozycję pośrednią między monowarstwowymi hodowlami komórkowymi a modelami zwierzęcymi. Trzy rodzaje komórek ludzkich, w tym keratynocyty HaCaT, fibroblasty dziąseł i makrofagi THP-1, są współhodowane na żelu kolagenowym i stymulowane przez inicjatory stanu zapalnego do budowy iGTE. IGTE ściśle symuluje warunki in vivo różnicowania komórek, interakcji komórka-komórka i aktywacji makrofagów w dziąsłach. Model ten ma wiele możliwych zastosowań w badaniach przesiewowych leków i testowaniu nowych podejść farmakologicznych w chorobach przyzębia, a także do analizy mechanizmów komórkowych i molekularnych w gojeniu się ran, stanach zapalnych i regeneracji tkanek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Ten protokół jest przeznaczony do tworzenia odpowiedników ludzkiej tkanki dziąsełowej, modeli ran dziąsłowych i modeli zapalenia dziąseł. Keratynocyty naskórka ludzkiej skóry (HaCaT) zostały udostępnione dzięki uprzejmości profesora Norberta E. Fuseniga z Deutsches Krebsforschungszentrum (Heidelberg, Niemcy)7. Ludzkie fibroblasty dziąseł (HGF) zostały wyizolowane z tkanek dziąseł zgodnie z wcześniej opublikowanymi protokołami8. Wcześniej uzyskano świadomą zgodę, a badanie zostało zatwierdzone zgodnie z wytycznymi ustalonymi przez Komisję Etyki, Nippon Dental University School of Life Dentistry w Tokio (numer autoryzacji: NDU-T2012-35). Kroki protokołu 1–3 należy wykonać w kapturze do hodowli komórkowej.

1. Przygotowanie 3D Ludzkich Tkanek Odpowiedników Dziąsła (GTE) (Rysunek 1A)

  1. Wymieszaj żel kolagenowy typu I-A z 10% skoncentrowanym MEM-alfa i 10% buforem odbudowującym (2,2 gNaHCO3 i 4,47 g HEPES w 100 ml 0,05 N NaOH) w sterylnej probówce o pojemności 15 ml przez pipetowanie. Mieszany roztwór kolagenu należy przechowywać na lodzie do momentu użycia.
  2. Umieść 24-dołkowe wkładki hodowlane (wielkość porów 3,0 μm) na 24-dołkowej płytce.
  3. Usuń HGF z powierzchni hodowli za pomocą 0,25% roztworu trypsyny-EDTA. Zawiesić komórki w 10 ml pożywki hodowlanej A (MEM-alfa + 20% FBS + 1% GlutaMAX). Policz komórki za pomocą licznika komórek Bürker-Türk.
    1. Wyekstrahuj żądaną ilość komórek (1-5 x105 komórek/ml), a następnie odwiruj przez 4 minuty przy 190 x g.
    2. Zawieś komórki w mieszanym roztworze kolagenu. Trzymaj mieszaninę na lodzie do następnego kroku.
  4. Dodaj 0,5 ml mieszaniny komórka-kolagen (0,5–2,5 x 105 komórek/studzienkę) do wkładki hodowlanej, nie wytwarzając żadnych pęcherzyków. Inkubować mieszaninę przez 10–30 minut w wilgotnej atmosferze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C w celu koagulacji mieszaniny do postaci żelu.
    UWAGA: Dodaj mieszaninę kolagenu do środka wkładki hodowlanej, aby uniknąć nierównomiernego tworzenia się żelu kolagenowego.
  5. Dodać 1 ml pożywki do dołka i 0,5 ml do wkładki. Inkubować płytkę hodowlaną przez 24 godziny lub przez noc w wilgotnej atmosferze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C.
  6. Usuń komórki HaCaT z powierzchni hodowli za pomocą 0,25% roztworu trypsyny-EDTA. Zawieś komórki w 10 ml pożywki B (DMEM + 10% FBS + 1% GlutaMAX) i policz komórki. Pobrać potrzebną ilość komórek (1–5 x 105 komórek/ml) za pomocą pipety, odwirować przez 4 minuty przy 190 x g. Zawieś komórki w podłożu B.
  7. Usunąć pożywkę z wkładek hodowlanych, które zawierają mieszaninę HGF i kolagenu, przez aspirację. Dodaj 0,5 ml zawiesiny komórek HaCaT (0,5–2,5 x 105 komórek/dołek) na wierzch mieszaniny HGF-kolagen. Inkubować kultury przez 24 godziny lub przez noc.
    UWAGA: W tym momencie pożywka w studzience hodowlanej powinna być pożywką A, podczas gdy pożywką we wstawce hodowlanej powinno być pożywką B.
  8. Zastąp pożywkę hodowlaną pożywką KSR (pożywka kohodowlana) (MEM-alfa + 15% zamiennika surowicy nokautującej + 1% GlutaMAX) + 5% FBS. Dodać 1 ml pożywki do dołka hodowlanego i 0,5 ml do wkładki hodowlanej. Inkubuj kultury przez 24–48 godzin.
  9. Zastąp pożywkę hodowlaną pożywką KSR + 1% FBS. Dodaj 1 ml do dołka hodowlanego i 0,5 ml do wkładki hodowlanej. Inkubuj kultury przez 24 godziny lub przez noc.
  10. Zastąp pożywkę hodowlaną w studzience hodowlanej 0,7–1 ml pożywki KSR. Całkowicie usunąć pożywkę z wkładki hodowlanej (powierzchnia hodowli powinna być wystawiona na działanie powietrza). Inkubuj kultury przez 1–2 tygodnie. Zmieniaj pożywkę w kulturze dwa razy w tygodniu.
    UWAGA: Nie pozwól, aby poziom podłoża uniósł się ponad powierzchnię kultury (górna warstwa złożona z keratynocytów). Zawsze utrzymuj powierzchnię kultury w suchym miejscu.

