Artykuł metodologiczny

Niezbędny wychwyt metali przez bakterie Gram-ujemne: fluorescencja rentgenowska, radioizotopy i frakcjonowanie komórek

10.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57169

⸱

1 lutego 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Graduate Biomedical Sciences Microbiology Theme, University of Alabama at Birmingham, 2Department of Radiology, University of Alabama at Birmingham, 3Office of the Provost, University of Alabama at Birmingham, 4Department of Pharmacology and Toxicology, University of Alabama at Birmingham

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiono protokół ekstrakcji białka opiekuńczego z peryplazmatycznego metalu przejściowego w kontekście jego natywnych partnerów wiążących, oraz biofizyczną charakterystykę zawartości jego substratu za pomocą fluorescencji rentgenowskiej i wychwytu radiometalu.

Streszczenie

Pokazujemy skalowalną metodę oddzielania peryplazmy bakteryjnej od cytoplazmy. Metoda ta jest stosowana do oczyszczania białka peryplazmatycznego w celu charakterystyki biofizycznej i pomiaru transferu substratu między przedziałami peryplazmatycznymi i cytoplazmatycznymi. Poprzez ostrożne ograniczenie czasu, w którym peryplazma jest oddzielona od cytoplazmy, eksperymentator może wyekstrahować interesujące białko i oznaczyć każdy przedział indywidualnie pod kątem substratu bez przenoszenia zanieczyszczenia między przedziałami. Wyekstrahowane białko z frakcjonowania może być następnie dalej analizowane w celu określenia trójwymiarowej struktury lub profili wiązania substratu. Alternatywnie, metodę tę można przeprowadzić po inkubacji z radioznacznikiem w celu określenia całkowitego procentowego wychwytu, a także dystrybucji znacznika (a tym samym transportu metalu) w różnych przedziałach bakteryjnych. Eksperymenty z radioznacznikiem mogą pomóc w rozróżnieniu między substratem fizjologicznym a substratem artefaktowym, takim jak te spowodowane niewłaściwą metallacją.

Fluorescencja rentgenowska może być użyta do wykrycia obecności lub braku inkorporacji metalu w próbce, a także do zmierzenia zmian, które mogą wystąpić podczas inkorporacji metalu jako produktu warunków wzrostu, warunków oczyszczania i/lub warunków krystalizacji. Fluorescencja rentgenowska zapewnia również względną miarę obfitości dla każdego metalu, którą można wykorzystać do określenia najlepszego piku absorpcji energii metalu do wykorzystania do zbierania danych o anomalnym rozpraszaniu promieniowania rentgenowskiego. Wychwyt radiometalu może być wykorzystany jako metoda walidacji fizjologicznej natury substratu wykrytego za pomocą fluorescencji rentgenowskiej, a także jako pomoc w odkrywaniu nowych substratów.

Wprowadzenie

U bakterii Gram-ujemnych, pule cytoplazmatyczne atomów metali przejściowych są zwiększane i uzupełniane przez importery ABC (kasety wiążącej ATP) w błonie wewnętrznej, które łagodzą translokację metalu przez błonę wewnętrzną. Białka wiążące substraty (SBP) w klastrze peryplazmatycznym A-1 tworzą grupę białek opiekuńczych, które bezpośrednio wiążą atomy metalu i transportują je przez peryplazmę, aby dostarczyć je do pokrewnych importerów ABC1. Inne klastry SBP są dedykowane do transportu substratów, takich jak chelatowane metale (klaster A-2), węglowodany (klastry B i D-1) oraz aminokwasy (klastry B, C, F-2 i F-4); niemniej jednak, niezależnie od podłoża, SBP są zgodne z ewolucyjnie zachowaną klasą c-clamp fold2. Uogólniony proponowany mechanizm przenoszenia substratu SBP obejmuje zacisk c poddawany serii wygibasów, które przypominają muchołówkę3. Ogólnie rzecz biorąc, SBP Cluster A-1 oczyszczają się w formie holo (związanej z metalem), chociaż badanie tych SBP jest ograniczone przez trudności w generowaniu form białka apo (wolnych od metalu) do eksperymentów4. Do tej pory strategie badania SBP klastra A-1 apo ograniczały się do mutagenezy, dializ i częściowej denaturacji chelatorem kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA)5,6,7,8,9,10,11. Dane strukturalne pochodzące z tych eksperymentów sugerują, że SBP Gromady A-1 mogą nie podążać dokładnie za mechanizmem muchołówki. Obecnie w piśmiennictwie brakuje metody wytwarzania SBP klastra apo A-1 in vivo przy użyciu fizjologicznych partnerów wiążących.

Po raz pierwszy pokazujemy użycie frakcjonowania komórek do oczyszczenia YfeA, klastra A-1 SBP z Yersinia pestis, czynnika etiologicznego dżumy, który został przekształcony w formę apo poprzez interakcję z fizjologicznym pokrewnym importerem YfeBCDE ABC w komórce. Pokazujemy, że YfeA jest w formie apo za pomocą spektroskopii rentgenowskiej z dyspersją energii (EDS), znanej również jako fluorescencja rentgenowska. Wykazujemy również funkcjonalność YfeBCDE, łącząc frakcjonowanie komórek z bardzo czułymi badaniami wychwytu metali promieniotwórczych, aby odróżnić wychwyt metalu przez błonę zewnętrzną i import metalu przez błonę wewnętrzną. Zastosowanie znacznika radioaktywnego pozwala na detekcję ilości pg/L metali, znacznie niższych niż granica wykrywalności dla technik takich jak spektrometria mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie (ICP-MS) czy atomowa spektroskopia absorpcyjna (AAS). Pozwala to na minimalne zakłócenia badanego systemu. Ponadto wymienione tradycyjne metody często wymagają większych objętości próbek, dodatkowej obróbki końcowej i dłuższych czasów realizacji, co nie jest typowe dla testów radioznacznikowych. W związku z tym użycie radioznacznika zapewnia wygodną i prostą metodę monitorowania rozmieszczenia i wychwytu metalu w komórce. Pozostaje do ustalenia, czy klaster apo A-1 SBP wytworzony przy użyciu tej metody byłby echem obserwacji strukturalnych z obecnych praktyk stosowanych do wytwarzania białka apo.

