Artykuł metodologiczny

Wizualizacja zagęszczenia DNA u sinic za pomocą wysokonapięciowej krioelektronowej tomografii

DOI:

10.3791/57197

⸱

17 lipca 2018

 , 
1National Institute for Physiological Sciences, 2Graduate School of Science and Engineering, Saitama University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje, jak wizualizować przejściowe zagęszczenie DNA u cyjanobakterii. Stosuje się hodowlę synchroniczną, monitorowanie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, szybkie zamrażanie i wysokonapięciową kriotomografię elektronową. Przedstawiono protokół dla tych metodologii oraz omówiono przyszłe zastosowania i rozwój.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje, jak wizualizować przejściowe zagęszczenie DNA u cyjanobakterii. Zagęszczenie DNA to dramatyczne zdarzenie cytoplazmatyczne, które niedawno stwierdzono u niektórych cyjanobakterii przed podziałem komórki. Jednak ze względu na duży rozmiar komórki i przejściowy charakter trudno jest szczegółowo zbadać strukturę. Aby przezwyciężyć te trudności, po pierwsze, zagęszczenie DNA jest wytwarzane w sposób powtarzalny w sinicy Synechococcus elongatus PCC 7942 poprzez hodowlę synchroniczną przy użyciu 12 godzin każdego cyklu jasnego/ciemnego. Po drugie, zagęszczenie DNA jest monitorowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i wychwytywane przez szybkie zamrażanie. Po trzecie, szczegółowa struktura zagęszczonych komórek DNA jest wizualizowana w trzech wymiarach (3D) za pomocą wysokonapięciowej tomografii krioelektronowej. Ten zestaw metod ma szerokie zastosowanie do badania przejściowych struktur bakterii, np. podziału komórek, segregacji chromosomów, infekcji fagowej itp., które są monitorowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i bezpośrednio wizualizowane za pomocą tomografii krioelektronowej w odpowiednich punktach czasowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zagęszczenie DNA to dramatyczne zdarzenie cytoplazmatyczne, które zostało zidentyfikowane u niektórych cyjanobakterii. Kiedy Synechococcus elongatus był hodowany w ciągu 12 godzin każdego cyklu światła/ciemności, DNA wydawało się skondensowane pod koniec okresu światła, co wyraźnie różniło się od jego wyglądu w innych punktach czasowych1. Sugeruje się, że proces ten jest kontrolowany przez zegar okołodobowy oparty na białkach Kai2. Seki i wsp. donieśli, że DNA wybarwione Hoechst 33342 zostało zagęszczone w komórkach S. elongatus pod koniec okresu światła i wykazało falisty kształt pręcika pod mikroskopem fluorescencyjnym. Skompresowane DNA następnie rozdzieliło się na dwie części w środku pręcika, gdy komórka się podzieliła, a na koniec powróciło do normalnego równomiernego rozkładu w każdej komórce potomnej3. Jednak jego przejściowy charakter i duży rozmiar do mikroskopii elektronowej utrudniały analizę strukturalną. Murata i wsp. połączyli kilka metod, w tym hodowlę synchroniczną, mikroskopię fluorescencyjną, szybkie zamrażanie i kriotomografię elektronową wysokiego napięcia (cryo-HVET), i udało im się zidentyfikować strukturę przejściowego zagęszczenia DNA, w tym kinetykę ciał polifosforanowych (PPB)4. Manuskrypt zawiera wizualne wyjaśnienie tak trudnego materiału w szczegółach poprzez połączenie procedur eksperymentalnych.

