Artykuł metodologiczny

Tworzenie kowalencyjnych adduktów DNA przez enzymatycznie aktywowane czynniki rakotwórcze i leki in vitro oraz ich oznaczanie za pomocą 32p-posttagingu

13.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57177

⸱

20 marca 2018

1Department of Biochemistry, Charles University

W tym artykule

Podsumowanie

Ocena siły działania chemikaliów i leków środowiskowych, które mają być enzymatycznie bioaktywowane do produktów pośrednich generujących kowalencyjne addukty DNA, jest ważnym polem w rozwoju raka i jego leczeniu. Opisano metody aktywacji związków w celu utworzenia adduktów DNA, a także techniki ich wykrywania i kwantyfikacji.

Streszczenie

Kowalencyjne addukty DNA utworzone przez chemikalia lub leki o rakotwórczym potencjale są oceniane jako jeden z najważniejszych czynników w fazie inicjacji procesów rakotwórczych. To kowalencyjne wiązanie, które jest uważane za przyczynę nowotworzenia, jest obecnie oceniane jako centralny dogmat chemicznej kancerogenezy. W tym miejscu opisano metody wykorzystujące reakcje katalizowane przez cytochrom P450 i dodatkowe enzymy biotransformacyjne w celu zbadania siły działania substancji chemicznych lub leków na ich aktywację do metabolitów tworzących te addukty DNA. Przedstawiono procedury izolacji frakcji komórkowych posiadających enzymy biotransformacji (próbki mikrosomalne i cytozolowe z cytochromami P450 lub innymi enzymami biotransformacji, tj. peroksydazami, oksydoreduktazą NADPH:cytochromu P450, oksydoreduktazą NAD(P)H:chinonem lub oksydazą ksantynową). Ponadto opisano metody, które można wykorzystać do metabolicznej aktywacji analizowanych substancji chemicznych przez te enzymy, a także do izolacji DNA. Ponadto szczegółowo przedstawiono odpowiednie metody zdolne do wykrywania i ilościowego określania adduktów DNA pochodzących z substancji chemicznych/leków, tj. różne modyfikacje techniki znakowania końcowego 32P i zastosowanie analizowanych substancji chemicznych znakowanych radioaktywnie.

Wprowadzenie

Metabolizm ksenobiotyków (substancji chemicznych lub leków) zachodzi w dwóch fazach1. Fazy I i II mają na celu uczynienie pierwotnie hydrofobowych (nierozpuszczalnych w wodzie) związków bardziej hydrofilowymi (rozpuszczalnymi w wodzie), dzięki czemu będą one łatwo wydalane z moczem, kałem lub potem. Reakcje fazy I (funkcjonalizacji) obejmują utlenianie, redukcję i hydroksylację katalizowane przez enzymy, takie jak cytochrom P450 (P450, CYPs), peroksydazy (tj. cyklooksygenaza, COX), reduktazy aldo-ketonowe (AKR) i mikrosomalne monooksygenazy zawierające flawinę (FMO). Faza I obejmuje również reakcje redukcji, w których pośredniczą różne reduktazy, tj. mikrosomalna reduktaza NADPH: cytochromu P450 (POR) i cytozolowa oksydoreduktaza NAD(P)H:chinonu (NQO1), oksydaza ksantynowa (XO) i oksydaza aldehydowa (AO)1. W drugiej fazie (koniugacji) grupy funkcyjne, które zostały przyłączone w fazie I, są wykorzystywane do koniugacji małych cząsteczek polarnych w celu dalszego zwiększenia polarności. Przykładami enzymów biorących udział w reakcji fazy II są sulfotransferazy (SULT), N,O-acetylotransferazy (NAT), metylotransferazy, takie jak O-metylotransferaza katecholowa (COMT), S-transferazy glutationowe (GST) i glukuronozylotransferazy difosforanu urydyny (UGT)1. Klasyfikacja enzymów w fazie I lub II nie jest jednak sztywna, a niektóre enzymy można prawdopodobnie zaklasyfikować do dowolnej kategorii.

Enzymy P450 (EC 1.14.14.1) to białka zawierające hem obecne w różnych organizmach, które uczestniczą w biotransformacji wielu substancji chemicznych, katalizując ich konwersję3,4. Enzymy P450 katalizują hydroksylację wielu substratów, przy czym zachodzi reakcja, w której jeden atom ditlenu jest wprowadzany do cząsteczki ksenobiotyków, podczas gdy drugi atom tlenu jest redukowany do postaci wody w reakcji, która wymaga dwóch elektronów [równanie (1)]3,4:

RH + O2 + NADPH + H+ → ROH + H2O + NADP+ (1)

P450 enzymy zlokalizowane w błonie retikulum endoplazmatycznego komórek ssaków (mikrosomalne systemy P450) są członkami systemu monooksygenazy wieloenzymatycznej, który dodatkowo zawiera reduktazę cytochromu P450 (POR) i cytochrom b5, substrat enzymu określany jako NADH:cytochrom b5 Reduktazy. Ogólnie przyjęta teoria zakłada, że donorem dwóch elektronów potrzebnych do P450 jest układ NADPH / POR. Niemniej jednak cytochrom b5 może również działać jako donor elektronów dla P450, a mianowicie jako donor elektronu redukującego P450 podczas drugiej redukcji jego cyklu reakcji, gdzie działa razem z NADH:reduktaza cytochromu b52,3,4.

Ssaki wykorzystują różne enzymy P450 (np. enzymy z rodzin 5, 8, 11, 17, 19, 21, 24, 26 i 27) do syntezy cennych związków endogennych, takich jak sterydy, i wykorzystują je do katabolizmu produktów naturalnych2,3. Inne enzymy ssaków CYP, takie jak ludzki CYP1A2, 2C9, 2C19, 2D6 i 3A4, metabolizują egzogenne substancje chemiczne, które są stosowane jako leki. 5,6 Najważniejszymi enzymami katalizującymi metabolizm leków są CYP z podrodziny 3A, zwłaszcza CYP3A4. Konwersje ksenobiotyków, takich jak czynniki prorakotwórcze i protoksyczne, są pośredniczone przez ludzkie CYP1A1, 1A2, 1B1, 2A6, 2E1 i 3A42,5. Większość z tych CYP jest obecna w wątrobie (z wyjątkiem CYP1A1 i 1B1). Niemniej jednak CYP ulegają również ekspresji w kilku narządach pozawątrobowych. Takie P450 mogą mieć ogromne znaczenie, zwłaszcza gdy uczestniczą w metabolizmie bioaktywacji substancji chemicznych (leków) do reaktywnych produktów pośrednich w tych narządach7. Różne P450 są indukowane przez kilka związków, które są ich substratami, choć niekoniecznie tak jest.

Wiele enzymów P450 odgrywa rolę w toksyczności chemicznej (lekowej). Mogą przekształcać ksenobiotyki nie tylko w metabolity detoksykacyjne, ale także aktywować je do form reaktywnych, które modyfikują endogenne makrocząsteczki, które dodatkowo wykazują różne właściwości biologiczne, zwykle powodując ich toksyczność. DNA, lipidy i białka mogą być celem ich modyfikacji przez reaktywne elektrofile i rodniki generowane przez aktywowane substancje chemiczne. W przypadku DNA znane jest już rozwiązanie kilku ważnych odpowiedzi genów i ich mechanizmy2,3,4,5.

Zmiany w DNA mogą powodować zmniejszenie kontroli wzrostu komórek, a zjawisko to jest uważane za główny czynnik prowadzący do rozwoju procesów rakotwórczych. Wytwarzanie kowalencyjnych adduktów DNA z substancjami chemicznymi o działaniu rakotwórczym jest oceniane jako jeden z najważniejszych etapów w fazie inicjacji procesów rakotwórczych8,9,10,11. Wykazano, że zachodzą związki między powstawaniem adduktów DNA a nowotworzeniem się, przy czym zmniejszenie ilości adduktów DNA jest odpowiedzialne za chemoprewencję8,9,10,11,12,13,14. Powstawanie rakotwórczych/pochodnych leków adduktów DNA zależy od poszczególnych zasad DNA i zależy od sekwencji tych zasad w DNA. Naprawa adduktów DNA zależy od ich lokalizacji (na transkrybowanej lub nietranskrybowanej nici DNA) oraz typów zmodyfikowanych sekwencji nukleotydowych8,11,12,15,16.

