Wprowadzono metodę przeszczepiania wysp trzustkowych u myszy. Wyizolowane wysepki miesza się z hydrożelem, a mieszaninę umieszcza się w woreczku omentalnym myszy z cukrzycą. Następnie monitorowany jest poziom glukozy we krwi i wykonywana jest analiza immunohistochemiczna.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Metoda przeszczepu wysp trzustkowych do sieci u myszy
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Przeszczep wysp trzustkowych został zaproponowany jako potencjalna metoda leczenia cukrzycy typu 1. Ostatnie przekonujące dowody wskazują, że wewnątrznaczyniowa infuzja wysp trzustkowych jest daleka od ideału, a zatem sieć ponownie pojawia się jako potencjalnie cenne miejsce do przeszczepu wysp trzustkowych. Eksperyment ten wymaga wyizolowania wysokiej jakości wysp trzustkowych i zagnieżdżenia się wysp trzustkowych biorcom z cukrzycą. Przeszczep do sieci wymaga czynności chirurgicznych, które można lepiej zademonstrować wizualnie. Tutaj przedstawiono szczegółowe kroki tej procedury. Opisano tutaj dwie metody mieszania izolowanych wysepek z hydrożelem przed umieszczeniem mieszaniny w woreczku omentalnym myszy z cukrzycą. W różnych warunkach stosuje się różne hydrożele. Poziom glukozy we krwi myszy z cukrzycą, u których zastosowano syngeniczne wyspy trzustkowe w sieci komórkowej, monitorowano przez okres do 35 dni. Niektóre zwierzęta uśmiercono po 14 dniach w celu przeprowadzenia analizy immunohistochemicznej. To podejście oparte na przeszczepianiu przedklinicznym może być wykorzystane jako dane wstępne prowadzące do przełożenia na przeszczep kliniczny.
Wprowadzenie
Według Międzynarodowej Federacji Diabetologicznej (IDF), cukrzyca dotyka obecnie 382 miliony ludzi, z prognozowanym wzrostem do 592 milionów ludzi do 2035 roku1. Zarówno w przypadku allogenicznego, jak i ksenogenicznego przeszczepu wysp trzustkowych konieczne jest ogólnoustrojowe leczenie immunosupresyjne. Bez immunosupresji, odrzucenie immunologiczne jest główną przyczyną utraty przeszczepu2. Istnieje również poważny problem utraty przeszczepionych wysp trzustkowych z powodu natychmiastowej reakcji zapalnej za pośrednictwem krwi (IBMIR)3,4. Jednak nawet w przypadku braku odpowiedzi immunologicznej, takiej jak w modelach syngenicznych lub autotransplantacyjnych, komórki wysp trzustkowych przeszczepione do wątroby przez żyłę wrotną są tracone z powodu stanu zapalnego i/lub niekorzystnych warunków środowiskowych, takich jak słabe ukrwienie ze zmniejszonym natlenieniem i/lub składnikami odżywczymi5,6. W rezultacie, aby zapewnić długotrwałą funkcję metaboliczną, konieczna jest wyższa liczba wysp trzustkowych, aby skompensować początkową utratę komórek, która zmniejsza engraftment7.
W celu optymalizacji wszczepienia wysp trzustkowych, przetestowano eksperymentalnie i klinicznie kilka alternatywnych miejsc anatomicznych, uzyskując obiecujące, ale nie ostateczne wyniki8. Podczas gdy niektóre z alternatywnych miejsc oferują łatwy i bezpieczny dostęp (np. skóra, torebka nerkowa, błona podśluzowa żołądka i przednia komora oka) lub szerszą powierzchnię w przypadku większych mas wysp trzustkowych (np. jama otrzewnowa), przeżycie i fizjologiczna wydajność metaboliczna przeszczepionych wysp trzustkowych są nadal ograniczone i pozostają problemem9. Trwają poszukiwania bardziej odpowiedniego miejsca do szczepienia wysp trzustkowych.
