Artykuł metodologiczny

Dwufotonowe obrazowanie przyżyciowe leukocytów podczas odpowiedzi immunologicznej w wątrobie myszy leczonej lipopolisacharydem

10.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57191

⸱

6 lutego 2018

 ,  ,  , 
1Department of Anatomy, Yonsei University College of Medicine, 2Brain Korea 21 Plus Project for Medical Science, Yonsei University College of Medicine, 3Department of Surgery, Yonsei University College of Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ustaliliśmy nowatorski protokół chirurgiczny do obrazowania dwufotonowego żywej wątroby myszy z minimalną inwazją. Dzięki tej technice zidentyfikowaliśmy szczegółową strukturę wątroby podczas endotoksemii wywołanej lipopolisacharydem. Przewidujemy, że metoda ta może być wykorzystana do określenia skuteczności różnych odczynników do migracji leukocytów wątrobowych.

Streszczenie

Sepsa to rodzaj ciężkiej infekcji, która może powodować niewydolność narządów i uszkodzenie tkanek. Chociaż wskaźniki śmiertelności i zachorowalności związane z sepsą są niezwykle wysokie, żadne bezpośrednie leczenie ani mechanizm związany z narządami nie zostały szczegółowo zbadane w czasie rzeczywistym. Wątroba jest kluczowym narządem, który zarządza toksynami i infekcjami w organizmie człowieka. W tym przypadku naszym celem było wykonanie obrazowania przyżyciowego wątroby myszy po indukcji endotoksemii w celu śledzenia ruchliwości komórek odpornościowych, takich jak neutrofile i makrofagi torebki wątroby (LCM). W związku z tym zaprojektowaliśmy nowatorską metodę chirurgiczną do ekspozycji wątroby za pomocą minimalnie inwazyjnej operacji. Myszom wstrzyknięto dootrzewnowo lipopolisacharyd (LPS), powszechną endotoksynę. Stosując nasze nowatorskie podejście chirurgiczne do ekspozycji i obrazowania przyżyciowego wątroby myszy, stwierdziliśmy, że rekrutacja neutrofili w wątrobie myszy z zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) traktowanym LPS była zwiększona w porównaniu z wątrobą traktowaną solą fizjologiczną buforowaną fosforanami. Po leczeniu LPS liczba neutrofili znacznie wzrosła z czasem. Dodatkowo, używając myszy CX3Cr1-GFP, z powodzeniem zwizualizowaliśmy makrofagi rezydujące w wątrobie zwane LCM. Dlatego, aby zbadać skuteczność nowych odczynników w kontrolowaniu ruchliwości immunologicznej in vivo, określenie ruchliwości i morfologii neutrofili i LCM w wątrobie może pozwolić nam zidentyfikować efekt terapeutyczny w niewydolności narządów i uszkodzeniach tkanek spowodowanych aktywacją leukocytów w sepsi.

Wprowadzenie

Wątroba jest głównym organem metabolicznym u ssaków; działa jako wieża kontrolna dla energii, hormonów i detoksykacji1. Ze względu na jego znaczenie naukowcy przeprowadzili wiele eksperymentów in vitro i in vivo, aby wyjaśnić zmiany w wątrobie podczas stanu zapalnego. Mikroskopia przyżyteczna została wykorzystana do uchwycenia obrazów na żywo z liver2 . Rzeczywiście, wprowadzono różne metody obrazowania wątroby2,3,4,5,6. Jednakże, aby opracować bardziej uproszczone podejście chirurgiczne i osiągnąć stabilizację narządu docelowego i komórek odpornościowych, zaprojektowaliśmy prosty protokół, który może pomóc naukowcom zminimalizować wysiłek związany z obrazowaniem przyżyciowym.