W tym artykule opisujemy procedury wykorzystujące katalizowaną enzymatycznie konwersję substancji chemicznych (leków) do zbadania ich siły aktywacji w metabolity, które modyfikują DNA (generując addukty DNA). W przypadku kowalencyjnego wiązania DNA badany związek powinien być zwykle aktywowany przez reakcje oksydacyjne lub redukcyjne, w zależności od poszczególnych leków. Aktywacja oksydacyjna lub redukcyjna badanych substancji chemicznych odbywa się za pośrednictwem układu enzymatycznego zależnego od P450 obecnego we frakcji subkomórkowej mikrosomalnej lub przez redukcję za pomocą reduktaz obecnych zarówno w mikrosomach (POR, NADH: reduktaza cytochromu b5, enzymy P450), jak i w komórkowych cytozolowych frakcjach subkomórkowych (NQO1, XO, AO, peroksydaza). Reaktywne metabolity wiążą się następnie z DNA, tworząc addukty DNA. Ponieważ zarówno reakcje utleniające, jak i redukcyjne są ważne dla aktywacji kilku leków do tych reaktywnych gatunków, opisano procedury eksperymentalne wykorzystujące układ enzymatyczny utleniania/redukcji. Ponadto szczegółowo opisano odpowiednie metody zdolne do wykrywania i ilościowego określania tych adduktów DNA.

Zalecane są dwie niezależne procedury w celu określenia, czy badana substancja chemiczna, aktywowana przez systemy enzymatyczne, jest związana z DNA: technika znakowania 32P i wykorzystanie związku znakowanego radioaktywnie (np. 3H lub 14C). W przypadku pierwszego pilotażu zaleca się przeprowadzenie badania przesiewowego testu 32P-postlabeling. Oznaczanie zawartości DNA w roztworach, dokładnie ocenione, musi poprzedzać obie metody.

Technika 32P-postlabeling wykorzystuje enzymatyczną hydrolizę DNA zmodyfikowanego przez nieradioaktywne substancje chemiczne (rakotwórcze/narkotykowe) do 3'-fosfodeoksynukleozydów, dodatkową fosforylację radioaktywnym fosforem (32P) w pozycji 5'-OH oraz oddzielenie adduktów chemiczno-deoksynukleotydowych od normalnych (niezmodyfikowanych) deoksynukleotydów za pomocą chromatografii17 (Rysunek 1). DNA zmodyfikowane przez związek chemiczny jest hydrolizowane przez mieszaninę endonukleazy, nukleazy mikrokokowej i egzonukleazy, znanej jako fosfodiesterazy śledziony. Mieszanina hydrolizowanego DNA zawierająca zarówno normalne (niezmodyfikowane), jak i zmodyfikowane 3'-monofosforany deoksyrybonukleozydu reaguje z [γ-32P]ATP w obecności nośnika (nieradioaktywnego) ATP i kinazy polinukleotydowej T4 o pH 9,5, tworząc 5'-32znakowane P 3',5'-bisfosforany ("standardowa" procedura w Rysunek 1). Zastosowane zasadowe pH jest zdolne do zminimalizowania aktywności enzymatycznej kinazy T4-polinukleotydowej w celu defosforylacji 3'-monofosforanów deoksyrybonukleozydu w pozycji 3'. Separację i rozdzielczość 32adduktów znakowanych P od znakowanych deoksynukleotydów, które nie są modyfikowane przez chemikalia, przeprowadza się za pomocą wielokierunkowej chromatografii cienkowarstwowej anionowej wymiany anionowej (TLC) na celulozie polietylenoiniminowej (PEI) (Rysunek 2). W pierwszym i drugim etapie elucji (w kierunku D1 i D2) znakowane normalne (niezmodyfikowane) deoxynukleotydy oraz [32P]fosforan są eluowane od początku płytki celulozowej TLC-PEI za pomocą wodnych roztworów elektrolitu na krótkim kawałku bibuły chromatograficznej nałożonej na wierzch płytki TLC, podczas gdy deoksynukleotydy zawierające związane substancje chemiczne wykazujące właściwości hydrofobowe (rakotwórcze/addukty leków) są utrzymywane na początku płytki celulozowej PEI jako dodatkowo rozwiązany za pomocą kilku różnych układów rozpuszczalnikowych w kierunkach D3 i D4 (Rysunek 2). Lokalizacja przywodzików odbywa się za pomocą autoradiografii wspomaganej ekranem; oddzielone addukty są wykrywane jako ciemne, rozpoznawalne plamy na kliszach rentgenowskich. Obszary plam są wycinane z płytki i wykorzystywane do ilościowego oznaczania promieniotwórczości za pomocą scyntylacji cieczy lub liczenia Cerenkowa. Obecnie stosuje się również metodę obrazowania fosforu akumulacyjnego, która została dostosowana do mapowania i ilościowego oznaczania adduktów DNA na chromatogramach wykrytych w teście 32posttagów P. 18 Maszyna Instant Imager jest często wykorzystywana do takiego wykrywania i ilościowego oznaczania adduktów DNA. Ta metoda zapewnia ponad 10-krotnie wyższą czułość wykrywania 32P niż technika autoradiografii wzmocnionej ekranem19.

Ilości adduktów DNA są określane jako wartości względnego znakowania adduktów (RAL), obliczane za pomocą równania (2) w następujący sposób:

cpm. w deoksynukleotydach adduktów
RAL = ----------------------------------------------------------------------------------------- (2)
Specyficzna aktywność 32P-ATP (w cpm./pmol) x pmol deoksynukleotydów

Wartości RAL są stosunkiem szybkości zliczania adduktowanych deoksynukleotydów do współczynników zliczania całkowitych [przywiedzionych i normalnych (niezmodyfikowanych) deoxynukleotydów] deoksynukleotydów20,21. Jednak obliczenia te opierają się na równych wydajnościach znakowania adduktów i normalnych deoksynukleotydów22. Klasyczna ("standardowa") procedura techniki znakowania 32P jest odpowiednia dla różnych adduktów DNA (adduktów masywnych i/lub niemasywnych), jednak jej czułość nie jest zadowalająca do wykrywania adduktów znajdujących się w małych ilościach w DNA. Za pomocą tej procedury można wykryć ilość adduktu w 107 niezmodyfikowanych deoksynukleotydach w DNA (0,3 fmol addukt / μg DNA).

Różne modyfikacje tej klasycznej procedury 32P-postlabeling zostały wykorzystane do podniesienia czułości tej techniki. Do 10 do 100-krotnie wyższa czułość oznaczania adduktów za pomocą znakowania 32P została osiągnięta przy użyciu granicznych poziomów [γ-32P]ATP (procedura intensyfikacji). 23,24 Kolejna procedura zapewniająca zwiększenie czułości metody 32P-postlabeling wykorzystuje inkubację strawionego DNA zawierającego addukty z nukleazą P1 (z Penicillium citrinum)21 (Rysunek 1). Enzym ten preferuje defosforylację niezmodyfikowanych 3'-monofosforanów deoksyrybonukleozydu, podczas gdy deoksynukleotydy ze związanymi substancjami chemicznymi (addukowane nukleotydy) zasadniczo nie są substratami tego enzymu. Dlatego zdefosforylowane deoksyrybonukleozydy 3'-monofosforany (tj. Deoksyrybonukleozydy) nie są fosforylowane przez kinazę polinukleotydową T4 przez [32P]fosforan z γ-32 P]ATP. Jednak niektóre nukleotydy, w których związki chemiczne są związane (addukowane deoxynukleotydy), takie jak addukty aryloaminy podstawione w C8 deoksyguanozyny, mogą być bedefosforylowane przez ten enzym. W przeciwieństwie do tego, większość innych adduktów (np. addukty podstawione w N2 deoksyguanozyny) nie jest defosforylowana przez nukleazę P1. Ta modyfikacja 32P-postlabeling sprawia, że metoda ta jest znacznie bardziej czuła, zwiększając jej czułość o ponad trzy rzędy wielkości. Co więcej, ta wersja 32P-posttaging zapewnia metodę, w której można wykorzystać większe ilości DNA (5-10 μg) i nadmiar wolnego od nośników [γ-32P] ATP.

