Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek hepatocytów pochodzących z komórek macierzystych do odkrywania leków

DOI:

10.3791/57194

⸱

19 maja 2018

 ,  , 
1Department of Regenerative Medicine and Cell Biology, Medical University of South Carolina

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiony tutaj protokół opisuje platformę do identyfikacji małych cząsteczek w leczeniu chorób wątroby. Przedstawiono szczegółowy opis szczegółowy różnicowania iPSC w komórki o charakterystyce hepatocytów na płytkach 96-dołkowych oraz wykorzystania komórek do badań przesiewowych w poszukiwaniu małych cząsteczek o potencjalnej aktywności terapeutycznej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zdolność do różnicowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) w komórki podobne do hepatocytów (HLC) stwarza nowe możliwości badania wrodzonych błędów w metabolizmie wątrobowym. Jednak, aby zapewnić platformę wspierającą identyfikację małych cząsteczek, które mogą być potencjalnie stosowane w leczeniu chorób wątroby, procedura wymaga formatu hodowli, który jest kompatybilny z badaniami przesiewowymi tysięcy związków. W tym miejscu opisujemy protokół wykorzystujący całkowicie zdefiniowane warunki hodowli, które umożliwiają powtarzalne różnicowanie ludzkich iPSC do komórek podobnych do hepatocytów na 96-dołkowych płytkach do hodowli tkankowych. Podajemy również przykład wykorzystania platformy do badań przesiewowych związków pod kątem ich zdolności do obniżania poziomu apolipoproteiny B (APOB) wytwarzanej z hepatocytów pochodzących z iPSC generowanych od pacjenta z hipercholesterolemią rodzinną. Dostępność platformy, która jest kompatybilna z odkrywaniem leków, powinna umożliwić naukowcom zidentyfikowanie nowych metod leczenia chorób wątroby.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sukces w identyfikowaniu leków, które mogą być użyte do zwalczania rzadkiej choroby, zależy od opracowania testów, które mogą być wykorzystane do badań przesiewowych. Hipotezy lub badania przesiewowe oparte na celach (farmakologia odwrotna) są przydatne, ale wymagają szczegółowego zrozumienia molekularnych podstaw choroby. Badania przesiewowe fenotypowe (farmakologia klasyczna) pozwalają uniknąć konieczności szczegółowego zrozumienia szlaków biochemicznych, ale opierają się na opracowaniu modeli, które dokładnie odzwierciedlają patofizjologię choroby. Pomimo entuzjazmu dla podejść opartych na celach, analizy zatwierdzonych przez FDA leków pierwszej w swojej klasie pokazują, że badania fenotypowe były znacznie bardziej udane1. Ogólnym celem tej metody jest stworzenie platformy do wysokoprzepustowych badań przesiewowych, które można wykorzystać do identyfikacji małych cząsteczek w leczeniu metabolicznej choroby wątroby. Opisano kilka modeli in vitro, w tym pierwotne hepatocyty, komórki wątrobiaka i komórki progenitorowe wątroby2. Jednak większość z tych modeli ma ograniczenia i istnieje zapotrzebowanie na nowe modele, które mogą dokładnie podsumować patofizjologię metabolicznych niedoborów wątroby w hodowli. Ostatnio ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste w połączeniu z edycją genów dały możliwość modelowania nawet najrzadszych chorób rzadkich w hodowli bez konieczności bezpośredniego dostępu do pacjentów3. Chociaż wykorzystanie specyficznych dla pacjenta iPSC jako narzędzia do odkrywania małych cząsteczek do leczenia rzadkich chorób wątroby jest koncepcyjnie uzasadnione, istnieje tylko kilka doniesień wykazujących wykonalność tego podejścia4. Jednak niedawno stworzyliśmy platformę, która wykorzystała hepatocyty pochodzące z iPSC, aby skutecznie zidentyfikować leki, które można ponownie wykorzystać do leczenia niedoborów metabolizmu wątroby5.

