Artykuł metodologiczny

Osadzanie parafiny i cienkie cięcie biofilmów kolonii drobnoustrojów do analizy mikroskopowej

DOI:

10.3791/57196

⸱

23 marca 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Columbia University, 2Department of Biology, Barnard College, Columbia University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy techniki utrwalania, zatapiania parafiny i cienkiego cięcia biofilmów kolonii mikroorganizmów. W przygotowanych próbkach za pomocą mikroskopii można uwidocznić podstrukturę biofilmu i wzorce ekspresji reporterowej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cięcie poprzez zatapianie parafiny jest szeroko rozpowszechnioną techniką w systemach eukariotycznych. W tym miejscu przedstawiamy metodę utrwalania, osadzania i cięcia nienaruszonych biofilmów kolonii drobnoustrojów za pomocą perfundowanego wosku parafinowego. Aby dostosować tę metodę do stosowania na biofilmach kolonijnych, opracowaliśmy techniki utrzymywania każdej próbki na podłożu wzrostowym i laminowania jej warstwą agaru, a także dodaliśmy lizynę do roztworu utrwalającego. Optymalizacje te poprawiają retencję próbek i zachowanie cech mikromorfologicznych. Tak przygotowane próbki są podatne na cienkie przekroje i obrazowanie za pomocą mikroskopii świetlnej, fluorescencyjnej i transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Zastosowaliśmy tę technikę do biofilmów kolonii Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilis i Vibrio cholerae. Wysoki poziom szczegółowości widoczny w próbkach generowanych tą metodą, w połączeniu z inżynierią szczepów reporterowych lub zastosowaniem określonych barwników, może dostarczyć ekscytujących informacji na temat fizjologii i rozwoju społeczności drobnoustrojów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Większość mikrobów ma zdolność do tworzenia biofilmów, społeczności komórek utrzymywanych razem przez samodzielnie wyprodukowane matryce. Biofilmy mogą być uprawiane w wielu typach konfiguracji fizycznych, z różnymi reżimami dostarczania składników odżywczych i substratów. Specyficzne testy tworzenia biofilmu mają tendencję do uzyskiwania powtarzalnych struktur wielokomórkowych, a wspólne architektury obserwuje się dla gatunków zróżnicowanych filogenetycznie na poziomie społeczności lub makroskopowym. Gdy mikroorganizmy są hodowane jako kolonie na stałym podłożu pod atmosferą, morfologia makroskopowa przekazuje informacje o zdolności do produkcji matrycy i często koreluje z innymi cechami 1,2,3. Wewnętrzna architektura kolonii drobnoustrojów może również dostarczyć wskazówek dotyczących chemii i fizjologii specyficznej dla biofilmu, ale była trudna do scharakteryzowania. Niedawne zastosowania technik krioempensji i kriosekcji kolonii bakteryjnych umożliwiły obrazowanie i wizualizację określonych cech w niespotykanej dotąd rozdzielczości 4,5,6. Jednak badania na tkankach zwierzęcych wykazały, że osadzanie parafiny zapewnia lepsze zachowanie morfologii w porównaniu z krioemtopowaniem 7 i zostało wykorzystane do wizualizacji bakterii w tkankach 8,9. W związku z tym opracowaliśmy protokół utrwalania, zatapiania parafiny i cienkiego cięcia biofilmów kolonii drobnoustrojów. W tym miejscu opiszemy przygotowanie cienkich odcinków biofilmu kolonii Pseudomonas aeruginosa PA14 10,11, ale z powodzeniem zastosowaliśmy tę technikę również do biofilmów tworzonych przez bakterie Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilis i Vibrio cholerae12.

