Method Article

Rozmiar ma znaczenie: pomiar średnicy kapsułki u Cryptococcus neoformans

DOI:

10.3791/57171

⸱

February 27th, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Middle Tennessee State University, 2DRVision Technologies

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kapsułka polisacharydowa jest głównym czynnikiem wirulencji u Cryptococcus neoformans, a jej rozmiar koreluje ze zjadliwością szczepu. Pomiary średnicy kapsułki są wykorzystywane w testach fenotypowych i do oceny skuteczności terapeutycznej. Przedstawiono tutaj standardową metodę indukcji kapsułek, a także porównano dwie metody barwienia i pomiaru średnicy.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kapsułka polisacharydowa Cryptococcus neoformans jest głównym czynnikiem wirulencji i jednym z najczęściej badanych aspektów tych chorobotwórczych drożdży. Wielkość kapsułki może się znacznie różnić w zależności od szczepu, ma zdolność do szybkiego wzrostu po wprowadzeniu do stresujących lub ubogich w składniki odżywcze warunków i jest dodatnio skorelowana ze zjadliwością szczepu. Z tych powodów rozmiar kapsułki jest bardzo interesujący dla badaczy C. neoformans. Wzrost torebki C. neoformans jest indukowany podczas testów fenotypowych, aby pomóc zrozumieć wpływ różnych zabiegów na drożdże lub różnice w wielkości między szczepami. W tym miejscu opisujemy jedną ze standardowych metod indukcji kapsułki i porównujemy dwie akceptowane metody barwienia i pomiaru średnicy kapsułki: (i) tusz indyjski, barwienie negatywowe, stosowane w połączeniu z konwencjonalną mikroskopią świetlną oraz (ii) barwienie barwnikami fluorescencyjnymi zarówno ściany komórkowej, jak i kapsułki, a następnie mikroskopia konfokalna. Na koniec pokazujemy, w jaki sposób można zautomatyzować pomiar średnicy kapsułki z próbek poplamionych tuszem indyjskim za pomocą obliczeniowej analizy obrazu.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dotykając ćwierć miliona ludzi każdego roku i powodując ponad 180 000 zgonów rocznie, Cryptococcus neoformans jest chorobotwórczym, wewnątrzkomórkowym drożdżem i czynnikiem wywołującym kryptokokozę1,2,3. Najbardziej dotknięci są pacjenci zakażeni wirusem HIV w biednych krajach, którzy nie mają łatwego dostępu do terapii antyretrowirusowej, co czyni ich bardzo podatnymi na tę chorobę4,5,6. Dane z CDC wskazują, że w Afryce Subsaharyjskiej C. neoformans zabija rocznie więcej ludzi niż gruźlica i więcej każdego miesiąca niż jakakolwiek inna epidemia Eboli w historii1. Najczęstszą drogą narażenia jest wdychanie wysuszonych zarodników, które są powszechne w środowisku7. Po dostaniu się do płuc istnieje kilka czynników wirulencji, które przyczyniają się do sukcesu C. neoformans u zakażonych osób. Kapsułka polisacharydowa jest uważana za główny czynnik wirulencji drobnoustroju, ponieważ szczepy beztorebkowe nie są zjadliwe8.

Kapsułka kryptokokowa składa się z trzech głównych składników: glukuronoksylomannanu (GXM), galaktoksylomannanu (GalXM) i mannoprotein (MPs)9. Chociaż MP są stosunkowo niewielkim składnikiem kapsułki związanym ze ścianą komórkową, są immunogenne i mogą promować głównie odpowiedź prozapalną9,10. Natomiast GXM i GalXM stanowią większość kapsułki (>90% wagowo) i mają działanie immunosupresyjne11. Oprócz działania immunomodulującego, szybkie powiększenie kapsułki in vivo tworzy mechaniczną barierę przed spożyciem przez komórki fagocytarne gospodarza (tj. neutrofile i makrofagi)12. Kapsułka C. neoformans i jej synteza są złożone, ale ogólnie rzecz biorąc, zwiększona średnica kapsułki jest skorelowana ze zwiększoną zjadliwością6,13,14. Biorąc to pod uwagę, ważne jest, aby naukowcy z C. neoformans byli w stanie szybko i dokładnie określić ilościowo wymiary kapsułek.