Frakcjonowanie komórek to sprawdzona metoda rozdzielania kompartmentów komórkowych w celu szczegółowego zbadania ich zawartości w izolacji12. Frakcjonowanie komórek jest powszechnie stosowane do potwierdzania lokalizacji cząsteczki podczas cyklu komórkowego lub mierzenia aktywności określonego przedziału13. Na przykład aktywność transportu metali można oznaczyć, badając przedziały komórkowe pod kątem podłoża metalowego. Integracja frakcjonowania komórek umożliwia rozróżnienie i porównanie między wychwytem metalu przez błonę zewnętrzną a przenoszeniem metalu przez błonę wewnętrzną. Procesy te można następnie mierzyć w czasie. W przypadku oczyszczania białek najczęstszymi metodami lizy komórek i oddzielania składników rozpuszczalnych od nierozpuszczalnych są mechaniczne rozrywanie (tj. mielenie, mieszanie), homogenizacja wysokociśnieniowa (tj. francuska prasa ciśnieniowa, rozbijacz komórek) oraz częstotliwości ultradźwiękowe (tj. sonikacja)14. Stosowanie częstotliwości ultradźwiękowych do lizy komórek jest na ogół najlepiej odpowiednie dla małych objętości; Wiadomo jednak, że sonikacja generuje nadmierne ciepło, które może denaturować białko. Aby uniknąć generowania nadmiernego ciepła, częstotliwości ultradźwiękowe są zwykle stosowane w sekwencyjnych krótkich seriach, które mogą być czasochłonne i nieumyślnie rozkładać cząsteczki DNA na mniejsze fragmenty. Dodatkowo, do eksperymentów przygotowawczych i analitycznych może być wymaganych wiele drogich sond sonizacyjnych, ponieważ każda sonda ma ograniczony zakres objętości próbki, którą można przetworzyć. Zastosowanie wysokiego ciśnienia do lizy komórek pozwala uniknąć generowania nadmiernego ciepła podczas lizy komórek poprzez schładzanie elementów francuskiej prasy ciśnieniowej przed lizą lub obsługę zakłócacza ogniw w zimnym środowisku, takim jak zimne pomieszczenie. Podobnie jak w przypadku sond sonizacyjnych, może być konieczne zakupienie wielu zestawów elementów francuskich pras ciśnieniowych w celu przetworzenia szerokiego zakresu objętości próbek. Francuskie zespoły pras ciśnieniowych są łatwe do podłączenia, ale niewygodne w obsłudze i czyszczeniu, mogą być ciężkie do przenoszenia i są podatne na zatykanie się gęstych próbek. Zalety stosowania częstotliwości ultradźwiękowych i systemów wysokociśnieniowych do lizy komórek obejmują wysoki odzysk próbek, możliwość przetwarzania wielu próbek przy minimalnym zanieczyszczeniu krzyżowym oraz regulowaną siłę ścinającą, którą można dostosować do optymalizacji lizy szerokiej gamy typów próbek. Optymalizacja może nastąpić poprzez dostosowanie częstotliwości ultradźwięków, czasu trwania pęknięć, ciśnienia tłoka funtów na cal kwadratowy (psi) i liczby przejść przez prasę. Zastosowanie mechanicznego rozerwania do lizy komórek może być najbardziej trywialną technicznie i najtańszą strategią lizy komórek. Zakłócenia mechaniczne mogą stanowić wyzwanie w odzyskiwaniu próbek i nie są idealne do przetwarzania wielu próbek. Zakłócenia mechaniczne są łagodniejsze dla próbek niż częstotliwości wysokociśnieniowe lub ultradźwiękowe, ale nie mają dużej przepustowości i są podatne na nieefektywną lizę. Znaczącym eksperymentalnym ograniczeniem zakłóceń mechanicznych, homogenizacji wysokociśnieniowej i częstotliwości ultradźwiękowych jest niekontrolowane zakłócenie całej architektury komórkowej w taki sposób, że po lizie wszystkie wodne składniki komórek są mieszane ze sobą. Co więcej, wszystkie przedziały komórkowe nie zaburzają się w tym samym czasie; W związku z tym zawartość przedziałów, które ulegają wczesnej lizie, może być narażona na ciągłe działania zakłócające dłużej niż zawartość przedziałów, które ulegają późnej lizie. Frakcjonowanie komórek pozwala na niedrogie, technicznie proste i wydajne rozdzielanie zawartości komórek w oparciu o komory, przy jednoczesnym unikaniu konieczności stosowania drogiego sprzętu i narażenia próbki na silne, zakłócające siły.

W przypadku SBP, importowany substrat jest ponownie wprowadzany do potencjalnie białka apo i regeneruje białko holo podczas lizy, przed dalszą chromatografią lub innymi technikami oczyszczania. Włączenie chelatora EDTA podczas lizy stanowi dodatkową przeszkodę, w której powinowactwo do metalu jako pierwszy etap oczyszczania białka nie jest możliwe, ponieważ EDTA usunie metal z żywicy chromatograficznej i zapobiegnie wiązaniu białek15. Prostym i niedrogim rozwiązaniem jest frakcjonowanie komórek przez szok osmotyczny, w którym wirowanie różnicowe i powszechne odczynniki laboratoryjne umożliwiają badaczowi staranną ekstrakcję wystarczającej ilości białka do analizy funkcjonalnej. Frakcjonowanie wstrząsu osmotycznego wykorzystuje dwuetapową zmianę ciśnienia osmotycznego w celu oddzielenia przedziałów komórkowych. Po pierwsze, bufor hipertoniczny powoduje ząbkowanie komórek, gdy woda opuszcza każdą komórkę, a po drugie, bufor hipotoniczny powoduje pęcznienie komórek, gdy woda ponownie dostaje się do każdej komórki. Poprzez staranne kontrolowanie, jak długo komórki pęcznieją, błony zewnętrzne mogą być selektywnie lizowane (z powodu wzrostu ciśnienia osmotycznego z dopływającej wody), opróżniając w ten sposób ich zawartość do buforu. Zachowanie błon wewnętrznych zapewnia, że zawartość cytoplazmatyczna jest zatrzymywana w sferoplastach i jest łatwo oddzielana od zawartości peryplazmatycznej przez wirowanie.

YfeA to polispecyficzny SBP zdolny do wiązania atomów żelaza, manganu i16. Względne proporcje włączonego metalu mogą być zmieniane w zależności od suplementacji metalu podczas wzrostu i oznaczane za pomocą fluorescencji rentgenowskiej, takiej jak dostępna w Argonne National Laboratory's Advanced Photon Source16. Fluorescencja rentgenowska umożliwia badaczowi szybkie profilowanie szerokiego zestawu metali bez konieczności stosowania dużych kryształów o jakości dyfrakcyjnej, a nawet może zbierać dane z osadu białkowego lub roztworu białkowego.

Fluorescencja rentgenowska może szybko ujawnić nieoczekiwane wyniki, takie jak, w tym przypadku, głównym substratem YfeA jest, a nie udokumentowane fizjologiczne substraty żelazo lub mangan16. Jeśli fluorescencja rentgenowska zostanie użyta przed zebraniem danych dotyczących rozpraszania promieniowania rentgenowskiego, może poinformować badacza w projekcie eksperymentalnym, na przykład o tym, które krawędzie energetyczne metalu należy użyć do zbierania danych dotyczących anomalnego rozpraszania promieniowania rentgenowskiego. Równie przydatna jak określenie względnej obfitości metalu, fluorescencja rentgenowska może również określić, czy metal jest nieobecny w próbce, zapewniając szybką metodę oddzielania kryształów zawierających białko apo od białka holo i szacowania siły sygnału metalu bez konieczności czasochłonnego przetwarzania danych. Po zidentyfikowaniu próbki z silnym sygnałem metalowym, dokładną długość fali, która ma być użyta do zbierania danych o anomalnym rozpraszaniu promieniowania rentgenowskiego, można określić za pomocą skanowania anomalnej dyspersji o wielu długościach fal (MAD).

Ten szczegółowy protokół ma na celu pomóc nowym eksperymentatorom w skutecznym przeprowadzaniu frakcjonowania komórek i efektywnym wykorzystaniu sprzętu synchrotronowej linii badawczej do profilowania całkowitej zawartości metalu i postępu w badaniach nad białkami wiążącymi metale.

Protokół

1. Bakteryjna kultura starterowa (Dzień 1)

  1. W skośnej kolbie o pojemności 200 ml zaszczepij 30 ml bulionu Luria Bertani (LB) komórkami Escherichia coli BL21-CodonPlus (DE3)-RIPL zawierającymi plazmid pYFE3 16.
  2. Dodać 30 μl ampicyliny o stężeniu 50 mg/ml do kolby, zasysając pipetą i końcówką o objętości 200 μl. Wstrząsać przez noc z prędkością 225 obr./min w temperaturze 37 °C.

2. Uzupełnione M9 Minimalne przygotowanie podłoża (Dzień 2)

UWAGA: To jest adaptacja z podręcznika Amresco.