Ten protokół wyjaśnia proces różnicowania ludzkich iPSC do komórek podobnych do hepatocytów na 96-dołkowych płytkach i używania ich do badania przesiewowego biblioteki małych cząsteczek. Opisano w nim również analizę punktu końcowego na przykładzie hipercholesterolemii jako przykładu metabolicznej choroby wątroby. Takie podejście powinno być przydatne do badania roli i zastosowania małych cząsteczek w kontekście zakaźnych chorób wątroby, metabolicznych chorób wątroby, toksyczności leków i innych zaburzeń wątroby.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hodowla ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

  1. Powlekanie rekombinowanego ludzkiego białka fuzyjnego E-kadheryny Fc (E-cad-Fc) lub innych matryc odpowiednich do hodowli hPSC6
    1. Rozcieńczyć E-cad-Fc do 15 μg/ml roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami firmy Dulbecco zawierającym wapń i magnez (DPBS (+)).
    2. Pokryć 100-milimetrowe zawiesiny kultur tkankowych 5 ml rozcieńczonego E-cad-Fc i inkubować w temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 godzinę. Usunąć substrat i zastąpić 5 ml pożywki (np. mTeSR1 zwanej dalej M-podłożem)7.
      nuta: Pożywka hodowlana używana w tym protokole jest przygotowywana zgodnie z opublikowanymi protokołami7. Opisano jednak kilka innych preparatów pożywek lub które są dostępne na rynku, które prawdopodobnie są zgodne z tą procedurą.
    3. Pobrać fiolkę z kriokonserwowanymi iPSC z ciekłego azotu. Rozmrozić w temperaturze 37 °C, aż pozostanie mały kryształek lodu. Delikatnie pipetować komórki do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 4 ml pożywki M.
    4. Wirować przy 300 x g przez 5 min. Usunąć supernatant i delikatnie ponownie zawiesić komórki za pomocą 5 ml pożywki uzupełnionej 10 μM Y-27632, selektywnym inhibitorem kinazy białkowej (ROCK) związanej z Rho, zwiniętej cewki.
    5. Usunąć pożywkę M z kroku 1.1.2 i przenieść 5 ml komórek z kroku 1.1.4 na 100-milimetrowe płytki do hodowli tkankowych w zawiesinie E-cad-Fc.
  2. Utrzymanie ludzkich komórek iPS w kulturze
    1. Gdy iPSC osiągną około 80% konflufluacji, usuń pożywkę hodowlaną i przemyj raz DPBS bez wapnia i magnezu (-). Zassać DPBS (-) i dodać wystarczającą ilość 0,02% roztworu EDTA, aby pokryć płytki, a następnie inkubować do 3 minut w temperaturze pokojowej.
      nuta: Przy 80% konfluencji płytka powinna zawierać około 2 x 107 komórek. Ważne jest, aby nie przerastać komórek i zapewnić, że komórki zachowują niezróżnicowaną morfologię. Pluripotencję komórek można określić przez barwienie markerem komórek macierzystych Tra-1-60 lub równoważnym8.
    2. Gdy tylko komórki zaczną się uwalniać, usuń 0,02% roztwór EDTA i zalej naczynie 10 ml pożywki M, aby uwolnić komórki. Pomóc w odłączaniu iPSC, delikatnie pipetując.
      nuta: Średni czas inkubacji komórek do odłączenia wynosi około 3 minut, ale należy go określić empirycznie dla każdej linii iPSC. Komórki powinny zostać uwolnione w postaci małych skupisk zawierających około 5 - 10 iPSC na klaster.
    3. Przenieść 1/10 zawieszonych komórek na świeżą zawiesinę 100 mm pokrytą E-cad-Fc, naczynie do hodowli tkankowej zawierające 5 ml pożywki M. Inkubować kultury w temperaturze 37 °C w temperaturze 4%O2/5% CO2 i codziennie zmieniać pożywkę.
      nuta: Chociaż iPSC są rutynowo hodowane w fizjologicznych warunkach tlenowych w celu promowania pluripotencji, iPSC mogą być również hodowane przy użyciu tlenu z otoczenia.