2. Przygotowanie rannego GTE (Rysunek 1B)

  1. Przygotuj dziurkacz do tkanek o średnicy 1–3 mm. Sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 20 min.
  2. Wepchnij dziurkacz do tkanek prostopadle do GTE na głębokość około 300 μm i wybij otwór w tkance, aby zasymulować ranę.
  3. Na tym etapie użyj rannego GTE do zbadania gojenia się ran i regeneracji tkanek. Alternatywnie, utrwal GTE za pomocą 10% neutralnego roztworu buforowego formaliny do przeprowadzenia analizy histologicznej.

3. Przygotowanie zapalnego GTE (iGTE) (Rysunek 1B)

  1. Hoduj komórki THP-1 zgodnie z poprzednim raportem9.
  2. Wymieszaj żel kolagenowy typu I-A z 10% skoncentrowanym RPMI 1640, 10% buforem odbudowującym (2,2 gNaHCO3 i 4,47 g HEPES w 100 ml 0,05 N NaOH) i 10 ng/ml PMA. Mieszany roztwór kolagenu należy przechowywać na lodzie do czasu użycia.
  3. Policz 1–2 x 106 komórek THP-1 i wiruj przez 4 minuty przy 190 x g. Zawiesić komórki w 1 ml zmieszanego roztworu kolagenu. Trzymaj mieszaninę na lodzie do następnego kroku.
  4. Dodaj 10–30 μl mieszaniny kolagenu THP-1 do zranionego obszaru GTE. Zastąp pożywkę hodowlaną na 0,7–1 ml pożywki KSR zawierającej 10 ng/ml PMA.
  5. Mieszaninę inkubować w wilgotnej atmosferze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez 72 godziny.
  6. Użyj modelu do badania zapalenia dziąseł lub choroby przyzębia (na przykład dodaj potencjalny lek przeciwzapalny do iGTE, aby zobaczyć jego wpływ na uwalnianie cytokin10). Alternatywnie, pomiń 72-godzinny zabieg PMA, dodaj 2 μg/ml LPS do kultury i inkubuj tkankę w wilgotnej atmosferze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez 48 h11,12.