S. elongatus ma kształt kapsułki, długość od 2 do 5 μm, szerokość około 0,5 μm, a doskonałe zagęszczenie DNA pojawia się w żywych komórkach tylko na bardzo krótki czas. W związku z tym zmiany strukturalne zachodzące w zagęszczeniu DNA sinic nie były znane w szczegółach. Aby zbadać te struktury za pomocą mikroskopii elektronowej, konieczne jest przezwyciężenie dwóch głównych problemów technicznych. Jednym z nich jest obserwacja tak grubego okazu całej bakterii w warunkach zbliżonych do rodzimych, a drugim szybkie utrwalenie dynamicznej struktury. Jeśli chodzi o pierwszy problem, nieelastyczna średnia droga swobodna elektronów (iMFP) zależy od napięcia przyspieszającego mikroskopu elektronowego5. W transmisyjnym mikroskopie elektronowym (TEM) o napięciu 300 kV jest to mniej niż 350 nm. Na przykład, gdy w 200 kV TEM (iMFP ≈ 250 nm) obserwuje się zanurzoną w lodzie sinicę (grubość próbki ≈ 600 nm), struktury wewnątrz komórki są trudne do zaobserwowania. Natomiast 1 MV TEM (iMFP ≈ 500 nm) może dać obraz struktury cytoplazmatycznej w całej komórce (Rysunek 1). W tym protokole, jako jedną z części rozwiązania, zastosowano wysokonapięciowy mikroskop elektronowy (HVEM) o napięciu przyspieszającym 1 MV. Jednak obiekty, które wdrażają HVEM, są ograniczone na całym świecie. Możliwe alternatywne rozwiązania są również omówione w sekcji Dyskusja. Drugi problem został rozwiązany za pomocą mikroskopii krioelektronowej (cryo-EM). Jest to potężne narzędzie do wizualizacji dynamicznych struktur w warunkach zbliżonych do natywnych, gdzie próbka jest szybko zamrażana w ciekłym etanie za pomocą urządzenia do szybkiego zamrażania, a moment zamrożenia jest bezpośrednio obserwowany przy minimalnych modyfikacjach6. W połączeniu z tomografią, migawka trójwymiarowych (3D) struktur może zostać zrekonstruowana z serii tilt7. W tym eksperymencie zagęszczenie DNA odtworzono u S. elongatus przy użyciu hodowli synchronicznej w ciągu 12 godzin każdego cyklu światła/ciemności, a czas zamrożenia próbki określono przez monitorowanie pod mikroskopem fluorescencyjnym.

Opisane tutaj podejścia mają szerokie zastosowanie do badania dynamicznych struktur w komórkach bakteryjnych, np. podziału komórek, segregacji chromosomów i infekcji fagowej, i mają potencjał, aby otworzyć nowe drogi w badaniach mikrobiologicznych.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Synchroniczna hodowla sinic

  1. Kultura S. elongatus PCC 7942 na sterylizowanej płytce BG 11 (na sterylnej plastikowej szalce Petriego o średnicy 9 cm) zawierającej 1,5% (w/v) agaru i 0,3% (w/v) tiosiarczanu sodu8.
  2. Umieścić płytki w komorze wzrostowej w temperaturze 23 °C o natężeniu światła 50 μE/m2/s i poddać cyklom 12 godzin światła/12 godzin ciemności.
  3. Raz w tygodniu przenosić komórki na świeże płytki agarowe BG11.
    UWAGA: Kultury na agarze pojawią się jako zielone pasma aktywnie proliferujących komórek po tygodniu w tych warunkach hodowli.
  4. Weź zielone grudki komórek za pomocą wysterylizowanej płomieniem pętli drucianej i rozłóż komórki na świeżej płytce agarowej BG11. Zrób to na czystej ławce.

2. Monitorowanie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

  1. Użyj komórek hodowanych na płytce agarowej przez 6 dni, aby obserwować zagęszczenie DNA. Zebrać komórki z płytki pod koniec okresu światła, wlewając 1 ml 0,2 M roztworu sacharozy na komórki. Powtórz wlewanie roztworu na komórki, tak aby większość komórek została zebrana. Przenieś roztwór zawieszonych komórek do mikroprobówki w celu barwienia DNA.
  2. Dodać roztwór barwnika barwiącego DNA (np. Hoechst 33342) do 500 μl zawieszonego roztworu komórkowego w mikroprobówce do końcowego stężenia 1 μg/ml. Następnie trzymaj probówkę w ciemności przez 10 minut.
  3. Wirować przez 1 minutę przy 2 000 x g w celu osadzenia komórek. Odrzucić supernatant i dodać 10 μl 0,2 M roztworu sacharozy w celu uzyskania gęstej zawiesiny komórek.
  4. Przenieść 1 μl roztworu zawierającego barwione komórki do szkiełka szkiełkowego, nałożyć szkiełko nakrywkowe i obserwować za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w filtr UV przy użyciu soczewki obiektywowej o powiększeniu 100X i olejku immersyjnego.
  5. Upewnij się, że w tym momencie w większości komórek obserwuje się zagęszczenie DNA, a następnie przygotuj próbkę do następnego etapu zamrażania.