Proces zatapiania parafiny i cienkiego cięcia biofilmów przebiega zgodnie z prostą logiką. Po pierwsze, biofilmy są otoczone warstwą agaru w celu zachowania morfologii podczas przetwarzania. Po drugie, otoczone biofilmy są zanurzane w utrwalaczu w celu usieciowania makrocząsteczek i zachowania mikromorfologii. Są one następnie odwadniane alkoholem, oczyszczane bardziej niepolarnym rozpuszczalnikiem, a następnie infiltrowane płynnym woskiem parafinowym. Po infiltracji próbki są umieszczane w blokach woskowych w celu podziału. Sekcje są cięte, montowane na szkiełkach, a następnie ponownie nawilżane, aby przywrócić je do bardziej natywnego stanu. Od tego momentu można je wybarwić lub pokryć podłożem montażowym do analizy mikroskopowej.

Ten protokół wytwarza cienkie odcinki biofilmów mikrobiologicznych nadające się do analizy histologicznej. Podstruktury biofilmu kolonii są widoczne, gdy cienkie skrawki przygotowane tą metodą są obrazowane za pomocą mikroskopii świetlnej. Biofilmy mogą być również hodowane na podłożach zawierających barwniki fluorescencyjne specyficzne dla poszczególnych cech lub barwione na etapie ponownego uwodnienia, bezpośrednio przed montażem (kroki 9.5-9.6). Wreszcie, mikroorganizmy mogą być modyfikowane tak, aby wytwarzały białka fluorescencyjne w sposób konstytutywny lub regulowany, umożliwiając raportowanie in situ dystrybucji komórek lub ekspresji genów w tych społecznościach. Użyliśmy tych metod do określenia głębokości biofilmu kolonii, rozmieszczenia komórek, rozmieszczenia macierzy, wzorców wzrostu i czasoprzestrzennej ekspresji genów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Wzrost biofilmów kolonii Pseudomonas aeruginosa

  1. Przygotowanie płyt średnio-dwuwarstwowych
    1. Przygotować roztwór 10 g/l tryptonu i 10 g/l agaru (patrz tabela materiałów) w wodzie dejonizowanej.
    2. Autoklaw przez 20 min. Schłodzić do 50-60 °C w łaźni wodnej.
    3. Wlać 45 ml roztworu agaru i tryptonu do kwadratowego naczynia o wymiarach 100 mm x 100 mm (patrz tabela materiałów) za pomocą stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Pozwól agarowi zastygnąć (~20-30 min). Wlej drugą, 15-mililitrową warstwę na wierzch pierwszej warstwy. Pozostaw do zestalenia się na noc, w razie potrzeby usuwając kondensację z pokrywek, wycierając niestrzępiącą się chusteczką.
  2. Wykrywanie biofilmów kolonii
    1. Szczepy z zamrażarek należy rozprowadzić na płytkach agarowych LB13 i inkubować w ciemności przez 12-16 godzin w temperaturze 37 °C i wilgotności względnej 80-100%.
    2. Dla każdego szczepu lub kontrpróby użyć pojedynczej kolonii do zaszczepienia 2 ml LB i inkubować w ciemności przez 12-16 godzin w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 250 obr./min.
    3. Subkultura przez rozcieńczenie w stosunku 1:100 do świeżego LB i inkubację w ciemności przez 2,5–3 godziny w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 250 obr./min.
    4. Zmierz gęstość optyczną za pomocą spektrofotometru i wyreguluj sterylnym LB, aby uzyskać zawiesinę komórek o średnicy zewnętrznej500 nm ~0,5.
    5. W zależności od pożądanej wielkości kolonii, odpipetuj 2,5-10 μl zawiesiny komórek na średniowarstwową płytkę (przygotowaną w kroku 1.1) i pozostaw miejsce do wyschnięcia na ~20 min. Pozostawienie uchylonej pokrywki Petriego w pobliżu otwartego ognia może ułatwić suszenie.
    6. Inkubuj kolonie punktowe w temperaturze 25 °C i wilgotności względnej 80-100%, w ciemności przez okres do 4 dni.

