Artykuł metodologiczny

Metoda określania wpływu wzbogacania środowiska na bioróżnorodność biomu mikrobiomu jelita grubego w mysim modelu guza jelita grubego

DOI:

10.3791/57182

⸱

28 lutego 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Gastroenterology, Hepatology, and Nutrition, Department of Internal Medicine, University of Utah, 2Huntsman Cancer Institute, University of Utah

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wzbogacenie środowiska (EE) to środowisko przetrzymywania zwierząt, które służy do ujawniania mechanizmów leżących u podstaw powiązań między stylem życia, stresem i chorobami. Protokół ten opisuje procedurę, która wykorzystuje mysi model nowotworzenia jelita grubego i EE w celu szczegółowego zdefiniowania zmian w różnorodności biologicznej mikrobioty, które mogą mieć wpływ na śmiertelność zwierząt.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kilka ostatnich badań zilustrowało korzystny wpływ życia w wzbogaconym środowisku na poprawę chorób ludzkich. U myszy wzbogacenie środowiska (EE) zmniejsza nowotworzenie poprzez aktywację układu odpornościowego myszy lub wpływa na przeżycie zwierząt niosących nowotwór poprzez stymulację odpowiedzi naprawy rany, w tym poprawę różnorodności mikrobiomu, w mikrośrodowisku guza. Poniżej przedstawiono szczegółową procedurę oceny wpływu wzbogacenia środowiska na różnorodność biologiczną mikrobiomu w modelu guza jelita grubego u myszy. Opisano środki ostrożności dotyczące hodowli zwierząt oraz rozważania dotyczące genotypu zwierząt i integracji kolonii myszy, z których wszystkie ostatecznie wpływają na różnorodność biologiczną drobnoustrojów. Przestrzeganie tych środków ostrożności może umożliwić bardziej jednolitą transmisję mikrobiomu, a w konsekwencji złagodzić skutki niezależne od leczenia, które mogą zakłócić wyniki badania. Ponadto w tej procedurze zmiany mikrobioty są charakteryzowane za pomocą sekwencjonowania 16S rDNA wyizolowanego z kału pobranego z dystalnej części jelita grubego po długotrwałym wzbogaceniu środowiska. Brak równowagi mikrobioty jelitowej jest związany m.in. z patogenezą nieswoistych zapaleń jelit i raka jelita grubego, ale także z otyłością i cukrzycą. Co ważne, ten protokół analizy EE i mikrobiomu może być wykorzystany do badania roli patogenezy mikrobiomu w różnych chorobach, w których istnieją solidne modele myszy, które mogą podsumować chorobę człowieka.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania wzbogacające środowisko (EE) wykorzystują złożone parametry mieszkaniowe do wpływania na stymulację społeczną (duże klatki mieszkaniowe, większe grupy zwierząt), stymulację poznawczą (chaty, tunele, materiały do gniazdowania, platformy) i aktywność fizyczną (koła do biegania). EE zostało wykorzystane przez wiele laboratoriów do zrozumienia wpływu zwiększonej aktywności i poprawy interakcji społecznych i poznawczych na inicjację i postęp choroby przy użyciu szerokiej gamy modeli mysich, w tym łysienia wywołanego przez fryzjerstwo, chorobę Alzheimera, zespół Retta oraz kilka modeli nowotworów i chorób układu pokarmowego1,2,3,4,5,6.

Kilka modeli myszy zostało opracowanych do badania nowotworzenia jelita grubego u myszy. Być może najlepiej zdefiniowanym modelem jest mysz ApcMin. Mysz ApcMin została opracowana w laboratorium Williama Dove'a w 1990 roku7 i była używana jako mysi model mutacji w genie APC, które są powszechnie związane z ludzkim rakiem jelita grubego. W przeciwieństwie do ludzi będących nosicielami mutacji APC, myszy ApcMin rozwijają przede wszystkim guzy jelita cienkiego, z bardzo rzadkim występowaniem guzów jelita grubego. Jednak allel Tcf4Het z pojedynczą heterozygotyczną mutacją knockin-knockout w Tcf4 znacznie zwiększa nowotworzenie jelita grubego w połączeniu z allelem ApcMin8. Ostatnio ten mysi model nowotworzenia jelita grubego został wykorzystany do określenia wpływu EE na nowotworzenie jelita grubego6. W Bice i wsp. zdefiniowano fizjologiczne i fenotypowe skutki EE na samce i samice czterech różnych linii myszy (typu dzikiego (WT), Tcf4Het/+ Apc+/+, Tcf4+/+ ApcMin/+ i Tcf4Het/+ApcMin/+)). Być może najciekawszym odkryciem było to, że EE znacznie wydłuża życie zarówno samców, jak i samic zwierząt z guzem jelita grubego. Wykazano w tym, że EE może zmniejszyć przynajmniej niektóre objawy związane z nowotworzeniem jelita grubego i poprawić zdrowie zwierząt. Co ciekawe, ta poprawa długości życia u mężczyzn nie jest bezpośrednim wynikiem zmniejszonej nowotworzenia, a zamiast tego była związana z inicjacją reakcji na gojenie się ran nowotworowych, w tym poprawą różnorodności biologicznej mikrobiomu6.

Opublikowano kilka badań specyficznych dla EE, które przyniosły interesujące wyniki. Jednak z technicznego punktu widzenia ważne wyniki często nie są możliwe do przełożenia na inne laboratoria. Utrzymanie identycznych metodologii EE między różnymi laboratoriami jest niezwykle złożonym zagadnieniem, nie tylko ze względu na używane urządzenia wzbogacające i pomieszczenia, ale także między innymi ściółkę, żywność, wentylację, hodowlę, genetykę, aktywność w pomieszczeniu i wymagania protokołu dla zwierząt9,10,11. Jednym z przykładów jest integracja zwierząt, w której zwierzęta muszą być stabilnie zintegrowane z kolonią myszy, normalizując w ten sposób tło genetyczne i skład diety, aby uniknąć skutków niezwiązanych z leczeniem. Co więcej, wiele badań EE zostało zakończonych przed uświadomieniem sobie znaczenia mikrobiomu w chorobie oraz sposobu, w jaki powszechne praktyki hodowlane myszy mogą wpływać na skład mikrobiomu jelitowego10,12.