  1. Przygotować 6 l płynnej pożywki, postępując zgodnie z następującą procedurą. W kolbie skośnej o pojemności 2 l dodać 10,5 g minimalnej ilości podłoża M9 do 1 litra ultraczystegoH2O. Autoklaw w temperaturze 121 °C przez 20 minut, a następnie schłodzić do temperatury pokojowej.
  2. W asepcie dodać następujące sterylne roztwory suplementów: 2 ml/l 1 M MgSO4, 10 ml/l 20% w/v glukozy, 0,1 ml/l 1 M CaCl2 i 1 ml/l 50 mg/ml ampicyliny. Wykonaj ten krok w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby utrzymać sterylne środowisko. Podgrzać podłoże do temperatury 37 °C.

3. Subkultura bakteryjna

  1. Dodaj 5 ml/l nocnej kultury starterowej do minimalnej ilości podłoża M9, zasysając za pomocą automatycznej pipety i końcówki o pojemności 5 ml. Potrząsać subkulturą w sposób ciągły z prędkością 225 obr./min w temperaturze 37 °C przez 9 godzin
    UWAGA: Podczas tego etapu YfeABCDE ulega nadekspresji przez autoindukcję z jego rodzimego promotora Y. pestis.
  2. Odzyskać komórki przez odwirowanie w temperaturze 4 500 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Ponownie zawiesić komórki w 50 ml lodowatego roztworu buforowego fosforanu (20 mM Na2HPO4 pH 7,6, 50 mM NaCl) przez zasysanie pipetą i końcówką o pojemności 1 ml i zamrozić przez noc w temperaturze -80 °C.

4. Frakcjonowanie komórek (Dzień 3)

  1. Rozmrozić rekompensację w temperaturze 4 °C i komórki osadu w temperaturze 4 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Ponownie zawiesić komórki w 50 ml lodowatego buforu o wysokiej zawartości soli (200 mM Tris-HCl pH 8,0, 400 mM NaCl i 2 mM EDTA) poprzez zasysanie za pomocą automatycznej pipety i końcówki o pojemności 25 ml. Inkubować zawiesinę nad lodem przez 20 minut, od czasu do czasu inwersję w celu wymieszania.
  2. Osadzać komórki w temperaturze 4 500 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Ponownie zawiesić komórki w 50 ml lodowatego buforu o niskiej zawartości soli (10 mM Tris-HCl pH 8,0), zasysając za pomocą automatycznej pipety i końcówki o pojemności 25 ml. Inkubować zawiesinę nad lodem przez 20 minut, od czasu do czasu inwersję w celu wymieszania.
  3. Zawiesić sferoplasty w temperaturze 4 500 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Odzyskać supernatant zawierający peryplazmę. Zawiesić granulowane sferoplasty w buforowanym roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (krok 3.2) przez zasysanie za pomocą automatycznej pipety i końcówki o pojemności 25 ml, a następnie poddać komórki lizie przez trzy cykle francuskiej prasy ciśnieniowej przy ciśnieniu 1500 psi.
    UWAGA: Francuska prasa ciśnieniowa może być niewygodna w obsłudze i wykorzystuje pompę hydrauliczną do napędzania lizy komórek. Zachowaj ostrożność podczas włączania pompy hydraulicznej, upewniając się, że tłok jest prawidłowo wyrównany z prasą i trzymając ręce wolne od pompy hydraulicznej.
  4. Osadzać szczątki komórkowe w temperaturze 50 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Odzyskać supernatant zawierający cytoplazmę. W razie potrzeby błony zewnętrzna i wewnętrzna mogą być dalej frakcjonowane16.

5. Oczyszczanie białek za pomocą FPLC

  1. Bezpośrednio po frakcjonowaniu przefiltrować frakcję peryplazmatyczną za pomocą jednostki membranowej 0,45 μm. Użyj filtra strzykawkowego Luer lock, aby ułatwić i przyspieszyć filtrację. Zrównoważyć 5 ml kolumny wymiany anionów Q przy użyciu 20 mM Tris pH 7,6, 0,05% w/v buforu ładującego NaN3 przy natężeniu przepływu 5 ml / min.
  2. Załadować filtrat peryplazmatyczny na wstępnie zrównoważoną kolumnę wymieniacza anionowego Q o pojemności 5 ml przy użyciu buforu ładującego 20 mM Tris pH 7,6, 0,05% w/v NaN3 o natężeniu przepływu 2 ml / min. Kontynuować płukanie kolumny anionitalnej Q o pojemności 5 ml za pomocą buforu ładującego 20 mM Tris pH 7,6, 0,05% w/v NaN3, aż do osiągnięcia odczytu podstawowego A280 przy natężeniu przepływu 5 ml / min.
  3. Eluować związane białko za pomocą 20 mM Tris pH 7,6, 0,05% w/v NaN3, 0 - 1 M NaCl przez gradient liniowy przez 10 objętości kolumn przy natężeniu przepływu 5 ml / min. Połączyć frakcje zawierające pik A280. Apo YfeA eluuje od 200 mM NaCl do 300 mM NaCl.
  4. Zagęścić eluat za pomocą koncentratora odśrodkowego, aż objętość osiągnie ~5 ml.
  5. Zrównoważyć żelową kolumnę filtracyjną Superdex 200 pg z 20 mM Bis-Tris pH 6,3, 50 mM NaCl, 0,05% w/v NaN3 żelowym buforem filtracyjnym przy natężeniu przepływu 2,5 ml / min.
  6. Załadować skoncentrowany eluat anionowymienny do wstępnie zrównoważonej żelowej kolumny filtracyjnej Superdex 200 pg i oczyścić za pomocą żelowego buforu filtracyjnego z kroku 5.5 przy natężeniu przepływu 2,5 ml/min. Połączyć frakcje zawierające pik A280 odpowiadający białku ~30 kilodaltonów (kDa).
    UWAGA: Poniższe odniesienie jest przykładowym eksperymentem FPLC w celu zademonstrowania protocol17.

6. Krystalizacja białek

  1. Zagęścić eluat z filtracji żelowej za pomocą koncentratora odśrodkowego do końcowego stężenia białka 22 mg/ml.
    1. Obliczyć stężenie białka, dzieląc odczyt A280 przez 1,276 mg/ml. Ten teoretyczny współczynnik ekstynkcji został przewidziany przez ExPASY ProtParam18.
      UWAGA: Odczyt próbki A280 wynoszący 5,104 j.a. odpowiada roztworowi o stężeniu 4,000 mg/ml; 5,104 j.a. ÷ 1,276 mg/ml = 4,00 mg/ml.
  2. Wymieszaj 1,5 μl białka z 1,5 μl 30% w/v PEG 4000, 50 mM NaCl, 20 mM Bis-Tris pH 6,3, 0,05% w/v NaN3 w konfiguracji siedzącej lub wiszącej, zasysając pipetą i końcówką 10 μl.
  3. Inkubacja krystalizacji spada w temperaturze 293 K przez 2 - 4 tygodnie.
  4. Kryształy zamrażania błyskawicznego w zbiorniku ciekłego azotu do transportu do synchrotronu.

7. Fluorescencja rentgenowska (przy użyciu oprogramowania GM/CA Beamline)

  1. Przejdź do zakładki Hutch. Użyj podtytułu Energia, aby ustawić energię na 10,0 keV.
  2. Przejdź do zakładki Skanowanie. Przejdź do zakładki Interaktywne. Zamontuj próbkę.
  3. Wybierz opcję Optymalizuj sygnał fluorescencji. Wprowadź 4.00 s w podtytule Czas. Wybierz opcję Weź widmo fluorescencji. Wyświetlanie widma za pomocą karty Wykres.