2. Przygotowanie roztworu utrwalającego

  1. Roztwór utrwalający należy przygotować w dniu pobrania próbki. Rozcieńczyć 37% formaldehydu (FA) w 1x PBS do końcowego stężenia 4% FA.
    UWAGA: FA jest lotny i toksyczny. Nosić sprzęt ochronny i pracować w dobrze wentylowanym dygestorium.
  2. Bezpośrednio przed użyciem rozpuścić chlorowodorek L-lizyny w 4% FA (przygotowanym w kroku 2.1) w temperaturze pokojowej do końcowego stężenia 50 mM HCl L-lizyny.

3. Bezpośrednie zastosowanie utrwalacza do biofilmu kolonii [opcjonalnie]

UWAGA: Odkryliśmy, że morfologia biofilmu jest najlepiej zachowana, gdy nakładka agarowa jest dodawana przed utrwaleniem. Jednak ten krok stanowi również zmianę warunków środowiskowych, która może wpływać na ekspresję genów. Wzorce ekspresji fluorescencyjnego reportera powinny być zatem weryfikowane przy użyciu oddzielnego protokołu, w którym etap utrwalania przeprowadza się przed dodaniem nakładki agarowej, jak opisano tutaj.

  1. W dniu utrwalenia, pracując w dobrze wentylowanym dygestorium, pipetować utrwalacz przygotowany w kroku 2 bezpośrednio do powierzchni agaru wokół krawędzi kolonii, umożliwiając mu dotarcie do obrzeży kolonii bez jej zanurzania. Zastosuj tylko tyle utrwalacza, ile jest potrzebne do pełnego otoczenia kolonii, około 500 μl. Pozwól utrwalaczowi dyfundować do kolonii i otaczającego agaru.
  2. Gdy utrwalacz zostanie w pełni wchłonięty przez kolonię i otaczające pożywki, około 20-30 minut, a resztki FA nie są już widoczne na płytce, powtórz krok 3.1. Pozwól temu utrwalaczowi dyfundować do kolonii i otaczającego agaru.
  3. Gdy utrwalacz zostanie w pełni wchłonięty przez kolonię i otaczające podłoże, powtórz krok 3.1, tym razem nakładając utrwalacz bezpośrednio na powierzchnię kolonii. Pozwól temu utrwalaczowi dyfundować do kolonii i otaczającego agaru, przechodząc do kroku 4 dopiero po wchłonięciu całego utrwalacza i przestanie być widoczny na płytce.

4. Nakładanie kolonii agarem

  1. W dniu utrwalenia przygotować 10 g/l roztworu agaru w wodzie dejonizowanej i sterylizować w autoklawie przez 10-20 minut do rozpuszczenia. Schłodzić w łaźni wodnej do temperatury 50 °C.
  2. Delikatnie wlej 15 ml roztworu agaru na pożywkę wzrostową i kolonię. Pozwól agarowi uformować żel w temperaturze pokojowej przez 5 minut (Rysunek 1B).
  3. Użyj ostrej żyletki, aby wyciąć kwadratowy, 3-warstwowy uchwyt z kolonią laminowaną między dwiema górnymi warstwami. W przypadku przygotowywania wielu próbek należy upewnić się, że każdy uchwyt jest przycięty do porównywalnego rozmiaru.
  4. Delikatnie usuń nadmiar agaru z karkówki zawierającej kolonię.
  5. Aby podnieść dwie górne warstwy agaru (zawierające kolonię) z dolnej warstwy uchwytu (Rysunek 1C), zwilż płaską główkę szpatułki w 1x PBS lub wodzie i delikatnie włóż między górną i dolną warstwę. Laminowana kolonia powinna oddzielić się od dolnej warstwy. Uważaj, aby nie zniekształcić ani nie zgiąć laminowanej kolonii podczas podnoszenia jej z podstawy.