Strategia hodowlana i umieszczanie zwierząt w EE może zwiększyć stres, jeśli nie jest wykonywana prawidłowo. Ponieważ w badaniach EE wykorzystuje się dużą liczbę zarówno samców, jak i samic oraz wiele genotypów, konfiguracja eksperymentalna może być trudna, biorąc pod uwagę wymóg łączenia zwierząt z kilku miotów. W związku z tym opracowano strategię hodowli i odsadzania, która pozwoliła na łączenie zwierząt odsadzonych od maciory o prawidłowym genotypie z różnych miotów. Głównym powodem takiego stanu rzeczy była normalizacja mikrobioty wśród miotów i zmniejszenie stresu związanego z przenoszeniem zwierząt do środowiska doświadczalnego. Mikrobiom został przeniesiony z klasy dam10. Aby zapewnić kolonii różnorodność mikrobiologiczną, samice zakupiono w Jackson Labs i włączono do kolonii na miesiąc przed rozpoczęciem eksperymentu9,10,12. Aby jeszcze bardziej znormalizować bioróżnorodność mikrobiomu między zwierzętami, samice były trzymane razem przed rozmnażaniem. Po rozrodzie, wspólne trzymanie się w pomieszczeniach odchowu i możliwość ucieczki od karmiących szczeniąt poprawiło poziom stresu związanego z opieką nad matką13,14, co prawdopodobnie przyczyniło się do normalizacji mikrobiomu. Aby zapobiec skutkom niezwiązanym z EE na mikrobiom, to wspólne trzymanie wszystkich zwierząt doświadczalnych zapobiegało walkom i dodatkowemu stresowi, który występował podczas łączenia kilku samców z różnych miotów w jedną klatkę doświadczalną. Wreszcie, w klatkach umieszczono równą liczbę zwierząt o wszystkich genotypach. Dało to możliwość poprawy różnorodności biologicznej mikrobioty we wszystkich genotypach i wyeliminowało wpływ koprofagii (skłonności zwierzęcia do spożywania stolca) lub możliwych różnic behawioralnych specyficznych dla genotypu do całego badania.

Ten protokół zapewnia strategię, która rozszerza poprzednie badania EE o znane aspekty badań nad mikrobiomem, w tym transmisję mikrobioty i integrację kolonii zwierzęcych w celu normalizacji mikrobioty, aby umożliwić bardziej jednolite populacje mikrobiomu między zwierzętami doświadczalnymi. Przestrzeganie tych środków ostrożności jest niezbędne ze względu na zdolność różnic w mikrobiocie niezwiązanych z leczeniem do mylenia wyników badania. Wyeliminowanie zmian mikrobioty niezwiązanych z EE umożliwi naukowcom precyzyjne określenie roli EE w składzie mikrobioty podczas rozwoju i progresji choroby.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane tutaj metody zostały wykonane zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie w Utah.

1. Projekt eksperymentalny oraz konfiguracja EE i klatki kontrolnej

Uwaga: Dla porównania, zilustrowano zarys projektu eksperymentalnego (Rysunek 1).

  1. Ustaw klatki kontrolne (NE) i EE (Rysunek 2).
    1. Aby ustawić klatki NE, należy użyć autoklawowanych konwencjonalnych klatek kontrolnych (Tabela 1), które nie mają urządzeń wzbogacających.
    2. W przypadku dużych koszyków należy wywiercić jeden otwór na klatkę, który jest wystarczająco duży, aby pomieścić przelotkę i tunel (tabela materiałów).
    3. Aby ustawić klatki do odchowu szczeniąt i EE, połącz dwie duże klatki autoklawowane ze sterylizowanym tunelem zabezpieczonym przelotką i 2 wysterylizowanymi platformami, aby zwiększyć powierzchnię podłogi (tabela 1). Do eksperymentów EE zapewnij wysterylizowane koła jezdne, tunele, igloo, chaty, piłki do pełzania i materiał do gniazdowania w klatkach EE.
    4. Umieść klatki EE i NE w wentylowanym stojaku, aby zapewnić równomierną wentylację.
      nuta: Dwie duże klatki z 2 platformami (Tabela 1) pozwalają na maksymalnie 12 ciężarnych samic na konfigurację odchowu młodych15 (patrz Spis materiałów, krok 3.2 w dokumencie i Tabela 2).
    5. Karm myszy ad libitum napromieniowaną standardową karmą i autoklawowaną wodą z odwróconej osmozy.
    6. Zapewnij myszom sterylne materiały ściółkowe.
      nuta: Wszystkie manipulacje pustymi klatkami i klatkami ze zwierzętami muszą być wykonywane w kapturze, aby zapobiec zanieczyszczeniu. W przypadku manipulacji dużymi klatkami należy przykryć otwór w klatce folią samoprzylepną.
  2. Przygotuj zwierzęta do hodowli. W grupie trzyma się 15 2-miesięcznych samic w jednej dużej klatce (tabela 1) przez 2 tygodnie przed kryciem. Oddzielnie trzymaj 2-miesięczne samce z miotu przez 2 tygodnie przed kryciem.
    nuta: Liczba samic do hodowli zależy od doświadczenia i wymaganej liczby zwierząt. W tym badaniu wykorzystano 15 samic w celu uzyskania 12 zatkanych samic, co jest maksymalną liczbą dozwoloną w konfiguracji odchowu szczeniąt opisaną w 1.1.2 (Tabela 2).
  3. Do hodowli połącz zwierzęta męskie i żeńskie, 1 samiec na 2 samice. Pierwsza kontrola rano powinna dotyczyć zatyczek dopochwowych, które mogą być wizualnym znakiem, że zwierzęta kojarzyły się w nocy.
    nuta: Trzymaj samce i samice razem, aż każda samica się podłączy. Zatyczkę dopochwową można zidentyfikować wizualnie, jeśli jest zewnętrzna.
    1. Aby wykryć zatyczki wewnętrzne, sonda jest wkładana do otworu pochwy i jeśli czop dopochwowy jest obecny, sonda nie jest łatwo wkładana (16; patrz sekcja 4.3.6).
      nuta: Zapisz poranek, w którym wtyczka zostanie wykryta, jako 1/2 dnia, ponieważ krycie nastąpiło w nocy.
    2. Gdy samice będą miały zatyczki dopochwowe, przenieś je do dużej klatki do odchowu szczeniąt w celu grupowego trzymania z innymi pokrytymi samicami (konfiguracja w kroku 1.1.2 bez urządzeń wzbogacających).
    3. Zastąp kryte samice nowymi samicami trzymanymi w grupie bez krycia i kontynuuj krycie, aby uzyskać maksymalną liczbę miotów w okresie 7 dni.
      nuta: Wszystkie zwierzęta muszą mieć wyznaczony termin dostawy w odstępie 7 dni.
  4. Pozwolić ciężarnym samicom na rodzenie w pomieszczeniach grupowych, tak aby wszystkie mioty były hodowane w jednej dużej klatce do odchowu szczeniąt (konfiguracja w kroku 1.1.2 bez urządzeń urozmaicających).
    1. Śledź liczbę szczeniąt i daty urodzenia oraz rozpocznij genotypowanie szczeniąt w wieku 7 dni.
      1. Tatuaż szczeniąt na palcach u nóg w wieku 7 dni z kodem numerycznym, aby je zidentyfikować13,17.
      2. Oczyść palec u nogi 70% etanolem i delikatnie włóż urządzenie do mikrotatuażu zawierające tusz w powierzchnię skóry równolegle do palca u nogi 17 (patrz Tabela Materiałów).
      3. Zbierz tkankę nożyczkami do genotypowania z końcówek ogona, nacinając mały fragment tkanki od 7-dniowych noworodków.
    2. Wyizoluj genomowe DNA z tkanki i wykonaj PCR przy użyciu konwencjonalnej metody HotSHOT, jak opisano w 18.
    3. Oddziel zwierzęta według płci w wieku 14-21 dni do dużych klatek z matkami.
      nuta: Upewnij się, że starsze szczenięta są w stanie samodzielnie się odżywiać, a młodsze szczenięta kontynuują karmienie, dopóki nie osiągną odpowiedniego wieku, aby samodzielnie się karmić.
    4. Po 21-28 dniach rozprowadź samce i samice oddzielnie według genotypu w środowiskach NE lub EE, upewniając się, że zachowałeś równe proporcje każdego genotypu na klatkę (Rysunek 2A).
      nuta: Należy zapewnić, aby całkowita liczba zwierząt dozwolona w każdej klatce NE lub EE była oparta na maksymalnej liczbie dozwolonej przez IACUC (tabela 2). W klatkach NE znajduje się co najwyżej 5 zwierząt (tabela 2). W klatkach EE, do stymulacji społecznej, nie mniej niż 20 i przy ograniczeniach przestrzennych, nie powinno się dopuszczać więcej niż 41 zwierząt w klatce EE (tabela 2).