Inna metoda wzbogacania adduktów, opisana przez Gupta25, wykorzystuje właściwości fizykochemiczne dużych adduktów deoksynukleotydowych, które mogą być ekstrahowane do n-butanolu w obecności czynnika przenoszącego fazę chlorku tetrabutyloamoniowego (TBA) (Rysunek 1) przed [32znakowanie fosforanów, podczas gdy niemodyfikowane deoksynukleotydy są słabo ekstrahowane przez ten rozpuszczalnik organiczny. Jednak mniej hydrofobowe addukty, składające się na przykład z deoksynukleotydów zmodyfikowanych niearomatycznymi grupami o dużej objętości lub małymi resztami alkilowymi, nie są skutecznie ekstrahowane n-butanolem. W związku z tym są one zasadniczo niewykrywalne, gdy są analizowane za pomocą tej modyfikacji metody 32P-postlabeling.

Obie wcześniej wymienione wersje 32P-postlabeling ogromnie zwiększają czułość i kwantyfikację adduktów DNA (do trzech rzędów wielkości), będąc w stanie wykryć jeden addukt na 109,10 normalnych nukleotydów (0,3 - 3 amol/μg DNA). Te dwie metody są zalecane do testowania substancji chemicznych pod kątem ich zdolności do kowalencyjnego wiązania się z DNA i dlatego zostały szczegółowo opisane w tej pracy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie doświadczenia na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z Regulaminem Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych (311/1997, Ministerstwo Rolnictwa, Republika Czeska), który jest zgodny z Deklaracją Helsińską.

1. Izolacja frakcji mikrosomalnych i cytozolowych wątroby

  1. Przygotuj subkomórkowe frakcje wątroby (mikrosomy bogate w enzymy P450 lub cytozole bogate w reduktazy lub rozpuszczalne peroksydazy) od szczurów przez proste wirowanie różnicowe (105 000 x g).
    UWAGA: Osad i supernatant są traktowane odpowiednio jako mikrosomy i cytozole.
    1. Próbki wątroby (1-10 g) przemyć dwukrotnie 50 mM buforem Tris-HCl o pH 7,4 zawierającym 150 mM buforu KCl (bufor 1) (10-krotnie większa objętość niż masa tkanki, tj. 10-100 ml) i pokroić tkanki na małe kawałki (o wymiarach około 2 x 2 mm).
    2. Homogenizować tkankę w obecności tego buforu (>3 objętości/wag. ml/g) w homogenizatorze w temperaturze 4 °C przez 5 minut i wyrzucić pozostałe niehomogenizowane kawałki tkanki przez filtrację przy użyciu bibuły filtracyjnej. Odwirować homogenat przy 600 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i przenieść supernatant do innej probówki wirówkowej.
    3. Ponownie homogenizować osad w buforze 1 (1 ml na 1 g tkanki), powtórzyć krok 1.1.3 i wyrzucić osad. Odwirować połączone supernatanty o stężeniu 15 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant do innej probówki wirówkowej.
    4. Odwirować supernatant przy 105 000 x g przez 60 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać supernatant (cytozol) i przechowywać go w podwielokrotnościach (1 - 10 ml) w temperaturze -80 °C. Scharakteryzować cytozol pod kątem ilości białka, stosując metodę opisaną przez Bradford26.
    5. Zawiesić osad w 100 mM buforze fosforanu sodu o pH 7,4 (>2 objętości/wagowo mL/g), odwirować przy 105 000 x g przez 60 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant. Ponownie homogenizować osad (mikrosomy) w 50 mM buforze Tris-HCl o pH 7,4 zawierającym 150 mM KCl i 20% glicerolu (<5 objętości/wagowo ml/g) w homogenizatorze w temperaturze 4 °C. Przechowywać mikrosomy w 0,5 - 1 ml podwielokrotności w temperaturze -80 °C. Scharakteryzować mikrosomy pod kątem zawartości białek metodą opisaną przez Bradford26.
    6. Określić stężenie cytochromu P450 w mikrosomach.
      UWAGA: Stężenie enzymów P450 w mikrosomach mierzy się zgodnie z opisem Omura i Sato27, określając absorpcję kompleksu zredukowanego P450 z tlenkiem węgla (CO). Tlenek węgla jest związkiem toksycznym i należy obchodzić się z nim ostrożnie i w kapturze.