Zarówno komórka C. neoformans, jak i jej kapsułka polisacharydowa są dynamicznymi strukturami i wykazują zmiany w czasie15. Kapsuła może zmieniać gęstość, rozmiar i montaż w odpowiedzi na zmiany w środowisku hosta16,17,18. Wiadomo, że niski poziom żelaza lub składników odżywczych, ekspozycja na surowicę, fizjologiczne pH człowieka i podwyższony poziom CO2 inicjują wzrost kapsułki16,18,19,20. Co więcej, naukowcy wykazali zmiany strukturalne skutkujące znaczącymi różnicami w immunoreaktywności podczas infekcji, co daje przewagę C. neoformans nad jego host21,22. Jest to znane, ponieważ architektura kapsuły C. neoformans była analizowana na różne sposoby. Mikroskopia elektronowa, na przykład, ujawniła, że kapsuła ma niejednorodną matrycę z wewnętrzną warstwą o dużej gęstości elektronów pod zewnętrzną, bardziej przepuszczalną warstwą23. Rozpraszanie światła i użycie pęsety optycznej pozwoliły naukowcom na dokładniejsze wyjaśnienie jej właściwości makromolekularnych24. Analizując wyniki zarówno statycznych, jak i dynamicznych pomiarów rozpraszania światła, wiemy, że kapsuła polisacharydowa ma złożoną strukturę rozgałęzioną23. Pęseta optyczna została użyta do zbadania sztywności struktury, a także oceny jej reaktywności przeciwciał24. Jednak zdecydowanie najczęściej stosowaną analizą kapsułki C. neoformans jest pomiar jej wielkości.

Aby określić ilościowo rozmiar kapsuły, badacze używają prostego pomiaru: liniowej średnicy kapsuły. Mikroskopy cyfrowe są używane do rejestrowania obrazów wielu komórek C. neoformans (zwykle setek) wybarwionych tuszem indyjskim lub barwnikami fluorescencyjnymi. Mierzy się wielkość każdego korpusu komórki i otaczającej kapsułki. Dane są kompilowane, a średnia średnica kapsułki jest obliczana poprzez odjęcie średnicy ciała komórki od całej średnicy komórki (korpus komórki + kapsułka). Do tej pory pomiary te były wykonywane ręcznie. Chociaż metoda ta jest ogólnie dokładna, ma wady dla badaczy. Ręczna analiza dużych zbiorów danych może zająć dni, a nawet tygodnie. A ponieważ pomiary te są wykonywane ręcznie, subiektywność i błąd ludzki mogą mieć wpływ na wynik.

Zautomatyzowana obliczeniowa analiza obrazów stała się nieodzownym narzędziem dla badaczy w wielu dziedzinach molekularnej biologii komórki, umożliwiając szybszą i bardziej wiarygodną analizę obrazów biologicznych 25,26,27. Precyzyjne techniki analizy obrazu są niezbędne do wydobywania informacji ilościowych z często złożonych i ogromnych zbiorów danych. Jednak niektóre pomiary, zwłaszcza pomiar torebki C. neoformans, były trudne do zautomatyzowania. Dokładna identyfikacja granicy faz między ścianą komórkową a torebką, która zwykle wygląda jak ciemny pierścień, gdy jest obrazowana za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym, może być kłopotliwa do rozwiązania przy użyciu prostego progu. Co więcej, komórki C. neoformans w hodowli mają tendencję do zlepiania się ze sobą, a dokładna segmentacja komórek jest niezbędna do dokładnych pomiarów.

Celem tego projektu było (i) zilustrowanie jednego ze standardowych protokołów indukcji kapsułek u C. neoformans, (ii) porównanie i zestawienie barwienia tuszem indyjskim i fluorescencyjnym w odniesieniu do pomiarów średnicy kapsułki, (iii) opracowanie prostych, obliczeniowych metod pomiaru średnicy kapsułki za pomocą obrazów komórek barwionych tuszem indyjskim za pomocą oprogramowania do analizy obrazu, oraz (iv) ocenić korzyści i ograniczenia związane z ręcznym pomiarem średnicy kapsułki i wykorzystaniem automatyzacji oprogramowania. Okazało się, że z dwóch metod barwienia, fluorescencyjne znakowanie ściany komórkowej i kapsułki, choć bardziej czasochłonne, zapewniło najbardziej spójne wyniki między eksperymentami. Jednak obie metody pozwoliły nam z powodzeniem odróżnić laboratoryjne i kliniczne szczepy C. neoformans o różnych rozmiarach kapsułek. Co więcej, byliśmy w stanie zautomatyzować pomiar średnicy kapsułki na podstawie indyjskich obrazów barwionych atramentem i stwierdziliśmy, że jest to realna alternatywa dla ręcznego pomiaru kapsułki.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: C. neoformans jest patogenem o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2) i badacze pracujący z nim muszą podjąć odpowiednie środki ostrożności. Szczegółowe procedury dotyczące bezpiecznej pracy z patogenami BSL-2 można znaleźć na stronie internetowej Centrum Kontroli Chorób (CDC), ale należy pamiętać, że wszystkie osoby mające kontakt z C. neoformans powinny być odpowiednio przeszkolone w zakresie obchodzenia się z czynnikami chorobotwórczymi i zawsze powinny nosić odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE), zwykle rękawice lateksowe lub nitrylowe. Ponadto wirniki wirówek powinny być uszczelnione, aby zapobiec aerozolowaniu próbek i natychmiastowemu usuwaniu wszelkich wycieków za pomocą 10% roztworu wybielacza28.