5. Fiksacja

  1. Pracując w dobrze wentylowanym dygestorio, natychmiast przenieś laminowaną kolonię (tj. 2-warstwowy uchwyt) do kasety do zatapiania (patrz Tabela materiałów), oznaczonej odpornym na chemikalia pisakiem do znakowania. Umieścić kasetę do zatapiania w szklanej paczce na szkiełka (patrz tabela materiałów) zawierającej utrwalacz przygotowany w krokach 2.1-2.2. Upewnij się, że w kasecie do osadzania nie ma pęcherzyków powietrza uwięzionych.
  2. Próbkę inkubować w utrwalaczu przez noc w ciemności w temperaturze pokojowej.

6. Przetwarzanie próbek: Mycie bufora, odwadnianie, oczyszczanie i infiltracja

  1. Po utrwaleniu przez noc przemyć próbkę dwukrotnie w 1x PBS przez 1 godzinę każdy. Aby uzyskać najlepsze wyniki, należy zautomatyzować homogenizację odczynników za pomocą funkcji wirowania automatycznego procesora tkanek (patrz tabela materiałów) ustawionej na niskie ustawienie. Jeśli żaden procesor nie jest dostępny, przetwarzanie można uruchomić ręcznie.
  2. Postępuj zgodnie z płukaniem buforem przez odwodnienie przez stopniowaną serię rozcieńczeń etanolu (EtOH) w 1x PBS (25%, 50%, 70%, 95%) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  3. Odwodnić w trzech praniach 100% EtOH przez 1 godzinę każde w temperaturze pokojowej.
  4. Odwodnioną próbkę należy oczyścić w trzech przemycikach środkiem czyszczącym na bazie 100% oleju pomarańczowego (patrz tabela materiałów) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  5. Oczyszczoną próbkę należy dwukrotnie naciekać stopionym woskiem parafinowym (patrz tabela materiałów), podgrzewanym do temperatury 55°C przez 2 godziny każdy.

7. Osadzanie próbki

  1. Napełnij formę woskową stopionym woskiem parafinowym podgrzanym do 55 °C. Za pomocą podgrzanej, płaskiej szpatułki szybko przenieś infiltrowany uchwyt z kasety do zatapiania do formy woskowej, upewniając się, że uchwyt spoczywa równolegle do podstawy formy. Unikaj wywierania nadmiernego nacisku na uchwyt. Formy woskowe mogą być drukowane na zamówienie w 3D lub są dostępne na rynku (patrz tabela materiałów).
  2. Pozostawić wosk do zestalenia się przez noc w temperaturze 4 °C. Próbki uformowane w stałym wosku mogą być przechowywane przez czas nieokreślony w temperaturze 4 °C.
  3. Gdy wosk zastygnie, wyciąć próbkę z formy i odciąć nadmiar wosku z okolic próbki za pomocą żyletki. Pozostawić nadmiar wosku rozciągający się od jednego końca próbki, równolegle do płaszczyzny przekroju, który może być użyty do zaciśnięcia go w mikrotomie (patrz tabela materiałów). Pozostaw również osłonkę wosku o grubości około 1 mm wokół próbki i wygładź jej powierzchnie.