2. Różnicowanie ludzkich iPSC do komórek hepatocytów na płytkach 96-dołkowych

Uwaga: Ta sekcja opisuje różnicowanie iPSC w formacie, który jest zgodny z badaniami przesiewowymi. Dzięki takiemu podejściu możliwe jest nakłonienie ludzkich iPSC do różnicowania się i tworzenia komórek podobnych do hepatocytów w ciągu 20 dni. Chociaż jest to odpowiednie dla większości testów, długość hodowli można wydłużyć, aby poprawić dojrzałość komórek.

  1. Powlekanie 96-dołkowych płytek do hodowli tkankowych matrycą błony podstawnej o obniżonym współczynniku wzrostu
    1. Przygotować wywar, rozcieńczając matrycę do 2 mg/ml lodowato zimnym, sterylnym podłożem do hodowli tkankowych DMEM/F12. Podzielić matrycę na 250 μl podwielokrotności i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu, gdy będzie to wymagane. Schłodzić 10 ml DMEM/F12 na lodzie przez 30 minut. Pobrać 250 μl podwielokrotności 2 mg/ml wywaru o matrycy i rozmrozić na lodzie.
    2. Połączyć matrycę z 10 ml zimnego DMEM/F12, delikatnie mieszając za pomocą wstępnie schłodzonej pipety, aby uzyskać końcowe stężenie 0,05 mg/ml.
    3. Przenieść 100 μl rozcieńczonej matrycy do każdego dołka 96-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Inkubować w temperaturze 37 °C, 4%O2/5% CO2 przez co najmniej 1 godzinę. Odrzucić matrycę i zastąpić ją 50 μl pożywki M na studzienkę. Przechowywać w temperaturze 37 °C, 4% O2/5% CO2 do czasu, gdy będzie potrzebny.
  2. Komórki płytkowe do różnicowania
    1. Hoduj iPSC na płytkach o średnicy 100 mm, aż komórki zbliżą się do 80% konfluencji. Upewnij się, że płytka zawiera około 2 x 107 komórek. Określ liczbę komórek za pomocą cytometru przepływu komórek lub hemocytometru.
      nuta: Dzięki doświadczeniu jakość komórek iPSC można ocenić za pomocą mikroskopii; jednak blisko 98% komórek powinno wyrażać markery pluripotencji, takie jak epitop TRA-1-60, mierzony za pomocą FACS lub barwienia immunologicznego. Ważne jest, aby komórki aktywnie się dzieliły i nie były przerośnięte.
    2. Aby zebrać iPSC z każdej płytki o średnicy 100 mm, należy odessać pożywkę hodowlaną i przepłukać 5 ml DPBS (-). Zastąp płukanie 3 ml roztworu do oddzielania komórek (np. akutazy) i inkubuj przez około 2 minuty w temperaturze 37 °C, 4% O2/5% CO2,
      nuta: Ważne jest, aby śledzić odklejanie komórek za pomocą mikroskopii. Nie trawić nadmiernie z akutazą. Celem jest uwolnienie komórek w postaci małych skupisk przy minimalnym traktowaniu.
    3. Gdy tylko komórki zaczną się odłączać, zbierz je, dodając 7 ml pożywki M. Pipetuj kilka razy, aby zdysocjować kolonie komórek na małe skupiska po około 3 - 6 komórek (Rysunek 1A).
    4. Zebrać iPSC do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i wirować przy 300 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 5 ml M-pożywki.
    5. Równomiernie rozprowadzić komórki na 96-dołkowych płytkach pokrytych matrycą, pipetując 50 μl komórek zawiesiny do każdej studzienki. Aby ustawić każdą 96-dołkową płytkę, użyj jednej 100-milimetrowej płytki iPSC z komórkami o zbiegu około 80%, która zawiera około 5 x 106 komórek w celu ustawienia różnicowania. Użyj pipety wielokanałowej, aby przyspieszyć ten proces. Hodować komórki przez noc w temperaturze 37 °C, 4%O2/5% CO2,
      nuta: Ważne jest, aby w każdym dołku zdeponować równą liczbę komórek, aby zapewnić powtarzalne różnicowanie.