2. Pobieranie stolca w wieku 16 tygodni

  1. Pobieranie kału należy rozpocząć na 1 do 2 dni przed złożeniem w uśmierceniu, a kał należy zbierać oddzielnie w dniu złożenia ofiary podczas sekcji przy użyciu sterylnych narzędzi.
    nuta: Pobranie kału w tym samym czasie 1-2 dni przed pobraniem może pomóc uniknąć utraty próbki ze względu na możliwość, że w momencie pobrania nie ma stolca.
    1. Aby zebrać stolec od żywych zwierząt, ostrożnie przełóż zwierzę na czystą klatkę. Pobrać stolec za pomocą sterylnych kleszczyków do sterylnej probówki do mikrofugi.
      nuta: Zwierzęta zazwyczaj eliminują stolec po unieruchomieniu, co pozwala na szybkie pobranie stolca bezpośrednio do sterylnej probówki do mikrofugi. Jeśli zwierzę nie wypróżnia się natychmiast po unieruchomieniu, umieść je w czystej klatce i poczekaj, aż zwierzę się wypróżni (zwykle do 1 godziny).
    2. Zbieraj stolec w dniu ofiary.
      1. W celu eutanazji zwierzęcia umieść je w słoiku zawierającym mały pojemnik z wacikiem nasączonym izofluranem. Po zaobserwowaniu zaprzestania oddychania (zwykle po 2 minutach) połóż zwierzę na plecach, aby umożliwić wycięcie jelita grubego.
      2. Nałóż 70% etanolu na brzuch myszy.
      3. Podnieś skórę do przodu do ujścia cewki moczowej za pomocą kleszczy i użyj nożyczek, aby przeciąć wzdłuż brzusznej linii środkowej, aż dojdziesz do klatki piersiowej, i przeciąć od podstawy pierwszego nacięcia w kierunku każdej nogi. Odchyl skórę do tyłu i użyj nożyczek, aby przeciąć ścianę otrzewnej w ten sam wzór.
      4. Użyj kleszczy, aby chwycić dystalną okrężnicę przy odbycie, aby wypreparować i odłączyć dystalną okrężnicę od odbytnicy. Ciągnąc okrężnicę pionowo kleszczami, użyj nożyczek, aby przeciąć krezkę, aby uwolnić okrężnicę.
      5. Wytnij okrężnicę tuż pod jelitem ślepym i połóż ją na bibule filtracyjnej. Użyj kleszczyków, aby podnieść górną część rurki jelita grubego, otwierając światło, aby umożliwić włożenie jednej strony otwartych nożyczek. Przeciąć wzdłużnie, dystalnie do proksymalnie i rozchylić okrężnicę wzdłuż.
      6. Zbierz stolec z dystalnej części jelita grubego do sterylnej probówki do mikrofuge za pomocą sterylnych kleszczy.
  2. Przechowywać stolec w probówce do mikrofuge w temperaturze -80 °C do czasu izolacji DNA bakteryjnego.
    nuta: W dniu ofiary, oprócz stolca, zbierz inne próbki, takie jak krew pełna, surowica, osocze, tkanka normalna i nowotworowa z okrężnicy i jelita cienkiego, mikrosomy, tkanka tłuszczowa itp. w celu odpowiedzi na zdefiniowane pytania w badaniu.

3. Izolacja genomowego DNA z kału

Uwaga: Użyj komercyjnego zestawu do izolacji DNA drobnoustrojów z kału zgodnie z protokołem wykrywania patogenów w stolcu. Pobrać próbki bezpośrednio do zamrażarki o temperaturze -80 °C i przechowywać na suchym lodzie podczas ważenia.

  1. Przenieść do 220 mg stolca do czystej probówki do mikrodymu zawierającej 1,4 ml buforu do lizy stolca o temperaturze pokojowej (RT) (patrz Tabela materiałów).
  2. Wirować próbkę przez 1 minutę, aby dokładnie homogenizować ciała stałe (Rysunek 2B). Podgrzewać zawiesinę do temperatury 95 °C przez 5 minut, aby zmylić wszystkie bakterie (w tym bakterie Gram-dodatnie).
  3. Wirować próbki przez 15 sekund, a następnie odwirować przy 20 000 x g przez 1 minutę w celu osadzenia kału. Przenieść supernatant do probówki do mikrofiltrów o pojemności 2 ml. Dodać jedną tabletkę do każdej próbki, aby wchłonąć inhibitory PCR, wirować aż tabletka się rozpuści i inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez 1 minutę.
  4. Odwirować próbkę o masie 20 000 x g przez 3 minuty i przenieść supernatant do nowej probówki do mikrodymowania. Wirować przy 20 000 x g przez 3 min. Porcję 15 μl proteinazy K (zapas 20 mg/ml) do nowej probówki o pojemności 1,5 ml. Odpipetować 200 μl próbki do probówki zawierającej proteinazę K.
  5. Dodać 200 μl buforu do lizy chlorku guanidyny do probówki, dokładnie wirować przez 15 s (patrz tabela materiałów) i inkubować próbkę w temperaturze 70 °C przez 10 minut. Dodać 200 μl etanolu (96-100%) do probówek i dobrze wymieszać przez wirowanie.
  6. Umieść kolumnę wirową na bazie krzemionki w probówce zbiorczej o pojemności 2 ml i nałóż próbki na kolumnę. Zamknij pokrywę i odwiruj przez 1 minutę przy 20 000 x g.
  7. Przenieść kolumnę do nowej probówki zbiorczej o pojemności 2 ml i dodać 500 μl buforu płuczącego 1 do kolumny, zakryć kolumnę i odwirować przez 1 minutę przy 20 000 x g. Przenieść kolumnę do nowej probówki zbiorczej o pojemności 2 ml i dodać do kolumny 500 μl buforu płuczącego 2, Zamknij nakrętkę i odwiruj przy 20 000 x g przez 3 minuty.
  8. Przy zamkniętej nasadce przenieść kolumnę do nowej probówki zbiorczej o pojemności 2 ml i odwirować przez dodatkową 1 minutę przy 20 000 x g, aby usunąć resztki buforu do płukania. Przenieść kolumnę do znakowanej 1,5 ml probówki do mikrofuge i wymyć próbkę, dodając 200 μl buforu elucyjnego zawierającego EDTA do membrany (patrz tabela materiałów).
  9. Zamknąć nakrętkę i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 minutę. Odwirować próbkę przez 1 minutę przy 20 000 x g. Wyrzucić kolumnę.