8. Skanowanie MAD w poszukiwaniu piku absorpcji energii metalu (przy użyciu oprogramowania GM/CA Beamline)

  1. Przenieś próbkę poza belkę. Przejdź do zakładki Skanowanie. Przejdź do zakładki Układ okresowy pierwiastków. Wybierz krawędź K interesującego nas elementu.
    UWAGA: Wartość energii w podpozycji Energia jest wyrażona w eV.
  2. Przejdź do zakładki Budka. Użyj nagłówka podrzędnego Energia, aby ustawić wartość energii w kroku 8.1 w keV.
  3. Przenieś próbkę do belki. Przejdź do zakładki Skanowanie. Przejdź do zakładki Auto. Wprowadź 2.00 s pod podnagłówkiem Czas.
  4. Wybierz opcję Rozpocznij skanowanie. Wyświetl skanowanie MAD za pomocą karty Wykres.
    UWAGA: Wartość energii w podpozycji Szczyt jest wyrażona w eV, a nie w keV.
  5. Wybierz opcję Gotowe z fluorescencją.
  6. Odsunąć próbkę od belki. Przejdź do zakładki Hutch. Użyj podtytułu Energia, aby ustawić wartość energii w kroku 8.4 zaokrągloną w górę do następnej eV (tj. Szczyt: 9658.3 eV, ustaw Energia na 9659 eV).
  7. Przenieś próbkę do belki. Zbierz zestaw danych. Powtórz kroki 8.1 - 8.6 dla wszystkich interesujących Cię metali.

9. Protokół analityczny do oznaczania absorpcji metali promieniotwórczych

  1. W probówce hodowlanej o pojemności 14 ml zaszczepij 5 ml LB komórkami E. coli BL21-CodonPlus (DE3)-RIPL zawierającymi plazmid pYFE3 16. Dodać 5 μl ampicyliny o stężeniu 50 mg/ml, zasysając pipetą i końcówką o objętości 10 μl. Wytrząsać przy 225 obr./min w temperaturze 37 °C przez 7 godzin.
  2. Granulować komórki w temperaturze 15 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej za pomocą wirówki stołowej. Umyj komórki w 1 ml uzupełnionej minimalnej ilości pożywki M9, zasysając pipetą i końcówką o pojemności 1 ml. Powtórz raz.
  3. W stożkowej probówce o pojemności 50 ml subkultura komórek w 30 ml uzupełniła minimalną pożywkę M9 poprzez zasysanie pipetą i końcówką o pojemności 1 ml. Wytrząsać przy 225 obr./min w temperaturze 37 °C przez 9 godzin.
  4. Określ ilość radioaktywności wymaganą do osiągnięcia około 100 000 zliczeń na minutę (cpm).
    UWAGA: Będzie się to różnić w zależności od radioizotopu i instrumentu użytego do wykrywania. Na przykład próbka zawierająca 7,4 kilobekereli (kBq) (0,2 mikrocurie (μCi)) o wielkości 52Mn daje odczyt 550 000 cpm na automatycznym detektorze gamma (NaI). W ten sposób ilość radioaktywności potrzebną do uzyskania liczby 100 000 cpm można określić za pomocą następującego równania: (100 000 cpm/550 000 cpm)*7,4 kBq (0,2 μCi) = 1,35 kBq (0,036 μCi).
    Uwaga: Rozpad promieniotwórczy powoduje uwolnienie promieniowania jonizującego, które jest niebezpieczne. Podczas pracy z promieniotwórczością zawsze używaj odpowiedniego ekranowania i postępuj zgodnie z zasadami ALARA, tak niskimi, jak rozsądnie osiągalne (ALARA), zwiększając odległość i ekranowanie przy jednoczesnym skróceniu czasu ekspozycji. Tylko przeszkolony personel powinien zajmować się radioaktywnością w specjalnie wyznaczonych laboratoriach, które są licencjonowane do stosowania materiałów promieniotwórczych.
  5. Pomnóż wymaganą radioaktywność obliczoną w kroku 9.4 przez całkowitą objętość subkultury, aby określić całkowitą ilość radioaktywności niezbędnej. Dodaj tę ilość (najlepiej w małej objętości 50 - 100 μL) do probówki zawierającej subkulturę, tak aby było 100 000 cpm/ml i dobrze wiruj przez 30 s.
    UWAGA: Dla 31 ml subkultury całkowita wymagana ilość radioaktywności wynosi 1,35 kBq (0,036 μCi) x 31 ml = 41,3 kBq (1,12 μCi).
  6. Podzielić 1 ml subkultury (obecnie zawierającej radioaktywny znacznik) do pojedynczych probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml poprzez zasysanie pipetą i końcówką o pojemności 1 ml i umieścić w termomikserze o temperaturze 37°C, z wirowaniem w ilości 1 × g. Dołączyć wystarczającą liczbę probówek, aby na każdy pożądany pomiar przypadały trzy powtórzenia, jak również trzy dodatkowe powtórzenia do użycia jako wzorce (odłożyć wzorce na bok, NIE wykonywać testu frakcjonowania na wzorcach).
    UWAGA: Oznaczanie po 1, 2 i 4 godzinach wymagałoby łącznie 12 probówek.
  7. Po inkubacji odwirować probówki o masie 15 000 × g przez 30 s za pomocą wirówki stołowej (najlepiej schłodzonej do 4 °C) i odrzucić supernatanty.
  8. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml lodowatego buforu o wysokiej zawartości soli (krok 4.1), zasysając pipetą i końcówką o pojemności 1 ml, a następnie natychmiast umieścić na lodzie na 20 minut.
  9. Ponownie zagnieździć komórki w temperaturze 15 000 × g przez 30 s za pomocą wirówki stołowej (najlepiej schłodzonej do temperatury 4 °C) i odrzucić supernatanty.
    UWAGA: Supernatant zawiera niezwiązany wolny metal.
  10. Ponownie zawiesić komórki w lodowatym buforze o niskiej zawartości soli (krok 4.2), zasysając pipetą i końcówką o pojemności 1 ml, a następnie inkubować na lodzie przez 20 minut
    UWAGA: Na tym etapie ważne jest, aby delikatnie zassać za pomocą pipety.
  11. Osadzać komórki w ilości 15 000 × g przez 30 s i zebrać każdy z supernatantów do nowych probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml. W każdym punkcie czasowym powinno być teraz sześć probówek.
    UWAGA: Supernatant zawiera frakcję peryplazmatyczną, a osad zawiera frakcję błoniastą i cytoplazmatyczną. Osad nazywamy frakcją cytoplazmatyczną.
  12. Zmierz radioaktywność w każdej frakcji (sześć probówek na punkt czasowy), a także w wzorcach odłożonych na bok w kroku 9.6. Ilość promieniotwórczości w wzorcach należy wykorzystać do określenia całkowitej ilości promieniotwórczości pierwotnie dodanej do każdej próbki.
  13. Aby określić procentowy wychwyt promieniotwórczy w peryplazmie, należy użyć następującego równania: (Średnia cpm frakcji peryplazmatycznej/średnia cpm wzorców) x 100.
  14. Aby określić procentowy wychwyt promieniotwórczy w cytoplazmie, należy użyć następującego równania: (Średnia cpm frakcji cytoplazmatycznej/średnia cpm wzorców) x 100.
  15. Aby określić % całkowitego wychwytu, należy użyć następującego równania: ((Średnia cpm frakcji peryplazmatycznej + średnia cpm odpowiedniej frakcji cytoplazmatycznej)/(średnia cpm wzorców)) x 100.