2. Inkubacje badanych substancji chemicznych (rakotwórczych/leków) z DNA w obecności układów enzymatycznych

  1. Inkubacja badanych substancji chemicznych (czynników rakotwórczych/leków) z DNA w obecności oksydacyjnych układów enzymatycznych zawierających cytochromy P450
    1. Przygotować mieszaniny inkubacyjne zawierające, w końcowej objętości 0,75 ml w temperaturze 4 °C, następujące związki i układy enzymatyczne.
      1. Zmieszać 100 mM buforu fosforanowego o pH 7,4 (0,375 ml) z 10 mM NADPH lub systemem generującym NADPH (10 mM MgCl2, 10 mM D-glukozy 6-fosforanu, 10 mM NADP+, 1 U/ml dehydrogenazy D-glukozy 6-fosforanowej) (75 μL).
      2. Dodać do tej mieszaniny mikrosomy lub czysty rekombinowany P450 w supersomach, które są mikrosomami wyizolowanymi z komórek owadów transfekowanych konstruktem bakulowirusa zawierającym cDNA rekombinowanych enzymów P450, 50 enzymów pmol P450 w 50 μl preparatów mikrosomalnych lub nadsomalnych - wątrobowych frakcji mikrosomalnych wyizolowanych w laboratorium lub ze źródła komercyjnego.
      3. Dodać 1 mg DNA grasicy cielęcej (0,3 ml roztworu podstawowego - 3,3 mg/ml w wodzie destylowanej) i wstrząsać na wytrząsarce wirowej przez 5 s.
      4. Na koniec dodać 7,5 μl 0,1 mM testowego leku eliptycynowego rozpuszczonego w DMSO i 42,5 μl wody destylowanej, aby uzyskać objętość mieszaniny inkubacyjnej 0,75 ml. Używaj substancji chemicznych znakowanych 3H lub 14C lub nieznakowanych chemikaliów, w zależności od procedury wykrywania adduktów DNA.
      5. Wstrząsać na wytrząsarce wirowej przez 5 s. Inkubować w otwartych probówkach w temperaturze 37 °C przez 30 - 60 minut.
      6. Należy również przygotować dwie inkubacje kontrolne w podobny sposób, ale (i) bez systemu aktywującego (próbki mikrosomalne) lub (ii) z nim, ale bez badanego związku.
  2. Inkubacja badanych substancji chemicznych (czynników rakotwórczych/leków) z DNA w obecności redukcyjnych układów enzymatycznych
    1. Przygotować mieszaniny inkubacyjne zawierające, w końcowej objętości 0,75 ml w temperaturze 4 °C, następujące związki i układy enzymatyczne.
      1. W temperaturze 4 °C wymieszać 100 mM buforu Tris-HCl o pH 7,4, zawierającym 0,2% Tween 20, (0,375 mL), 10 mM roztwór kofaktora enzymu redukcyjnego NQO1 (NADPH) (75 μL), frakcję cytozolową (wątrobowe frakcje cytozolowe - wyizolowane w laboratorium lub w przypadku stosowania frakcji cytozolowych wyizolowanych od indywidualnych dawców ludzkich, które uzyskano ze źródła handlowego zawierającego 1 mg białka (50 μL)).
      2. Dodać 1 mg DNA grasicy cielęcej (0,2 ml roztworu podstawowego - 3,3 mg/ml wody destylowanej) i wstrząsać na shakerze przez 5 sekund.
      3. Na koniec dodać 7,5 μl 0,1 mM badanej substancji chemicznej (rozpuszczonej w wodzie destylowanej, metanolu, etanolu lub DMSO, w zależności od rozpuszczalności związku) i 42,5 μl wody destylowanej, aby osiągnąć objętość 0,75 ml dla mieszaniny inkubacyjnej. Używaj substancji chemicznych znakowanych temperaturą 3H lub 14C lub nieznakowanych chemikaliów, w zależności od procedury wykrywania adduktów DNA (patrz poniżej).
      4. Mieszaninę reakcyjną należy przepłukać argonem przez 1 minutę. Wstrząsać na wytrząsarce przez 5 s. Inkubować w zamkniętych probówkach w temperaturze 37 °C przez 30 - 60 minut.
      5. Należy również przygotować dwie inkubacje kontrolne w podobny sposób, ale (i) bez układu aktywującego (frakcje cytozolowe) lub (ii) z nim, ale bez badanych substancji chemicznych.
  3. Ekstrakcja mieszanin inkubacyjnych rozpuszczalnikami organicznymi w celu usunięcia nadmiaru badanych substancji chemicznych
    1. Wymieszać mieszaninę inkubacyjną w probówce z nakrętką o tej samej objętości octanu etylu (lub eteru dietylowego lub heksanu), dodając te rozpuszczalniki. Wstrząśnij zawartością probówki na shakerze, aż utworzy się emulsja.
    2. Wirować (3 min) przy 1 600 x g w wirówce w temperaturze otoczenia. Jeśli faza organiczna i wodna nie są odpowiednio oddzielone, należy wirować jeszcze raz przez dłuższy czas lub z większą prędkością wirowania.
    3. Usuń górną, zbierającą się fazę organiczną za pomocą pipety. W przypadku stosowania małych objętości (<400 μl) należy użyć pipety automatycznej wyposażonej w odpowiednią końcówkę. Odrzuć tę organiczną fazę.
    4. Powtórz kroki 2.3.1., 2.3.2 i 2.3.3. Usunąć resztki rozpuszczalników organicznych za pomocą strumienia azotu gazowego (potrzebne jest co najmniej 5 - 10 minut usuwania).
  4. Izolacja DNA z inkubacji
    1. Ekstrakcja DNA z roztworów fenolu/chloroformu i jego wytrącanie etanolem
      1. Wyeliminuj białka w celu wyizolowania DNA z mieszanin inkubacyjnych poprzez ekstrakcję białek z roztworów DNA z fenolem, fenolem/chloroformem (1:1) i chloroformem zgodnie z procedurą pokazaną poniżej.
      2. Połączyć mieszaninę inkubacyjną z taką samą ilością fenolu lub fenolu/chloroformu (1:1) w probówce Falcona lub Eppendorfa z nakrętką. Mieszaj mieszaninę, aż utworzy się emulsja.
      3. Wirować (3 min) przy 1 600 x g w wirówce w temperaturze otoczenia. Jeśli faza organiczna i wodna nie są prawidłowo oddzielone, należy wirować jeszcze raz przez dłuższy czas lub z większą prędkością wirowania.
      4. Przenieś górną fazę wodną za pomocą pipety do nowej rurki polipropylenowej. W przypadku stosowania małych objętości (<400 μl) należy użyć pipety automatycznej wyposażonej w odpowiednią końcówkę. Usuń granicę faz białkowych wraz z fazą organiczną.
      5. Połączyć górną fazę wodną z taką samą ilością mieszaniny fenolu i chloroformu (1:1). Powtórz kroki 2.4.1.2. - 2.4.1.4.
      6. Połączyć górną fazę wodną z taką samą ilością chloroformu i powtórzyć kroki 2.4.1.2. - 2.4.1.4. Odzyskać DNA przez wytrącanie 2 objętościami zimnego (-20 °C) etanolu. Określić objętość roztworu DNA.
      7. Dostosować stężenie kationów jednowartościowych przez dodanie 5 M chlorku sodu do końcowych stężeń 0,1 M. Energicznie wymieszać. Połączyć z 2 objętościami zimnego (-20 °C) etanolu i odpowiednio wymieszać. Schłodzić do -20°C.
      8. Przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu wytrącenia DNA. W przypadku gdy DNA ulega fragmentacji podczas inkubacji (np. w wyniku tworzenia rodników tlenowych podczas reakcji aktywacji enzymatycznej) lub podczas procedury izolacji do wielkości DNA, która jest mała (<1 kb) lub gdy DNA jest obecne w małych ilościach (<0,1 mg/ml), czas chłodzenia musi zostać wydłużony, a temperatura zmniejszona do -70 °C.
      9. Wirować (10 min) w temperaturze 1 600 x g w temperaturze 0 °C w wirówce. Jeśli DNA jest obecne w niskich stężeniach lub w postaci małych fragmentów, wiruj jeszcze raz przez dłuższy czas (30 minut). Odrzucić supernatant.
      10. W celu usunięcia wszelkich substancji rozpuszczonych (lub pozostałości badanej substancji chemicznej), które mogą być obecne w wytrąconym DNA, należy przepłukać DNA 70 % etanolem i eterem dietylowym. Przepłukać wytrącone DNA zimnym (-20 °C) 70% etanolem. Wirować (10 min) w temperaturze 1 600 x g w temperaturze 0 °C w wirówce. Odrzucić supernatant.
      11. Powtórz krok 2.4.1.10. Przepłukać wytrącone DNA zimnym (-20 °C) 70% etanolem. Wirować (10 min) w temperaturze 1 600 x g w temperaturze 0 °C w wirówce. Odrzucić supernatant.
      12. Powtórz krok 2.4.1.10. Umieścić probówkę w stanie pionowym na bilecie chłonnym, aby usunąć resztki supernatantu. Przepłukać osad DNA, dodając 1 ml eteru dietylowego w celu usunięcia potencjalnych pozostałości badanej substancji chemicznej z wyizolowanego DNA. Wirować (10 min) w temperaturze 1 600 x g w temperaturze 0 °C w wirówce. Odrzucić supernatant.
      13. Rozpuść osad DNA w odpowiedniej objętości (zwykle w 100 - 400 μL, aby uzyskać stężenie DNA 0,5 - 1 μg/μL) wody destylowanej (lub w 0,15 mM cytrynianu sodu i 1,5 mM chlorku sodu). Roztwór DNA może stać w temperaturze 4 °C przez noc lub może być podgrzewany do 37 °C przez 10-30 minut, aby zwiększyć rozpuszczanie DNA.
      14. Przed przechowywaniem należy rozdzielić DNA na małe porcje (10 - 20 μl), ponieważ wielokrotne zamrażanie i rozmrażanie roztworów DNA może spowodować spadek stężeń adduktów. Przechowywać w temperaturze -80 °C lub niższej.
        UWAGA: Spektrofotometryczne oznaczanie DNA: Prostą i dokładną metodą, która jest szeroko stosowana do pomiaru ilości DNA w preparacie, jeśli próbka jest czysta (tj. bez znacznych ilości zanieczyszczeń, takich jak białko, fenol lub inne kwasy nukleinowe), jest spektrofotometryczny pomiar ilości DNA promieniowania UV pochłoniętego przez zasady (patrz procedury opisane wcześniej)28.
