Przedstawiony tutaj protokół opisuje platformę do identyfikacji małych cząsteczek w leczeniu chorób wątroby. Przedstawiono szczegółowy opis szczegółowy różnicowania iPSC w komórki o charakterystyce hepatocytów na płytkach 96-dołkowych oraz wykorzystania komórek do badań przesiewowych w poszukiwaniu małych cząsteczek o potencjalnej aktywności terapeutycznej.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wykorzystanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek hepatocytów pochodzących z komórek macierzystych do odkrywania leków
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zdolność do różnicowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) w komórki podobne do hepatocytów (HLC) stwarza nowe możliwości badania wrodzonych błędów w metabolizmie wątrobowym. Jednak, aby zapewnić platformę wspierającą identyfikację małych cząsteczek, które mogą być potencjalnie stosowane w leczeniu chorób wątroby, procedura wymaga formatu hodowli, który jest kompatybilny z badaniami przesiewowymi tysięcy związków. W tym miejscu opisujemy protokół wykorzystujący całkowicie zdefiniowane warunki hodowli, które umożliwiają powtarzalne różnicowanie ludzkich iPSC do komórek podobnych do hepatocytów na 96-dołkowych płytkach do hodowli tkankowych. Podajemy również przykład wykorzystania platformy do badań przesiewowych związków pod kątem ich zdolności do obniżania poziomu apolipoproteiny B (APOB) wytwarzanej z hepatocytów pochodzących z iPSC generowanych od pacjenta z hipercholesterolemią rodzinną. Dostępność platformy, która jest kompatybilna z odkrywaniem leków, powinna umożliwić naukowcom zidentyfikowanie nowych metod leczenia chorób wątroby.
Wprowadzenie
Sukces w identyfikowaniu leków, które mogą być użyte do zwalczania rzadkiej choroby, zależy od opracowania testów, które mogą być wykorzystane do badań przesiewowych. Hipotezy lub badania przesiewowe oparte na celach (farmakologia odwrotna) są przydatne, ale wymagają szczegółowego zrozumienia molekularnych podstaw choroby. Badania przesiewowe fenotypowe (farmakologia klasyczna) pozwalają uniknąć konieczności szczegółowego zrozumienia szlaków biochemicznych, ale opierają się na opracowaniu modeli, które dokładnie odzwierciedlają patofizjologię choroby. Pomimo entuzjazmu dla podejść opartych na celach, analizy zatwierdzonych przez FDA leków pierwszej w swojej klasie pok....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Hodowla ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych
- Powlekanie rekombinowanego ludzkiego białka fuzyjnego E-kadheryny Fc (E-cad-Fc) lub innych matryc odpowiednich do hodowli hPSC6
- Rozcieńczyć E-cad-Fc do 15 μg/ml roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami firmy Dulbecco zawierającym wapń i magnez (DPBS (+)).
- Pokryć 100-milimetrowe zawiesiny kultur tkankowych 5 ml rozcieńczonego E-cad-Fc i inkubować w temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 godzinę. Usunąć substrat i zastąpić 5 ml pożywki (np. mTeSR1 zwanej dalej M-podłożem)7.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Generowanie komórek-podobnych do hepatocytów: Rycina 1 przedstawia ramy czasowe zmian zachodzących podczas różnicowania ludzkich iPSC w komórki podobne do hepatocytów. Hodowla iPSC na E-Cad-Fc daje kolonie o średnicy około 2 mm, które wykazują ekspresję markera pluripotencji OCT4 (Rycina 1A-B). Morfologia komórek hodowanych na matrycy z E-kadheryny będzie się nie.