Wyniki

W celu oceny jakości oczyszczania białka z preparatywnego frakcjonowania periplazmy zebrano chromatogramy z żelu SDS-PAGE oraz filtracji żelowej. Oczyszczanie holo YfeA zostało opisane wcześniej16; jednak oczyszczanie apo YfeA nie zostało dotąd zgłoszone. Strategia oczyszczania apo YfeA opisana w tej metodzie wykorzystuje rekombinowany konstrukt typu dzikiego, który nie zawiera żadnego znacznika powinowactwa, w szczególności takiego, który mógłby zostać użyty do immunoblotingu białek (t.j. znacznik His), a przeciwciało monoklonalne rozpoznające YfeA nie zostało opisane. Dlatego w celu weryfikacji oczyszczania YfeA wykorzystano analizę spektrometrii mas. Aby oczyścić YfeA poprzez frakcjonowanie, zaleca się zastosowanie liniowego gradientu elucji w chromatografii wymiany anionowej (Rycina 1). Liniowy gradient elucji znacząco poprawia wzbogacenie YfeA, zwiększając jego udział z około 8% we frakcji periplazmy do 49% w produkcie wymiany anionowej, zgodnie z obliczeniami densytometrycznymi (Rycina 1C). Skład ten poprawia się do 61% dzięki filtracji żelowej, a objętość elucji białka apo jest identyczna z objętością elucji białka holo (Rycina 2). Analiza spektrometrii mas potwierdza oczyszczanie YfeA poprzez wykrycie 92,5% sekwencji aminokwasowej YfeA, łącznie 246 widm polipeptydowych YfeA, 24 unikalnych peptydów oraz 50 unikalnych widm polipeptydowych. Alternatywnie, aby zestawić produkt z gradientu liniowego z produktem z elucji gradientem skokowym, YfeA oczyszczono metodą wymiany anionowej, stosując etap płukania 50 mM NaCl, a następnie etap elucji 250 mM NaCl (Rycina 1D). Gradient skokowy nieznacznie wzbogaca YfeA, zwiększając jego udział z 17% we frakcji periplazmy do 18% w produkcie wymiany anionowej, zgodnie z obliczeniami densytometrycznymi. Elucja gradientem skokowym powoduje również wzbogacenie pasma białka zanieczyszczającego, które spektrometria mas zidentyfikowała jako zawierające wiele białek SBP E. coli o podobnej masie cząsteczkowej. Ze względu na ograniczenia rozdzielczości kolumny HiLoad 26/600 Superdex 200 pg oraz podobieństwo mas cząsteczkowych i struktur zanieczyszczających białek SBP, filtracja żelowa nieznacznie poprawiła wzbogacenie YfeA do 20% produktu filtracji żelowej. W przypadku, gdy zastosowanie liniowego gradientu elucji w wymianie anionowej nie jest możliwe, zaleca się przetestowanie wielokrotnych płukań skokowych w przyrostach 25 - 50 mM NaCl, aby zidentyfikować stężenie NaCl niezbędne do usunięcia tych zanieczyszczeń.

Oczyszczone formy apo i holo YfeA krystalizują w tych samych warunkach krystalizacji, choć obrazy morfologii kryształów apo i holo YfeA wykazują różnice w ich wzroście pomiędzy stanem apo a holo YfeA (Rysunek 3). Oprócz weryfikacji za pomocą spektrometrii mas, dane z dyfrakcji rentgenowskiej (nie pokazane), zebrane z kryształów wyhodowanych z białka oczyszczonego tą metodą, potwierdziły oczyszczanie i krystalizację YfeA. Zakres zanieczyszczenia przedziałów (cynk cytoplazmatyczny przekształcający białko apo w holo w frakcji peryplazmatycznej) można ocenić poprzez rejestrację widm fluorescencji rentgenowskiej (Rysunek 4). Biorąc pod uwagę, że cynk jest głównym substratem wiążącym się z rekombinacyjnym YfeA16, widma fluorescencji rentgenowskiej pozwalają na szybkie rozróżnienie między próbką YfeA zawierającą silny sygnał cynku odpowiadający holo YfeA (Rysunek 4A), co wskazuje na zanieczyszczenie krzyżowe, a słabym sygnałem cynku sugerującym apo YfeA i minimalne zanieczyszczenie krzyżowe (Rysunek 4B). Analiza ICP-MS minimalnego medium M9 potwierdziła, że poziomy metali przejściowych znajdują się w zakresie submikromolarnym (nie pokazane); w związku z tym po pomyślnym frakcjonowaniu należy spodziewać się wykrycia jedynie minimalnych ilości metali przejściowych. Frakcjonowanie analityczne (Rysunek 5) może być wykorzystane do pomiaru szybkości transportu radiometali i pozyskiwania danych funkcjonalnych. 60-minutowa analiza porównawcza frakcji peryplazmatycznych i cytoplazmatycznych komórek E. coli wykazujących ekspresję wyłącznie YfeA, pełnego transportera YfeABCDE oraz żadnego z komponentów YfeABCDE ujawnia skutki ekspresji pojedynczego rekombinowanego białka lub kompleksu białkowego dla poboru metali (Rysunek 6). Komórki E. coli niewykazujące ekspresji żadnego białka rekombinowanego przetransportowały do cytoplazmy około połowę dodanego do medium 52Mn, przy minimalnej retencji w peryplazmie. Ta kontrola negatywna reprezentuje endogenny transport manganu. Komórki E. coli wykazujące ekspresję rekombinacyjnego YfeA przetransportowały do cytoplazmy około jednej czwartej dodanego do medium 52Mn, a kolejną ćwierć zatrzymały w peryplazmie. Retencja manganu w peryplazmie i ograniczony transport do cytoplazmy demonstrują zapotrzebowanie metaboliczne oraz wąskie gardło wynikające z produkcji YfeA wobec braku transportera Yfe. Komórki E. coli wykazujące ekspresję rekombinacyjnego transportera YfeABCDE przetransportowały prawie 100% dodanego do medium 52Mn do cytoplazmy przy minimalnej retencji w peryplazmie. Zwiększony transport manganu do cytoplazmy ilustruje wkład transportera Yfe w transport manganu.

Proces wzbogacania YfeA; elektroforeza białek w żelu, etapy oczyszczania i wykresy analizy.
Rycina 1. Oczyszczanie YfeA poprzez frakcjonowanie. A. Hipotetyczny model transportera Yfe. B. Żel SDS-PAGE z oczyszczania YfeA z frakcji peryplazmatycznej przy użyciu elucji z gradientem liniowym z wymiany anionowej. Żel SDS-PAGE pokazuje wzbogacenie YfeA (30 kDa) w kolejnych etapach oczyszczania. Czarna strzałka oznacza pozycję migracji elektroforetycznej YfeA. Standardy masy cząsteczkowej pokazane po prawej stronie. (1) Frakcja peryplazmatyczna. (2) Przebieg przez kolumnę wymiany anionowej Q. (3) Elucja piku z kolumny wymiany anionowej Q. (4) Pik z kolumny do filtracji żelowej Superdex 200 pg. C. Wzbogacanie YfeA – przykład prawidłowy. Przetwarzanie obrazu żelu SDS-PAGE z punktu B pozwala obliczyć za pomocą densytometrii całkowite wzbogacenie YfeA, które wzrosło z 8% frakcji peryplazmatycznej do 61% produktu filtracji żelowej. Niebieskie ramki wskazują sygnał YfeA/całkowity użyty do obliczeń densytometrycznych. Analiza spektrometrii mas prążka w ramce w ścieżce 4 wykazała obecność 259/280 aminokwasów YfeA, zaznaczonych kolorem zielonym. Aminokwasy obecne w dojrzałym polipeptydzie są przedstawione pogrubioną, wielką czarną czcionką, a aminokwasy tworzące odcięty peptyd sygnałowy są przedstawione kursywą, małą szarą czcionką. D. Wzbogacanie YfeA – przykład nieprawidłowy. Żel SDS-PAGE z oczyszczania YfeA z frakcji peryplazmatycznej przy użyciu elucji z gradientem skokowym z wymiany anionowej. Żel SDS-PAGE pokazuje wzbogacenie YfeA w kolejnych etapach oczyszczania. Czarna strzałka oznacza pozycję migracji elektroforetycznej głównego zanieczyszczenia białkowego, które nasiliło się podczas chromatografii wymiany anionowej. Standardy masy cząsteczkowej pokazane po prawej stronie. (1) Pik z kolumny do filtracji żelowej Superdex 200 pg. (2) Elucja z gradientem skokowym 250 mM NaCl z kolumny wymiany anionowej Q. (3) Frakcja peryplazmatyczna. Przetwarzanie obrazu żelu SDS-PAGE z punktu D pozwala obliczyć za pomocą densytometrii marginalne całkowite wzbogacenie YfeA do maksymalnie 20% produktu filtracji żelowej. Niebieskie ramki wskazują sygnał YfeA/całkowity użyty do obliczeń densytometrycznych. Analiza spektrometrii mas prążka oznaczonego czarną strzałką w ścieżce 1 wykazała 26 unikalnych peptydów LivJ (39 kDa), 25 unikalnych peptydów EfeO (41 kDa) i 17 unikalnych peptydów LivK (39 kDa). Wszystkie trzy zanieczyszczenia są peryplazmatycznymi SBP E. coli. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Wykres chromatografii filtracyjnej żelowej; A280 vs. Ve; rozdział białek; kontrast holo vs. apo.
Rysunek 2. Chromatogramy filtracji żelowej apo YfeA i holo YfeA. Czarna strzałka oznacza pozycję objętości martwej. Piki filtracji żelowej dla apo YfeA (krzywa czarna) i holo YfeA (krzywa niebieska) pokazują, że oba stany białka elują przy tej samej objętości elucji, co wskazuje, że apo YfeA oczyszczone z frakcji peryplazmatycznej ma podobny promień hydrodynamiczny jak holo YfeA oczyszczone z całkowitej zawartości komórkowej po zastosowaniu prasy francuskiej.