1. Indukcja kapsuły

UWAGA: Wszystkie kroki powinny być wykonywane w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej.

  1. Hodować C. neoformans w bulionie z dekstrozy peptonowej (YPD) (pH 6,5 +/-0,2) i inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem, aż znajdą się w fazie logarytmicznej (około 18-36 godzin).
  2. Odwirować komórki przy 870 x g przez 5 minut w temperaturze 21 °C i przemyć trzykrotnie roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
  3. Użyj hemocytometru (lub automatycznego licznika komórek), aby policzyć komórki i ponownie zawiesić przy 2 x 105 komórek/2 ml w minimalnej pożywce Dulbecco (DMEM).
  4. Aby indukować kapsułkę, inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 18 h.
    UWAGA: Połączenie braku składników odżywczych w pożywce i obecności CO2 stymuluje wzrost torebki C. neoformans.
  5. Po inkubacji zebrać komórki, odwirowując (jak wyżej) i usuwając wszystko oprócz 5-10 μl supernatantu. W tym samym czasie należy pobrać odpowiednią nieindukowaną próbkę komórek dla każdego szczepu, który ma być mierzony. Użyj ich jako kontroli negatywnej.
    UWAGA: Granulki komórek będą bardzo małe i mogą być trudne do zauważenia. Zachowaj ostrożność podczas zasysania supernatantu.
  6. Barwić tuszem indyjskim (sekcja 2.1) lub barwnikami fluorescencyjnymi (sekcja 2.2).

2. Barwienie

  1. Barwienie tylko atramentem indyjskim
    1. Aby zabarwić drożdże atramentem indyjskim, ponownie zawieś osad w pozostałym supernatantze i dodaj 4 μl (około połowy) zawiesiny komórek i 4 μl tuszu indyjskiego na szklane szkiełko mikroskopowe. Delikatnie wymieszaj i unikaj pienienia.
    2. Nałóż szklane szkiełko nakrywkowe o grubości 13 mm (grubość #1,5) i uszczelnij krawędzie nietoksycznym uszczelniaczem (przezroczystym lakierem do paznokci), aby zapobiec wysychaniu próbki.
  2. Barwienie tylko barwnikami fluorescencyjnymi
    1. Aby zabarwić drożdże barwnikiem fluorescencyjnym, należy ponownie zawiesić osad komórkowy w 50 μl PBS z 1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA).
    2. Inkubować kulturę z równą objętością Calcofluor white (CFW) (1 μg/ml) i kapsułki mAb 18B7 (patrz tabela materiałów) sprzężonej z AlexaFluor488 (AF488) (10 μg/ml) przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
    3. Odwirować komórki przy 870 x g przez 5 minut w temperaturze 21 °C po inkubacji i aspirować supernatant.
    4. Zawiesić osad komórkowy w 10 μl PBS z 1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA).
    5. Odpipetować 8 μl zawiesiny komórek na szklane szkiełko mikroskopowe.
    6. Nałóż szklane szkiełko nakrywkowe o grubości 13 mm (grubość #1,5) i uszczelnij krawędzie nietoksycznym uszczelniaczem (przezroczystym lakierem do paznokci), aby zapobiec wysychaniu próbki.
  3. Barwienie zarówno tuszem indyjskim, jak i barwnikami fluorescencyjnymi
    1. Aby bardziej bezpośrednio porównać skuteczność barwienia atramentem indyjskim z barwieniem barwników fluorescencyjnych, należy wybarwić tę samą populację komórek za pomocą obu rodzajów barwników. Aby to zrobić, najpierw inkubuj komórki zarówno za pomocą kapsułki fluorescencyjnej, jak i barwienia ściany komórkowej, zgodnie z krokami 2.2.1 - 2.2.3.
    2. Następnie odpipetować równe objętości (4 μl) fluorescencyjnie barwionej zawiesiny komórek i atramentu indyjskiego na szkiełko podstawowe. Delikatnie wymieszaj.
    3. Nałóż szklane szkiełko nakrywkowe o grubości 13 mm (grubość #1,5) i uszczelnij krawędzie nietoksycznym uszczelniaczem (przezroczystym lakierem do paznokci), aby zapobiec wysychaniu próbki.