W tym badaniu wprowadziliśmy stabilną i nowatorską komorę obrazowania oraz technikę chirurgiczną, które mogą być wykorzystane do zminimalizowania krwawienia i możliwych infekcji. Potwierdziliśmy, że wątroba pozostała nienaruszona przez ponad 2 godziny. Dzięki tej metodzie udało nam się zidentyfikować morfologie LCMs7 i neutrofili w warunkach septycznych. Ponieważ metoda ta minimalizuje fizyczne i biologiczne czynniki zakłócające, takie jak drżenie i nieoczekiwany stan zapalny podczas zabiegu chirurgicznego, przewidujemy, że metoda ta może być stosowana do obserwacji ostrych reakcji komórek odpornościowych w wątrobie w odpowiedzi na odczynniki takie jak LPS.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Yonsei University College of Medicine, Korea. Myszy z zielonym białkiem fluorescencyjnym LysM (GFP; gfp/+) 8 i CX3Cr1-GFP (gfp/+)9 myszy w wieku 8-12 tygodni wykorzystano do obrazowania przyżyciowego. Wszystkie narzędzia chirurgiczne zostały autoklawowane i zdezynfekowane 70% alkoholem.

1. Specjalnie zaprojektowana komora obrazowania wątroby myszy z narzędziami pomocniczymi

  1. Konstrukcja komory do obrazowania wątroby myszy
    1. Wykonaj komorę o następującym rozmiarze do obrazowania wątroby myszy (Rysunek 1): komora wewnętrzna (120 mm długości × 160 mm szerokości × 30 mm wysokości), komora zewnętrzna (100 mm długości × 100 mm szerokości × 24 mm wysokości), (Ф 3 mm × 30 mm wysokości), nakrętki (Ф 4 mm) i nakrętki w kształcie skrzydełek (Ф 4 mm).
    2. Odmierz utwardzacz i bazę elastomerową w stosunku 1:9, aby uzyskać łącznie 120 g silikonu.
    3. Umieść płynną mieszaninę silikonu w kolbie Erlenmeyera o pojemności 250 ml i dobrze wymieszaj. Następnie umieścić kolbę w eksykatorze i usuwać pęcherzyki powietrza przez około 1 godzinę pod próżnią przez pompę.
    4. Wlej płynną mieszankę silikonu do specjalnie zaprojektowanej komory myszy o wysokości do 10 mm i pozwól jej utwardzić się przez kilka dni (Rysunek 1A).
  2. Przygotowanie preparatów nakrywkowych i łoża mocującego wątrobę
    1. Na metalowej ramie przymocuj szkło nakrywkowe za pomocą kleju silikonowego. Pozostaw do wyschnięcia na 1 dzień (Rysunek 1B).
    2. Aby skutecznie utrzymać wodę destylowaną do soczewki zanurzeniowej w wodzie, niezbędna jest półtrwała struktura blokująca wodę. Zrób okrągły klej silikonowy o grubości 1 mm i utwardź go przez noc.
    3. Wymieszać utwardzacz i bazę elastomerową, a następnie wlać do płytki 6-dołkowej na wysokości około 8-10 mm. Przeprowadzić proces utwardzania zgodnie z opisem w 1.1.2-1.1.4.

2. Przygotowanie LPS

  1. Przygotować sterylną sól fizjologiczną buforowaną fosforanem 1× (PBS) w celu rozcieńczenia proszku LPS z serotypu enteritidis Salmonella enterica. (1× PBS: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4).
  2. Podgrzej PBS w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C i ostrożnie otwórz butelkę z proszkiem LPS (25 mg).
  3. Za pomocą pomocy do pipetowania wlać sterylny PBS (5 ml) do butelki z proszkiem LPS i delikatnie wymieszać lub zawiesić roztwór, aby przygotować roztwór podstawowy.
    UWAGA: Po upłynnieniu proszku LPS ostre wirowanie może powodować powstawanie pęcherzyków. Unikaj robienia bąbelków, aby zminimalizować straty podczas robienia porcji w probówkach o pojemności 1,5 ml.
  4. Przechowywać podstawowy roztwór LPS w temperaturze -20 °C i rozcieńczyć go do 1 mg/ml roztworu LPS do wstrzykiwań.
  5. Wstrzyknąć 1 mg/ml roztwór LPS (20 mg/kg) do otrzewnej nieznieczulonej myszy za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml. W przypadku zwierzęcia kontrolnego wstrzyknąć taką samą objętość PBS.
  6. Odczekaj 2 godziny, aby uzyskać wystarczającą odpowiedź zapalną.