3. Zamrażanie próbek dla Cryo-HVET

  1. Ustaw urządzenie do zamrażania wgłębnego. Napełnij zbiornik ciekłym azotem i rozpocznij chłodzenie kriokomory po połączeniu zbiornika i komory rurką teflonową.
  2. Wlej ciekły etan do małego garnka wewnątrz komory po schłodzeniu komory do temperatury ciekłego azotu. Podczas pracy należy nosić okulary, ponieważ ciekły etan jest wybuchowy.
  3. Wyładowanie jarzeniowe po stronie węglowej dziurawej, pokrytej węglem siatki EM (dziurawa siatka) przez 30 s przy 50 mA za pomocą bombardera z jonami plazmy.
  4. Nanieść 1 μl złotego znacznika BSA (15 nm) na dziurawą siatkę jako znacznik odniesienia.
  5. Nałożyć 2,5 μl podwielokrotności komórek na etapie zagęszczania DNA na dziurawą siatkę. Zetrzyj nadmiar roztworu bibułą filtracyjną. Natychmiast zanurz siatkę w ciekłym etanie za pomocą tłoka w urządzeniu do zamrażania wgłębnego.
  6. Zamrożone kratki należy przechowywać w zbiorniku ciekłego azotu do czasu ich zbadania.

4. Krio-HVET

  1. Ustaw HVEM na wysokie napięcie 1 MV.
  2. Zamontuj zamrożoną siatkę w uchwycie na próbki kriogeniczne dla HVEM wstępnie schłodzonego do -150 °C ciekłym azotem wewnątrz stacji kriogenicznej i załaduj ją do HVEM. Uważaj, aby uniknąć zanieczyszczenia lodem.
  3. Wybierz obszar obrazowania przy mniejszym powiększeniu 1,000X. Dostosuj wysokość eucentrycznej osi z.
  4. Przechylić stolik na próbkę do -60° i usunąć luz związany z obrotem przechyłu.
  5. Dostosuj ostrość w pobliżu miejsca docelowego przy powiększeniu 10 000X. Ustaw niedostateczną ostrość od 6 do 10 μm poprzez odchylenie od ostrości obrazu. W celu obrazowania należy wcześniej ustawić dawkę na 2 e-/Å-2 lub mniej na próbce.
  6. Zmierz dawkę elektronów przez gęstość prądu na ekranie obrazu w HVEM. Zrób zdjęcie na kliszy elektronowej lub aparatem cyfrowym przy takim samym powiększeniu, jak w procesie ustawiania ostrości.
  7. Obrazy nachylenia należy zbierać ręcznie, postępując zgodnie z tą samą procedurą, co w (4.5) od -60° do +60° z przyrostem kąta nachylenia od 2° do 4°,
    UWAGA: W wielu nowoczesnych mikroskopach elektronowych akwizycja serii pochylenia jest zautomatyzowana przez połączenie kamery cyfrowej. W takim przypadku postępuj zgodnie z instrukcją obsługi. W przypadku filmów negatywowych wywoływać filmy przez 12 minut w temperaturze 20°C w zbiorniku wywoływacza za pomocą wywoływacza o pełnej mocy i utrwalać w utrwalaczu na 10 minut. Digitalizuj filmy w rozdzielczości 4 000 dpi (0,635 nm/piksel na obrazie) za pomocą skanera płaskiego. W przypadku aparatu cyfrowego zebrane obrazy należy poddać bezpośrednio kolejnemu etapowi przetwarzania obrazu. W razie potrzeby zmniejsz rozmiar obrazu za pomocą filtra mediany, używając dwóch do czterech kategoryzacji (współczynnik zmniejszania rozmiaru) i odpowiedniego oprogramowania (np. ImageJ).

5. Rekonstrukcja tomograficzna

  1. Utwórz plik obrazu stosu z poszczególnych obrazów pochylenia za pomocą polecenia "tif2mrc" lub "newstack" w oprogramowaniu IMOD 9.
  2. Uruchom oprogramowanie eTomo GUI w IMOD i ustaw parametry obrazu: rozmiar piksela, średnicę odniesienia, obrót obrazu itp. Następnie utwórz skrypty.
  3. Poszczególne programy należy wykonywać zgodnie z oprogramowaniem wymienionym w tabelach materiałów, gdzie seria pochylenia jest wyrównana za pomocą znaczników odniesienia (ze średnim błędem resztkowym mniejszym niż 0,5). Na koniec zrekonstruuj tomogram 3D za pomocą algorytmu SIRT w IMOD.
  4. Wyodrębnij obszar zainteresowania (ROI) z tomogramu i odszumiaj go za pomocą filtra odszumiającego: anizotropowego filtra dyfuzyjnego w IMOD, filtra dwustronnego w EMAN10 lub matematycznego filtra morfologicznego11, itd., z odpowiednimi parametrami zwiększającymi kontrast.