3. Akwizycja obrazu/Mikroskopia

  1. Obrazowanie komórek barwionych tuszem indyjskim.
    1. Rejestruj obrazy za pomocą standardowego mikroskopu świetlnego (powiększenie 100x).
    2. Obraz co najmniej 50 komórek na warunek.
      UWAGA: Liczba komórek w polu będzie się różnić i jest to dopuszczalne. Ważne jest jednak, aby ograniczyć do minimum nakładające się na siebie komórki, ponieważ są one trudne do zmierzenia (zarówno ręcznie, jak i za pomocą zautomatyzowanego oprogramowania). W tych eksperymentach obrazy uzyskano na głębokości 16 bitów z czasami ekspozycji zoptymalizowanymi w celu maksymalizacji kontrastu obrazu przy jednoczesnej minimalizacji rozmycia spowodowanego niewielkimi ruchami komórek.
  2. Obrazowanie komórek barwionych barwnikami fluorescencyjnymi
    1. Aby zobrazować komórki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, otwórz oprogramowanie do obrazowania mikroskopu i wybierz odpowiednie długości fal wzbudzenia i emisji dla zastosowanych fluoroforów (CFW i AF488 są wzbudzane odpowiednio za pomocą lamp 405 nm i 488 nm). Rejestruj obrazy za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.
    2. Obraz co najmniej 50 komórek na warunek.
      UWAGA: Liczba komórek w polu będzie się różnić i jest to dopuszczalne. Ważne jest jednak, aby ograniczyć do minimum nakładające się na siebie komórki, ponieważ są one trudne do zmierzenia (zarówno ręcznie, jak i za pomocą zautomatyzowanego oprogramowania).
    3. Uzyskaj serię obrazów stosu z komórkami, aby upewnić się, że uzyskano maksymalną średnicę kapsułki dla każdej komórki w danym polu.
      1. W oprogramowaniu sterującym mikroskopem kliknij pasek "z-stack", aby otworzyć panel sterowania "z-stack", a następnie wybierz opcję "Pierwszy/Ostatni" w lewym górnym rogu panelu.
      2. Użyj precyzyjnego elementu sterującego ostrością na mikroskopie, aby ustawić ostrość na poziomie poniżej najszerszego punktu pojedynczej komórki drożdży i kapsułek dla wszystkich w bieżącym polu view i kliknij "Ustaw najpierw".
      3. Użyj kontrolki precyzyjnego ustawiania ostrości, aby ustawić ostrość powyżej najszerszego punktu ciała komórki tej samej komórki i kapsułki dla wszystkich komórek w bieżącym polu view i kliknij "Ustaw ostatnie".
      4. Następnie kliknij "Rozpocznij eksperyment" w zakładce "Akwizycja", aby uzyskać stos z dla bieżącej pozycji. Powtarzaj proces w wielu pozycjach, aż uzyskane zostaną obrazy stosu z co najmniej 50 komórek.
        UWAGA: W tych eksperymentach konfokalny otworek został ustawiony na 1,0 j.a., a w wybranych pozycjach uzyskano nakładającą się serię z 10-20 warstw o powierzchni 0,7 μM każdy. AU = jednostka przewiewna.
    4. Następnie przekształć każdą serię z-stack w projekcje maksymalnej intensywności (MIP) za pomocą odpowiedniego oprogramowania do analizy obrazu.
      UWAGA: MIP-y rzutują największą intensywność na każdej płaszczyźnie ułożonego obrazu29. Tworzenie MIP-ów pozwala na tworzenie reprezentacji 2D obrazów, które odpowiadają maksymalnej średnicy komórki i kapsułki w przechwyconym stosie 3D.
  3. Obrazowanie komórek barwionych zarówno tuszem indyjskim, jak i barwnikami fluorescencyjnymi
    1. Rejestruj obrazy za pomocą mikroskopu szerokokątnego (powiększenie 40x) lub konfokalnego (powiększenie 63x lub 100x). W przypadku komórek barwionych zarówno tuszem indyjskim, jak i barwnikami fluorescencyjnymi, obrazy można rejestrować za pomocą mikroskopu szerokokątnego wyposażonego w sterowany komputerowo stolik i obiektyw zanurzeniowy w oleju.
      UWAGA: Używany mikroskop powinien być sterowany za pomocą oprogramowania do obrazowania CFW. fluorescencja, która jest wzbudzana przez filtr wzbudzenia 340-380 nm, a emitowane światło powinno być wykrywane przez filtr barierowy 435-485 nm odbity od lustra dichroicznego 400 nm. Fluorescencja AF488 może być wzbudzana przez filtr wzbudzenia 465-495 nm, a emitowane światło może być wykrywane przez filtr barierowy 515-555 nm odbity od lustra dichroicznego 505 nm.
    2. Zobrazuj co najmniej 50 komórek na warunek dla każdej metody barwienia.