8. Podział na sekcje

  1. Podgrzać łaźnię wodną do temperatury 42 °C. Zawiesić próbkę w mikrotomie tak, aby powierzchnia kolonii była ustawiona prostopadle do krawędzi ostrza (patrz tabela materiałów).
  2. Przycinaj próbkę w odstępach 50 μm, aż do osiągnięcia pożądanej płaszczyzny kolonii, z której zostaną pobrane skrawki.
  3. Przeciąć wstęgę o żądanej liczbie odcinków o grubości 10 μm za pomocą mikrotomu ustawionego na prędkość cięcia 75-80 obr./min i kąt przyłożenia 6-10°. Użyj pędzla z cienką końcówką, aby odłączyć wstążkę od ostrza.
  4. Używając kropli wody na końcówce pipety Pasteura (preferowanej) lub kleszczy, delikatnie przenieś wstążkę do łaźni wodnej. Uważaj, aby nie uwięzić pęcherzyków powietrza pod sekcją.
  5. Natychmiast włóż szkiełko do łaźni wodnej i umieść je pod wstążką pod kątem 45°.
  6. Przyłóż wąską krawędź wstążki do slajdu, tuż pod matową etykietą. Wstążka powinna przylegać.
  7. Wyciągnij zjeżdżalnię z łaźni wodnej, regulując kąt tak, aby stał się prostopadły do powierzchni wody i pozwalając, aby wstążka leżała płasko na zjeżdżalni na całej jej długości. Unikaj zatrzymywania nadmiaru wody pod wstążką.
  8. Delikatnie postaw szkiełko na chłonnej, niestrzępiącej się chusteczce, odprowadzając nadmiar wody z sekcji.
  9. Połóż szkiełko na ręczniku papierowym i pozostaw do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez noc w ciemności. Szkiełka można przechowywać w nieskończoność w temperaturze 4 °C w ciemności.