  3. Indukuj różnicowanie komórek
    1. Zbadaj 96-dołkowe płytki pod mikroskopem, aby upewnić się, że komórki pokrywają co najmniej 70% powierzchni każdej pojedynczej studzienki. Jeśli pokrycie jest mniejsze niż 70%, zastąpić pożywkę świeżą i inkubować przez dodatkowe 24 godziny w temperaturze 37 °C, 4% O2/5% CO2,
      nuta: Inkubacja komórek przez ponad 48 godzin po posiewie bez indukowania różnicowania zwykle zmniejsza efektywność różnicowania. Różnicowanie będzie również zachodzić przy użyciu tlenu w otoczeniu, chociaż może to mieć wpływ na wydajność.
    2. W okresie od 1 do 2 dnia różnicowania należy zastąpić pożywkę hodowlaną RPMI uzupełnionym o 2% witaminy B27 (bez insuliny), 100 ng/ml aktywiny A, 10 ng/ml BMP4 i 20 ng/ml FGF2. Dodać 100 μl pożywki do studzienki i inkubować w temperaturze 37 °C, w temperaturze otoczeniaO 2/5% CO2 z codzienną wymianą pożywki przez 2 dni.
      nuta: Praca z dużą liczbą płytek 96-dołkowych wymaga użycia pipety lub robota ze wspomaganiem. Pipety 12- i 96-kanałowe idealnie nadają się do codziennej wymiany podłoża.
    3. Na dzień 3 do dnia 5 różnicowania zastąpić pożywkę hodowlaną RPMI uzupełnioną 2% B27 (bez insuliny) i 100 ng/ml aktywiny A. Hoduj komórki w temperaturze 37 °C, w otoczeniu O2/5% CO2 z codzienną zmianą pożywki przez 3 dni.
    4. W 5 dniu różnicowania, przed zastąpieniem świeżą pożywką, należy potraktować każdą studzienkę 100 μl 0,02% roztworu EDTA przez 30 s, a następnie usunąć i zastąpić świeżą pożywką hodowlaną.
      nuta: Jeśli różnicowanie do endodermy jest skuteczne, monowarstwa różnicujących się komórek jest podatna na złuszczanie się z płytki. Krótka kuracja 0,02% roztworem EDTA pomaga złagodzić odwarstwienie komórek. Leczenie to nie wpływa na różnicowanie do hepatocytów.
    5. W celu różnicowania między dniami od 6 do 10 należy zastąpić pożywkę hodowlaną RPMI/2% B27 (z insuliną) uzupełnioną 20 ng/ml BMP4 i 10 ng/ml FGF2 i inkubować w temperaturze 37 °C, 4% O2/5% CO2 przez 5 dni z dzienną zmianą pożywki. Ten etap indukuje komórki do różnicowania się w komórki progenitorowe wątroby.
    6. W celu różnicowania między dniami od 11 do 15 należy zastąpić pożywkę hodowlaną RPMI/2% B27 (z insuliną) uzupełnioną 20 ng/ml HGF. Inkubować w temperaturze 37 °C, 4% O,2/5% CO2 przez 5 dni z codzienną wymianą podłoża.
    7. W celu różnicowania między dniami od 16 do 20 należy zastąpić pożywkę hodowlaną pożywką do hodowli komórek hepatocytów (HCM) uzupełnioną 20 ng/ml onkostatyny-M (OSM). Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, w temperaturze otoczenia O2/5% CO2 z codzienną zmianą pożywki przez 5 dni.
      nuta: Odtwarzalność różnicowania między poszczególnymi studzienkami można skutecznie określić, mierząc względny poziom albuminy, AFP lub APOB wydzielanej do pożywki za pomocą testu ELISA (patrz 3.2).

3. Badania przesiewowe małych cząsteczek

Uwaga: Poniżej opisano procedurę używaną do identyfikacji związków, które mogą być użyte do obniżenia poziomu APOB w pożywce komórek hepatocytów pochodzących z rodzinnych hipercholesterolemii iPSC. Opis modelu i jego zastosowania w identyfikacji leków obniżających poziom cholesterolu został szczegółowo opisany wcześniej5,9. W bieżącym przykładzie przebadano 1000 związków z biblioteki South Carolina Compound Collection (SC3). Każdy związek został przebadany w stężeniu 2 μg/ml.