Sieć była jednym z wielu miejsc anatomicznych, które były badane we wczesnym rozwoju przeszczepu wysp trzustkowych i okazała się skutecznym środowiskiem dla wysp trzustkowych10,11,12,13,14. Jednak infuzja z wysp trzustkowych wewnątrzwrotnych stała się wyborem klinicznym, częściowo ze względu na względną prostotę procedury i wczesny sukces w modelach zwierzęcych6. Ponadto, częściowo, negatywy związane z tym miejscem, szczególnie masowa wczesna utrata wysp trzustkowych, były mniej zrozumiałe i mniej ograniczające we wczesnych dniach eksperymentalnego przeszczepu wysp trzustkowych, w miarę dojrzewania pola. Dzięki nowszym przekonującym dowodom wskazującym, że wewnątrznaczyniowa infuzja wysp trzustkowych jest daleka od ideału, sieć ponownie pojawia się jako potencjalnie cenne miejsce do przeszczepu komórek.
Sieć (w formie woreczka na kapsułkę) oferuje względną przewagę nad wątrobą15,16. Jest dobrze unaczyniony i łatwo dostępny. Umożliwia pobranie przeszczepu (jeśli to konieczne) i/lub biopsję. Okres niedokrwienny doświadczany przez wyspy trzustkowe jest skrócony w porównaniu z wątrobą, a sieć może przyjąć stosunkowo duże masy wysp trzustkowych, co nie jest możliwe wewnątrzwrotnie, gdzie wzrost ciśnienia wrotnego może powodować powikłania.
Syngeniczny mysi model transplantacji został wykorzystany w protokole testowanym w badaniu, wykorzystując samce myszy C57BL/6 w wieku od 6 do 8 tygodni o masie ciała 20-25 g. Biorcy wysp trzustkowych zostali uznani za diabetyków po pojedynczym wstrzyknięciu streptozotocyny w dawce 250 mg/kg ip. Indukcję cukrzycy można uznać za udaną, jeśli poziom glukozy we krwi myszy jest większy niż 24 mmol/L 48 godzin po wstrzyknięciu i utrzymuje się powyżej tego poziomu przez co najmniej 5 dni.
Syngeniczne wyspy trzustkowe zostały wyizolowane z trzustki dawców o dopasowanym wieku, stosując wcześniej opublikowane metody z pewnymi modyfikacjami. Krótko mówiąc, kolagenaza została wstrzyknięta do woreczka żółciowego zamiast do przewodu żółciowego. Zostało to zrobione jako ulepszenie w celu ułatwienia wstrzykiwania. Po infuzji kolagenazy następowała inkubacja, rozbijanie tkanek, separacja gradientu gęstości i ręczne zbieranie w celu uzyskania czystych wysepek. Wyspy trzustkowe hodowano przez noc w pożywce CMRL-1066 uzupełnionej 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS) w kolbach T175 w temperaturze 37 °C, poniżej 95% powietrza-5% CO2 przed przeszczepem.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie myszy użyte w tym badaniu zostały pozyskane z Centrum Medycznego dla Zwierząt w prowincji Guangdong. Wykorzystanie zwierząt zostało zatwierdzone przez Komisję ds. Oceny Etyki Drugiego Szpitala Ludowego w Shenzhen, zgodnie z zasadami dobrostanu zwierząt.
1. Przeszczep wysp trzustkowych do sieci
UWAGA: Ten protokół wymaga 2 osób do jego wykonania.
- Zbierz materiały chirurgiczne, które są wymienione w Tabeli 1. Przygotuj aseptyczne pole w polu operacyjnym za pomocą sterylnych materiałów, takich jak serwety i materiały jednorazowego użytku, i utrzymuj warunki aseptyczne przez cały czas operacji. Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne. Noś sterylne fartuchy.