4. Utrwalenie i barwienie immunologiczne całego wierzchowca kultur GTE i iGTE

  1. Fiksacja kultur.
    1. Usunąć pożywkę hodowlaną z płytki 24-dołkowej. Umyj tkanki 2 razy solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).
    2. Dodaj 1 ml 10% neutralnego roztworu buforowego formaliny do wkładki i 1 ml do dołka hodowli. Płytkę 24-dołkową należy pozostawić na noc w lodówce w temperaturze 4 °C.
    3. Następnego dnia usunąć 10% roztwór buforowy neutralnej formaliny.
    4. W przypadku barwienia immunologicznego całej wierzchowca, po utrwaleniu należy przemyć tkanki 3-4 razy PBS.
    5. W przypadku barwienia hematoksyliną i eozyną (H&E) oraz regularnego barwienia immunologicznego należy przystąpić do odwodnienia, zatapiania parafiny i cięcia.
      UWAGA: W przypadku barwienia immunologicznego całego wierzchowca ten krok można pominąć.
  2. Barwienie immunologiczne całej góry
    UWAGA: Ten protokół został zmodyfikowany w stosunku do protokołu z odnośnika 13.
    1. Chusteczki myć 3x w PBS 0,5–1% Triton, za każdym razem po 10–30 minut.
    2. Inkubować tkanki dwukrotnie przez 30 minut w buforze blokującym (PBS 1% Triton + 10% BSA), w temperaturze pokojowej.
    3. Chusteczki myć 2× w buforze blokującym, za każdym razem 5–10 minut.
    4. Dodać 50 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego w wymaganym rozcieńczeniu/stężeniu do wkładek. Użyj cienkiej plastikowej folii spożywczej do owinięcia wkładek, aby uniknąć wysuszenia chusteczki.
    5. Inkubować tkankę przez 1-2 dni w temperaturze 4 °C.
    6. Chusteczki myć 3 razy, przez 30 min w PBS 1% Triton + 10% BSA. Umyj ponownie 3 razy, przez 5 minut w PBS 1% Triton.
    7. Dodać 50 μl przeciwciała drugorzędowego w buforze blokującym (PBS 1% Triton + 10% BSA) i 5 μl roztworu Hoechst 33342 (barwienie NucBlue Live Cell) do każdej wkładki. Użyj cienkiej plastikowej folii spożywczej do owinięcia wkładek, aby uniknąć wysuszenia chusteczki.
    8. Inkubować przez 1 do 2 dni w temperaturze 4 °C. Zawinąć 24-dołkową płytkę w mokry ręcznik papierowy, a następnie umieścić ją w plastikowym opakowaniu do stosowania przez cały okres inkubacji.
    9. Umyj chusteczki 3 razy, przez 10 minut w PBS 1% tryton
    10. Użyj ostrej igły, aby przeciąć błonę wkładki hodowlanej, aby uzyskać tkankę. Umieść membranę na szkiełku.
      UWAGA: Tkanka powinna znajdować się na membranie.
    11. Dodaj 2-3 krople pożywki do montażu fluorescencyjnego. Przykryć chusteczkę szklanym nakryciem i przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności do czasu analizy.
    12. Oglądaj tkanki za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej (LSM).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Komórki HaCaT wykazywały typową morfologię keratynocytów podczas obserwacji pod mikroskopem fazowo-kontrastowym (Rysunek 2A). Obrazy z transmisyjnego mikroskopu elektronowego (SEM) wykazały, że powierzchnie komórek HaCaT były pokryte licznymi mikrokosmkami. Połączenia międzykomórkowe między komórkami HaCaT były zapośredniczone przez wypustki błonowe (Rysunek 2B). Komórki HaCaT wykazywały ekspresję markera nabłonka dziąseł K8/18