6. Segmentacja interesującej nas cechy

UWAGA: Procedura opisana poniżej jest specyficzna dla używanego oprogramowania (zobacz Tabela materiałów), ale zamiast tego można użyć innych pakietów oprogramowania. Zapoznaj się z ich instrukcją obsługi.

  1. W oknie Przeglądarka 3D otwórz plik tomogramu w oprogramowaniu Amira i wygeneruj OrthoSlice.
  2. W oknie Edytor segmentacji utwórz plik segmentacji, wybierając nowe "pole etykiety".
  3. Ręcznie prześledź obramowanie obiektu zainteresowania (FOI). Podążaj za FOI przez wszystkie plastry tomogramu. W przypadku drugiego FOI utwórz nowy "materiał" i powtórz tę samą operację.
  4. Wygeneruj renderowanie powierzchni, wybierając menu "SurfaceGen". Aby zwizualizować podzieloną na segmenty objętość, wybierz menu "SurfaceView". Aby przesuwać, obracać i powiększać objętość 3D, użyj narzędzi dostępnych w oknie Przeglądarka 3D.
  5. Aby uzyskać automatyczną segmentację, użyj narzędzia Magiczna różdżka. Kliknij obiekt i dostosuj suwaki w opcjach Wyświetlanie i maskowanie, aby pokryć zakres wartości, tak aby obiekt był w pełni zaznaczony przez jego cechy.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W precyzyjnej hodowli synchronicznej w ciągu 12 godzin każdego cyklu jasnego/ciemnego, DNA oznaczone Hoechstem wykazuje normalny równomierny rozkład w stanie ciemnym (Rysunek 2a). Jednak stopniowo zagęszcza się w komórce w okresie światła i pojawia się jako falista struktura przypominająca pręcik (Rysunek 2b) pod koniec okresu światła. Na koniec pręt dzieli się w środku (strzałki w Rysunek 2c) i jego dwie części są rozprowadzane w komórkach potomnych ( Rysunek 2d). Po podziale komórki zbite DNA natychmiast znika, a DNA powraca do normalnego równomiernego rozkładu.

Gdy porcja komórek zawierających komórki w końcowym etapie zagęszczenia DNA została natychmiast przeniesiona na dziurawą siatkę i szybko zamrożona w ciekłym etanie, a zamrożona siatka została zaobserwowana przez 1 MV cryo-HVEM, wewnętrzne struktury cyjanobakterii, w tym DNA, warstwy błony tylakoidowej, ściany komórkowe i PPB, wyglądały jak na zrzucie ekranu w momencie zamrożenia (Rysunek 3a). Wiele komórek wykazywało wyraźne zagęszczenie DNA w komórkach (białe strzałki w Rysunek 3a) i można je było łatwo odróżnić od normalnych komórek (białe groty strzałek w Rysunek 3b). Niektóre wykazywały zwężenie w środku komórek, zgodnie z oczekiwaniami przed podziałem komórek (żółta strzałka w Rysunek 3a).

Na tomogramach 3D można podzielić główne organelle komórki; można wyróżnić ścianę komórkową, warstwy błony tylakoidowej, DNA i PPB (Rysunek 4). W szczególności zagęszczone DNA zostało oddzielone wyraźną szczeliną w cytoplazmie, w której DNA było otoczone materiałem o niskiej gęstości, a warstwy błony tylakoidowej były zniekształcone wzdłuż falistego pręta zagęszczonego DNA. Na nowo zaobserwowano dynamiczne zachowanie PPB: w komórkach zbitych DNA zaobserwowano, że wiele małych PPB przylega do DNA, podczas gdy w normalnych komórkach są one duże i mniej. Ponadto, większość PPB pojawiła się jako pary, a niektóre DNA wydawały się być w procesie oddzielania się od PPB. Sugeruje to, że same PPB są podzielone na dwie części przez duplikację DNA i działają jako dostawcy fosforanów do syntezy DNA.