  5. Procedury wykrywania tworzenia adduktów DNA
    1. 32Test znakowania post p
      UWAGA: Hydroliza DNA wykorzystuje hydrolizat przygotowany na tym etapie do analizy adduktów (2.5.1.), jak również normalnych (niezmodyfikowanych) deestrogenukleotydów (2.5.7.).
      1. Rozpuść nukleazę mikrokokową (MN) w wodzie w stężeniu ~450 jednostek (U)/ml. Dializować z wodą destylowaną i dostosować do 300 U/ml. Dializować roztwór fosfodiesterazy śledziony (SPD) i dostosować do 4 U/ml.
      2. Wymieszać MN i SPD do końcowych stężeń 150 mU/μL MN i 2,5 mU/μL SPD (roztwór MN/SPD). Pobrać roztwór DNA zawierający 12,5 μg i odparować do sucha w parowniku. Rozpuścić w 6,5 μl wody destylowanej.
      3. Dodać 5,0 μl roztworu MN/SPD (końcowe stężenie MN wynosi 60 mU/μL, końcowe stężenie SPD wynosi 1 mU/μL) i 1,0 μl buforu do wytrawiania (końcowe stężenie bursztynianu sodu wynosi 20 mM, końcowe stężenie CaCl2 wynosi 8 mM). Ostateczna objętość mieszaniny wynosi 12,5 μl. Wymieszać i pozostawić na reakcje przez 3 godziny w temperaturze 37 °C.
      4. Pobrać 2,5 μl (przenieść do innej probówki) w celu dalszego rozcieńczenia i analizy niezmodyfikowanych deoksynukleotydów (2.5.7.)
    2. Procedura wzbogacania nukleazy P1
      1. Do pozostałych 10,0 μl hydrolizatu dodać 0,65 μl buforu octanu sodu (stężenie końcowe, 40 mM), 0,65 μl roztworu ZnCl2 (stężenie końcowe 0,1 mM), 1,25 μl roztworu NP1 (stężenie końcowe, 0,385 μg/μL) i 0,45 μl wody destylowanej. Ostateczna objętość mieszaniny wynosi 13 μl.
      2. Pozostawić mieszaninę do reakcji przez 30 minut w temperaturze 37 °C i zakończyć reakcję dodaniem 3 μl roztworu Tris.
    3. Procedura wzbogacania n-butanolem
      1. Do pozostałych 10,0 μl hydrolizatu DNA dodać 215 μl 11,6 mM roztworu mrówczanu amonu o pH 3,5 i 25 μl 10 mM roztworu chlorku TBA. Ekstrakt z 250 μl n-butanolu (nasyconego wodą) przez energiczne mieszanie. Wirować (3 min) w temperaturze 1 600 x g, aby oddzielić warstwy i zdjąć górną warstwę n-butanolu. Wyekstrahuj jeszcze raz za pomocą 250 μl n-butanolu (nasyconego wodą), odwiruj, zdejmij górną warstwę n-butanolu i połącz z poprzednim ekstraktem.
      2. Do tego ekstraktu dodać 400 μl wody (nasyconej n-butanolem) i energicznie wymieszać. Obróć, aby rozdzielić warstwy i usunąć dolną warstwę wodną. Powtórz tę procedurę mycia, używając 400 μl wody (nasyconej n-butanolem). Dodać 3 μl 250 mM roztworu Tris-HCl o pH 9,5 do warstwy n-butanolu. Odparować n-butanol do sucha w parowniku w temperaturze otoczenia.
      3. Rozpuścić pozostałość w 100 μl n-butanolu, ponownie odparować do sucha i rozpuścić pozostałość w 16,0 μl wody.
    4. Oznakowanie przywodzeń
      1. Dodać 1 μl roztworu buforowego biciny (bufor znakujący) i 4,5 μl mieszaniny zawierającej 100 μCi [γ-32P]ATP, 45 pmol zimnego ATP i 10,0 U T4-PNK (kinaza T4-fosfonukleotydowa) do 16,0 μl roztworu z NP1 lub mieszanki wzbogacającej butanol. Końcowe stężenia odczynników będą następujące: 20 mM bicine, 10 mM MgCl2, 10 mM ditiotreitolu, 0,5 mM spermidyny i 0,5 U/μL T4-PNK, 3 μM ATP. Całkowita objętość mieszaniny wynosi 20 μL.
      2. Pozostaw mieszaninę na reakcję przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Nałożyć całą próbkę (tj. 20 μl) na płytkę TLC z celulozy PEI (2.5.6).
    5. Ocena skuteczności zabiegów wzmacniających NP1 lub n-butanolem
      1. Umyj dno probówki 50 μl wody. Mieszać energicznie przez 30 s i wirować (1 min) przy 1 600 x g w wirówce, aby upewnić się, że na pokrywce nie ma zanieczyszczeń. Punktowo 5 μl na płytce TLC z celulozy PEI (20 x 20 cm). Chromatograf przy użyciu roztworu o stężeniu 280 mM w (NH4)2SO4 i 50 mM NaH2PO4, pH 6,8.
    6. Separacja TLC addukowanych deoxynukleotydów
      1. Umyj wstępnie płytki TLC wodą destylowaną. Polecany jest szczególnie do talerzy domowej roboty.
        UWAGA: To mycie należy przeprowadzić w celu usunięcia żółtego koloru z płyt, koloru, który może podnieść tło, szczególnie z przodu rozpuszczalnika.
      2. Umieścić całą próbkę na płytce TLC z celulozy PEI i rozpocząć chromatografię (2.5.4.); oczyszczanie adduktów przeprowadza się poprzez wywołanie płytki w kierunkach D1 i D2 (Rysunek 2).
      3. Rozwiń płytkę w kierunku D1 (Rysunek 2). Użyj 1,7 M buforu fosforanu sodu o pH 6,8, aby upewnić się, że addukty DNA pozostają na początku płytki TLC. Analogicznie, rozwijaj płytkę w kierunku D2 za pomocą tego bufora. Aby uzyskać informacje na temat możliwych dla procedur, zobacz rozwiązania opisane dla rozwiązywania kilku typów adduktów20,28.
        UWAGA: Rozwinięcie płytki w kierunku D2 można pominąć.
      4. Myć płytkę w wodzie dejonizowanej po chromatografii przez około 5 minut w dwóch kolejnych kąpielach. Następnie wysusz talerze.
      5. Rozwinąć płytki w kierunku D3 i D4 za pomocą 3,5 M buforu mrówczanu litu, pH 3,5, zawierającego 8,5 M mocznika dla kierunku D3 i 0,5 M buforu Tris-HCl, pH 8,0, zawierającego 0,8 M LiCl i 8,5 M mocznika dla kierunku D4 (Rysunek 2). Rozpuszczalniki muszą być dostosowane do tworzenia się miejsc przywodzenia nad płytką TLC. Aby uzyskać informacje na temat możliwych dla procedur rozwojowych D3 i D4, zobacz opisane rozwiązania dla rozwiązywania kilku typów adduktów23,24,25,28.
      6. Aby uniknąć problemów w D4, po wywołaniu w kierunku D4 i płukaniu wodą, rozwiń płytki (wzdłuż D4) w 1,7 M fosforanie sodu o pH 6,0 (zwykle przypisywanym jako rozwój w kierunku D5), do górnej części papierowego (12 x 11,5 cm).
        UWAGA: Kierunek D5 można również pominąć. W takim przypadku konieczne jest otwarcie zbiornika TLC, gdy rozpuszczalnik dotrze do górnej części TLC i pozostawienie go na okres do 60 minut. Ta metoda jest nawet lepsza niż dodawanie (metoda często stosowana w wielu laboratoriach w celu usunięcia wszelkich problemów w D4).
    7. Kwantyfikacja normalnych (niezmodyfikowanych) deoksynukleotydów po hydrolizie
      1. Rozcieńczyć podwielokrotność hydrolizatu (z ppkt 2.5.1 opisującego hydrolizę DNA) wodą destylowaną (tj. 2,5 μl mieszaniny wytrawiającej z ppkt 2.5.1 dostosowaną do 250 μl i 10 μl tego roztworu dostosowaną do 150 μl).
      2. Pobrać 5 μl (10 pmol normalnych deoxynukleotydów) podwielokrotność tego trawienia, dodać 2,5 μl 10 mM buforu Tris-HCl o pH 9,0 i oznaczyć jak w 2.5.4 (końcowa objętość mieszaniny wynosi 10 μL). Pozostawić na 30 minut w temperaturze pokojowej.
      3. Pobrać 4 μl podwielokrotność mieszaniny i rozcieńczyć do 750 μl 10 mM Tris-HCl, pH 9,0. Wymieszaj i odwiruj, aby upewnić się, że pokrywka nie jest zanieczyszczona. Nanieść 5 μl na płytkę TLC z celulozy PEI. Rozwinąć płytkę TLC w roztworze 280 mM (NH4)2SO4 i 50 mM NaH2PO4 o pH 6,5. Pozostawić do wyschnięcia po TLC.
      4. Użyj autoradiografii, która jest wykonywana przez około 45 minut w temperaturze otoczenia, aby zlokalizować cztery niezmodyfikowane bis-fosforany deoksynukleotydu. Wyciąć miejsce do oznaczania ilościowego przez scyntylację cieczy lub liczenie Cerenkowa.
    8. Obliczanie względnego oznakowania przywodzenia (RAL)
      1. Określić wartości liczb w miejscach adduktów i liczby w podwielokrotności znakowanych niezmodyfikowanych (normalnych) deoknukleotydów.
        UWAGA: Te ostatnie muszą być określone na 180 000 zliczeń mniej materiału niż pierwsze, liczba, która jest współczynnikiem konwersji, który należy zastosować do liczby niezmodyfikowanych (normalnych) deonukleotydów w celu oceny wartości RAL poziomów adduktów. RAL adduktów DNA oblicza się zgodnie z równaniem (2) pokazanym powyżej.
    9. Wykrywanie wiązania badanych czynników rakotwórczych lub leków z DNA za pomocą leku znakowanego radioaktywnie
      1. Ocenić radioaktywność 3H lub 14C DNA zmodyfikowanego substancjami chemicznymi za pomocą ciekłego zliczania scyntylacyjnego.
      2. Dodać 10 - 50 μl roztworu DNA do 3 ml roztworu scyntylacyjnego w fiolce scyntylacyjnej. Dobrze wymieszaj. Zmierzyć radioaktywność za pomocą licznika scyntylacyjnego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Stosując opisane tutaj protokoły wykorzystania aktywacji katalizowanej enzymatycznie (tj. P450, peroksydazy, reduktazy) do badania zdolności substancji chemicznych (kancerogenów/leków) do metabolizowania do produktów pośrednich prowadzących do ich kowalencyjnego wiązania z DNA (powstawania adduktów DNA), udało nam się wyjaśnić (i) nowy mechanizm działania farmakologicznego przeciwnowotworowego leku ellipticine (przegląd patrz,29,

