Kwantyfikacja stechiometrii stechiometrii lizyny białek specyficznych dla miejsca przy użyciu spektrometrii mas z akwizycją niezależną od danych

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy bezstronną kwantyfikację specyficznej dla miejsca acetylacji białek i/lub zajętości sukcynylacji (stechiometria) całego proteomu poprzez analizę ratiometryczną endogennych modyfikacji modyfikacji wprowadzonych po ilościowym acylowaniu chemicznym przy użyciu stabilnych bezwodników znakowanych izotopami. W połączeniu ze spektrometrią mas akwizycji niezależnym od wrażliwych danych, uzyskuje się dokładne pomiary zajętości obiektu.

Streszczenie

Modyfikacja potranslacyjna (PTM) reszt lizyny białkowej przez N Ɛ-acylację indukuje zmiany strukturalne, które mogą dynamicznie regulować funkcje białek, na przykład poprzez zmianę aktywności enzymatycznej lub pośredniczenie w interakcjach. Precyzyjna kwantyfikacja zajętości acylacji białek specyficznych dla danego miejsca lub stechiometria jest niezbędna do zrozumienia funkcjonalnych konsekwencji zarówno globalnej stechiometrii niskiego poziomu, jak i indywidualnej stechiometrii acylacji wysokiego poziomu specyficznych reszt lizyny. Inne grupy zgłosiły pomiar stechiometrii acetylacji lizyny, porównując stosunek izotopów prekursorowych peptydów z endogennej, naturalnej acylacji obfitości i egzogennej, ciężkiej acylacji znakowanej izotopami wprowadzonej po ilościowej chemicznej acetylacji białek przy użyciu stabilnego bezwodnika octowego znakowanego izotopem. Protokół ten opisuje zoptymalizowane podejście z kilkoma ulepszeniami, w tym: (1) zwiększoną wydajnością acylacji chemicznej, (2) możliwością pomiaru sukcynylacji białek oprócz acetylacji oraz (3) poprawioną dokładnością ilościową dzięki zmniejszonym zakłóceniom przy użyciu kwantyfikacji jonów fragmentowych z akwizycji niezależnych od danych (DIA) zamiast sygnału jonów prekursorowych z akwizycji zależnej od danych (DDA). Wykorzystanie wyekstrahowanych obszarów pików z jonów fragmentacyjnych do kwantyfikacji umożliwia również unikalne różnicowanie stechiometrii acylacji na poziomie miejsca od peptydów proteolitycznych zawierających więcej niż jedną resztę lizyny, co nie jest możliwe przy użyciu sygnałów jonów prekursorowych do kwantyfikacji. Wizualizacja danych w Skyline, ilościowym środowisku proteomicznym typu open source, pozwala na wygodną inspekcję i przegląd danych. Razem ten przepływ pracy oferuje bezstronną, precyzyjną i dokładną ocenę ilościową zajętości całego proteomu w zakresie acetylacji i sukcynylacji lizyny specyficznej dla danego miejsca, co może ujawnić i nadać priorytet biologicznie istotnym miejscom acylacji.

Wprowadzenie

N Ɛ-acylacja białek reszt lizyny jest ważnym regulatorem funkcji białek. Uważa się, że acetylacja lizyny i inne acylacje, takie jak sukcynylacja, malonylacja i glutarylacja, regulują metabolizm, sygnalizację komórkową i inne procesy komórkowe1^,2,3,4 i mają wpływ na zaburzenia metaboliczne⁵. Liczne badania wykazały, że modyfikacje acylu lizyny ulegają dużym zmianom fałdowania w różnych warunkach w tkankach i liniach komórkowych ssaków^5,6,7,8 a także bakterie^9,10,11, jednak te względne zmiany fałdowania nie dają wglądu w proporcję całkowitego zmodyfikowanego białka. Badania przedstawiające pomiary zajętości miejsc acylacji są rzadkie^12,13,14, pomimo znaczenia i potrzeby takich badań, ponieważ dostarczają one więcej szczegółów niż względna zmiana krotności. Na przykład 10-krotna zmiana może oznaczać wzrost obłożenia witryny z 0,01 do 0,1%, z 1 do 10%, a nawet z 10 do 100%. Dokładne pomiary stechiometryczne są niezbędne do interpretacji biologicznego znaczenia acylacji i przewidywania wpływu na wielkość zmian strukturalnych i ewentualnie funkcjonalnych białek.

Jedna z poprzednich metod ilościowego określania zajętości miejsca wykorzystuje ciężkie chemiczne znakowanie stabilnymi izotopami niezmodyfikowanych reszt lizyny, a następnie spektrometrię mas do pomiaru stosunku między endogenną "lekką" acetylacją w porównaniu do egzogennej, chemicznie znakowanej "ciężkiej" acetylo-lizyny przy użyciu intensywności jonów prekursorowych12. Inne niedawne badanie przeprowadzone przez Zhou i wsp. ¹³ opisał podobne podejście do oceny stechiometrii acetylacji lizyny, które również wykorzystywało pełną chemiczną acetylację wszystkich niezmodyfikowanych reszt lizyny w białkach ze stabilnym znakowaniem izotopowym, ale wykorzystywało intensywność fragmentów jonów mierzoną przez DDA. Nakayasu i wsp. ¹⁴ użył podobnego podejścia DDA, ale zamiast tego użył stosunku lekkich i ciężkich jonów acetylo-lizyny imonu do kwantyfikacji. Kwantyfikacja na podstawie jonów fragmentacyjnych, jonów imonowych lub jonów sekwencyjnych (MS2) w większości przypadków skutkuje mniejszymi zakłóceniami sygnału w porównaniu z przetwarzaniem nienaruszonych jonów prekursorowych peptydów (MS1). Jednak kwantyfikacja jonów fragmentacyjnych z widm MS/MS generowanych przez DDA może cierpieć z powodu stochastycznych niedoborów w próbkowaniu, w których jony prekursorowe o wysokiej obfitości są bardziej prawdopodobne, że zostaną wybrane do MS/MS, a tym samym prowadzą do stronniczego i niekompletnego próbkowania jonów prekursorowych.