figure-results-1
Rysunek 1. Obrazy kriogeniczne zanurzonych w lodzie normalnych sinic, S. elongatus PCC 7942 przy różnych napięciach przyspieszających. a) 200kV oraz b) 1000kV. Podziałka = 500 nm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rycina 2: Mikroskopia fluorescencyjna komórek cyjanobakterii S. elongatus. Po synchronicznej hodowli w ciągu 12 godzin każdego cyklu światło/ciemność, komórki barwiono Hoechst 33342. (a) Komórki po 2 godzinach od wystąpienia stanu ciemnego wykazują jednolite znakowanie DNA. DNA w wielu komórkach stopniowo kondensowało się w okresie światła. Ostatecznie uformował on gruby falisty pręt (b) typowy dla zagęszczenia DNA. Po tym etapie zagęszczone struktury DNA szybko dzieliły się w swoich środkach (grotach strzałek) podczas podziału komórki (c), a dwa fragmenty rozdzielały się na komórki potomne (d). Komórki potomne powróciły do jednolitego znakowania DNA ponownie w ciemnym okresie. Podziałka = 2 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Obraz Cryo-HVEM sinic osadzonych w amorficznym lodzie. (a) Pokazuje obraz RAW przy nachyleniu 0°. Zdjęcia wykonano pod koniec okresu światła. Niektóre komórki wykazują faliste ciała DNA w kształcie pręcików, podobne do eukariotycznych skondensowanych chromosomów (białe strzałki). W normalnych komórkach cyjanobakterie wykazują dostrzegalną strukturę DNA w cytoplazmie (białe groty strzałek). Niektóre wykazują zwężenie w środku komórek, zgodnie z oczekiwaniami przed podziałem komórek (żółta strzałka). b) plasterki xy, xz, yz tomogramu 3D. Żółte kropkowane linie pokazują przecięcia plasterków. Podziałka liniowa = 2 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Ryc. 4: Ultrastruktura komórek zawierających skompresowane DNA. Główne składniki są podzielone na segmenty: ściana komórkowa (jasnożółta), błony tylakoidowe (czerwone) i DNA (niebieskie). (a) przedstawia wycinek Z tomogramu 3D. b) wszystkie segmenty. Przewężenie wskazujące na separację komórek pojawia się w środku komórki (strzałka). PPB są modelowane jako żółte lub pomarańczowe kule; Każda pomarańczowa kula reprezentuje odpowiednik najbliższej żółtej kuli. Podziałka = 500 nm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiliśmy sekwencję protokołów do wizualizacji przejściowego zagęszczenia DNA u sinic. Podstawowa koncepcja jest podobna do koncepcji korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej (CLEM)12. Ponadto w tej metodzie żywe cyjanobakterie monitorowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, szybko zamrażano na siatkach EM i bezpośrednio wizualizowano za pomocą wysokonapięciowej kriotomografii elektronowej. W pierwszej kolejności udało się zobrazować szczegółową strukturę zbitych komórek bakteryjnych DNA w 3D. Obecnie procedura ta jest specyficzna dla tego tematu, ale będzie stosowana w szerszym zakresie, w niektórych przypadkach ze zmodyfikowaną metodyką. W tym miejscu omówiono zalety, ograniczenia i przyszłe możliwości tej metody.

Jedną z zalet tej metody jest wizualizacja 3D całej komórki. 1 MV HVEM z powodzeniem zobrazował dynamiczną strukturę organelli subkomórkowych w komórkach zagęszczonych DNA. Jednak drobna struktura wewnątrz normalnych komórek nie mogła być rozróżniona ze względu na niski kontrast obrazu. Rosnące rozproszenie nieelastyczne i wielokrotne w grubych próbkach powoduje rozmycie obrazu13. Filtrowanie obrazów o zerowej stracie i najbardziej prawdopodobnych stratach za pomocą filtra energetycznego może poprawić kontrast obrazu poprzez zmniejszenie rozpraszania nieelastycznego14,15, ale nie zadziała w przypadku próbek grubszych niż iMFP. Szczyty zerowej straty i najbardziej prawdopodobnej straty drastycznie zmniejszają się wraz z grubością próbki. Szczególnie trudno jest uzyskać wystarczający stosunek sygnału do szumu dla wrażliwych na elektrony próbek zanurzonych w lodzie. Murata i wsp. wykazali, że skaningowa mikroskopia transmisyjna 1MV (STEM) daje wyższy kontrast obrazu niż obraz jasnego pola w osadzonych w plastiku komórkach drożdży o grubości 5 μm, gdzie kontrast obrazu jest przede wszystkim określany przez kontrast amplitudy13. Oczekuje się jednak, że wpływ uszkodzeń typu knock-on na bardziej przyspieszone elektrony tworzy kolejne ograniczenie dawki promieniowania dla wrażliwych na uszkodzenia próbek kriogenicznych16. Zastosowanie płytek fazowych Volta i Zernike17,18 dla HVEM może być w stanie zmniejszyć uszkodzenia spowodowane efektem domina poprzez zmniejszenie całkowitej dawki w przyszłości. Innym ograniczeniem w stosowaniu HVEM do grubych próbek jest fakt, że obiekty użytkowników, które zapewniają HVEM, są rzadkie na całym świecie.