  1. Leczenie iPSC - hepatocytów pochodzących z małych cząsteczek
    1. Rozcieńczyć główną bibliotekę związków, aby wytworzyć płytki z materiałami roboczymi związkami o stężeniu 20 μg/ml w 2% DMSO i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    2. Przygotuj wystarczającą liczbę 96-dołkowych płytek hepatocytów pochodzących z iPSC, aby umożliwić przetestowanie każdego związku.
      nuta: Liczba związków, które mają być przesiewane, będzie dyktować liczbę wymaganych płytek 96-dołkowych. Ogólnie rzecz biorąc, dla każdego związku należy przygotować jedną studzienkę oraz dodatkowe studzienki dla wszelkich próbek kontrolnych. Często unika się najbardziej zewnętrznych dołków płyty, aby zmniejszyć możliwość wystąpienia efektów krawędziowych, które mogą zniekształcić interpretację. Trafienia można zidentyfikować za pomocą metody z-score bez konieczności stosowania powtórzeń. Jeżeli uwzględniono kontrpróby, bardziej odpowiednie jest zastosowanie testu t.
    3. Po zakończeniu różnicowania (dzień 20, patrz 2.3.7) zastąpić pożywkę hodowlaną 100 μl świeżego HCM uzupełnionego 20 ng/ml Oncostatin-M. Inkubować w temperaturze 37 °C, 4% O,2/5% CO2 dokładnie przez 24 godziny. Pobrać pożywkę hodowlaną na świeżą 96-dołkową płytkę i przechowywać w temperaturze -20 °C. Użyć tej próbki do obliczenia poziomu APOB w pożywce przed dodaniem leku.
    4. Do każdej studzienki dodać 90 μl świeżego HCM uzupełnionego 20 ng/ml Oncostatin-M. Dodać po 10 μl każdego związku z zapasu roboczego po wymieszaniu przez pipetowanie. Dodać DMSO do 0,2% do studzienek kontrolnych w celu dopasowania do końcowego stężenia w próbkach poddanych działaniu substancji i inkubować w temperaturze 37 °C, temperaturze otoczenia O2/5% CO2 przez dokładnie 24 godziny. Zebrać pożywkę hodowlaną i przechowywać w temperaturze -20 °C. Użyć tej próbki do określenia poziomu APOB po poddaniu działaniu związków.
    5. Opcjonalnie - pozostałe komórki mogą być przetwarzane w celu barwienia immunologicznego, żywotności komórek lub analiz poziomów mRNA przy użyciu standardowych metod.
      nuta: To badanie przesiewowe zostało zaprojektowane w celu identyfikacji leków, które miały szybki wpływ na poziomy APOB. Jednak w zależności od modelu choroby, dalszych testów lub mechanizmu działania leku, korzystne może być traktowanie próbki przez wiele dni.
  2. Określ poziomy APOB za pomocą testu ELISA
    1. Określić stężenie apolipoproteiny B (APOB) zarówno w próbkach przed, jak i po leczeniu farmakologicznym za pomocą ludzkiego zestawu rozwojowego APOB ELISA, zgodnie z protokołami producenta.
    2. Przygotowanie następujących rozwiązań
      1. Bufor do płukania, składający się z 0,05% Tween 20 w PBS, pH 7,4. Przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia.
      2. Bufor do inkubacji, składający się z 0,05% Tween 20 i 0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w PBS, pH 7,4. Przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia.