9. Utrwalanie termiczne, nawadnianie i montaż

  1. Podgrzej wypoziomowaną płytę grzejną do 45 °C. Podgrzewaj szkiełko przez 30-60 min. Wosk stanie się na wpół stopiony i spłaszczy się na szkiełku.
  2. Delikatnie zdejmij szkiełko z płyty grzejnej i połóż je płasko na gładkiej, wyrównanej powierzchni o temperaturze pokojowej, uważając, aby stopiony wosk nie ciągnął się po żadnej stronie szkiełka, aż wosk zastygnie (~1 min).
  3. Za pomocą szklanej koperty do szkiełek odwoskować szkiełka w czterech płukaniach środka czyszczącego przez 5 minut każde, używając aspiratora Büchnera do usunięcia roztworu między praniami.
  4. Umyj szkiełka trzy razy w 100% EtOH przez 1 minutę każde.
  5. Ponownie uwodnić szkiełka w stopniowanej serii etanolu w odwrotnej kolejności przetwarzania (95%, 70%, 50% i 25%) przez 1 minutę każde, a następnie dwa 1-minutowe płukania w 1x PBS.
  6. Natychmiast zamontuj sekcje w podłożu montażowym buforowanym Tris (patrz Tabela materiałów) i nałóż szkiełko nakrywkowe, unikając wprowadzania pęcherzyków powietrza. Pozostawić podłoże montażowe do polimeryzacji przez noc w temperaturze pokojowej.
  7. Po polimeryzacji uszczelnij szkiełko nakrywkowe do szkiełka za pomocą przezroczystego lakieru do paznokci. Zamknięte szkiełka mogą być przechowywane przez czas nieokreślony w ciemności w temperaturze 4 °C.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta metoda generuje cienkie odcinki biofilmu, w których można obrazować różne cechy morfologiczne i strefy ekspresji genów za pomocą DIC, mikroskopii fluorescencyjnej i TEM. Podczas gdy obrazowanie DIC przy użyciu 40-krotnego obiektywu immersyjnego z olejkiem może być wystarczające do pokazania pewnych cech morfologicznych (Rysunek 2E), odkryliśmy, że mikroskopia fluorescencyjna szczepów zaprojektowanych do konstytutywnej ekspresji białka fluorescencyjnego zapewnia leps...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Próbki tkanek zatapiające w parafinie i cienkowarstwowe są klasyczną techniką histologiczną, która umożliwia obrazowanie struktur mikromorfologicznych i jest powszechnie stosowana w tkankach eukariotycznych i została zastosowana z pewnym powodzeniem do próbek drobnoustrojów 8,9. Podczas gdy zatapianie w parafinie pozwala na silne zatrzymanie endogennego i immunofluorescencyjnego sygnału, osadzanie parafiny jest ogólnie preferowane, ponieważ zapewnia lepsze zachow...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez NSF CAREER AWARD 1553023 oraz nagrodę NIH/NIAID R01AI103369.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pipeta Pasteura 5 3/4"Fisher Scientific13-678-6A Zakupionaw uniwersyteckich sklepach biologicznych 
Agar Teknova A7777
Kolba aspiratora Buchnera (próżniowego) Pyrex5340Zakupiony w uniwersyteckich biosklepach 
Chemicznie odporny pisak do znakowaniaVWR103051-182Producent: Lakier do paznokci Leica
Clear Kupiony w sklepie
Congo Red Indicator GradeVWRAAAB24310-14Producent: Alfa Aesar
Coomassie Blue VWREM-3340Producent: EMD Millipore
TRIS-buffered Mounting Medium (z DAPI) Fisher Scientific50 247 04Producent: Mikroskopia elektronowa Nauki
Osadzanie formy Drukowana w 3D
wewnętrzna forma do osadzania (komercyjna) Mikroskopia elektronowa Nauki70182
Etanol 200PDecon Labs, Inc. 2701Zakupiony w biosklepach uniwersyteckich 
Szczotka z cienką końcówką kupionaw Sklepie, pędzel
Szkiełka nakrywkowe do szkła 60x22mmFisher Scientific12-519-21C
Szklana koperta do nawilżania Ted Pella2104320 slajdów 
Histoclear-II, środek czyszczący na bazie olejku pomarańczowego Fisher Scientific50 899 90150Producent: National Diagnostics 
Histosette, Kaseta do zatapianiaFisher Scientific15 182 701A
Chlorowodorek L-lizyny Fisher ScientificBP386 100
Niskoprofilowe ostrza mikrotomuFisher Scientific22 210 048Producent: Turcja 
Mikropipeta VWR89080-004Zestaw promocyjny
końcówek do mikropipet Zobacz sekcję komentarzyZobacz sekcję komentarzyp10 (Fisher Scientific, 02 707 469), p200 (VWR, 89079-474), p1250 (VWR, 89079-486)
Mikrotom Fisher Scientific905200U/00016050Model: HM355S, Producent: Microm, NON-CATALOG, Vendor Catalog # 905200U/00016050
Formaldehyd, 37% Wodny (formalina)Ricca ChemicalRSOF0010-500A
Paraplast Xtra (wosk parafinowy)VWR15159-486Producent: McCormick Scientific 
Szalki Petriego kwadratowe 100x100x15mmLaboratoryjne produkty jednorazowego użytku D210-16
Chlorek potasu Chemikalia EMD PX1405-1Składnik soli fizjologicznej buforowanej fosforanami, przygotowany we własnym zakresie 
Fosforan potasu Fisher ScientificP380-500Składnik soli fizjologicznej buforowanej fosforanami, przygotowany we własnym zakresie 
Żyletki VWR55411-050Zakupiony w uniwersyteckich sklepach biologicznych 
Podgrzewacz do slajdów Fisher ScientificNC0865259NON-CATALOG, Katalog dostawcy # 12857D
Chlorek sodu VWR0241-1KGSkładnik soli fizjologicznej buforowanej fosforanami, przygotowany we własnym zakresie 
Fosforan sodu VWRBDH9296.500,Składniksoli fizjologicznej buforowanej fosforanami, przygotowany we własnym zakresie 
Szkiełka histologiczne Suprafrost Fisher Scientific12-544-2
Kąpiel wodna do flotacji tkanek Fisher ScientificNC0815797Producent: Ted Pella, Katalog dostawców # 28156-B
Automatyczny procesor tkanek Fisher Scientific813160U/Q#00009061Model: STP120 Procesor tkanek
Trypton Teknova T9012
Ekstrakt drożdżowyTeknova Y9010
powiedział:

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ray, V. A., Morris, A. R., Visick, K. L. A semi-quantitative approach to assess biofilm formation using wrinkled colony development. J. Vis. Exp. (64), e4035(2012).
  2. Friedman, L., Kolter, R. Genes involved in matrix formation in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilms. Mol. Microbiol. 51 (3), 675-690 (2004).
  3. Okegbe, C., et al. Electron-shuttling antibiotics structure bacterial communities by modulating cellular levels of c-di-GMP. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 114 (26), E5236-E5245 (2017).
  4. Vlamakis, H., Aguilar, C., Losick, R., Kolter, R. Control of cell fate by the formation of an architecturally complex bacterial community. Genes Dev. 22 (7), 945-953 (2008).
  5. Serra, D. O., Richter, A. M., Klauck, G., Mika, F., Hengge, R. Microanatomy at cellular resolution and spatial order of physiological differentiation in a bacterial biofilm. MBio. 4 (2), e00103-e00113 (2013).
  6. Serra, D. O., Richter, A. M., Hengge, R. Cellulose as an architectural element in spatially structured Escherichia coli biofilms. J. Bacteriol. 195 (24), 5540-5554 (2013).
  7. McGlinn, E., Mansfield, J. H. Detection of gene expression in mouse embryos and tissue sections. Methods Mol. Biol. 770, 259-292 (2011).
  8. Choi, Y. S., Kim, Y. C., Baek, K. J., Choi, Y. In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA. J. Vis. Exp. (99), e52836(2015).
  9. James, G., Hunt, A. M. A. Imaging Biofilms in Tissue Specimens. Antibiofilm Agents. , 31-44 (2014).
  10. Madsen, J. S., et al. Facultative control of matrix production optimizes competitive fitness in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilm models. Appl. Environ. Microbiol. 81 (24), 8414-8426 (2015).
  11. Jo, J., Cortez, K. L., Cornell, W. -C., Price-Whelan, A., Dietrich, L. E. P. An orphan cbb3-type cytochrome oxidase subunit supports Pseudomonas aeruginosa biofilm growth and virulence. bioRxiv. , 171538(2017).
  12. Fong, J. C., et al. Structural dynamics of RbmA governs plasticity of Vibrio cholerae biofilms. Elife. 6, (2017).
  13. Bertani, G. Lysogeny at mid-twentieth century: P1, P2, and other experimental systems. J. Bacteriol. 186 (3), 595-600 (2004).
  14. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  15. Dietrich, L. E. P., Teal, T. K., Price-Whelan, A., Newman, D. K. Redox-active antibiotics control gene expression and community behavior in divergent bacteria. Science. 321 (5893), 1203-1206 (2008).
  16. Zupančič, D., Terčelj, M., Štrus, B., Veranič, P. How to obtain good morphology and antigen detection in the same tissue section? Protoplasma. , (2017).
  17. Priester, J. H., et al. Enhanced visualization of microbial biofilms by staining and environmental scanning electron microscopy. J. Microbiol. Methods. 68 (3), 577-587 (2007).
  18. Boyles, J., Anderson, L., Hutcherson, P. A new fixative for the preservation of actin filaments: fixation of pure actin filament pellets. J. Histochem. Cytochem. 33 (11), 1116-1128 (1985).
  19. Blackburn, M. R. Examination of normal and abnormal placentation in the mouse. Methods Mol. Biol. 136, 185-193 (2000).
  20. Hoffman, E. A., Frey, B. L., Smith, L. M., Auble, D. T. Formaldehyde crosslinking: a tool for the study of chromatin complexes. J. Biol. Chem. 290 (44), 26404-26411 (2015).
  21. Jennings, L. K., et al. Pel is a cationic exopolysaccharide that cross-links extracellular DNA in the Pseudomonas aeruginosa biofilm matrix. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112 (36), 11353-11358 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Biofilm SectioningAgar OverlayerFixative SolutionTissue ProcessingMicrotome SectioningFluorescence MicroscopyTransmission Electron Microscopy

Powiązane artykuły