4. Ręczny pomiar kapsułki

  1. W przypadku komórek barwionych atramentem indyjskim lub barwnikami fluorescencyjnymi należy użyć oprogramowania do pomiaru komórek, aby ręcznie zmierzyć średnicę kapsułki i komórki (patrz Tabela materiałów). Aby to zrobić, przejdź do "Plik" > "Otwórz obraz" > "Zmierz" i użyj kursora, aby narysować linię prostą przez najszerszy punkt całej komórki (średnica całkowita).
  2. Następnie ponownie kliknij "Zmierz" i narysuj linię prostą przez ciało komórki (średnica ciała komórki).
    UWAGA: Pomiary są automatycznie zapisywane w komórkach.
  3. Powtórz ten proces dla wszystkich komórek (minimum 50/grupę).
  4. Aby zapisać obrazy po ich zmierzeniu, kliknij "Plik" > "Zapisz jako" i odpowiednio nazwij obrazy.
  5. Wybierz nowo zmierzone pliki i wyeksportuj dane do arkusza kalkulacyjnego.
  6. Oblicz średnią średnicę kapsułki, korzystając z równania: ([średnica całkowita] - [średnica korpusu komórki]).

5. Automatyczny pomiar kapsułki

UWAGA: Dla udanego automatycznego pomiaru, użyj 16-bitowych obrazów o wysokim poziomie kontrastu i odpowiednio ostrych wraz z odpowiednim oprogramowaniem do analizy obrazu (patrz Tabela Materiałów). Podczas obrazowania C. neoformans w celu pomiaru kapsułki ważne jest, aby skupić się na ciemnym pierścieniu na granicy ściany komórkowej i torebki. Dzięki temu oprogramowanie może prawidłowo wyznaczyć komórkę i kapsułkę.