3. Przygotowanie teksańsko-czerwonego dekstranu do barwienia naczyń krwionośnych

  1. Przygotuj dwie stożkowe probówki o pojemności 15 ml i 10 ml sterylnego PBS.
  2. Rozcieńczyć deszek Texas-Red Dextran w proszku (25 mg) w 3 ml PBS i dobrze wymieszać. Przenieść mieszaninę do pustej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
  3. Przenieść pozostały PBS (7 ml) do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej mieszaninę dekstranu (3 ml).
  4. Podłącz filtr strzykawkowy 0,45 μm do końcówki strzykawki o pojemności 10 ml. Filtr strzykawkowy powinien zastąpić igłę.
  5. Przefiltrować mieszaninę dekstranu (10 ml). Równomiernie docisnąć strzykawkę, aby uniknąć rozlania.
  6. Dozować 500 μl roztworu dekstranu o stężeniu 2,5 mg/ml w probówce o pojemności 1,5 ml z zablokowanym światłem i przechowywać w temperaturze -20 °C. Po rozmrożeniu przechowywać w temperaturze 4°C.

4. Proces chirurgiczny

  1. Przed zabiegiem należy zdezynfekować stół operacyjny i wszystkie narzędzia przy użyciu 70% alkoholu. Następnie ustaw narzędzia do operacji wątroby i ustaw płytę grzewczą na 37 °C (Rysunek 2A, B).
  2. W celu znieczulenia należy wstrzyknąć myszom 30 mg/kg tiletaminy/zolazepamu i 10 mg/kg ksylazyny. Roztwory te można mieszać i rozcieńczać w PBS w celu jednoczesnego wstrzykiwania. Potwierdź znieczulenie, delikatnie naciskając palec u nogi myszy. Kontynuuj następny krok, gdy nie ma odruchu.
  3. Nałóż niewielką ilość maści do oczu, aby zapobiec wysuszeniu siatkówki myszy.
  4. Usuń owłosienie na ciele w okolicy brzucha za pomocą kremu do depilacji (Rysunek 2C).
  5. Wstrzyknąć 200 μl roztworu dekstranu Texas-Red (stężenie 2,5 mg/ml) przez żyłę ogonową lub wstrzyknięcie zaoczodołowe za pomocą strzykawki insulinowej (Rysunek 2D).
  6. Zaznacz markerem prawy obszar podżebrowy. Linię należy narysować od wyrostka mieczykowatego do końca żebra. Przetnij naskórek kleszczami i nożyczkami (Rysunek 2E, F).
  7. Otwórz jamę brzuszną za pomocą mikronożyczek i kleszczy i ostrożnie odsłaniaj wątrobę. Lewy płat boczny należy rozwinąć za pomocą wacików bawełnianych (Rysunek 2G, H).
  8. Wlać 500 μl sterylnego PBS do jamy brzusznej, aby zapobiec wysuszeniu wątroby.
  9. Umieść mysz w pozycji prawoodleżynowej w specjalnie zaprojektowanej komorze i nałóż niewielką ilość kleju tkankowego na łóżko silikonowe. Następnie ostrożnie przymocuj wątrobę za pomocą bawełnianych wacików (Rysunek 2I).
    UWAGA: Ponieważ tkanka wątroby jest wyjątkowo krucha, nie należy jej mechanicznie wyciągać. Delikatnie rozwałkuj go za pomocą bawełnianych wacików.
  10. Kilka sekund później ponownie zwilż wątrobę 500 μl sterylnego PBS, aby uniknąć wysuszenia wątroby. Umieść metalową ramkę na wątrobie i mocno przymocuj ją nakrętkami (Rysunek 2J).