4. Oznaczanie stężenia DNA i przygotowanie próbki do PCR

Uwaga: Użyj fluorometru i dostępnego na rynku testu fluorescencyjnego dsDNA, aby określić stężenie genomowego DNA w każdej próbce (zobacz Tabelę Materiałów). Barwnik fluorescencyjny musi specyficznie wiązać dwuniciowe DNA.

  1. Przygotować rozcieńczenie 1:200 każdej próbki (1 μl każdej próbki w 199 μl mieszanki wzorcowej dsDNA) i rozcieńczenie wzorców 1:50. Analiza na fluorometrze przy użyciu ustawienia dsDNA.
    nuta: Duża objętość DNA w PCR może działać hamująco, dlatego objętość użytego DNA nie może przekraczać 10% końcowej objętości PCR. Fluorometr umożliwia dokładny pomiar DNA w próbce, ponieważ tylko DNA związane z barwnikiem fluorescencyjnym będzie fluoryzować, eliminując ewentualny udział zanieczyszczeń w końcowym obliczonym stężeniu DNA. Ten poziom dokładnej oceny ilościowej ma zasadnicze znaczenie dla dalszego zastosowania sekwencjonowania.
  2. Przygotować matryce do PCR rozcieńczone do 5 ng/μl o odpowiedniej objętości 10 mM Tris, pH 8,5, aby przygotować robocze zapasy matryc dla każdej próbki.
  3. Próbki należy przechowywać w temperaturze -20 °C.

5. Zaprojektuj elementarze do pożądanych regionów V 16S

  1. Zaprojektuj startery, aby selektywnie wzmacniać pożądane regiony rRNA V 16S.
  2. Przeanalizuj startery za pomocą Probe Match, z Ribosomal Database Project19, aby określić przybliżony współczynnik trafień dla różnych typów.
    nuta: W przypadku regionów V1-V3 w obecnym badaniu użyto opublikowanych starterów Bosshard forward20, które wiążą się na pozycji 8 w regionie V1, oraz 533 reverse21, która wiąże się na pozycji 533 w regionie V3. Podkłady muszą zawierać sekwencje adapterów zwisających do indeksowania.
  3. Projektując startery, należy uwzględnić sekwencje adapterów na końcach 5' każdego startera, zgodnie z zaleceniami dla przygotowania biblioteki sekwencjonowania metagenomiki 16S22 (Tabela 3).
  4. Zsyntetyzuj te duże startery z oczyszczaniem wkładu. Rozpuść wysuszone startery i rozcieńczyć materiał roboczy PCR do 1 μM w 10 mM Tris, pH 8,5.

6. Amplicon PCR do wzmacniania regionu V z dołączonymi sekwencjami adapterów zwisu 22

  1. Ustawić mieszaninę reakcyjną amplikonów PCR zgodnie z opisem w Tabeli 4.
  2. Umieścić na płytce samoprzylepną, przezroczystą plombę PCR i uruchomić amplikonową płytkę PCR, korzystając z parametrów podanych w tabeli 5.
  3. (Opcjonalnie) Uruchom produkty amplikonu PCR na żelu agarozowym lub teście DNA o wysokiej czułości, który umożliwia ilościowy pomiar wielkości amplikonu (patrz Tabela materiałów).
    nuta: Wielkość amplikonu z tego badania wynosi 550 pz (Rysunek 3A).

7. Czyszczenie metodą PCR za pomocą kulek magnetycznych 22

  1. Szybko odwirować płytkę amplikonową PCR przy 1 000 x g przez 1 minutę w celu zebrania kondensacji.
    nuta: Zamiast płytek do PCR można używać pasków probówek do PCR, aby zminimalizować zanieczyszczenie. Wyrzuć pokrywki tubki i nigdy nie używaj ponownie.
  2. Wiruj kulki magnetyczne, aby równomiernie je rozproszyć, i dodaj 20 μl kulek magnetycznych do każdej studzienki amplikonowej PCR, a następnie powoli pipetuj całą objętość w górę iw dół 10 razy.
  3. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Umieścić płytkę PCR na stojaku magnetycznym na 2 minuty, aż do zebrania kulek magnetycznych i uzyskania klarowności supernatantu. Usunąć i wyrzucić sklarowany osad.
  4. Umyj koraliki 200 μl świeżego 80% etanolu, gdy płytka PCR znajduje się na stojaku magnetycznym i inkubuj przez 30 s w temperaturze pokojowej na stojaku magnetycznym. Ostrożnie usunąć supernatant.
  5. Powtórz pranie po raz drugi. Teraz użyj cienkiej końcówki pipety, aby usunąć resztki etanolu ze studzienek i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez 10 minut.
  6. Wyjmij płytkę PCR ze stojaka magnetycznego i dodaj 52,5 μl 10 mM Tris pH 8,5 do każdej studzienki. Pipetować w górę i w dół 10 razy, aby zawiesić kulki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 minuty.
  7. Przenieść płytkę PCR na stojak magnetyczny w celu zebrania kulek magnetycznych i przeniesienia 50 μl supernatantu na czystą płytkę PCR. Umieścić na niej samoprzylepną, przezroczystą uszczelkę PCR i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do jednego tygodnia.

8. Przygotowanie schematu płytki do Index PCR

Uwaga: Aby wygenerować bibliotekę V1-V3, przeprowadzono drugi PCR za pomocą zestawu indeksowego (patrz Tabela materiałów). Domyślny schemat indeksowania został użyty do odwzorowania unikalnych kombinacji podwójnych indeksów dla każdej próbki (Rysunek 3B i 23).