Wykorzystując alternatywną metodologię obserwacji grubych próbek, tomografia krio-STEM przy napięciu 300 kV wykazała obrazy o wysokim kontraście na zamrożonych i uwodnionych próbkach o grubości przekraczającej kilkaset nanometrów19. Aby uzyskać kontrast fazowy w cryo-STEM, wprowadzono również mikroskopię ptychograficzną elektronową, w której płytka fazowa w soczewce kondensatora transponuje dyfrakcję modulowaną fazowo do rozpikselowanego detektora2D 20. Obrazy są uzyskiwane za pomocą obliczeń z wielu dyfrakcji. Do bezpośredniego i szybkiego krioobrazowania 3D dużych natywnych zamrożonych próbek, można również zastosować cryo-FIB-SEM21, gdzie stosuje się seryjne cięcie ze skupioną wiązką jonów i blokowym obrazowaniem twarzy do obrazowania w pełni uwodnionych zamrożonych próbek. Chociaż technologie te rozszerzają zakres widzenia próbek biologicznych, trudno jest znaleźć docelową lokalizację bakterii, np. bakterii oznakowanych, ponieważ cel znajduje się całkowicie pod lodem i nie można go zidentyfikować przed przycięciem.

Zagęszczenie DNA wytwarza wyraźną strukturę u sinic. Komórki zagęszczone DNA można łatwo odróżnić, nawet bez barwienia, ze względu na duże odchylenie gęstości w komórkach, które nie występuje w normalnych komórkach. Jednak, aby uwidocznić bardziej lokalne zdarzenia w komórce, konieczne jest przeniesienie fluorescencyjnie znakowanego ROI do mikroskopu elektronowego. W przypadku korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej (CLEM) obrazy z mikroskopu świetlnego i obrazy z mikroskopu elektronowego są na ogół korelowane za pomocą fluorescencyjnych kulek lateksowych lub kropek kwantowych na siatkach szukacza EM12. Znakowane cząstki muszą mieć nie tylko fluorescencję, ale także wysoką gęstość elektronów. Mogą one dokładnie i niezawodnie skorelować pozycje między dwoma obrazami. Ponadto, potwierdzając oznaczony obszar za pomocą mikroskopii krioświetlnej, można osiągnąć całkowite nałożenie się zwrotu z inwestycji między dwoma mikroskopami. Przy charakteryzowaniu bardziej szczegółowych zdarzeń strukturalnych w zagęszczeniu DNA, cząstki te i mikroskop krioświetlny będą niezastąpionym narzędziem do bardziej solidnej i dokładnej korelacji w przyszłości.