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten opiera się na metodach tworzenia ekwiwalentów tkanki dziąsłowej i podskórnych odpowiedników tkanki tłuszczowej opisanych w poprzednich raportach 8,21,22. Chociaż jest to prosta i łatwa metoda, niektóre kroki wymagają szczególnej uwagi. Na przykład mieszaninę kolagenu należy przechowywać na lodzie do czasu użycia, aby uniknąć tworzenia się żelu w roztworze. Dodając mieszaninę kolagenu do wkładki hodowlanej, upewnij s...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca była częściowo wspierana przez Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki (JSPS) Grant-in-Aid for Scientific Research (26861689 i 17K11813). Autorzy pragną podziękować Panu Nathanielowi Greenowi za korektę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kolagen typu I-ANitta Gelatin IncDo wytwarzania skóry właściwej GTE
MEM-alphaThermo Fisher Scientific 11900073Pożywka do hodowli
komórkowych Wkładka do hodowli komórkowych (na płytkę 24-dołkową), wielkość porów 3,0 i mu; mCorning, Inc.353096Do hodowli tkankowych
GlutaMAXThermo Fisher Scientific35050061Odczynnik do hodowli komórkowych
DMEMThermo Fisher Scientific31600034Pożywka do hodowli komórkowych
KnockOut Wymiana surowicyThermo Fisher Scientific10828028Odczynnik do hodowli komórkowych
Dziurkacz do tkanekShibata system service co., LTDSP-703Do dziurkowanie otworów w GTE
RPMI 1640Thermo Fisher Scientific31800022Pożywka do hodowli komórkowych
BSASigma-AldrichA3294Do barwienia immunologicznego
Hoechst 33342 (NucBlue Live Cell stain)Thermo Fisher ScientificR37605Do znakowania jąder
Podłoże do montażu fluorescencyjnegoDakoDo mocowania próbek po barwieniu immunologicznym
Przeciwciało anty-cytokeratyny 8 + 18 [5D3]abcamab17139Do identyfikacji nabłonka
Skaningowy mikroskop elektronowyHitachi, Ltd.HITACHI S-4000Do obserwacji topografii i składu powierzchni próbek
Konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa,LSM 700; Carl Zeiss Microscopy Co., Sp. z o.o.LSM 700Do obserwacji barwienia immunofluorescencyjnego próbek Przeciwciało
anty-cytokeratyny 19abcamab52625Do identyfikacji nabłonka
Przeciwciało anty-wimentynoweabcamab92547Do identyfikacji fibroblastów i aktywowanych makrofagów
Przeciwciało anty-TE-7MilliporeCBL271Do identyfikacji fibroblastów w skórze właściwej
Anty-CD68 przeciwciałoSigma-AldrichSAB2700244Do identyfikacji makrofagów
Ludzkie przeciwciało CD14R& D SystemsMAB3832-SPDo identyfikacji makrofagów
Alexa Fluor 594-sprzężone wtórne kozie przeciwciało anty-króliczeThermo Fisher ScientificA11012Do barwienia immunofluorescencyjnego
Alexa Fluor 488-sprzężone wtórne kozie przeciwciało anty-mysieThermo Fisher ScientificA11001Do barwienia immunofluorescencyjnego
EVOS FL System obrazowania komórekThermo Fisher Scientificbarwienia immunofluorescencyjnego próbki
komórek Riken BRCRCB1189Do wytwarzania iGTE
PMA (12-mirystynian 13-octanu)Sigma-AldrichP8139Do różnicowania komórek THP-1
: Do obserwacji komórek THP-1 Bank