Obraz z mikroskopu krystalografii białek; kryształy Holo-YfeA i Apo-YfeA, skala 30 µm.
Rycina 3. Morfologia kryształów Apo YfeA i holo YfeA. Holo YfeA krystalizuje w postaci kryształu monolitycznego, podczas gdy apo YfeA w tych samych warunkach krystalizacji zazwyczaj tworzy kryształy bliźniacze. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykresy widm fluorescencji; energia emisji względem liczby zliczeń, pokazujące piki Zn, Mn i Fe.
Rysunek 4. Widma fluorescencji rentgenowskiej apo-YfeA i holo-YfeA. A. Widma fluorescencji rentgenowskiej holo-YfeA oczyszczonego z minimalnego medium M9 bez dodatkowej suplementacji metalami przejściowymi, krzywa zielona. Oznaczono charakterystyczne piki dla manganu, żelaza i cynku. B. Widma fluorescencji rentgenowskiej z próbki YfeA otrzymanej w kontekście YfeBCDE. Oznaczono charakterystyczne piki dla manganu, żelaza i cynku. Krzywa niebieska. Widma fluorescencji rentgenowskiej YfeA oczyszczonego w kontekście YfeBCDE po skutecznym frakcjonowaniu frakcji peryplazmatycznej z minimalnym zanieczyszczeniem cytoplazmatycznymi metalami przejściowymi i/lub białkiem holo-YfeA. Krzywa czerwona. Widma fluorescencji rentgenowskiej YfeA oczyszczonego w kontekście YfeBCDE po nieskutecznym frakcjonowaniu z powodu nadmiernej lizy i znacznym zanieczyszczeniem cytoplazmatycznymi metalami przejściowymi i/lub białkiem holo-YfeA. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat wirowania: etapy resuspensji w buforze; zbieranie supernatantu, frakcja periplazmatyczna.
Rysunek 5. Ogólny schemat postępowania w procesie frakcjonowania. Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Wykres słupkowy przedstawiający rozkład Mn-52 w periplazmie i cytoplazmie; warunki: Brak YfeA, YfeABCDE, YfeA.
Rycina 6. Dane z frakcjonowania poboru radioaktywnego metalu po 60 min. Każdy eksperyment przeprowadzono trzykrotnie, a słupki błędów oznaczają odchylenie standardowe. Czerwony słupek. Komórki E. coli, które nie zawierają transportera Yfe, transportują około ~50% 52Mn do cytoplazmy po 60 minutach i utrzymują niski poziom 52Mn w periplazmie. Niebieski słupek. Komórki E. coli zawierające transporter Yfe transportują >90% 52Mn do cytoplazmy po 60 minutach i utrzymują niski poziom 52Mn w periplazmie. Zielony słupek. Komórki E. coli zawierające tylko YfeA transportują około ~25% 52Mn do cytoplazmy i zatrzymują ~25% 52Mn w periplazmie po 60 minutach.

Radiometal zastosowany w niniejszej pracy, 52Mn (t1/2 = 5,59 d), został otrzymany w UAB Cyclotron Facility (Birmingham, AL) poprzez bombardowanie protonami naturalnego tarczy Cr i oczyszczony zgodnie z wcześniejszymi opisami19. Uwaga: 52Mn jest emitorem pozytonów (β+avg = 242 keV, 29,4%) i emituje również kilka wysokoenergetycznych promieni gamma o wysokiej intensywności (Eγ = 744,2, 935,5, 1434,0 keV; I = 90,0%, 94,5%, 100%). Z tych powodów eksperyment musi być przeprowadzony zgodnie z zasadami ochrony radiologicznej ALARA, opisanymi powyżej. Wszystkie elementy uznane za odpady radioaktywne powinny być odpowiednio zabezpieczone, wyraźnie oznakowane i utylizowane zgodnie z ustalonymi procedurami.

Dyskusja

Frakcjonowanie komórek jest użytecznym narzędziem do specyficznego badania zawartości przedziału komórkowego i może służyć jako przydatne narzędzie do ekstrakcji małych cząsteczek, takich jak atomy metali, a także makrocząsteczek, takich jak białka. Warto zauważyć, że frakcjonowanie komórek nie jest techniką absolutną i może być podatne na błędy bez zwrócenia szczególnej uwagi na mieszanie/ponowne zawieszenie, temperaturę inkubacji i czas inkubacji. Niepełne wymieszanie może skutkować minimalną lizą błonową, a tym samym znikomym frakcjonowaniem, frakcjonowanie w temperaturze pokojowej może spowodować szybką lizę obu błon, powodując zanieczyszczenie frakcji peryplazmatycznej zawartością cytoplazmatyczną, a wydłużony czas inkubacji może również powodować nadmierną lizę, a tym samym zanieczyszczenie frakcji. Rozsądnym kompromisem dla osiągnięcia wydajnej i stosunkowo pełnej lizy błony zewnętrznej (przy jednoczesnym zachowaniu błony wewnętrznej) jest 20-minutowa inkubacja nad lodem w hipotonicznym buforze frakcjonującym. Inną kwestią jest metoda ekstrakcji, w której ostra ekstrakcja przez wytrząsanie lub wirowanie może pogorszyć jakość ekstraktu, powodując agregację białek. Zaleca się delikatne mieszanie, np. szpatułką, inwersją lub zasysaniem pipetą, w celu utrzymania wysokiej jakości materiału do dalszej analizy. Oczyszczanie z preparatywnego frakcjonowania komórek może odbywać się ze zmienną wydajnością, jak pokazano na rysunku 1. W jednym eksperymencie YfeA rozpoczęła się jako 8% wyekstrahowanej zawartości peryplazmatycznej (ryc. 1C), podczas gdy w innym eksperymencie YfeA rozpoczęła się jako 17% zawartości peryplazmatycznej (ryc. 1D). Różnice te mogą wynikać z kilku powodów, takich jak zmienne warunki ekspresji (dodanie EDTA do pożywki wzrostowej może zwiększyć ekspresję genów regulowanych przez mechanizmy głodu, takie jak regulacja futra promotora Yfe), wielokrotne stosowanie zamrożonych trwałych zapasów i błąd ludzki. Zamiast dostosowywać czas inkubacji, zaleca się zwiększenie skali preparatu. Zaleca się oczyszczanie z frakcji peryplazmowej w celu uwzględnienia elucji w gradionym przepływie liniowym z etapu chromatografii anionowymiennej. Elucja w gradionym skoku to strategia elucji, która wykorzystuje dyskretne i nagłe zmiany w składzie fazy ruchomej (tj. 0 mM NaCl, 50 mM NaCl, 150 mM NaCl itp.). Elucja w gradinie liniowym to strategia elucji, która wykorzystuje stopniową zmianę składu fazy ruchomej (tj. 0 mM NaCl, 5 mM NaCl, 10 mM NaCl itp.). Gradient krokowy jest przydatny do oddzielania cząsteczek o różnym powinowactwie do fazy stacjonarnej, a elucja gradientowa liniowa jest przydatna do rozdzielania cząsteczek o podobnym powinowactwie do fazy stacjonarnej. W przypadku białka oczyszczającego bez sztucznego znacznika oczyszczającego (w celu zwiększenia powinowactwa do fazy stacjonarnej) z przedziału komórkowego, który jest bogaty w unikalne gatunki białek, zaleca się elucję w gradiencie liniowym w celu oddzielenia białek niebędących przedmiotem zainteresowania, które mogą mieć podobne powinowactwo do fazy stacjonarnej jak białko będące przedmiotem zainteresowania. Ogólnie rzecz biorąc, oczekuje się plonu 1 - 2 mg oczyszczonego apo YfeA z każdego litra kultury wyrażającej YfeA z jej endogennego promotora Y. pestis .