    3. Przygotować przeciwciało APOB (mAB 20/17) rozcieńczając do 2 μg/ml w PBS, pH 7,4. Dodać 100 μl rozcieńczonego przeciwciała do dołka i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.
    4. Usunąć przeciwciało z płytek testowych i przemyć każdą studzienkę dwukrotnie 200 μl PBS o pH 7,4.
    5. Dodać 200 μl/basenik 0,05% Tween 20, 0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w PBS, pH 7,4 i inkubować na platformie wstrząsającej przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    6. Przygotuj 8-punktową krzywą wzorcową, używając 0,05% Tween 20 i 0,1% BSA w PBS, pH 7,4 o następujących stężeniach APOB: 300 ng/mL, 200 ng/mL, 175 ng/ml, 150 ng/mL, 125 ng/mL, 100 ng/mL, 75 ng/ml i 50 ng/mL.
    7. Rozcieńczyć badane próbki w stosunku 1:4 0,05% Tween 20 i 0,1% BSA w PBS, pH 7,4.
    8. Po 1 godzinie blokowania buforem inkubacyjnym wyrzucić bufor i przemyć płytki testowe pięciokrotnie 200 μl 0,05% Tween 20 w PBS, pH 7,4.
    9. Całkowicie usunąć resztki buforu płuczącego i przenieść 90 μl rozcieńczonych próbek i wzorców APOB na płytki testowe. Inkubować w temperaturze pokojowej na wytrząsarce przez 1 godzinę.
    10. Odrzucić próbkę i przemyć 200 μl 0,05% Tween 20 w PBS, pH 7,4 na studzienkę. Powtórz pranie w sumie 5 razy. Dodać 100 μl na studzienkę mAB LDL 11-biotyny rozcieńczonej 1:1,000 w 0,05% Tween 20 i 0,1% BSA w PBS, pH 7,4. Inkubować w temperaturze pokojowej na platformie wytrząsającej przez 1 godzinę.
    11. Wyrzucić odczynnik i przemyć 5 razy 200 μl na bufor do płukania studzienki. Dodać 100 μl przeciwciała Streptawidyna-HRP na studzienkę (rozcieńczenie 1:1 000 przy użyciu buforu inkubacyjnego), a następnie inkubować w temperaturze pokojowej na platformie wstrząsającej przez 1 godzinę.
    12. Wyrzucić odczynnik i przemyć 200 μl 0,05% Tween 20 w PBS, pH 7,4 na studzienkę. Powtórz pranie w sumie 5 razy. Całkowicie usunąć resztki buforu płuczącego z płytek testowych i dodać 100 μl roztworu substratu tetrametylobenzydyny (TMB) na studzienkę i inkubować w temperaturze pokojowej przez 8 minut.
    13. Nie usuwając substratu TMB, bezpośrednio dodać 100 μl roztworu zatrzymującego (1N HCl) na studzienkę.
    14. Oznaczyć absorbancję przy długości fali 450 nm za pomocą czytnika płytek.
    15. Krzywą standardową można ustalić przy użyciu metody czteroparametrowej regresji logistycznej, a następnie użyć do zdefiniowania stężenia APOB w każdej próbce10.