W artykule pokazano, jak scharakteryzować przejściową strukturę zagęszczenia DNA u sinic za pomocą połączenia hodowli synchronicznej, mikroskopii fluorescencyjnej i wysokonapięciowej krioelektronowej tomografii. Protokół ten koncentruje się na obserwacji zagęszczonego DNA. Dzięki połączeniu tej metody z innymi nowymi technologiami wymienionymi powyżej, możliwe będzie dokładniejsze zbadanie procesu zagęszczania DNA, a odpowiednio zmodyfikowane metody mają szerokie zastosowanie do innych dynamicznych zdarzeń strukturalnych u bakterii.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Tammo Reisewitzowi za krytyczne przeczytanie manuskryptu, a także Mako Hayashi i Sayuri Hagiwara za staranną hodowlę i obserwację cyjanobakterii, Yoshitaka Kimori za przetwarzanie obrazu, Chihong Song, Naoyuki Miyazaki i Miyoko Nagayoshi za pomoc w segmentacji struktur. Prace te były wspierane przez Program Badań Zespołowych Narodowego Instytutu Nauk Fizjologicznych (NIPS) dla Y.K.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Roztwór Hoechst 33342Dojindo346-079511 mg / ml w H2< / sub>O
Agar w proszku (do hodowli roślin)Wako016-11875
Kwas borowyWako027-0219299,5%
Czterowodny chlorek manganuWako139-0072299%
Siarczan siedmiowodnyWako264-0040599,5%
Molibdenian soduWako196-0247299%
Siarczan miedzi pięciowodnyWako039-0441299,5%
Sześciowodny azotan kobaltuWako031-0375299,5%
Azotan soduWako191-0254299%
Siarczan magnezu siedmiowodnyWako131-0040599,5%
Wapń chlorek odwadniającyWako031-0043599,5%
Kwas cytrynowyWako036-0552298%
EDTA-2NaDojindo343-0186199,5%
Węglan soduWako197-0158199,8%
Fosforan potasu dwuzasadowyWako164-0429599%
TES (Dobry' bufor s)Dojindo344-0265399%
Cytrynian żelazowo-amonowyWako092-008021. gatunek
Tiosiarczan sodu pentahydratWako197-0358599%
BSA złoty znacznik 15nmAurion215.133
Siatka Quantifoil EMQuantifoilMicroTools R3.5/1 Siatka
Folie elektronoweKodakSO-163
DeveloperKodakD19
FixerKodakRapid fixerSolution
Bibuła filtracyjnaWhatmanGrade 1
Komora wzrostowaNKsystemLH-100SP
Mikroskop fluorescencyjnyNikonECLIPSE 50i
TEM HItachiH1250M
Uchwyt na próbki kriogeniczne doGatan
LeicaEM CPC
Plasma Ion BombarderUrządzenie próżniowePIB-10
Przechowywanie ciekłego azotuTaylor-Wharton25LDB
Zbiornik rozwijającyDosaka EMTB-3-75
płaskiNikonOprogramowanie do segmentacji Coolscan 9000ED
FEIAmirahttps://www.fei.com/software/amira
Oprogramowanie do rekonstrukcji tomograficznejeTOMOhttp://bio3d.colorado.edu/imod
miedziana Wysokonapięciowy urządzenia do zamrażania wgłębnego HVEM skaner