- Pobrać wysepki za pomocą końcówki do pipety o pojemności 200 μl pod mikroskopem stereoskopowym. Każda mysz otrzyma 450–500 ekwiwalentu wysepek (IEQ) na tansplant. Dla każdego zwierzęcia umieść wystarczającą ilość wysepek do pojedynczego przeszczepu w sterylnej probówce typu snap-top o pojemności 1,5 ml ze 100 μl pożywki CMRL-1066.
UWAGA: Wyspy trzustkowe można wyizolować w dniu przeszczepu, ale lepiej jest je odizolować dzień wcześniej, aby umożliwić powrót do zdrowia w procesie izolacji. - Trzymaj rurki typu snap-top z wysepkami na lodzie, aż będą gotowe do przesadzenia.
- Rozmrozić hydrożel z matrycą membrany podstawnej i przechowywać go na lodzie po wyjęciu go z zamrażarki o temperaturze -20 °C. Hydrożel jest płynny w temperaturze od 4 °C do 10 °C i krzepnie w wyższych temperaturach.
- Zważ i oznacz wszystkie myszy biorców z cukrzycą. Wstrzyknąć dootrzewnowo 60 mg/kg pentobarbitalu sodu. Przetestuj głębokość znieczulenia, podając szczypanie palca u nogi. Podać dodatkowe 10 mg/kg pentobarbitalu sodu, jeśli zwierzę zareaguje na uszczypnięcie. Jeśli nie ma odruchu wycofania, poziom znieczulenia jest prawidłowy dla operacji.
- Wymaz z miejsca operowanego na brzuchu przy użyciu 70% etanolu. Ogol włosy z tego miejsca za pomocą żyletki i zdezynfekuj obszar za pomocą Jodoforu. Podawaj maść weterynaryjną do oczu, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
- Za pomocą nożyczek okulistycznych otwórz brzuch wzdłuż linii środkowej brzucha z nacięciem od 4 do 5 cm. Przesuń jelita na lewą stronę i przykryj gazą nasączoną solą fizjologiczną, aby zapobiec nadmiernemu odwodnieniu podczas zabiegu chirurgicznego.
- Użyj bawełnianych wacików, aby w pełni odsłonić pole widzenia żołądka i zlokalizować sieć (znajdującą się poniżej żołądka). Użyj dwóch par cienkich kleszczy, aby rozciągnąć sieć. Uważaj, aby nie dopuścić do rozdarcia.
- W tym momencie hydrożel jest całkowicie rozmrożony. Wirować probówkę z wysepkami przez 30 s przy 200 x g i usunąć supernatant. Odessać 50 μl hydrożelu, dodać go do probówki zawierającej wysepki i delikatnie zawiesić mieszankę, unikając tworzenia się pęcherzyków. Podczas zabiegu utrzymuj probówki na lodzie.
- Użyj dwóch kleszczy, aby podnieść krawędzie sieci i delikatnie ją podnieść, aby utworzyć rowek między ścianą żołądka a jelitami, który może pomieścić niewielką objętość płynu z przeszczepem wysp trzustkowych.
- Pozwól drugiej osobie asystować w procedurze i zassać zawieszoną mieszaninę wysepki i hydrożelu (całą zawartość probówki) za pomocą końcówki pipety o pojemności 200 μl, Dostarczyć zawartość do rowka.
- Upewnij się, że mieszanina jest dobrze umieszczona w rowku, delikatnie podnosząc lub opuszczając krawędzie sieci komórkowej. Całkowite umiejscowienie mieszaniny w ciągu 3 minut, zanim hydrożel zestali się pod wpływem temperatury ciała. Po związaniu hydrożelu złóż sieć tak, aby pokryła przeszczep.
UWAGA: Sieć będzie przylegać do otaczającej ściany żołądka w miarę zestalania się hydrożelu. - Po całkowitym zestaleniu hydrożelu użyj bawełnianych wacików, aby przestawić jelita z powrotem do jamy brzusznej, uważając, aby nie dotknąć miejsca przeszczepu.