    16. Zbadaj stosunek APOB przed lekiem do post-leku w każdej próbce, aby zidentyfikować związki, które mogą obniżyć poziomy APOB w pożywce.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Generacja komórek podobnych do hepatocytów: Rysunek 1 opisuje ramy czasowe zmian, które zachodzą podczas różnicowania ludzkich iPSC do komórek podobnych do hepatocytów. Hodowla iPSC na E-Cad-Fc zapewnia kolonie o średnicy około 2 mm, które wyrażają pluripotencjalny marker OCT4 (Rysunek 1A-B). Morfologia komórek wyhodowanych na matrycy E-kadheryny będzie nieco inna niż tych...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Odkrywanie leków w oparciu o cele, w ramach których identyfikowane są małe cząsteczki wpływające na aktywność określonego białka, było przedmiotem wielu istniejących badań przesiewowych. Chociaż podejście to dostarczyło wielu farmaceutyków, badania przesiewowe oparte na odwróceniu fenotypu, klasyczna farmakologia, były bardziej skuteczne w identyfikacji pierwszych w swojej klasie związków, które były klinicznie skuteczne1. Wadą odkrywania leków fenotypowych jest to, że zależy ono od dostępności od...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health (DK55743, DK087377, DK102716 i HG006398 do S.A.D.). Chcielibyśmy podziękować dr Behshadowi Pournasrowi, dr Jamesowi Heslopowi i Ran Jingowi za ich wkład.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sterylne szalki do hodowli tkankowych 100 mm x 20 mm Corning430167
100 mm x 20 mm sterylne zawiesinowe naczynia do hodowliCorning430591
96-dołkowa płytka do hodowli tkankowej Corning3595
Albumina antyludzkaDakoA 0001
Anty-ludzka FOXA2(6C12)Novus BiologicznaH00003170-M12
Anty-ludzka HNF4 alfaSanta CruzSC-6556
Przeciwciało anty-ludzkie Oct-3/4Santa CruzSC-9081
Anty-ludzkie SOX17R& DAF1924
Anty-ludzki TRA-1-60 FITC sprzężonyz miliporemFCMAB115F
aktywiną A Rekombinowane białko ludzkie InvitrogenPHC9563
B-27 Suplement, bez insuliny Suplement Invitrogen0050129SA
B-27, bez surowicy Invitrogen17504044
BMP4 Rekombinowane białko ludzkie InvitrogenPHC9533
Odczynnik do dysocjacji komórek StemPro  Akumulator InvitrogenA1110501
CellTiter-Glo Test żywotności komórek luminescencyjnych Promega7572
DPBS+(wapń, magnez)Invitrogen14040-133
DPBS-(bez wapnia, bez magnezu)Invitrogen14190-144
DMEM/F-12, HEPES Invitrogen11330057
Zestaw rozwojowy ELISA dla ludzi APOB Zestaw rozwojowy ELISAMabtech3715-1H-20
Czynnik wzrostu fibroblastów 2 (FGF2)PHG0023Invitrogen
(zestaw HCM Bullet) LonzaCC-3198
Czynnik wzrostu hepatocytów  (HGF)InvitrogenPHC0321
L-glutamina Invitrogen25030081
MEM Roztwór aminokwasów endogennychInvitrogen11140076
Onkostatyna M (OSM) Rekombinowane białko ludzkie InvitrogenPHC5015
Penicylina-Streptomycyna Invitrogen15140163
Pożywka z pluripotencjalnych komórek macierzystych bez pożywki: mTesR1 STEMCELL technologies5850
Matryca błony podstawnej o obniżonym współczynniku wzrostu InvitrogenA1413301
RPMI 1640 Medium, HEPES Invitrogen22400105
StemAdhere Zdefiniowana matryca dla hPSC (E-cad-Fc)Primorigen BiosciencesS2071
TMB-ELISA Substrate SolutionThermo Scientific 34022
Anty-TRA-1-60 FITC sprzężonyz miliporemFCMAB115F
versenem (EDTA) 0,02% Lonza17-711E
Y-27632 Inhibitor ROCKSTEMCELL Technologies72302
Pożywka do hodowli hepatocytów