  1. Upewnij się, że każda próbka ma unikalną kombinację 2 starterów indeksowych (tj. podwójne indeksowanie).

9. Wykonaj Index PCR, aby dołączyć kody kreskowe do sekwencji adapterów zgodnie z opisem 22 .

  1. Przenieś 2,5 μl amplikonów PCR (czystych amplikonów) na nową płytkę 96-dołkową i umieść w uchwycie na płytce indeksowej, aby ułatwić indeksowanie.
  2. Ułóż startery indeksu 1 i indeksu 2 tak, jak w przykładzie przygotowanej grafiki tablicowej (Rysunek 3B).
    nuta: Zapewnione są wskazówki wizualne, aby uniknąć pomylenia starterów: probówki ze starterem indeksu 2 powinny mieć białe nakrętki i klarowny roztwór, podczas gdy probówki ze starterem indeksu 1 powinny mieć pomarańczowe nakrętki i żółty roztwór.
  3. Zebrać reakcję mieszania wskaźnikowego PCR zgodnie z opisem w tabeli 6. Wymieszać, pipetując w górę i w dół 10 razy. Przykryj samoprzylepną, przezroczystą płytką PCR i odwiruj do zbierania w temperaturze 1 000 x g w temperaturze pokojowej przez 1 min.
  4. Uruchomić indeks PCR, korzystając z parametrów podanych w tabeli 7.

10. Oczyść ostateczną bibliotekę PCR

Uwaga: To czyszczenie PCR jest identyczne z krokiem 7 powyżej i wykorzystuje kulki magnetyczne do przeprowadzenia czyszczenia PCR indeksu PCR22.

  1. Szybko odwirować płytkę PCR z kroku 10 przy 1 000 x g przez 1 minutę, aby zebrać kondensację.
  2. Wiruj kulki magnetyczne, aby równomiernie je rozproszyć, następnie dodaj 20 μl kulek magnetycznych do każdej studzienki amplikonu PCR, a następnie pipetuj całą objętość powoli w górę iw dół 10 razy, aby wymieszać.
  3. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
  4. Umieść płytkę PCR na stojaku magnetycznym na 2 minuty, aż zbierze się kulki magnetyczne i supernatant będzie klarowny. Usunąć i wyrzucić sklarowany osad.
  5. Umyj koraliki 200 μl świeżego 80% etanolu, gdy płytka PCR znajduje się na stojaku magnetycznym i inkubuj przez 30 s w temperaturze pokojowej na stojaku magnetycznym. Ostrożnie usunąć supernatant.
  6. Powtórz pranie po raz drugi.
  7. Po drugim płukaniu użyj cienkiej końcówki pipety, aby usunąć resztki etanolu ze studzienek i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez 10 minut.
  8. Wyjmij płytkę PCR ze stojaka magnetycznego i dodaj 52,5 μl 10 mM Tris pH 8,5 do każdej studzienki. Pipetować w górę i w dół 10 razy, aby zawiesić kulki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 minuty.
  9. Przenieść płytkę PCR na stojak magnetyczny w celu zebrania kulek magnetycznych i przeniesienia 50 μl supernatantu na czystą płytkę PCR. Umieścić na niej samoprzylepną, przezroczystą uszczelkę PCR i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do jednego tygodnia.
  10. (Opcjonalnie) Przeprowadzić produkty indeksacyjne PCR na żelu agarozowym lub teście DNA o wysokiej czułości, który umożliwia ilościowy pomiar wielkości amplikonu (patrz Tabela materiałów).
    nuta: Ostateczny rozmiar indeksowanej biblioteki z tego badania wynosił 668 bp (Rysunek 3C-D).

11. Kwantyfikacja, normalizacja i łączenie indeksowanych bibliotek do sekwencjonowania

  1. Określić stężenie DNA w każdej próbce za pomocą fluorometru i zestawu do oznaczania fluorescencyjnego dsDNA (patrz tabela materiałów).
    1. Przygotować próbkę w rozcieńczeniu 1:200 (1 μl każdej próbki w 199 μl mieszanki wzorcowej dsDNA, która zawiera bufor i odczynnik) dla każdej ze zindeksowanych próbek i wzorców (190 μl mieszaniny wzorcowej dsDNA i 10 μl wzorca). Analizuj na fluorometrze przy użyciu ustawienia dsDNA.
  2. Po obliczeniu stężenia DNA znormalizuj biblioteki, obliczając średni rozmiar biblioteki. Zrób to, sumując długości adapterów, długości indeksów i rozmiar amplikonu V ze starterów i przeglądaj produkty według żelu agarozowego, aby upewnić się, że rzeczywisty rozmiar jest podobny do obliczonego rozmiaru (Rysunek 3C, patrz 22).
    1. Alternatywnie, można zastosować test DNA o wysokiej czułości, który umożliwia ilościowy pomiar integralności DNA, wielkości amplikonu i stężenia (Tabela materiałów, Rysunek 3D).
      nuta: W tym badaniu średni rozmiar biblioteki został obliczony na podstawie zsumowania długości adapterów, długości indeksów i rozmiaru amplikonów V1-V3 ze starterów. Średni wolumen wyniósł 668 punktów bazowych.
    2. Stężenia próbek normalizuje się za pomocą wzoru podanego w tabeli 8.
  3. Rozcieńczyć próbki do 4 nM i zebrać 5 μl z każdej próbki 4 nM w jednej probówce do sekwencjonowania.

12. Sekwencjonowanie biblioteki za pomocą systemu sekwencjonowania nowej generacji i analizowanie danych

  1. Uporządkuj plik library.
    nuta: Na potrzeby tego badania University of Utah High Throughput Genomics Core przeprowadził denaturację biblioteki i sekwencjonowanie próbek (zgodnie z opisem w 6,22).
  2. Przeanalizuj dane.
    nuta: Aby oddzielić dane od próbek zbiorczych, odczyty indeksów zostały zidentyfikowane i oddzielone (zgodnie z opisem w 22).
  3. Wygeneruj pliki FASTQ i wykorzystaj je do późniejszej analizy danych.

13. Analizuj sekwencjonowane dane z biblioteki amplikonów 16S

Uwaga: Ten krok jest wykonywany zgodnie z opisem w Bice et al., 20176.