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W artykule przedstawiono szeroko dostępną metodologię badania siły działania substancji chemicznych, które mogą być bioaktywowane do produktów pośrednich metabolizmu, co prowadzi do generowania kowalencyjnych adduktów DNA. Jest to kwestia kluczowa, ponieważ ocena siły działania substancji chemicznych lub leków środowiskowych na ich enzymatyczną aktywację do metabolitów generujących kowalencyjne addukty DNA jest ważną dziedziną w rozwoju nowotworów i ich leczeniu. Modyfikacja DNA przez czynniki rakotwórcze uważana za przy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autor nie ma nic do zdradzienia.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez Czeską Fundację Naukową (GACR, grant 17-12816S).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
TrisSigma-Aldrich252859
Chlorek potasuSigma-AldrichP9541
Octan soduSigma-AldrichS2889
PhenolRoth0032.8
Fenol/chloroform/alkohol izoamylowyRothA156.1
EtanolPenta70390-11000
Grasica cielęca DNASigma-AldrichD4522
NADHSigma-AldrichN7004
NADP+Sigma-AldrichN5755
NADPHSigma-AldrichN7505
D-glukoza 6-fosforanSigma-Aldrich7647001
DehydrogenazaD-glukozySigma-AldrichG6378
SupersomyCorning Gentest456211, 456203, 456220, 456204, 456210, 456222, 456219, 456212, 456206, 456207, 456202 Mikrosomy
ludzkiej wątrobyCorning Gentest452172
Tween 20Sigma-AldrichP1379
HipoksantynaSigma-Aldrich77662
2-hydroksypirymidynaSigma-AldrichH56800
Octan etyluSigma-Aldrich437549
Eter dietylowySigma-Aldrich179272
Nukleaza mikrokokkowa z Staphylococcus aureusSigma-AldrichN3755
Fosfodiesterazy śledziony ze śledziony cielęcej, typ IICalbiochem524711
Nukleaza P1 z Penicillium citrinumSigma-AldrichN8630
BicineSigma-Aldrich163791
DL-DitiotreitolSigma-AldrichD0632
SpermidynaSigma-AldrichS2626
Chlorek tetrabutyloamoniowySigma-Aldrich86870
n-ButanolSigma-Aldrich437603
Kinaza polinukleotydowaT4 USB Corp70031Y
[γ-32P]ATPHartman Analytic GmbHFP-201
Celulozowe płytki TLC impregnowane PEIMacherey-Nagel801053
Packard Instant Imager A202400PackardG120337
EllipticineSigma-Aldrich285730
3-nitrobenzantronprzygotowany (zsyntetyzowany), jak pokazano w ref. 40