- Dodaj 20 μl cefalosporyny (5 ~ 10 mg) do jamy brzusznej, aby zapobiec infekcji, a następnie użyj szwu 4-0, aby zamknąć brzuch.
- Umieść mysz z powrotem w klatce i powtórz wszystkie kroki dla każdego odbiorcy myszy. Utrzymuj myszy w cieple i monitoruj wzrokowo, aż w pełni odzyskają wystarczającą świadomość, aby utrzymać leżącą mostek. Trzymaj myszy oddzielnie od innych zwierząt, dopóki w pełni nie wyzdrowieją.
- Wstrzykiwać 50 μl cefazoliny sodowej (0,05 mg/ml) codziennie przez tydzień w ramach profilaktyki pooperacyjnej. Podawać Bupiwakainę + Buprenorfinę, tj. Miejscowo nanieść 1-3 krople 0,25% bupiwakainy w miejsce nacięcia przed założeniem klipsów do ran. Podawać buprenorfinę (0,03 mg/ml ze sterylnym 0,9% soli fizjologicznej, 0,05-0,10 mg/kg) drogą dootrzewnową (IP).
- Zmierz poziom glukozy we krwi na czczo z próbki krwi z żyły ogonowej za pomocą glukometru raz dziennie po przeszczepie. Podczas przesadzania do sieci przeszczep wysp trzustkowych może mieć opóźnioną funkcję i nie osiągać całkowicie normalnego poziomu glukozy we krwi przez 2-3 tygodnie.
- W przypadku badania histologicznego należy usunąć przeszczep omentalny z myszy pod koniec eksperymentu po przeszczepie. Napraw tkankę zgodnie z protokołami histologicznymi. Przeszczep może być analizowany pod kątem barwienia immunologicznego lub badań immunofluorescencyjnych.
2. Alternatywna metoda przeszczepu do sieci
UWAGA: Alternatywny hydrożel fibrynowo-trombinowy, który jest używany w temperaturze pokojowej, może zostać zastąpiony hydrożelem z matrycą błony podstawnej. Składa się z 2 składników, roztworu białka uszczelniającego fibrynę (50 U/ml trombiny i 10 mg/ml fibrynogenu). Po zmieszaniu składniki tworzą skrzep, który utrzymuje wysepki na miejscu.
- Stosować związek hydrożelowy fibryno-tombin w temperaturze pokojowej. Podobnie jak w kroku 1.2, każda mysz otrzyma 450–500 ekwiwalentów wysp trzustkowych (IEQ) na przeszczep. Umieść wysepki w sterylnej probówce typu snap-top o pojemności 1,5 ml ze 100 μl pożywki CMRL-1066. Bezpośrednio przed przeszczepem odessać wyspy trzustkowe do sterylnej rurki PE50 o długości 10 cm i delikatnie odwirować (30 s przy 200 x g), aby utworzyć luźny osad .
- Przygotuj zwierzę, jak opisano powyżej (kroki 1.5-1.8) z rozłożoną siecią zębów. Wymieszać składniki hydrożelu (po 10 μl/każdy) i umieścić na sieci handlowej. (Rysunek 3D)
- Natychmiast wyrzuć wysepki z rurki na hydrożel. Hydrożel tworzy skrzep wokół wysepek. (Rysunek 3E)
- Złóż sieć na hydrożel i wysepki, aby utworzyć torebkę. (Rysunek 3F) Kontynuuj kroki od 1.13 do 1.18.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Stan trzustki po trawieniu przedstawiono na Rysunku 1A. Oczyszczone wysepki przedstawiono na Rysunku 1B. Barwienie dytyzonem oraz testy żywotności wysepek przedstawiono na Rysunku 2. Główne etapy transplantacji wysepek do sieci wielkoprzeponowej przedstawiono na Rysunku 3. Poziomy glukozy we krwi biorców po transplantacji do sieci wielkoprzeponowej przedstawiono na
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przeszczep wysp trzustkowych do wątroby przez żyłę wrotną jest najczęściej stosowaną metodą przeszczepiania wysp trzustkowych u ludzi, ale nadal istnieją obawy dotyczące skuteczności i bezpieczeństwa, takie jak zakrzepica żyły wrotnej i stłuszczenie wątroby17. Ostatnie badania pokazują, że sieć może być odpowiednią alternatywą dla wątroby, ale przed translacją kliniczną należy przeprowadzić więcej badań 12,14,18,19.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów.