  1. Zainstaluj ogólnodostępne narzędzia do analizy danych (patrz Tabela materiałów;Rozdział 24).
  2. Złóż zdemultipleksowane pliki fastq z sekwencjonowanych danych (zgodnie z opisem w25,26). Odrzuć wszystkie niezłożone sekwencje.
  3. Przeprowadzaj analizy zgodnie z protokołem wyboru de novo otwartej jednostki taksonomicznej (OTU) (zgodnie z opisem w 27).
    1. Sekwencje Bin do pojedynczego pliku fastq według sampleID i sekwencje grupowe z 97% lub większym podobieństwem do OTU, zgodnie z opisem w 28. Dopasuj reprezentatywne sekwencje zestawu podstawowego o minimalnej długości sekwencji 150 i 75% procentu tożsamości29,30. Przypisz taksonomię zgodnie z opisem28.
      nuta: Próbki można łączyć i analizować31, a następnie przypisać taksonomę i zbudować tabelę OTU32.
    2. Utwórz plik mapowania, który identyfikuje opisowe nazwy i cechy próbek, aby połączyć je z identyfikacją próbki i zweryfikować plik mapowania33,34.
    3. Utwórz sieć OTU, która łączy OTU z przykładowymi opisami za pomocą pliku mapowania35.
    4. Obliczanie podsumowań taksonomii pod względem względnej liczebności, podsumowując taksony za pomocą wykresów36.
    5. Badaj różnorodność alfa próbek przy jednolitej głębokości sekwencjonowania odpowiedniej dla próbek. Aby zdefiniować odpowiednią głębokość dla różnorodności alfa, podsumuj łączną liczbę zaobserwowaną w każdej próbce za pomocą polecenia biome summarize-table, zgodnie z opisem w 37.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kilka badań wykazało, że praktyka medycyny ciała i umysłu poprawia wyniki zdrowotne. Podobnie u myszy wzbogacenie środowiska poprawia wyniki, w tym wydłuża życie i goi ran nowotworowych6. W związku z tym opracowano procedurę EE w celu zdefiniowania roli mikrobioty w tym fenotypie, przy jednoczesnej normalizacji mikrobiomu przed rozpoczęciem eksperymentu (Rysunek 1). Co ważne, wszystkie zwierzęta hodowlane są włączane do kolonii myszy przez co na...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Procedura ta pozwala na analizę mikrobioty wyizolowanej z kału po wzbogaceniu środowiskowym zwierząt normalnych lub z nowotworami. Ponieważ są to duże eksperymenty, które obejmują hodowlę w celu uzyskania wielu zwierząt o różnej płci i genotypie, normalizacja mikrobiomu między zwierzętami przed rozpoczęciem eksperymentu jest niezbędna, aby uniknąć wpływu niezwiązanego z EE na różnorodność biologiczną mikrobiomu.