  1. Odwróć i utwórz kopię wszystkich obrazów komórek poplamionych atramentem indyjskim za pomocą odpowiedniego oprogramowania do edycji obrazów (patrz Spis materiałów). Aby to zrobić, kliknij "Plik" > "Otwórz", aby otworzyć obrazy poplamione atramentem indyjskim, a następnie "Control" + "I", aby odwrócić obraz. Kliknij "Plik" > "Zapisz jako", aby zapisać odwrócony obraz.
  2. Aby zaimportować do oprogramowania zarówno oryginalne, jak i odwrócone obrazy, kliknij "Plik" > "Importuj sekwencję" > "Załaduj obraz" > "Zdefiniuj sekwencję (ręcznie)" > "Wymiary (kanał)" > "Importuj" > "Zastosuj".
    UWAGA: Ciała komórkowe i kapsułki >C. neoformans mogą być identyfikowane i maskowane za pomocą specjalnych algorytmów - określanych jako "receptury" - zawartych w oprogramowaniu.
  3. Użyj przepisu "Analizator kolonii (fluorescencja)" na odwróconym obrazie, aby wykryć i zamaskować ciało komórki, a następnie kliknij "zastosuj". Na odwróconym obrazie ciemny pierścień wyznaczający granicę komórki C. neoformans staje się jaśniejszy niż otaczająca go kapsuła.
  4. Użyj przepisu "Colony Analyzer (Fluorescence)" na odwróconym obrazie, aby wydzielić ciała komórek C. neoformans z ich kapsułek, a następnie kliknij "zastosuj". Spowoduje to utworzenie maski zliczania. Zmień nazwę tej maski zliczania na "Treść komórki", klikając prawym przyciskiem myszy kartę oznaczoną "maska zliczająca".
    UWAGA: Receptura składa się z wielu etapów przetwarzania obrazu: usuwania tła, wykrywania obiektów, separacji obiektów i filtrowania podzbiorów.
  5. Następnie użyj przepisu "Proliferacja komórek" na oryginalnym obrazie, aby wykryć i zamaskować kapsułkę, a następnie kliknij "zastosuj". Spowoduje to utworzenie maski zliczania. Zmień nazwę tej maski zliczania na "Kapsuła", klikając prawym przyciskiem myszy zakładkę oznaczoną "maska zliczająca".
  6. Korzystając z przepisu "Partycja kapsułki", utwórz nową maskę na oryginalnym obrazie, aby oddzielić od siebie sąsiednie kapsułki. Aby to zrobić, kliknij "Partycja kapsułki" z menu rozwijanego przepisu. W polu Partycja kapsuły wybierz teraz zmienioną nazwę maski zliczania "Kapsuła" (5.5) dla regionu kapsuły. Wybierz teraz zmienioną nazwę maski liczenia "Ciało komórki" dla komórek kryptograficznych (5.4). Wybierz "Oryginalny" dla kanału wejściowego i "Utwórz maskę dla podzielonej kapsuły". Kliknij "Apply
    UWAGA: Receptura generuje średnicę komórki i kapsułki, zdefiniowaną jako średnia z najdłuższych i najkrótszych osi przecinających środek komórki i kapsułki oraz pomiary powierzchni z masek detekcyjnych. Znajdź dane wyjściowe, które znajdują się na karcie arkusza kalkulacyjnego w tym oprogramowaniu. Powtórz ten proces dla wszystkich obrazów (minimum 50 komórek/grupę). Parametry receptury można dostroić w celu optymalizacji wykrywania pojedynczych obrazów lub zoptymalizować pod kątem wykrywania wsadowego wielu obrazów. Dodatkowe pomiary można obliczyć na podstawie receptury w celu kompleksowej charakterystyki morfologii komórki i kapsułki.
  7. Eksportuj dane do wybranego oprogramowania do arkuszy kalkulacyjnych w celu dalszej analizy.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zilustrować indukcję kapsułki, barwienie komórek, obrazowanie i techniki pomiarowe, użyliśmy trzech szczepów C. neoformans: powszechnego, dobrze scharakteryzowanego szczepu laboratoryjnego, H99S30, oraz dwóch klinicznie izolowanych szczepów o wcześniej nieznanej średnicy kapsułki, B18 i B5231.