Podziękowania
Niektórzy autorzy tej pracy byli częściowo wspierani przez granty z National Key R&D Program of China (2017YFC1103704), Sanming Project of Medicine w Shenzhen (SZSM201412020), Fund for High Level Medical Discipline Construction of Shenzhen (2016031638), Shenzhen Foundation of Science and Technology (JCJY20160229204849975, GJHZ20170314171357556, JCYJ20160425110110658), Shenzhen Foundation of Health and Family Planning Commission (SZXJ2017021).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Sprzęt | |||
| 5 cala (12-13 cm) Nożyczki | RWD Nauki przyrodnicze | S12030-11 | |
| Kleszcze cienkie | RWD Life Science | F11010-13 | |
| Klipsy do małych ran | RWD Life Science | R33003-01 | |
| Acutenaculum | RWD Life Science | F31044-13 | |
| pary kleszczyków do tkanek | RWD Life Science | F13023-10 | |
| 4-0 Szew z igłą | Chenghe, Chiny | 17094 | |
| 200 μ L Pipeta i końcówki | Gilson | PN11 | |
| One Touch ultraeasy Podstawowy system monitorowania stężenia glukozy we krwi | Johnson & Żyletka Johnson | 33391713 | |
| Philips | HC1099/15 | ||
| Materiał i zwierzęta | |||
| Pentobarbital Sód | Sigmaaldrich.com P3761 | Do znieczulenia | |
| Hydrożel | bdbiosciences.com | 356234 | matrycą błony podstawnej |
| Baxter.com | 1501250 | Składniki skrzepają po zmieszaniu | |
| 70% etanolu | Yingniu medical, Anhui, Chiny | 23170608 | |
| Iodophor | Lierkang medical technology, Shangdong, Chiny | 170521 | |
| Sól fizjologiczna zwykła | Baxter.com | 2B1324 | |
| Cefalosporyna | Lukang medical, Shangdong, Chiny | 150303 | |
| Cefazolin | Baxter.com | 2G3508 | |
| smarująca maść do oczu | Główne farmaceutyki | 203964 | |
| streptozotocyna | Sigmaaldrich.com | S0130 | |
| kolagenaza typu V | Sigmaaldrich.com | C9262 | |
| CMRL-1066 media | celltrans, Wenzhou, Chiny | X018D1 | |
| histopaque | Sigmaaldrich.com | 10771 | gęstości |
| rury PE50 | Braintreesci.com | PE50 100 FT | Polietylen .023" x .038 |
| Calcein AM | Sigmaaldrich.com | C1359 | |
| Jodek propidyny | Sigmaaldrich.com | P4864 | |
| optymalna temperatura cięcia związek (OCT) | Tissue-Tek; Miles, Naperville, IL | 4583 | osadzanie pożywki |
| z przeciwciałem przeciwko insulinie | Technologia sygnalizacji komórkowej, Danvers, MA 01923 | 8138S | |
| Technologia sygnalizacji komórkowej, Danvers, MA 01923 | 14166S | ||
| media do barwienia eozyny | Beyotime Biotech, Chiny | C0109 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific Inc. | D1306 | |
| C57Bl/6 Myszy | Centrum Medyczne dla Zwierząt w prowincji Guangdong | / | |
| Surowica bydlęca płodu | GE Healthcare Nauki przyrodnicze | SH30084 | |
| Kolby T175 | Falcon | 353112 | |
| 1,5 ml Probówki zatrzaskowe | Axygen | MCT-150-C |
Bibliografia
- Guariguata, L., et al. Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035. Diabetes research and clinical practice. 103 (2), 137-149 (2014).