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered? Nat Rev Drug Discov. 10 (7), 507-519 (2011).
  2. Zeilinger, K., Freyer, N., Damm, G., Seehofer, D., Knospel, F. Cell sources for in vitro human liver cell culture models. Exp Biol Med (Maywood. 241 (15), 1684-1698 (2016).
  3. Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481 (7381), 295-305 (2012).
  4. Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461 (7262), 402-406 (2009).
  5. Cayo, M. A., et al. A Drug Screen using Human iPSC-Derived Hepatocyte-like Cells Reveals Cardiac Glycosides as a Potential Treatment for Hypercholesterolemia. Cell Stem Cell. 20 (4), 478-489 (2017).
  6. Nagaoka, M., et al. E-cadherin-coated plates maintain pluripotent ES cells without colony formation. PLoS One. 1, e15(2006).
  7. Ludwig, T. E., et al. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nat Methods. 3 (8), 637-646 (2006).
  8. International Stem Cell Initiative. Characterization of human embryonic stem cell lines by International Stem Cell Initiative. Nat Biotechnol. 25 (7), 803-816 (2007).
  9. Cayo, M. A., et al. JD induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes faithfully recapitulate the pathophysiology of familial hypercholesterolemia. Hepatology. 56 (6), 2163-2171 (2012).
  10. DeSilva, B., et al. Recommendations for the bioanalytical method validation of ligand-binding assays to support pharmacokinetic assessments of macromolecules. Pharm Res. 20 (11), 1885-1900 (2003).
  11. Rowland, T. J., et al. Roles of integrins in human induced pluripotent stem cell growth on Matrigel and vitronectin. Stem Cells Dev. 19 (8), 1231-1240 (2010).
  12. Nagaoka, M., Si-Tayeb, K., Akaike, T., Duncan, S. A. Culture of human pluripotent stem cells using completely defined conditions on a recombinant E-cadherin substratum. BMC Dev Biol. 10, 60(2010).
  13. Hay, D. C., et al. Efficient differentiation of hepatocytes from human embryonic stem cells exhibiting markers recapitulating liver development in vivo. Stem Cells. 26 (4), 894-902 (2008).
  14. Mallanna, S. K., Cayo, M. A., Twaroski, K., Gundry, R. L., Duncan, S. A. Mapping the Cell-Surface N-Glycoproteome of Human Hepatocytes Reveals Markers for Selecting a Homogeneous Population of iPSC-Derived Hepatocytes. Stem Cell Reports. 7 (3), 543-556 (2016).
  15. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
  16. Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. J Biomol Screen. 16 (7), 775-785 (2011).
  17. Lorenz, C., et al. Human iPSC-Derived Neural Progenitors Are an Effective Drug Discovery Model for Neurological mtDNA Disorders. Cell Stem Cell. 20 (5), 659-674 (2017).
  18. Rashid, S. T., et al. Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells. J Clin Invest. 120 (9), 3127-3136 (2010).
  19. Lu, W. Y., et al. Hepatic progenitor cells of biliary origin with liver repopulation capacity. Nat Cell Biol. 17 (8), 971-983 (2015).
  20. Ogawa, M., et al. Directed differentiation of cholangiocytes from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 33 (8), 853-861 (2015).
  21. Sampaziotis, F., et al. Cholangiocytes derived from human induced pluripotent stem cells for disease modeling and drug validation. Nat Biotechnol. 33 (8), 845-852 (2015).
  22. Mallanna, S. K., Duncan, S. A. Differentiation of hepatocytes from pluripotent stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 26 (Unit 1G 4), (2013).
  23. Song, Z., et al. Efficient generation of hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells. Cell Res. 19 (11), 1233-1242 (2009).
  24. Cai, J., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional hepatic cells. Hepatology. 45 (5), 1229-1239 (2007).
  25. Si-Tayeb, K., et al. Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51 (1), 297-305 (2010).
  26. Pashos, E. E., et al. Diverse Population Cohorts of hiPSCs and Derived Hepatocyte-like Cells Reveal Functional Genetic Variation at Blood Lipid-Associated Loci. Cell Stem Cell. 20 (4), 558-570 (2017).
  27. Davidson, M. D., Ware, B. R., Khetani, S. R. Stem cell-derived liver cells for drug testing and disease modeling. Discov Med. 19 (106), 349-358 (2015).
  28. Choi, S. M., et al. Efficient drug screening and gene correction for treating liver disease using patient-specific stem cells. Hepatology. 57 (6), 2458-2468 (2013).
  29. Tafaleng, E. N., et al. Induced pluripotent stem cells model personalized variations in liver disease resulting from alpha1-antitrypsin deficiency. Hepatology. 62 (1), 147-157 (2015).
  30. Jing, R., Duncan, C. B., Duncan, S. A. A small-molecule screen reveals that HSP90beta promotes the conversion of induced pluripotent stem cell-derived endoderm to a hepatic fate and regulates HNF4A turnover. Development. 144 (10), 1764-1774 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ludzkie indukowane pluripotencjalne kom rki macierzystewysokoprzepustowe przesiewanieplatforma odkrywania lek w96 do kowe p ytki do hodowli tkankowychzdefiniowane warunki hodowlitest apolipoproteiny Bmodel rodzinnej hipercholesterolemiiprotok r nicowania w kierunku hepatocyt wmetoda przesiewania zwi zk w

Powiązane artykuły