Bibliografia

  1. Croom, E. Metabolism of xenobiotics of human environments. Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 112, 31-88 (2012).
  2. Guengerich, F. P. Common and uncommon cytochrome P450 reactions related to metabolism and chemical toxicity. Chem. Res. Toxicol. 14 (6), 611-650 (2001).
  3. Guengerich, F. P. Cytochrome P450 and chemical toxicology. Chem. Res. Toxicol. 21 (2), 70-83 (2008).
  4. Stiborova, M., et al. NADH:Cytochrome b5 Reductase and Cytochrome b5 Can Act as Sole Electron Donors to Human Cytochrome P450 1A1-Mediated Oxidation and DNA Adduct Formation by Benzo[a]pyrene. Chem. Res. Toxicol. 29 (8), 1325-1334 (2016).
  5. Rendic, S., Guengerich, F. P. Contributions of human enzymes in carcinogen metabolism. Chem. Res. Toxicol. 25 (7), 1316-1383 (2012).
  6. Wienkers, L. C., Heath, T. G. Predicting in vivo drug interactions from in vitro drug discovery data. Nat. Rev. Drug Discov. 4 (10), 825-833 (2005).
  7. Guengerich, F. P., Liebler, D. C. Enzymatic activation of chemicals to toxic metabolites. Crit. Rev. Toxicol. 14 (3), 259-307 (1985).
  8. Poirier, M. C. Linking DNA adduct formation and human cancer risk in chemical carcinogenesis. Environ. Mol. Mutagen. 57 (7), 499-507 (2016).
  9. Rappaport, S. M., Li, H., Grigoryan, H., Funk, W. E., Williams, E. R. Adductomics: characterizing exposures to reactive electrophiles. Toxicol. Lett. 213 (1), 83-90 (2012).
  10. Luch, A. Nature and nurture - lessons from chemical carcinogenesis. Nat. Rev. Cancer. 5 (2), 113-125 (2005).
  11. Nebert, D. W., Dalton, T. P. The role of cytochrome P450 enzymes in endogenous signalling pathways and environmental carcinogenesis. Nat Rev Cancer. 6 (12), 947-960 (2006).
  12. Phillips, D. H. Macromolecular adducts as biomarkers of human exposure to polycyclic aromatic hydrocarbons. , Imperial College Press. London. 137-169 (2005).
  13. Phillips, D. H. DNA adducts as markers of exposure and risk. Mutat. Res. 577 (1-2), 284-292 (2005).
  14. Hemminki, K. DNA adducts, mutations and cancer. Carcinogenesis. 14 (10), 2007-2012 (1993).
  15. Hanawalt, P. C., Spivak, G. Transcription-coupled DNA repair: two decades of progress and surprises. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (12), 958-970 (2008).
  16. Geacintov, N. E., Broydem, S. Repair-resistant DNA lesions. Chem. Res. Toxicol. 30 (8), 1517-1548 (2017).
  17. Randerath, K., Reddy, M. V., Gupta, R. C. 32P-labeling test for DNA damage. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78 (10), PubMed ID: 7031643 6128-6129 (1981).
  18. Reichert, W. L., Stein, J. E., French, B., Goodwin, P., Vanarasi, U. Storage phosphor imaging technique for detection and quantitation of DNA adducts measured by the 32P-postlabeling assay. Carcinogensis. 13 (8), 1475-1479 (1992).
  19. Chang, L. W., Hsia, S. M. T., Chang, P. C., Hsieh, L. L. Macromolecular adducts - biomarkers for toxicity and carcinogenesis. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 34, 41-67 (1994).
  20. Gupta, R. C., Reddy, M. V., Randerath, K. 32P-post-labeling analysis of nonradioactive aromatic carcinogen DNA adducts. Carcinogenesis. 3 (9), 1081-1092 (1982).
  21. Reddy, M. V., Randerath, K. Nuclease-P1-mediated enhancement of sensitivity of 32P-postlabeling test for structurally diverse DNA adducts. Carcinogenesis. 7 (9), 1543-1551 (1986).
  22. Mourato, L. L., Beland, F. A., Marques, M. M. 32P-Postlabeling of N-(deoxyguanosin-8-yl)arylamine adducts: a comparative study of labeling efficiencies. Chem. Res. Toxicol. 12 (7), 661-669 (1999).
  23. Randerath, E., Agrawal, H. P., Weaver, J. A., Bordelon, C. B., Randerath, K. 32P-Postlabeling analysis of DNA adducts persisting for up to 42 weeks in the skin, epidermis and dermis of mice treated topically with 7,2-dimethylbez[a]anthracene. Carcinogenesis. 6 (8), 1117-1126 (1985).
  24. Everson, R. B., Randerath, E., Santella, R. M., Cefalo, R. C., Avits, T. A., Randerath, K. Detection of smoking-related covalent DNA adducts in human placenta. Science. 231 (4733), 57-65 (1986).
  25. Gupta, R. C. Enhanced sensitivity of 32P-postlabeling analysis of aromatic carcinogen-DNA adducts. Cancer Res. 45 (11 Pt 2), PubMed ID: 4053037 5656-5662 (1985).
  26. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
  27. Omura, T., Sato, R. The carbon monoxide-binding pigment of liver microsomes. I. Evidence for its hemoprotein nature. J. Biol. Chem. 239, PubMed ID: 14209971 2370-2378 (1964).
  28. Stiborová, M., Asfaw, B., Frei, E., Schmeiser, H. H., Wiessler, M. Benzenediazonium ion derived from Sudan I forms an 8-(phenylazo)guanine adduct in DNA. Chem. Res. Toxicol. 8 (4), 489-498 (1995).
  29. Stiborova, M., Rupertova, M., Schmeiser, H. H., Frei, E. Molecular mechanisms of antineoplastic action of an anticancer drug ellipticine. Biomed. Pap. Med. Fac. Univ. Palacky Olomouc Czech Repub. 150 (1), PubMed ID: 16936898 13-23 (2006).
  30. Stiborová, M., Rupertová, M., Frei, E. Cytochrome P450- and peroxidase-mediated oxidation of anticancer alkaloid ellipticine dictates its anti-tumor efficiency. Biochim. Biophys. Acta. 1814 (1), 175-185 (2011).
  31. Stiborova, M., Frei, E. Ellipticines as DNA-targeted chemotherapeutics. Current Med. Chem. 21 (5), 575-591 (2014).
  32. Arlt, V. M., Stiborova, M., Schmeiser, H. H. Aristolochic acid as a probable human cancer hazard in herbal remedies: a review. Mutagenesis. 17 (4), 265-277 (2002).
  33. Arlt, V. M., et al. Aristolochic acid mutagenesis: molecular clues to the aetiology of Balkan endemic nephropathy-associated urothelial cancer. Carcinogenesis. 28 (11), 2253-2261 (2007).
  34. Stiborová, M., Frei, E., Arlt, V. M., Schmeiser, H. H. Metabolic activation of carcinogenic aristolochic acid, a risk factor for Balkan endemic nephropathy. Mutat. Res. 658 (1-2), 55-67 (2008).
  35. Stiborová, M., Frei, E., Schmeiser, H. H. Biotransformation enzymes in development of renal injury and urothelial cancer caused by aristolochic acid. Kidney Int. 73 (11), 1209-1211 (2008).
  36. Schmeiser, H. H., Stiborová, M., Arlt, V. M. Chemical and molecular basis of the carcinogenicity of Aristolochia plants. Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 12 (1), PubMed ID: 19152223 141-148 (2009).
  37. Gökmen, M. R., et al. The epidemiology, diagnosis, and management of aristolochic acid nephropathy: a narrative review. Ann. Intern. Med. 158 (6), 469-477 (2013).
  38. Stiborová, M., Martínek, V., Frei, E., Arlt, V. M., Schmeiser, H. H. Enzymes metabolizing aristolochic acid and their contribution to the development of aristolochic acid nephropathy and urothelial cancer. Curr. Drug Metab. 14 (6), 695-705 (2013).
  39. Stiborová, M., Arlt, V. M., Schmeiser, H. H. Balkan endemic nephropathy: an update on its aetiology. Arch. Toxicol. 90 (11), 2595-2615 (2016).
  40. Arlt, V. M., et al. Metabolic activation of the environmental contaminant 3-nitrobenzanthrone by human acetyltransferases and sulfotransferase. Carcinogenesis. 23 (11), PubMed ID: 12419844 1937-1945 (2002).
  41. Arlt, V. M., Stiborova, M., Hewer, A., Schmeiser, H. H., Phillips, D. H. Human enzymes involved in the metabolic activation of the environmental contaminant 3-nitrobenzanthrone: evidence for reductive activation by human NADPH:cytochrome P450 reductase. Cancer Res. 63 (11), PubMed ID: 12782579 2752-2761 (2003).
  42. Arlt, V. M., et al. Environmental pollutant and potent mutagen 3-nitrobenzanthrone forms DNA adducts after reduction by NAD(P)H:quinone oxidoreductase and conjugation by acetyltransferases and sulfotransferases in human hepatic cytosols. Cancer Res. 65 (7), 2644-2652 (2005).
  43. Osborne, M. R., et al. Synthesis, characterization, and 32p-postlabeling analysis of DNA adducts derived from the environmental contaminant 3-nitrobenzanthrone. Chem. Res. Toxicol. 18 (6), 1056-1070 (2005).
  44. Arlt, V. M., et al. Identification of three major DNA adducts formed by the carcinogenic air pollutant 3-nitrobenzanthrone in rat lung at the C8 and N2 position of guanine and at the N6 position of adenine. Int. J. Cancer. 118 (9), 2139-2146 (2006).
  45. Stiborová, M., et al. Mechanisms of the different DNA adduct forming potentials of the urban air pollutants 2-nitrobenzanthrone and carcinogenic 3-nitrobenzanthrone. Chem. Res. Toxicol. 23 (7), 1192-1201 (2010).