- Bellin, M. D., et al. Potent Induction Immunotherapy Promotes Long-Term Insulin Independence After Islet Transplantation in Type 1 Diabetes. American Journal of Transplantation. 12 (6), 1576-1583 (2012).
- Moberg, L., et al. Production of tissue factor by pancreatic islet cells as a trigger of detrimental thrombotic reactions in clinical islet transplantation. The lancet. 360 (9350), 2039-2045 (2002).
- Nilsson, B., Ekdahl, K. N., Korsgren, O. Control of instant blood-mediated inflammatory reaction to improve islets of Langerhans engraftment. Current Opinion in Organ Transplantation. 16 (6), 620-626 (2011).
- Bellin, M. D., et al. Similar islet function in islet allotransplant and autotransplant recipients, despite lower islet mass in autotransplants. Transplantation. 91 (3), 367-372 (2011).
- Bruni, A., Gala-Lopez, B., Pepper, A. R., Abualhassan, N. S., Shapiro, A. J. Islet cell transplantation for the treatment of type 1 diabetes: recent advances and future challenges. Diabetes, metabolic syndrome and obesity: targets and therapy. 7, 211(2014).
- Shapiro, A. J., Pokrywczynska, M., Ricordi, C. Clinical pancreatic islet transplantation. Nature reviews Endocrinology. 13 (5), 268-277 (2017).
- Cantarelli, E., Piemonti, L. Alternative transplantation sites for pancreatic islet grafts. Current diabetes reports. 11 (5), 364(2011).
- Cantarelli, E., et al. Murine animal models for preclinical islet transplantation: no model fits all (research purposes). Islets. 5 (2), 79-86 (2013).
- Beli, E., et al. Erratum to: CX3CR1 deficiency accelerates the development of retinopathy in a rodent model of type 1 diabetes. J Mol Med (Berl). 95 (5), 565-566 (2017).
- Hafner, J., et al. Regional Patterns of Retinal Oxygen Saturation and Microvascular Hemodynamic Parameters Preceding Retinopathy in Patients With Type II Diabetes. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (12), 5541-5547 (2017).
- Schmidt, C. Pancreatic islets find a new transplant home in the omentum. Nature Biotechnology. 35 (1), 82017(2017).
- Voigt, M., et al. Prevalence and Progression Rate of Diabetic Retinopathy in Type 2 Diabetes Patients in Correlation with the Duration of Diabetes. Exp Clin Endocrinol Diabetes. , (2017).
- Baidal, D. A., et al. Bioengineering of an Intraabdominal Endocrine Pancreas. New England Journal of Medicine. 376 (19), 1887-1889 (2017).
- Espes, D., et al. Rapid restoration of vascularity and oxygenation in mouse and human islets transplanted to omentum may contribute to their superior function compared to intraportally transplanted islets. American Journal of Transplantation. , (2016).
- Berman, D. M., et al. Bioengineering the endocrine pancreas: intraomental islet transplantation within a biologic resorbable scaffold. Diabetes. 65 (5), 1350-1361 (2016).
- Delaune, V., Berney, T., Lacotte, S., Toso, C. Intraportal islet transplantation: the impact of the liver micro-environment. Transplant International. 30 (3), 227-238 (2017).
- Espes, D., et al. Rapid restoration of vascularity and oxygenation in mouse and human islets transplanted to omentum may contribute to their superior function compared to intraportally transplanted islets. American Journal of Transplantation. 16 (11), 3246-3254 (2016).
- Hajizadeh-Saffar, E., et al. Inducible VEGF expression by human embryonic stem cell-derived mesenchymal stromal cells reduces the minimal islet mass required to reverse diabetes. Scientific Reports. 5, (2015).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