Aby zapewnić spójność między warunkami NE i EE, proces hodowli przeprowadza się w ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy B. Dalleyowi z University of Utah Genomics za sekwencjonowanie biblioteki, oraz K. Boucherowi z University of Utah Biostatistics za porady statystyczne i dostęp do tych technicznych rdzeni wspierany przez National Cancer Institute award P30 CA042014. Opisany projekt był wspierany przez National Cancer Institute Grants P01 CA073992 i K01 CA128891 oraz Huntsman Cancer Foundation.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Teklad Diets/Harlan Labs ChowHarlan Labs3980XStandardowa napromieniowana karma opracowana przez dr Mario Capecchi we współpracy z Harlan Labs.
Pościel Cell-Sorb PlusFangman Specialties82010Autoklaw przed użyciem.
System do tatuowania AIMS dla noworodkówAIMSNEO-9https://animalid.com/neonate-rodent-tattoo-identification/32. Inne systemy i tusze do tatuażu klasy zwierzęcej mogą być używane z podobnymi wynikami, w tym zestaw Aramis Micro Tattoo Kit.
System mikroizolatorów myszy Zyfone One Cage 2100 AllerZone W komplecie z klatką, filtrem AllerZone i modułowym systemem dostarczania dietyProdukty laboratoryjne82120ZFKażda klatka EE wymaga jednej z każdego katalogu # 82120ZF, 82100ZF i 82101ZF, a także dwóch 82109ZF. Jedzenie jest tylko z jednej strony.
Zyfone One Cage 2100 Life Span Enrichment DeviceProdukty laboratoryjne82109ZFKażda klatka EE wymaga jednej z każdego katalogu # 82120ZF, 82100ZF i 82101ZF, a także dwóch 82109ZF. Jedzenie jest tylko z jednej strony.
Zyfone One Cage 2100 Klatka 13-7/8" Długość X 19-1/16" Szerokość X 7-3/4" GłębokośćProdukty laboratoryjne82100ZFKażda klatka EE wymaga jednej z każdego katalogu # 82120ZF, 82100ZF i 82101ZF, a także dwóch 82109ZF. Jedzenie jest tylko z jednej strony.
Zyfone One Cage 2100 AllerZone Micro-Isolator filter topProdukty laboratoryjne82101ZFKażda klatka EE wymaga jednej z każdego katalogu # 82120ZF, 82100ZF i 82101ZF, a także dwóch 82109ZF. Jedzenie jest tylko z jednej strony.
TunnelBio-ServK3323 lub K3332Połącz ze sobą klatki i użyj do wzbogacenia
Przelotka do połączenia tunelu z klatkamiWyprodukowana przez University of Utah Machine Shopn/aUpewnij się, że materiał jest odporny na żucie i można go sterylizować w autoklawie
Koło do szybkiej jazdyBio-ServK3250 lub K3251Do użytku z igloo myszy i podłogą
Mouse IglooBio-ServK3328, K3570 lub K3327Do użytku z kółkiem i podłogą Fast-track
Mouse Igloo floorBio-ServK3244Do użytku z myszą Igloo i Fast-Track
Mouse HutBio-ServK3272, K3102 lub K3271
Crawl BallBio-ServK3330 lub K3329
Bio-hutBio-ServK3352Chata z pulpy drzewnej używana do schronienia i gniazdowania
Folia samoprzylepna VWR60941-072Służy do tymczasowego zakrycia wywierconego otworu w dużej klatce, aby zapobiec ucieczce myszy z
wentylowanego stojaka z przepływem laminarnymTechniplastBio-C36Szafka, której użyliśmy w tym badaniu, nie jest obecnie dostarczana. Bio-C36 jest bardzo podobny.
1,5 ml probówka do mikrofuzy - bez RNAzy i DNAzyDowolny dostawca
QIAamp DNA Stool MiniKitQiagen51504Ten zestaw zawiera odczynniki do 50 preparatów DNA. Bufor do lizy stolca=ASL; Bufor do lizy chlorku guanidyny = AL; Przemywać bufor 1 chlorkiem guanidyny = AW1; Bufor płuczący 2= AW2; Bufor elucyjny z EDTA=AE
Łaźnia wodna (zdolny do podgrzania do 95)Dowolny dostawcaDo inkubacji próbek kału pod kątem 94 stopni w celu lizy komórek.
Łaźnia wodna (z możliwością podgrzania do 70 stopni)Dowolny dostawcaDo inkubacji próbek kału w 70 stopniach 
Etanol (200 dowodów)Fluorometr Sigma AldrichE7023
: QubitThermoFisher ScientificQ33216
Qubit dsDNA Zestaw do oznaczania szerokiego zakresuThermoFisher ScientificQ32850
EB Buffer lub 10 mM Tris pH 8,5Qiagen19086
Startery specyficzne dla eksperymentuDowolny dostawca
Klasa PCR wodaDowolny dostawca
2X KAPA HiFi HotStart Ready Mix Kapa BiosystemsKK2601Do amplifikacji amplikonu (1,25 ml pozwala na 100 rxns).
Agaroza do uruchamiania żeli diagnostycznychDowolny dostawca
TapeStation High Sensitivity D1000 Screen Tape TraceAgilent5067-5583TapeStation lub instrumenty Bioanalyzer są powszechne w rdzeniach genomiki instytucjonalnej do analizy jakości biblioteki. Alternatywnie można użyć bioanalizatora DNA1000 chip (Agilent, 5067-1504).
Koraliki magnetyczne Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63880Kulki magentyczne Do czyszczenia PCR - 5 ml wyczyści 250 reakcji PCR
Stojak magnetycznyLife TechnologiesAM10027
Przewodnik po przygotowaniu bibliotekiIlluminaIllumina. Przygotowanie biblioteki sekwencjonowania metagenomicznego 16S: Przygotowanie amplikonów genu rybosomalnego RNA 16S dla systemu Illumina MiSeq. https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/16s/16s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf.
IlluminaIllumina Experiment Managerpodwójnym indeksowaniemBezpłatnie dostępne pod adresem: https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/experiment_manager/downloads.html
Nextera XT 96 Index KitIlluminaFC-131-1002Służy do dodawania kodów kreskowych do amplikonów
MicroAmp Optyczna 96-dołkowa płytka reakcyjnaApplied Biosystems/ThermoFisherN8010560
Oprawa do płytek indeksowych TruSeqIlluminaFC-130-1005
Samoprzylepna bezbarwna uszczelka płytowaApplied Biosystems /ThermoFisher4360954Applied Biosystems/ThermoFisher Microamp folia samoprzylepna
Sekwencjonowanie przez MiSeq z odczynnikami v3 i podwójnymi odczytami 300 bpIlluminaMS-102-3003
Zestaw kontrolny PhiXIlluminaFC-110-3001
Proteinaza K (600 mAU/ml)Qiagen19131Równoważne 20 mg/ml proteinazy K. Dostarczane z zestawem QiaAmp
Narzędzia do analizy danych Narzędzia do oprogramowaniaQiimeQIIMEInstalacja może się różnić w zależności od systemu, a na stronie internetowej QIIME opisano kilka opcji (http://qiime.org/install/install.html). W tym badaniu wykorzystano pakiet oprogramowania MacQIIME 1.9.1 (opracowany przez Werner Lab, SUNY, http://www.wernerlab.org/software/macqiime
Krok 13.2.Metoda łączenia QiimeFastQ ( http://code.google.com/p/ea-utils  ).   W tym badaniu zastosowano wiele sparowanych końców http://qiime.org/scripts/multiple_join_paired_ends.html. Aronesty, E. ea-utils: Narzędzia wiersza poleceń do przetwarzania danych sekwencjonowania biologicznego. Analiza ekspresji, Durham, Karolina Północna. (2011).
Krok 13.3.Protokółkompletacji Qiime De-Novo OTUhttp://qiime.org/scripts/pick_de_novo_otus.html.
Krok 13.3.1.Otwarte jednostki taksonomiczne (OTU) przy użyciu UclustEdgar, R.C. Search i grupowanie o rzędy wielkości szybsze niż BLAST. Bioinformatyka. 26 (19), 2460-2461, doi:10.1093/bioinformatics/btq461 (2010).
Krok 13.3.1.PynastPynastCaporaso, J.G. et al. PyNAST: elastyczne narzędzie do wyrównywania sekwencji do wyrównania szablonu. Bioinformatyka. 26 (2), 266-267, doi:10.1093/bioinformatics/btp636 (2010). 
Krok 13.3.1.PynastPynast_GreengenesDeSantis, T.Z. et al. Greengenes, sprawdzona przez chimerę baza danych genów 16S rRNA i stół warsztatowy kompatybilny z ARB. Appl Environ Microbiol. 72 (7), 5069-5072, doi:10.1128/AEM.03006-05 (2006). W tym badaniu wykorzystano wersję Greengenes 13_8
13.3.1. Uwaga: QiimeWiele podzielonych bibliotekhttp://qiime.org/scripts/multiple_split_libraries_fastq.html.
13.3.1. Uwaga: QiimePick de novo OTUs scripthttp://qiime.org/scripts/pick_de_novo_otus.html 
Krok 13.2.2.QiimeUtwórz plik mapowaniahttp://qiime.org/documentation/file_formats.html.
Krok 13.2.2.QiimeZweryfikuj plik mapowaniahttp://qiime.org/scripts/validate_mapping_file.html.
Krok 13.3.3.QiimePołącz OTU z przykładowym opisem do pliku mapowaniahttp://qiime.org/scripts/make_otu_network.html.
Krok 13.3.4.QiimePodsumuj taksony za pomocą wykresówhttp://qiime.org/scripts/summarize_taxa_through_plots.html.
Krok 13.3.5.Tabela podsumowania biomuQiimehttp://biom-format.org/documentation/summarizing_biom_tables.html  W tym badaniu wszystkie próbki zostały rozdzielone do 20 000 OTU, a następnie poddano analizie przy użyciu skryptu alfa rozrzedzającego w QIIME.
Unikalne oprogramowanie z