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Circadian rhythms in gene transcription imparted by chromosome compaction in the cyanobacterium Synechococcus elongatus. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 103 (22), 8564-8569 (2006).">Smith, R. M., Williams, S. B. Circadian rhythms in gene transcription imparted by chromosome compaction in the cyanobacterium Synechococcus elongatus. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 103 (22), 8564-8569 (2006).
  2. A cyanobacterial circadian clock based on the kai oscillator. CSHS Quant. Biol. 72, 47-55 (2007).">Kondo, T. A cyanobacterial circadian clock based on the kai oscillator. CSHS Quant. Biol. 72, 47-55 (2007).
  3. Observation of polyphosphate bodies and DNA during the cell division cycle of Synechococcus elongatus PCC 7942. Plant biol. 16 (1), Stuttgart, Germany. 258-263 (2014).">Seki, Y., Nitta, K., Kaneko, Y. Observation of polyphosphate bodies and DNA during the cell division cycle of Synechococcus elongatus PCC 7942. Plant biol. 16 (1), Stuttgart, Germany. 258-263 (2014).
  4. Ultrastructure of compacted DNA in cyanobacteria by high-voltage cryo-electron tomography. Sci. Rep. 6, 34934(2016).">Murata, K., Hagiwara, S., Kimori, Y., Kaneko, Y. Ultrastructure of compacted DNA in cyanobacteria by high-voltage cryo-electron tomography. Sci. Rep. 6, 34934(2016).
  5. Perspectives of molecular and cellular electron tomography. J. struct. boil. 120 (3), 276-308 (1997).">Koster, A. J., et al. Perspectives of molecular and cellular electron tomography. J. struct. boil. 120 (3), 276-308 (1997).
  6. Cryo-electron tomography: The challenge of doing structural biology in situ. J. Cell Biol. 202 (3), 407-419 (2013).">Lučić, V., Rigort, A., Baumeister, W. Cryo-electron tomography: The challenge of doing structural biology in situ. J. Cell Biol. 202 (3), 407-419 (2013).
  7. Visualizing Adsorption of Cyanophage P-SSP7 onto Marine Prochlorococcus. Sci. Rep. 7, 44176(2017).">Murata, K., et al. Visualizing Adsorption of Cyanophage P-SSP7 onto Marine Prochlorococcus. Sci. Rep. 7, 44176(2017).
  8. Generic assignments, strain histories and properties of pure cultures of Cyanobacteria. J. Gen. Microbiol. 111, 1-61 (1979).">Rippka, R., Deruelles, J., Waterbury, J. B., Herdman, M., Stanier, R. Y. Generic assignments, strain histories and properties of pure cultures of Cyanobacteria. J. Gen. Microbiol. 111, 1-61 (1979).
  9. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J. struct. boil. 116, 71-76 (1996).">Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J. struct. boil. 116, 71-76 (1996).
  10. Applications of a bilateral denoising filter in biological electron microscopy. J. Struct. Biol. 144, 114-122 (2003).">Jiang, W., Baker, M. L., Wu, Q., Bajaj, C., Chiu, W. Applications of a bilateral denoising filter in biological electron microscopy. J. Struct. Biol. 144, 114-122 (2003).
  11. Morphological image processing for quantitative shape analysis of biomedical structures: effective contrast enhancement. J. Sync. Rad. 20, 848-853 (2013).">Kimori, Y. Morphological image processing for quantitative shape analysis of biomedical structures: effective contrast enhancement. J. Sync. Rad. 20, 848-853 (2013).
  12. Correlative microscopy for 3D structural analysis of dynamic interactions. J. Visual. Exper. 76, e50386(2013).">Jun, S., Zhao, G., Ning, J., Ga Gibson,, Watkins, S. C., Zhang, P. Correlative microscopy for 3D structural analysis of dynamic interactions. J. Visual. Exper. 76, e50386(2013).
  13. Whole-cell imaging of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae by high-voltage scanning transmission electron tomography. Ultramicros. 146, 39-45 (2014).">Murata, K., Esaki, M., Ogura, T., Arai, S., Yamamoto, Y., Tanaka, N. Whole-cell imaging of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae by high-voltage scanning transmission electron tomography. Ultramicros. 146, 39-45 (2014).
  14. Imaging of thick sections of nervous tissue with energy-filtering transmission electron microscopy. J. Microsc. 183, 89-101 (1996).">Kortje, K. H., Paulus, U., Ibsch, M., Rahmann, H. Imaging of thick sections of nervous tissue with energy-filtering transmission electron microscopy. J. Microsc. 183, 89-101 (1996).
  15. Automated most-probable loss tomography of thick selectively stained biological specimens with quantitative measurement of resolution improvement. J. Struct. Biol. 148 (3), 297-306 (2004).">Bouwer, J. C., et al. Automated most-probable loss tomography of thick selectively stained biological specimens with quantitative measurement of resolution improvement. J. Struct. Biol. 148 (3), 297-306 (2004).
  16. Radiation damage in the TEM and SEM. Micron. 35 (6), 399-409 (2004).">Egerton, R. F., Li, P., Malac, M. Radiation damage in the TEM and SEM. Micron. 35 (6), 399-409 (2004).
  17. Volta potential phase plate for in-focus phase contrast transmission electron microscopy. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 111 (44), 15635-15640 (2014).">Danev, R., Buijsse, B., Khoshouei, M., Plitzko, J. M., Baumeister, W. Volta potential phase plate for in-focus phase contrast transmission electron microscopy. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 111 (44), 15635-15640 (2014).
  18. Zernike phase contrast cryo-electron microscopy and tomography for structure determination at nanometer and subnanometer resolutions. Structure. 18 (8), 903-912 (2010).">Murata, K., et al. Zernike phase contrast cryo-electron microscopy and tomography for structure determination at nanometer and subnanometer resolutions. Structure. 18 (8), 903-912 (2010).
  19. Cryo-scanning transmission electron tomography of biological cells. Nat. Methods. 11 (4), 423-428 (2014).">Wolf, S. G., Houben, L., Elbaum, M. Cryo-scanning transmission electron tomography of biological cells. Nat. Methods. 11 (4), 423-428 (2014).
  20. Efficient linear phase contrast in scanning transmission electron microscopy with matched illumination and detector interferometry. Nat. Comm. 7, 1-7 (2016).">Ophus, C., et al. Efficient linear phase contrast in scanning transmission electron microscopy with matched illumination and detector interferometry. Nat. Comm. 7, 1-7 (2016).
  21. Cryo FIB-SEM: Volume imaging of cellular ultrastructure in native frozen specimens. J. Struct. Biol. 184 (2), 355-360 (2013).">Schertel, A., et al. Cryo FIB-SEM: Volume imaging of cellular ultrastructure in native frozen specimens. J. Struct. Biol. 184 (2), 355-360 (2013).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Cyanobacteria DNA CompactionHigh voltage Cryo electron TomographyFluorescence MicroscopySynchronous CultureDNA VisualizationCryo specimen HolderTilt Series ReconstructionSIRT AlgorithmSurface Rendering3D Tomogram Analysis

Powiązane artykuły