Fluorescencja rentgenowska to technika, która umożliwia badaczowi szybkie określenie zawartości metalu w próbce i poinformowanie badacza o nieoczekiwanym włączeniu metalu, które w innym przypadku byłoby nieznane. Chociaż EDTA jest zawarty w hipertonicznym buforze frakcjonującym w celu usunięcia luźno związanego lub wolnego metalu, YfeA pochodzący z frakcji peryplazmowej może zawierać pewną ilość białka holo. Biorąc pod uwagę, że transport metali jest procesem dynamicznym, być może zawartość białka holo pochodzi z YfeA, który jeszcze nie przekazał swojego ładunku YfeBCDE. Warto zauważyć, że fluorescencja rentgenowska mierzy tylko całkowitą zawartość metalu i nie wskazuje, czy metal jest uporządkowany w sieci krystalicznej, czy też jest specyficznie związany z białkiem. Aby określić, czy metal jest uporządkowany w sieci krystalicznej i/lub specyficznie związany z cząsteczką białka, wymagane jest gromadzenie i przetwarzanie danych dotyczących rozpraszania promieniowania rentgenowskiego. Niemniej jednak fluorescencja rentgenowska pozwala na szybką ocenę próbki pod kątem zanieczyszczenia metalami i/lub resztkowej integracji białek holologicznych. Czas promieniowania synchrotronowego jest ograniczony i nie zawsze jest czas na opracowanie strategii zbierania danych o rozpraszaniu promieniowania rentgenowskiego na każdej próbce, dlatego fluorescencja rentgenowska jest cenną techniką badania przesiewowego wielu kryształów i ustalania priorytetów, dla których próbek należy zebrać dane dotyczące rozpraszania promieniowania rentgenowskiego. Ponadto fluorescencja rentgenowska umożliwia zbieranie danych z próbek, które mogą nie ulegać dyfrakcji promieniowania rentgenowskiego. Podczas zbierania danych o fluorescencji rentgenowskiej czasami sygnał może być bardzo słaby, a wynikowe widma mało pouczające. Aby poprawić siłę sygnału, zarówno w przypadku fluorescencji rentgenowskiej, jak i skanowania MAD, należy rozważyć wydłużenie czasu ekspozycji i/lub zmniejszenie tłumienia wiązki promieniowania rentgenowskiego. Gdy próbka zostanie zidentyfikowana do zbierania danych o rozpraszaniu promieniowania rentgenowskiego, zaleca się zebranie danych o rozpraszaniu promieniowania rentgenowskiego na innej części próbki niż ta, która została użyta do fluorescencji rentgenowskiej i skanowania MAD, w celu zminimalizowania uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem, poprawy jakości zbierania danych i zminimalizowania potencjału redukcji sygnału anomalnego.

Wykrywanie znaczników promieniotwórczych wymaga nanomolowych ilości materiału lub mniejszych, a zastosowanie tych znaczników jako środków śledzenia molekularnego zapewnia prostą i bardzo czułą metodę sondowania procesów komórkowych. Opisany powyżej test radiometalowy może być wykorzystany do określenia całkowitego wychwytu metalu, dystrybucji w przedziałach komórkowych, a także szybkości wychwytu. Rzeczywiście, każdy punkt czasowy danych wymaga 40-minutowego frakcjonowania; jednakże, po osiągnięciu każdego punktu czasowego, komórki są natychmiast granulowane i inkubowane w buforze o wysokiej zawartości soli (Rysunek 5, Krok 1). Pomiary radiometali w pożywce, odrzuconym buforze o wysokiej zawartości soli (Rysunek 5, Krok 1) oraz frakcjach peryplazmatycznych i cytoplazmatycznych po (Rysunek 5, Krok 3) wskazują, że inkubacja buforu o wysokiej zawartości soli skutecznie usuwa wszystkie pozostałe niezwiązane wolne metale, które pozostały po początkowym odwirowaniu po osiągnięciu punktu czasowego. Wstępne wirowanie usuwa większość (do 80%) niezwiązanego wolnego metalu, a odwirowanie po inkubacji w buforze o wysokiej zawartości soli usuwa również dodatkowe pozostałe niezwiązane wolne metale. Oczekuje się, że pozostały niezwiązany wolny metal nie wpłynie znacząco na transport metalu podczas 40-minutowego frakcjonowania. Wpływ 40-minutowego frakcjonowania na wewnątrzkomórkowy transport metali jest kolejnym czynnikiem wpływającym na ostrożną interpretację danych. Praktycznie cały protokół frakcjonowania odbywa się nad lodem, z wyjątkiem 30-sekundowego wirowania między etapami. Eksperymenty z biegiem czasu transportu metali wykazały, że utrzymywanie komórek w temperaturze 4 °C znosi transport metalu 20,21,22; W związku z tym, ponieważ eksperymenty odbywają się nad lodem, nie oczekuje się, że 40-minutowe frakcjonowanie znacząco zwiększy poziom metali w peryplazmie cytoplazmy i oczekuje się, że poziomy metali będą reprezentatywne dla punktów czasowych, w których komórki zostały początkowo odwirowane.

Określenie względnego wychwytu w różnych przedziałach komórkowych może pomóc w dostarczeniu danych XFS, potwierdzić fizjologiczną naturę substratu, a także umożliwić badaczowi dalsze badanie szczegółów molekularnych mechanizmu. Na przykład dodanie mutagenezy genetycznej do eksperymentów z wychwytem radiometali stanowi bezpośrednią metodę wzmacniania kluczowych reszt funkcjonalnych lub cząsteczek biorących udział w transporcie substratu. Zalety eksperymentów i analiz wychwytu radiometali obejmują szybki zwrot, wysoką przepustowość, wysoką odtwarzalność i równoległość eksperymentów porównujących warunki wzrostu i konstrukty genetyczne.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konfliktu interesów.