Przebieg procesu indukcji, barwienia i akwizycji obrazu za pomocą tuszu indy...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przez dziesięciolecia kapsułka była głównym przedmiotem badań zarówno dla mikologów, jak i klinicystów zainteresowanych C. neoformans i kryptokokozą ze względu na jej rolę jako głównego czynnika wirulencji patogenu. Wykorzystanie mikroskopii do pomiaru różnic w wielkości kapsułki między szczepami i w różnych warunkach wzrostu może dostarczyć ważnych informacji o patogenie i jego reakcjach na różne bodźce (tj. różne warunki środowiskowe, potencjalne leczenie farmakologiczne itp.) W tym miejscu p...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autor, Hoyin Lai, jest menedżerem produktu w firmie DRVision, która publikuje oprogramowanie do automatycznej analizy obrazu, Aivia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy programowi doktoranckiemu Molecular Biosciences (MOBI) oraz Wydziałowi Biologii Uniwersytetu Stanowego Middle Tennessee (MTSU) za zapewnienie funduszy na to badanie. Projekt został również częściowo sfinansowany z grantu Special Projects przyznanego D.E.N. przez Fundację MTSU.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Induction
C. neoformans cellsKliniczny szczep laboratoryjny, H99S, był miłym prezentem od dr Johna Perfecta (Duke University).  Szczepy kliniczne, B18 i B52, były miłymi prezentami od dr Grega Bissona (University of Pennsylvania). 
Drożdżowy bulion dekstrozowy z peptonem (YPD)Fisher ScientificDF0428-17-5
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Jest wytwarzany w laboratorium przy użyciu standardowej receptury (137mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10mM Na2HPO4O, 2 mM Kh2PO4O)
DMEM/wysoka glukoza z L-glutaminą, bez pirogronianu soduGE Life SciencesSH30022.01
Płytki 6-dołkoweFalconCL5335-5EA
Inkubator z wytrząsaniemThermo Scientific MaxQ6000
izotempowaFisher Scientific
Thermo ScientificLegend XTR
strong>Staining
MicrowirówkaThermo ScientificLegend Micro 21R
Indiaatrament Fisher Scientific14-910-56
Calcofluor whiteSigma-Aldrich18909-100ML-F
18B7 mysie przeciwciało anty-GXM sprzężone z Alexafluorem 488Miły prezent od dr Arturo Casadevalla (Uniwersytet Johnsa Hopkinsa) 
PBS z 1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA)PBS to ta sama receptura, którą wymieniono powyżej (wiersz 4) z dodatkiem 1% BSA i sterylizacją filtra.
Surowica bydlęca AlbuminaSigma-AldrichA9418
Szkiełka mikroskopowe SuperfrostFisher Scientific12-550-143
Szkiełka nakrywkoweCorning2855-18#1,5 grubość
Bezbarwny lakier do paznokci lub inny nietoksyczny uszczelniacz
Akwizycja obrazu 
Olejek immersyjnyCargille 16484
Mikroskop świetlny z obiektywem z olejkiem immersyjnymZeiss ZeissAxio A1 z planem - NEOFLUAR 100-krotne zanurzenie w oleju Obiektyw NA 1.30
Kamera mikroskopu świetlnegoZeiss ZeissAxiocam ErCD
Mikroskop konfokalny z olejkiemZeissLSM 700 wyposażony w obiektyw Plan-Apochromat 63X NA 1.4 DIC M27 z olejkiem immersyjnym. nbsp;
Oprogramowanie mikroskopu konfokalnegoZen 2009
Kamera mikroskopu konfokalnegoNikonNikon Ti-Eclipse z oświetlaczem epifluorescencyjnym Intensilight (Nikon), kamera mikroskopowa CoolSNAP MYO (fotometria), obiektyw immersyjny olejek Plan Apo 60x NA 1,40 (Nikon) i zmieniacz powiększenia 1,5x.
Oprogramowanie do obrazowania szerokokątnegoNikon Elements (Nikon)
Capsule Measurement
Oprogramowanie do edycji obrazuPhotoshop (Adobe)
Oprogramowanie mikroskopowe do pomiarów ręcznychAxiovision (Carl Zeiss)
Oprogramowanie do analizy obrazu do zautomatyzowanych pomiarówAivia (DRVision Technologie)
Arkusz kalkulacyjnyExcel (Microsoft)
Inkubator CO2 Wirówka < Skaningowy konfokalny