Bibliografia

  1. Cekici, A., Kantarci, A., Hasturk, H., Van Dyke, T. E. Inflammatory and immune pathways in the pathogenesis of periodontal disease. Periodontology 2000. 64 (1), 57-80 (2014).
  2. Hasturk, H., Kantarci, A., Van Dyke, T. E. Oral Inflammatory Diseases and Systemic Inflammation: Role of the Macrophage. Frontiers in Immunology. 3, 118(2012).
  3. Koh, T. J., DiPietro, L. A. Inflammation and wound healing: The role of the macrophage. Expert reviews in molecular medicine. 13, e23(2011).
  4. Mescher, A. L. Macrophages and fibroblasts during inflammation and tissue repair in models of organ regeneration. Regeneration. 4 (2), 39-53 (2017).
  5. Struillou, X., Boutigny, H., Soueidan, A., Layrolle, P. Experimental Animal Models in Periodontology: A Review. The Open Dentistry Journal. 4, 37-47 (2010).
  6. Han, Y. W., et al. Interactions between Periodontal Bacteria and Human Oral Epithelial Cells: Fusobacterium nucleatum Adheres to and Invades Epithelial Cells. Infection and Immunity. 68 (6), 3140-3146 (2000).
  7. Boukamp, P., Petrussevska, R. T., Breitkreutz, D., Hornung, J., Markham, A., Fusenig, N. E. Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line. J Cell Biol. 106 (3), 761-771 (1988).
  8. Xiao, L., Miwa, N. Hydrogen-rich water achieves cytoprotection from oxidative stress injury in human gingival fibroblasts in culture or 3D-tissue equivalents, and wound-healing promotion, together with ROS-scavenging and relief from glutathione diminishment. Hum Cell. 30 (2), 72-87 (2017).
  9. Tsuchiya, S., Yamabe, M., Yamaguchi, Y., Kobayashi, Y., Konno, T., Tada, K. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
  10. Ara, T., Kurata, K., Hirai, K., Uchihashi, T., Uematsu, T., Imamura, Y., Furusawa, K., Kurihara, S., Wang, P. L. Human gingival fibroblasts are critical in sustaining inflammation in periodontal disease. J Periodontal Res. 44 (1), 21-27 (2009).
  11. Park, E. K., Jung, H. S., Yang, H. I., Yoo, M. C., Kim, C., Kim, K. S. Optimized THP-1 differentiation is required for the detection of responses to weak stimuli. Inflamm Res. 56 (1), 45-50 (2007).
  12. Sharif, O., Bolshakov, V. N., Raines, S., Newham, P., Perkins, N. D. Transcriptional profiling of the LPS induced NF-kappaB response in macrophages. BMC Immunol. 8, 1(2007).
  13. Abcam. Whole mount fluorescent immunohistochemistry. , Available from: http://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/whole_mount_fluorescent_ihc.pdf (2017).
  14. Shetty, S., Gokul, S. Keratinization and its disorders. Oman Med J. 27 (5), 348-357 (2012).
  15. Klinge, B., Matsson, L., Attström, R. Histopathology of initial gingivitis in humans. A pilot study. J Clin Periodontol. 10 (4), 364-369 (1983).
  16. Nagarakanti, S., Ramya, S., Babu, P., Arun, K. V., Sudarsan, S. Differential expression of E-cadherin and cytokeratin 19 and net proliferative rate of gingival keratinocytes in oral epithelium in periodontal health and disease. J Periodontol. 78 (11), 2197-2202 (2007).
  17. Goodpaster, T., Legesse-Miller, A., Hameed, M. R., Aisner, S. C., Randolph-Habecker, J., Coller, H. A. An immunohistochemical method for identifying fibroblasts in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. J Histochem Cytochem. 56 (4), 347-358 (2008).
  18. Langeland, K., Rodrigues, H., Dowden, W. Periodontal disease, bacteria, and pulpal histopathology. Oral Surg Oral Med Oral Pathol. 37 (2), 257-270 (1974).
  19. Holness, C. L., Simmons, D. L. Molecular cloning of CD68, a human macrophage marker related to lysosomal glycoproteins. Blood. 81 (6), 1607-1613 (1993).
  20. Mor-Vaknin, N., Punturieri, A., Sitwala, K., Markovitz, D. M. Vimentin is secreted by activated macrophages. Nat Cell Biol. 5 (1), 59-63 (2003).
  21. Xiao, L., Aoshima, H., Saitoh, Y., Miwa, N. The effect of squalane-dissolved on adipogenesis-accompanied oxidative stress and macrophage in a preadipocyte-monocyte co-culture system. Biomaterials. 31 (23), 5976-5985 (2010).
  22. Xiao, L., Aoshima, H., Saitoh, Y., Miwa, N. Highly hydroxylated fullerene localizes at the cytoskeleton and inhibits oxidative stress in adipocytes and a subcutaneous adipose-tissue equivalent. Free Radic Biol Med. 51 (7), 1376-1389 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

R wnowa niki zapalnej tkanki dzi s aludzkie fibroblasty dzi s akeratynocyty HaCaTmonocyty THP 1wstrzykiwanie elu kolagenowegomodel rany z u yciem wykrojnika tkankowegor nicowanie PMAstymulacja LPSbarwienie H Ebarwienie immunofluorescencyjne
Trójwymiarowe zapalne odpowiedniki tkanek ludzkich dziąsła
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.