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Odkrywanie leków w oparciu o cele, w ramach których identyfikowane są małe cząsteczki wpływające na aktywność określonego białka, było przedmiotem wielu istniejących badań przesiewowych. Chociaż podejście to dostarczyło wielu farmaceutyków, badania przesiewowe oparte na odwróceniu fenotypu, klasyczna farmakologia, były bardziej skuteczne w identyfikacji pierwszych w swojej klasie związków, które były klinicznie skuteczne1. Wadą odkrywania leków fenotypowych jest to, że zależy ono od dostępności od.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health (DK55743, DK087377, DK102716 i HG006398 do S.A.D.). Chcielibyśmy podziękować dr Behshadowi Pournasrowi, dr Jamesowi Heslopowi i Ran Jingowi za ich wkład.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Sterylne szalki do hodowli tkankowych 100 mm x 20 mm | Corning | 430167 | |
| 100 mm x 20 mm sterylne zawiesinowe naczynia do hodowli | Corning | 430591 | |
| 96-dołkowa płytka do hodowli tkankowej | Corning | 3595 | |
| Albumina antyludzka | Dako | A 0001 | |
| Anty-ludzka FOXA2(6C12) | Novus Biologiczna | H00003170-M12 | |
| Anty-ludzka HNF4 alfa | Santa Cruz | SC-6556 | |
| Przeciwciało anty-ludzkie Oct-3/4 | Santa Cruz | SC-9081 | |
| Anty-ludzkie SOX17 | R& D | AF1924 | |
| Anty-ludzki TRA-1-60 FITC sprzężony | z miliporem | FCMAB115F | |
| aktywiną A Rekombinowane białko ludzkie | Invitrogen | PHC9563 | |
| B-27 Suplement, bez insuliny | Suplement Invitrogen | 0050129SA | |
| B-27, bez surowicy | Invitrogen | 17504044 | |
| BMP4 Rekombinowane białko ludzkie | Invitrogen | PHC9533 | |
| Odczynnik do dysocjacji komórek StemPro Akumulator | Invitrogen | A1110501 | |
| CellTiter-Glo Test żywotności komórek luminescencyjnych | Promega | 7572 | |
| DPBS+(wapń, magnez) | Invitrogen | 14040-133 | |
| DPBS-(bez wapnia, bez magnezu) | Invitrogen | 14190-144 | |
| DMEM/F-12, HEPES | Invitrogen | 11330057 | |
| Zestaw rozwojowy ELISA dla ludzi APOB Zestaw rozwojowy ELISA | Mabtech | 3715-1H-20 | |
| Czynnik wzrostu fibroblastów 2 (FGF2) | PHG0023 | Invitrogen | |
| (zestaw HCM Bullet) | Lonza | CC-3198 | |
| Czynnik wzrostu hepatocytów (HGF) | Invitrogen | PHC0321 | |
| L-glutamina | Invitrogen | 25030081 | |
| MEM Roztwór aminokwasów endogennych | Invitrogen | 11140076 | |
| Onkostatyna M (OSM) Rekombinowane białko ludzkie | Invitrogen | PHC5015 | |
| Penicylina-Streptomycyna | Invitrogen | 15140163 | |
| Pożywka z pluripotencjalnych komórek macierzystych bez pożywki: mTesR1 | STEMCELL technologies | 5850 | |
| Matryca błony podstawnej o obniżonym współczynniku wzrostu | Invitrogen | A1413301 | |
| RPMI 1640 Medium, HEPES | Invitrogen | 22400105 | |
| StemAdhere Zdefiniowana matryca dla hPSC (E-cad-Fc) | Primorigen Biosciences | S2071 | |
| TMB-ELISA Substrate Solution | Thermo Scientific | 34022 | |
| Anty-TRA-1-60 FITC sprzężony | z miliporem | FCMAB115F | |
| versenem (EDTA) 0,02% | Lonza | 17-711E | |
| Y-27632 Inhibitor ROCK | STEMCELL Technologies | 72302 |
Bibliografia
- Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered? Nat Rev Drug Discov. 10 (7), 507-519 (2011).
- Zeilinger, K., Freyer, N., Damm, G., Seehofer, D., Knospel, F. Cell sources for in vitro human liver cell culture models. Exp Biol Med (Maywood. 241 (15), 1684-1698 (20....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Przeglądaj więcej artykułów
Ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzystewysokoprzepustowe przesiewanieplatforma odkrywania leków96-dołkowe płytki do hodowli tkankowychzdefiniowane warunki hodowlitest apolipoproteiny Bmodel rodzinnej hipercholesterolemiiprotokół różnicowania w kierunku hepatocytówmetoda przesiewania związków