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bechard, A., Meagher, R., Mason, G. Environmental enrichment reduces the likelihood of alopecia in adult C57BL/6J mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 50 (2), 171-174 (2011).
  2. Jankowsky, J. L., et al. Environmental enrichment mitigates cognitive deficits in a mouse model of Alzheimer's disease. J Neurosci. 25 (21), 5217-5224 (2005).
  3. Kondo, M., et al. Environmental enrichment ameliorates a motor coordination deficit in a mouse model of Rett syndrome--Mecp2 gene dosage effects and BDNF expression. Eur J Neurosci. 27 (12), 3342-3350 (2008).
  4. Reichmann, F., Painsipp, E., Holzer, P. Environmental enrichment and gut inflammation modify stress-induced c-Fos expression in the mouse corticolimbic system. PLoS One. 8 (1), 54811(2013).
  5. Cao, L., et al. Environmental and genetic activation of a brain-adipocyte BDNF/leptin axis causes cancer remission and inhibition. Cell. 142 (1), 52-64 (2010).
  6. Bice, B. D., et al. Environmental Enrichment Induces Pericyte and IgA-Dependent Wound Repair and Lifespan Extension in a Colon Tumor Model. Cell reports. 19 (4), 760-773 (2017).
  7. Moser, A. R., Pitot, H. C., Dove, W. F. A dominant mutation that predisposes to multiple intestinal neoplasia in the mouse. Science. 247 (4940), 322-324 (1990).
  8. Angus-Hill, M. L., Elbert, K. M., Hidalgo, J., Capecchi, M. R. T-cell factor 4 functions as a tumor suppressor whose disruption modulates colon cell proliferation and tumorigenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (12), 4914-4919 (2011).
  9. Holmdahl, R., Malissen, B. The need for littermate controls. Eur J Immunol. 42 (1), 45-47 (2012).
  10. Ubeda, C., et al. Familial transmission rather than defective innate immunity shapes the distinct intestinal microbiota of TLR-deficient mice. J Exp Med. 209 (8), 1445-1456 (2012).
  11. Spor, A., Koren, O., Ley, R. Unravelling the effects of the environment and host genotype on the gut microbiome. Nat Rev Microbiol. 9 (4), 279-290 (2011).
  12. Fujiwara, R., Watanabe, J., Sonoyama, K. Assessing changes in composition of intestinal microbiota in neonatal BALB/c mice through cluster analysis of molecular markers. Br J Nutr. 99 (6), 1174-1177 (2008).
  13. Castelhano-Carlos, M. J., Sousa, N., Ohl, F., Baumans, V. Identification methods in newborn C57BL/6 mice: a developmental and behavioural evaluation. Lab Anim. 44 (2), 88-103 (2010).
  14. Curley, J. P., Davidson, S., Bateson, P., Champagne, F. A. Social enrichment during postnatal development induces transgenerational effects on emotional and reproductive behavior in mice. Frontiers in behavioral neuroscience. 3, 25(2009).
  15. National Research Council (U.S.). Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Institute for Laboratory Animal Research (U.S.). , National Academies Press. Washington, D.C. 220(2011).
  16. Silver, L. M. Mouse genetics : concepts and applications. , Oxford University Press. New York. (1995).
  17. Chen, M., Kan, L., Ledford, B. T., He, J. Q. Tattooing Various Combinations of Ears, Tail, and Toes to Identify Mice Reliably and Permanently. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 55 (2), 189-198 (2016).
  18. Truett, G. E., et al. Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and tris (HotSHOT). Biotechniques. 29 (1), 52-54 (2000).
  19. Cole, J. R., et al. Ribosomal Database Project: data and tools for high throughput rRNA analysis. Nucleic Acids Res. 42, 633-642 (2014).
  20. Bosshard, P. P., Zbinden, R., Altwegg, M. Turicibacter sanguinis gen. nov., sp. nov., a novel anaerobic, Gram-positive bacterium. Int J Syst Evol Microbiol. 52, Pt 4 1263-1266 (2002).
  21. Chen, W., Liu, F., Ling, Z., Tong, X., Xiang, C. Human intestinal lumen and mucosa-associated microbiota in patients with colorectal cancer. PLoS One. 7 (6), 39743(2012).
  22. 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation: Preparing 16S ribosomal RNA Gene Amplicons for the Illumina MiSeq System. Illumina. , Available from: https://suport.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/16s/16s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf (2017).
  23. Illumina Experiment Manager. Illumina. , Available from: https://www.illumina.com/informatics/research/experimental-design/illumina-experiment-manager.html (2017).
  24. Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nat Methods. 7 (5), 335-336 (2010).
  25. Aronesty, E. ea-utils: Command-line tools for processing biological sequencing data. Expression Analysis. , Durham, NC. (2011).
  26. Knight, R., Caporaso, J. G. QIIME: Multiple Paired Ends Script. QIIME. , Available from: http://qiime.org/scripts/multiple_join_paired_ends.html (2017).
  27. Knight, R., Caporaso, J. G. QIIME: De-Novo OTU Picking Protocol. QIIME. , Available from: http://qiime.org/scripts/pick_de_novo_otus.html (2017).
  28. Edgar, R. C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461 (2010).
  29. Caporaso, J. G., et al. PyNAST: a flexible tool for aligning sequences to a template alignment. Bioinformatics. 26 (2), 266-267 (2010).
  30. DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Appl Environ Microbiol. 72 (7), 5069-5072 (2006).
  31. Knight, R., Caporaso, J. G. QIIME: Multiple Split Libraries Fastq Script. QIIME. , Available from: http://qiime.org/scripts/multiple_split_libraries_fastq.html (2017).
  32. Knight, R., Caporaso, J. G. QIIME: De Novo Otus Script. QIIME. , http://qiime.org/scripts/pick_de_novo_otus.html (2017).
  33. Knight, R., Caporaso, J. G. QIIME: Links to Sample Identification. QIIME. , Available from: http://qiime.org/documentation/file_formats.html (2017).
  34. Knight, R., Caporaso, J. G. QIIME: Validation of Mapping File. QIIME. , Available from: http://qiime.org/scripts/validate_mapping_file.html (2017).
  35. Knight, R., Caporaso, J. G. QIIME: Link of OTUs to Sample Description Using Mapping File. QIIME. , Available from: http://qiime.org/scripts/make_otu_network.html (2017).
  36. Knight, R., Caporaso, J. G. QIIME: Summarize Taxa Through Plots. QIIME. , Available from: http://qiime.org/scripts/summarize_taxa_through_plots.html (2017).
  37. Knight, R., Caporaso, J. G. QIIME: Biome Summarize Table Command. QIIME. , Available from: http://qiime.org/documentation/summarizing_biom_tables.html (2017).
  38. Moon, C., et al. Vertically transmitted faecal IgA levels determine extra-chromosomal phenotypic variation. Nature. 521 (7550), 90-93 (2015).
  39. Chakravorty, S., Helb, D., Burday, M., Connell, N., Alland, D. A detailed analysis of 16S ribosomal RNA gene segments for the diagnosis of pathogenic bacteria. J Microbiol Methods. 69 (2), 330-339 (2007).
  40. Chen, H. M., et al. Decreased dietary fiber intake and structural alteration of gut microbiota in patients with advanced colorectal adenoma. Am J Clin Nutr. 97 (5), 1044-1052 (2013).
  41. Zhu, Q., et al. Analysis of the intestinal lumen microbiota in an animal model of colorectal cancer. PLoS One. 9 (6), 90849(2014).
  42. Evans, C. C., et al. Exercise prevents weight gain and alters the gut microbiota in a mouse model of high fat diet-induced obesity. PLoS One. 9 (3), 92193(2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

mysi model nowotworowysekwencjonowanie 16S rDNAizolacja DNA mikrobiologicznegopobieranie ka utumorigenezamikrobiota jelitowahodowla zwierz t

Powiązane artykuły