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Park, B. J., et al. Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS. AIDS. 23 (4), 525-530 (2009).
  2. Coelho, C., Bocca, A. L., Casadevall, A. The intracellular life of Cryptococcus neoformans. Annu Rev Pathol. 9, 219-238 (2014).
  3. Rajasingham, R., et al. Global burden of disease of HIV-associated cryptococcal meningitis: an updated analysis. Lancet Infect Dis. 17 (8), 873-881 (2017).
  4. Limper, A. H., Adenis, A., Le, T., Harrison, T. S. Fungal infections in HIV/AIDS. Lancet Infect Dis. 17 (11), e334-e343 (2017).
  5. Casadevall, A. Crisis in Infectious Diseases: 2 Decades Later. Clin Infect Dis. 64 (7), 823-828 (2017).
  6. McClelland, E. E. C., Eisenmann, A., H, Ch 6. New Insights in Medical Mycology. , Springer. Netherlands. 131-157 (2007).
  7. Leopold Wager, C. M., Wormley, F. L. Jr Classical versus alternative macrophage activation: the Ying and the Yang in host defense against pulmonary fungal infections. Mucosal Immunol. 7 (5), 1023-1035 (2014).
  8. Kwon-Chung, K. J., Rhodes, J. C. Encapsulation and melanin formation as indicators of virulence in Cryptococcus neoformans. Infect Immun. 51 (1), 218-223 (1986).
  9. Vecchiarelli, A., et al. Elucidating the immunological function of the Cryptococcus neoformans capsule. Future Microbiol. 8 (9), 1107-1116 (2013).
  10. Murphy, J. W. Influence of cryptococcal antigens on cell-mediated immunity. Rev Infect Dis. 10 Suppl 2, S432-S435 (1988).
  11. Cherniak, R., Morris, L. C., Belay, T., Spitzer, E. D., Casadevall, A. Variation in the structure of glucuronoxylomannan in isolates from patients with recurrent cryptococcal meningitis. Infect Immun. 63 (5), 1899-1905 (1995).
  12. Collins, H. L., Bancroft, G. J. Encapsulation of Cryptococcus neoformans impairs antigen-specific T-cell responses. Infect Immun. 59 (11), 3883-3888 (1991).
  13. Yasuoka, A., Kohno, S., Yamada, H., Kaku, M., Koga, H. Influence of molecular sizes of Cryptococcus neoformans capsular polysaccharide on phagocytosis. Microbiol Immunol. 38 (11), 851-856 (1994).
  14. Robertson, E. J., et al. Cryptococcus neoformans ex vivo capsule size is associated with intracranial pressure and host immune response in HIV-associated cryptococcal meningitis. J Infect Dis. 209 (1), 74-82 (2014).
  15. Cordero, R. J., Bergman, A., Casadevall, A. Temporal behavior of capsule enlargement by Cryptococcus neoformans. Eukaryot Cell. 12 (10), 1383-1388 (2013).
  16. O'Meara, T. R., Alspaugh, J. A. The Cryptococcus neoformans capsule: a sword and a shield. Clin Microbiol Rev. 25 (3), 387-408 (2012).
  17. McClelland, E. E., Smith, J. M. Gender specific differences in the immune response to infection. Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis. 59 (3), (2011).
  18. McClelland, E. E., Perrine, W. T., Potts, W. K., Casadevall, A. Relationship of virulence factor expression to evolved virulence in mouse-passaged Cryptococcus neoformans lines. Infect Immun. 73 (10), 7047-7050 (2005).
  19. Zaragoza, O., Fries, B. C., Casadevall, A. Induction of capsule growth in Cryptococcus neoformans by mammalian serum and CO(2). Infect Immun. 71 (1), 6155-6164 (2003).
  20. Vartivarian, S. E., et al. Regulation of cryptococcal capsular polysaccharide by iron. J Infect Dis. 167 (1), 186-190 (1993).
  21. McFadden, D. C., Fries, B. C., Wang, F., Casadevall, A. Capsule structural heterogeneity and antigenic variation in Cryptococcus neoformans. Eukaryot Cell. 6 (8), 1464-1473 (2007).
  22. Garcia-Hermoso, D., Dromer, F., Janbon, G. Cryptococcus neoformans capsule structure evolution in vitro and during murine infection. Infect Immun. 72 (6), 3359-3365 (2004).
  23. Gates, M. A., Thorkildson, P., Kozel, T. R. Molecular architecture of the Cryptococcus neoformans capsule. Mol Microbiol. 52 (1), 13-24 (2004).
  24. Pontes, B., Frases, S. The Cryptococcus neoformans capsule: lessons from the use of optical tweezers and other biophysical tools. Front Microbiol. 6, 640(2015).
  25. Shen, H., et al. Automated tracking of gene expression in individual cells and cell compartments. J R Soc Interface. 3 (11), 787-794 (2006).
  26. Dorn, J. F., Danuser, G., Yang, G. Computational processing and analysis of dynamic fluorescence image data. Methods Cell Biol. 85, 497-538 (2008).
  27. Nketia, T. A., Sailem, H., Rohde, G., Machiraju, R., Rittscher, J. Analysis of live cell images: Methods, tools and opportunities. Methods. , 65-79 (2017).
  28. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , Centers for Disease Control and Prevention, Government Printing Office. Atlanta, GA. 33-38 (2015).
  29. Kwon, O., Kang, S. T., Kim, S. H., Kim, Y. H., Shin, Y. G. Maximum intensity projection using bidirectional compositing with block skipping. J Xray Sci Technol. 23 (1), 33-44 (2015).
  30. Janbon, G., et al. Analysis of the genome and transcriptome of Cryptococcus neoformans var. grubii reveals complex RNA expression and microevolution leading to virulence attenuation. PLoS Genet. 10 (4), e1004261(2014).
  31. Bisson, G. P., et al. The use of HAART is associated with decreased risk of death during initial treatment of cryptococcal meningitis in adults in Botswana. J Acquir Immune Defic Syndr. 49 (2), 227-229 (2008).
  32. van Teeffelen, S., Shaevitz, J. W., Gitai, Z. Image analysis in fluorescence microscopy: bacterial dynamics as a case study. Bioessays. 34 (5), 427-436 (2012).
  33. Granger, D. L., Perfect, J. R., Durack, D. T. Virulence of Cryptococcus neoformans. Regulation of capsule synthesis by carbon dioxide. J Clin Invest. 76 (2), 508-516 (1985).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cryptococcus neoformansCapsule DiameterIndia Ink StainingFluorescent Dye StainingConfocal MicroscopyLight MicroscopyAutomated Image AnalysisCapsule InductionYeast Cell MeasurementZ Stack Imaging

Related Articles