5. Obrazowanie wątroby w trybie przyżyciowym za pomocą mikroskopii dwufotonowej

  1. Uruchom oprogramowanie ZEN (Carl Zeiss), aby włączyć laser, ustaw długość fali na 880 nm i ustaw kanały zielony i czerwony. Dostosuj moc lasera w zależności od intensywności fluorescencji (Rysunek 3A). Informacje o filtrze emisji są następujące: Zielony/Alexa488, 500-550 nm i Czerwony/Alexa 555, 575-610 nm.
  2. Umieść komorę na stoliku do obrazowania i umieść soczewkę obiektywu zanurzonego w wodzie 20X blisko szkła osłonowego.
  3. Zamocuj grzałkę z gumy silikonowej pod korpusem myszy, aby utrzymać temperaturę jej ciała (Rysunek 3B).
  4. Upuść 500 μl wody destylowanej na metalową ramkę, a następnie przyciągnij soczewkę obiektywu do wątroby (Rysunek 3C).
  5. Dostosuj ostrość i określ głębokość i czas obszaru obrazowania.
  6. Przeprowadzanie obrazowania.
  7. W przypadku długotrwałego obrazowania należy wstrzykiwać pół dawki mieszaniny tiletaminy/zolazepamu i ksylazyny co godzinę podczas obrazowania. Na tym etapie niezbędne jest utrzymanie temperatury ciała myszy na poziomie 37 °C. Zawsze miej oko na mysz, ponieważ czas znieczulenia różni się u każdej myszy.
    UWAGA: Ta metoda nie nadaje się do rekonwalescencji po operacji i obrazowaniu. Etycznie poświęcamy mysz zaraz po operacji.
  8. Sprawdzaj odruchy pedałowania co 30 minut, aby zapewnić stabilne znieczulenie.