Podziękowania

Dane zostały również zebrane w GM/CA@APS, które zostało sfinansowane w całości lub w części z funduszy federalnych z National Cancer Institute (ACB-12002) i National Institute of General Medical Sciences (AGM-12006). W badaniach wykorzystano zasoby Advanced Photon Source (APS), Biura Użytkowników Nauki Departamentu Energii Stanów Zjednoczonych (DOE) obsługiwanego dla Biura Nauki DOE przez Argonne National Laboratory na podstawie umowy nr 1. DE-AC02-06CH11357. Wykorzystanie Zaawansowanego Źródła Fotonów było wspierane przez Departament Energii Stanów Zjednoczonych, Biuro Nauki, Biuro Podstawowych Nauk Energetycznych, w ramach kontraktu nr W-31-109-Eng-38.

Chcielibyśmy podziękować UAB Comprehensive Cancer Center - Mass Spectrometry/Proteomics Shared Facility (P30CA13148-38) za pomoc w analizie spektrometrii mas.

C.D.R. był wspierany przez grant z University of Alabama w Birmingham Office of Diversity, Equity, and Inclusion. L.L.R. był wspierany przez Wydział Radiologii Uniwersytetu Alabama w Birmingham. Departament Energii, Biuro Nauki, Program Izotopowy wsparł produkcję 52Mn i A.V.F.M. w ramach grantu DESC0015773.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Chemicals
Glikol polietylenowy 4000, EMD MilliporeFisherM1097270100
Sól sodowa ampicyliny (krystaliczny proszek)FisherBP1760-5
AMRESCO M9 Średni bulionFisherNC9688886
Bis-tris, Fisher BioReagentsFisherBP301-100
Chlorek wapnia dwuwodny (certyfikowany ACS)FisherC79-500
Dekstroza (D-glukoza) bezwodna (granulowany proszek/certyfikowany ACS)FisherD16-500
Kwas etylenodiaminotetraoctowy, sól disodowa dwuwodna (krystaliczna / certyfikowana ACS)FisherS311-100
Fisher BioReagents Podłoża mikrobiologiczne: LB Broth, MillerFisherBP1426-500
Siarczan magnezu siedmiowodny (krystaliczny / certyfikowany ACS)FisherM63-500
Azek sodu, biały proszekFisherBP922I-500
Chlorek sodu (krystaliczny / certyfikowany ACS)FisherS271-500
Fosforan sodu dwuzasadowy bezwodny (granulowany lub w proszku / certyfikowany ACS)FisherS374-500
Chlorowodorek Tris (małe białe płatki/biologia molekularna)FisherBP153-500
NazwaFirmaNumer katalogowyUwagi
Equipment
Cryschem PlateHamptonHR3-158
Filtry odśrodkowe EMD Millipore Amicon Ultra-15FisherUFC903024
EMD Millipore Millex Sterylne filtry strzykawkowe: Membrana Durapore PVFDFisherSLHV013SL
GE Healthcare HiLoad 26/600 Superdex 200 pgFisher28-9893-36
GE Healthcare HiTrap IEX HP Kolumny fabrycznie zapakowaneFisher17-1154-01
NazwaFirmaNumer katalogowyUwagi
Cells
Agilent Technologies BL21-CODON PLUS RIPL CELLSFisher230280

Bibliografia

  1. ter Beek, J., Guskov, A., Slotboom, D. J. Structural diversity of ABC transporters. J Gen Physiol. 143 (4), 419-435 (2014).
  2. Berntsson, R. P., Smits, S. H., Schmitt, L., Slotboom, D. J., Poolman, B. A structural classification of substrate-binding proteins. FEBS Lett. 584 (12), 2606-2617 (2010).
  3. Mao, B., Pear, M. R., McCammon, J. A., Quiocho, F. A. Hinge-bending in L-arabinose-binding protein. The "Venus's-flytrap" model. J Biol Chem. 257 (3), 1131-1133 (1982).
  4. Hoeppner, A., et al. Proteins and Their Ligands: Their Importance and How to Crystallize Them. Advanced Topics on Crystal Growth. , InTech. Rijeka, Croatia. (2013).
  5. Lee, Y. H., et al. The crystal structure of Zn(II)-free Treponema pallidum TroA, a periplasmic metal-binding protein, reveals a closed conformation. J Bacteriol. 184 (8), 2300-2304 (2002).
  6. Wei, B., Randich, A. M., Bhattacharyya-Pakrasi, M., Pakrasi, H. B., Smith, T. J. Possible regulatory role for the histidine-rich loop in the zinc transport protein, ZnuA. Biochemistry. 46 (30), 8734-8743 (2007).
  7. Yatsunyk, L. A., et al. Structure and metal binding properties of ZnuA, a periplasmic zinc transporter from Escherichia coli. J Biol Inorg Chem. 13 (2), 271-288 (2008).
  8. McDevitt, C. A., et al. A molecular mechanism for bacterial susceptibility to zinc. PLoS Pathog. 7 (11), e1002357(2011).
  9. Couñago, R. M., et al. Imperfect coordination chemistry facilitates metal ion release in the Psa permease. Nat Chem Biol. 10 (1), 35-41 (2014).
  10. Abate, F., et al. Apo, Zn2+-bound and Mn2+-bound structures reveal ligand-binding properties of SitA from the pathogen Staphylococcus pseudintermedius. Biosci Rep. 34 (6), e00154(2014).
  11. Ahuja, S., et al. Structural analysis of bacterial ABC transporter inhibition by an antibody fragment. Structure. 23 (4), 713-723 (2015).
  12. Alberts, B., et al. Fractionation of Cells. Molecular Biology of the Cell. , 4th edition, Garland Science. New York, NY. (2002).
  13. Zhao, H., Martinis, S. A. Isolation of bacterial compartments to track movement of protein synthesis factors. Methods. 113, 120-126 (2017).
  14. Brown, R. B., Audet, J. Current techniques for single-cell lysis. J R Soc Interface. 5, S131-S138 (2008).
  15. Bornhorst, J. A., Falke, J. J. Purification of proteins using polyhistidine affinity tags. Methods Enzymol. 326, 245-254 (2000).
  16. Radka, C. D., et al. Crystal structure of Yersinia pestis virulence factor YfeA reveals two polyspecific metal-binding sites. Acta Crystallogr D Struct Biol. 73 (7), 557-572 (2017).
  17. Elgundi, Z., Sifniotis, V., Reslan, M., Cruz, E., Kayser, V. Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody. J Vis Exp. (119), e55153(2017).
  18. Gasteiger, E., et al. Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server. The Proteomics Protocols Handbook. Walker, J. N. , Humana Press. 571-607 (2005).
  19. Wooten, A. L., Aweda, T. A., Lewis, B. C., Gross, R. B., Lapi, S. E. Biodistribution and PET Imaging of pharmacokinetics of manganese in mice using Manganese-52. PLoS One. 12 (3), e0174351(2017).
  20. Inman, R. S., Wessling-Resnick, M. Characterization of transferrin-independent iron transport in K562 cells. Unique properties provide evidence for multiple pathways of iron uptake. J Biol Chem. 268 (12), 8521-8528 (1993).
  21. Makui, H., et al. Identification of the Escherichia coli K-12 Nramp orthologue (MntH) as a selective divalent metal ion transporter. Mol Microbiol. 35 (5), 1065-1078 (2000).
  22. Forbes, J. R., Gros, P. Iron, manganese, and cobalt transport by Nramp1 (Slc11a1) and Nramp2 (Slc11a2) expressed at the plasma membrane. Blood. 102 (5), 1884-1892 (2003).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

periplazma bakteryjnapobieranie radioizotop wbia ko periplazmatyczneprzedzia cytoplazmatycznyszok osmotycznykomora ci nieniowa French Presswymiana anionowafiltracja elowa
Niezbędny wychwyt metali przez bakterie Gram-ujemne: fluorescencja rentgenowska, radioizotopy i frakcjonowanie komórek
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.