  46. Arlt, V. M., Hewer, A., Sorg, B. L., Schmeiser, H. H., Phillips, D. H., Stiborova, M. 3-aminobenzanthrone, a human metabolite of the environmental pollutant 3-nitrobenzanthrone, forms DNA adducts after metabolic activation by human and rat liver microsomes: evidence for activation by cytochrome P450 1A1 and P450 1A2. Chem. Res. Toxicol. 17 (8), 1092-1101 (2004).
  47. Arlt, V. M., Henderson, C. J., Wolf, C. R., Schmeiser, H. H., Phillips, D. H., Stiborova, M. Bioactivation of 3-aminobenzanthrone, a human metabolite of the environmental pollutant 3-nitrobenzanthrone: evidence for DNA adduct formation mediated by cytochrome P450 enzymes and peroxidase. Cancer Lett. 234 (2), 220-231 (2006).
  48. Stiborová, M., et al. 3-aminobenzanthrone, a human metabolite of the carcinogenic environmental pollutant 3-nitrobenzanthrone, induces biotransformation enzymes in rat kidney and lung. Mutat. Res. 676 (1-2), 93-101 (2009).
  49. Stiborová, M., Miksanová, M., Havlícek, V., Schmeiser, H. H., Frei, E. Mechanism of peroxidase-mediated oxidation of carcinogenic o-anisidine and its binding to DNA. Mutat. Res. 500 (1-2), 49-66 (2002).
  50. Stiborová, M., Miksanová, M., Sulc, M., Rýdlová, H., Schmeiser, H. H., Frei, E. Identification of a genotoxic mechanism for the carcinogenicity of the environmental pollutant and suspected human carcinogen o-anisidine. Int. J. Cancer. 116 (5), 667-678 (2005).
  51. Naiman, K., Martínková, M., Schmeiser, H. H., Frei, E., Stiborová, M. Human cytochrome-P450 enzymes metabolize N-(2-methoxyphenyl)hydroxylamine, a metabolite of the carcinogens o-anisidine and o-nitroanisole, thereby dictating its genotoxicity. Mutat. Res. 726 (2), 160-168 (2011).
  52. Naiman, K., et al. Formation, persistence, and identification of DNA adducts formed by the carcinogenic environmental pollutant o-anisidine in rats. Toxicol. Sci. 127 (2), 348-359 (2012).
  53. Stiborová, M., Bieler, C. A., Wiessler, M., Frei, E. The anticancer agent ellipticine on activation by cytochrome P450 forms covalent DNA adducts. Biochem. Pharmacol. 62 (12), 1675-1684 (2001).
  54. Stiborová, M., Stiborová-Rupertová, M., Borek-Dohalská, L., Wiessler, M., Frei, E. Rat microsomes activating the anticancer drug ellipticine to species covalently binding to deoxyguanosine in DNA are a suitable model mimicking ellipticine bioactivation in humans. Chem. Res. Toxicol. 16 (1), 38-47 (2003).
  55. Stiborová, M., et al. The anticancer drug ellipticine forms covalent DNA adducts, mediated by human cytochromes P450, through metabolism to 13-hydroxyellipticine and ellipticine N2-oxide. Cancer Res. 64 (22), 8374-8380 (2004).
  56. Kotrbová, V., et al. Cytochrome b5 shifts oxidation of the anticancer drug ellipticine by cytochromes P450 1A1 and 1A2 from its detoxication to activation, thereby modulating its pharmacological efficacy. Biochem. Pharmacol. 82 (6), 669-680 (2011).
  57. Stiborová, M., et al. Cytochrome b5 increases cytochrome P450 3A4-mediated activation of anticancer drug ellipticine to 13-hydroxyellipticine whose covalent binding to DNA is elevated by sulfotransferases and N,O-acetyltransferases. Chem. Res.Toxicol. 2 (5), 1075-1085 (2012).
  58. Stiborová, M., et al. Ellipticine oxidation and DNA adduct formation in human hepatocytes is catalyzed by human cytochromes P450 and enhanced by cytochrome b5. Toxicology. 302 (2-3), 233-241 (2012).
  59. Sulc, M., et al. Effectiveness of human cytochrome P450 3A4 present in liposomal and microsomal nanoparticles in formation of covalent DNA adducts by ellipticine. Neuro Endocrinol. Lett. 37 (Suppl 1), PubMed ID: 28263536 95-102 (2016).
  60. Stiborová, M., et al. Cytochrome b5 plays a dual role in the reaction cycle of cytochrome P450 3A4 during oxidation of the anticancer drug ellipticine. Monatsh. Chem. 148 (11), 1983-1991 (2017).
  61. Stiborová, M., Poljaková, J., Ryslavá, H., Dracínský, M., Eckschlager, T., Frei, E. Mammalian peroxidases activate anticancer drug ellipticine to intermediates forming deoxyguanosine adducts in DNA identical to those found in vivo and generated from 12-hydroxyellipticine and 13-hydroxyellipticine. Int. J. Cancer. 20 (2), 243-251 (2007).
  62. Enya, T., Suzuki, H., Watanabe, T., Hirayama, T., Hisamatsu, Y. 3-Nitrobenzanthrone, a powerful bacterial mutagen and suspected human carcinogen found in diesel exhausts and airborne particulates. Environ. Sci. Technol. 31 (10), 2772-2776 (1997).
  63. Seidel, A., Dahmann, D., Krekeler, H., Jacob, J. Biomonitoring of polycyclic aromatic compounds in the urine of mining workers occupationally exposed to diesel exhaust. Int. J. Hyg. Environ. Health. 204 (5-6), 333-338 (2002).
  64. Arlt, V. M. 3-Nitrobenzanthrone, a potential human cancer hazard in diesel exhaust and urban air pollution: a review of the evidence. Mutagenesis. 20 (6), 399-410 (2005).
  65. Hansen, T., Seidel, A., Borlak, J. The environmental carcinogen 3-nitrobenzanthrone and its main metabolite 3-aminobenzanthrone enhance formation of reactive oxygen intermediates in human A549 lung epithelial cells. Toxicol. Appl. Pharmacol. 221 (2), 222-234 (2007).
  66. Stiborová, M., et al. 3-aminobenzanthrone, a human metabolite of the carcinogenic environmental pollutant 3-nitrobenzanthrone, induces biotransformation enzymes in rat kidney and lung. Mutat. Res. 676 (1-2), 93-101 (2009).
  67. Nagy, E., et al. DNA adduct and tumor formations in rats after intratracheal administration of the urban air pollutant 3-nitrobenzanthrone. Carcinogenesis. 26 (10), 1821-1828 (2005).
  68. Stiborová, M., et al. The environmental pollutant and carcinogen 3-nitrobenzanthrone and its human metabolite 3-aminobenzanthrone are potent inducers of rat hepatic cytochromes P450 1A1 and -1A2 and NAD(P)H:quinone oxidoreductase. Drug Metab. Dispos. 34 (8), 1398-1405 (2006).
  69. Stiborová, M., et al. The environmental pollutant and carcinogen 3-nitrobenzanthrone induces cytochrome P450 1A1 and NAD(P)H:quinone oxidoreductase in rat lung and kidney, thereby enhancing its own genotoxicity. Toxicology. 247 (1), 11-22 (2008).
  70. Poirier, M. C. Chemical-induced DNA damage and human cancer risk. Nat. Rev. Cancer. 4 (8), 630-637 (2004).
  71. Poirier, M. C. Chemical-induced DNA damage and human cancer risk. Discov. Med. 14 (77), PubMed ID: 23114584 283-288 (2012).
  72. Phillips, D. H. Detection of DNA modifications by the 32P-postlabelling assay. Mutat. Res. 378 (1-2), 1-12 (1997).
  73. Phillips, D. H., et al. Methods of DNA adduct determination and their application to testing compounds for genotoxicity. Environ. Mol. Mutagen. 35 (3), 222-233 (2000).
  74. Phillips, D. H. Smoking-related DNA and protein adducts in human tissues. Carcinogenesis. 23 (12), 1979-2004 (2002).
  75. Phillips, D. H., Hewer, A., Arlt, V. M. 32P-postlabeling analysis of DNA adducts. Methods Mol. Biol. 291, 3-12 (2005).
  76. Farmer, P. B., et al. DNA adducts: mass spectrometry methods and future prospects. Toxicol. Appl. Pharmacol. 207 (2 Suppl), 293-301 (2005).
  77. Singh, R., Farmer, P. B. Liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry: the future of DNA adduct detection. Carcinogenesis. 27 (2), 178-196 (2006).
  78. Phillips, D. H., Arlt, V. M. The 32P-postlabeling assay for DNA adducts. Nat. Protoc. 2 (11), 2772-2781 (2007).
  79. Phillips, D. H. On the origins and development of the (32)P-postlabelling assay for carcinogen-DNA adducts. Cancer Lett. 334 (1), 5-9 (2013).
  80. Phillips, D. H., Arlt, V. M. 32P-postlabeling analysis of DNA adducts. Methods Mol. Biol. 1105, 127-138 (2014).
  81. Stiborová, M., Frei, E., Bieler, C. A., Schmeiser, H. H. 32P-Postlabelling: a sensitive technique for the detection of DNA adducts. Chem. Listy. 92, 661-668 (1998).
  82. Stiborová, M., Rupertová, M., Hodek, P., Frei, E., Schmeiser, H. H. Monitoring of DNA adducts in humans and 32P-postlabelling methods. A review. Collect. Czech. Chem. Commun. 69, 477-498 (2004).
  83. Beach, A. C., Gupta, R. C. Human biomonitoring and the 32P-postlabelling assay. Carcinogenesis. 13, 1053-1074 (1992).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Cytochrom P450enzymy biotransformacjitechnika postlabelingu 32Pizolacja DNAfrakcje mikrosomalnefrakcje cytozoloweaktywacja enzymatycznapotencja kancerogennyanaliza uszkodze DNA

Powiązane artykuły