6. Analiza danych

  1. Otwórz oprogramowanie do analizy danych Volocity, a następnie zaimportuj surowe dane z biblioteki do oprogramowania.
  2. Usuń szum z obrazu, aby dopasować go do sytuacji i zrób migawkę.
    UWAGA: Aby uzyskać gładkie obrazy, użyj filtra "Fine" (Dokładny) lub "Mediana". Ponadto użyj funkcji "Poprawa kontrastu", aby ciemne lub rozmyte obrazy były wyraźniejsze.
  3. Dopasuj edytowane elementy do 100% i wyeksportuj jako pliki JPEG lub TIFF w przypadku obrazów migawki i pliki AVI w przypadku filmów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Opracowano prostą i bardzo stabilną komorę obrazującą. Dno komory pokryto silikonem, co zapobiegało przesuwaniu się ciała i organów myszy. Dodatkowo, dzięki odpowiedniej elastyczności silikonu, udało się zapobiec przewidywanym uszkodzeniom wywołanym naciskiem szkiełka nakrywkowego (Rysunek 1A, C). Następnie, w celu unieruchomienia wypreparowanej wątroby na okrągłym podłożu silikonowym, zastosowano bezpieczny dla tkanek klej (Vet bond). Metoda...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wątroba była aktywnie badana przez wiele grup 3,10, ze względu na znaczenie jej funkcji. Na przykład Heymann i wsp. zasugerowali delikatną metodę z użyciem agarozy. Chociaż metoda ta okazała się bardzo precyzyjna, ustawienie agarozy wymaga czasu. Jednak dzięki naszej metodologii wszystkie procedury można przeprowadzić w ciągu 30 minut, minimalizując inne czynniki zakłócające. Po drugie, stabilizacja wątroby jest niezwykle ważna, ponieważ bicie serca może zakłócać...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez grant z Narodowej Fundacji Badawczej Korei (NRF) ufundowany przez rząd Korei (MSIP; grant nr 2016R1A2B4008199 dla Y-M. H.), oraz Ministerstwa Zdrowia i Opieki Społecznej, Republika Korei (numer grantu: HI14C1324).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Specjalnie zaprojektowana komoraInstrumenty Live Cell Specjalniezaprojektowany rozmiar
Metalowa prowadnica pokrywyInstrumenty Live CellSpecjalnie zaprojektowany rozmiar
Szkło nakrywkoweMikroskopia elektronowa Sciences#72204-03
Sylgard 184 Zestaw elastomerów silikonowychDow Corning
Kolba ErlenmeyeraDURAN21 216 36
Płytka do hodowli komórkowej (typ płaski)HYUNDAI Micro Co.H31006
EksykatorADARSH55204
High Q BOND SE 5 mLBJM LABDo produkcji półtrwałej zapory
Elastyczne grzejniki z gumy silikonowejSERIA OMEGASRFR / SRFG, M1250/0800
Zasilacz prądu stałegoToyotechDP30-03A
SolankaDomowa roboty
Lipopolisacharydy (LPS) z serotypu enterylostycznego Salmonella enteriaSigma-AldrichL6011
Texas Red DextranThermo Fisher ScientificD1830
15 mL Polipropylen o wysokiej czystości
rurka stożkowa		FALCON14-959-49B
0,45 μ Filtr m (Filtr strzykawkowy Minisart)Sartorius16555k
1,5 ml Micro Tube, BursztynowyAxygenMCT-150-XDo strzykawki blokującej światło
1 mlKorea VaccineKV-S01
Strzykawka 3 ml KoreaVaccineKV-S03
10 ml strzykawkaKorea VaccineKV-S10
0,3 ml strzykawka insulinowaBecton Dickinson324900
Krem do depilacji 100 mlNatur
ciała Wacik bawełnianyABDI
Zoletil 50 5 mLVirbac
Rompun 10 mLBayer
Płyta grzewczaInstrumenty Live CellPH-S-10Specjalnie zaprojektowany
rozmiar kontrolera DCInstrumentydo żywych komórekCU-301
Nożyczki do mikrodesekcjiAparat Harvard72-5418
NożyczkiRobozRS-5882
KleszczeRobozRS-5137
Vet bondOprogramowanie 3M1469SB
ZEN (Black Edition)Carl ZeissProgram dla LSM 7 MP
LSM 7 MPCarl Zeiss
Program do analizyobjętościPerkinElmer
buforowana fosforanami

Bibliografia

  1. Girard, J. R., et al. Fuels, hormones, and liver metabolism at term and during the early postnatal period in the rat. J Clin Invest. 52 (12), 3190-3200 (1973).
  2. Marques, P. E., et al. Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy. Nat Protoc. 10 (2), 258-268 (2015).
  3. Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. L. Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics. J Vis Exp. (101), e52303(2015).
  4. Honda, M., et al. Intravital imaging of neutrophil recruitment in hepatic ischemia-reperfusion injury in mice. Transplantation. 95 (4), 551-558 (2013).
  5. Jenne, C. N., Wong, C. H., Petri, B., Kubes, P. The use of spinning-disk confocal microscopy for the intravital analysis of platelet dynamics in response to systemic and local inflammation. PLoS One. 6 (9), e25109(2011).
  6. Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Sci Transl Med. 4 (158), 158ra145(2012).
  7. Sierro, F., et al. A Liver Capsular Network of Monocyte-Derived Macrophages Restricts Hepatic Dissemination of Intraperitoneal Bacteria by Neutrophil Recruitment. Immunity. 47 (2), 374-388 (2017).
  8. Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 719-726 (2000).
  9. Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol Cell Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).
  10. Heymann, F., et al. Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice. J Vis Exp. (97), (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ruchomo leukocyt wodpowied odporno ciowa w trobyrekrutacja neutrofilimakrofagi torebki w trobyw troba myszy traktowana LPSanaliza obrazowania intravitalnegomikroskopia fluorescencyjnachirurgiczne ods oni cie w trobymodel wstrz su septycznego

Powiązane artykuły