Ten nowatorski przepływ pracy⁴ (Rysunek 1) wykorzystuje koncepcyjnie metodę znakowania chemicznego stabilnych izotopów, pierwotnie opracowaną przez Baeza et al. ¹², jednak przepływ pracy jest następnie sprzężony z DIA w celu zebrania zarówno prekursorów, jak i wielu ilości jonów fragmentacyjnych w wykrywalnym zakresie mas^15,16 zapewniając dokładne obliczenia stechiometryczne.

Obszary pików z jonów fragmentacyjnych, które zawierają interesujące miejsce acylacji, lub 'jony różnicujące fragmenty', są używane do ilościowego określenia zajętości miejsca acylacji (Rysunek 2). Jony fragmentacyjne, które nie zawierają modyfikacji, mają identyczne wartości m/z światła i ciężkości i są używane do identyfikacji peptydów, ale nie do oznaczania ilościowego. Skyline software¹⁷ służy do wyodrębniania obszarów pików prekursorów i fragmentów. Obecność jonów wielofragmentacyjnych zawierających dane miejsce acylacji zapewnia elastyczność w przypadku wykrycia zakłóceń w niektórych jonach fragmentacyjnych. Wizualizacja danych w Skyline pozwala na krytyczną kontrolę proporcji jonów odłamkowych lekkich do ciężkich. Oprócz ręcznej analizy danych opracowano napisany przez siebie pakiet R o otwartym kodzie źródłowym, StiochiolyzeR (https://github.com/GibsonLab/StoichiolyzeR), który wykorzystuje dane dotyczące jonów prekursorowych i jonów fragmentacyjnych zebrane za pomocą DIA i określa ilościowo stechiometrię acylacji specyficznej dla miejsca z peptydów zawierających wiele reszt lizyny, co nie jest możliwe w przypadku pomiarów intensywności tylko jonów prekursorowych⁴.

Ten protokół pokazuje również użycie endoproteinazy Glu-C, która jest specyficzna dla C-końcowego rozszczepienia na resztach kwasu glutaminowego i asparaginowego, zamiast używania trypsyny lub proteazy Arg-C, ponieważ te ostatnie często generują bardzo duże i potencjalnie wielokrotnie acylowane peptydy proteolityczne wynikające z zablokowanego rozszczepienia trypsyny na acylowane reszty lizyny. Procedura znakowania chemicznego została również rozszerzona o zastosowanie bezwodnika bursztynowego (Rysunek 1), umożliwiając w ten sposób ilościowe określenie stechiometrii sukcynylometrycznej sukcynylacji. Oprócz ulepszeń w przygotowaniu próbek, wdrożenie frakcjonowania peptydów poprzez separację peptydów w trybie offline, zasadowym pH i odwróconej fazie (bRP) jeszcze bardziej zmniejszyło zakłócenia kwantyfikacji, umożliwiając lepszą dekonwolucję stechiometrii acylacji w całych próbkach proteomu. Łącznie metoda ta ma i podkreśla kilka zalet: (1) zwiększona wydajność acylacji chemicznej; (2) pomiar stechiometrii sukcynylacji białek oprócz acetylacji; oraz (3) poprawiona dokładność kwantyfikacji. Lepsza kwantyfikacja wynika ze zmniejszenia zakłóceń w sygnałach jonów fragmentacyjnych z DIA w porównaniu z sygnałem prekursorowym DDA, a także z wdrożenia wstępnego frakcjonowania peptydów off-line przez bRP.

Protokół

1. Ilościowo białka acetylowe i/lub sukcynylanowe przy użyciu bezwodnika octowego lub bursztynowego znakowanego izotopowo

1. Przygotować równolegle 3 powtórzenia po 100 μg próbki białka albuminy surowicy bydlęcej (BSA) o stężeniu 1 μg/μl (łącznie 100 μl), stosując roztwór mocznika i wodorowęglanu trietyloamonu (TEAB) (8 M mocznik, 200 mM TEAB, pH 8).
   UWAGA: Ważne jest, aby używać buforu wolnego od amin. Próbki białek użyte w sekcji dotyczącej wyników reprezentatywnych to BSA, ilościowo sukcynylowane BSA oraz ich mieszaniny dające próbki BSA o określonym zajętości sukcynylacji odpowiednio 0%, 1%, 1%, 10%, 50% i 100% (każda próbka zostanie przygotowana w 3 powtórzeniach). Protokół ten został również przeprowadzony przy użyciu lizatów białkowych z Escherichia coli i wątroby myszy ⁴. Protokół może być również stosowany do innych lizatów komórkowych lub tkankowych.
2. Zredukować 100 μl próbki BSA (100 μg) z 8 μl 250 mM ditiotreitolu (DTT), aby osiągnąć końcowe stężenie 20 mM DTT i inkubować próbkę w temperaturze 37 °C przez 30 minut z mieszaniem przy 1 400 obr./min.
3. Zredukowaną próbkę BSA należy zalkilować 21,6 μl 200 mM jodoacetamidu, aby osiągnąć końcowe stężenie 40 mM jodoacetamidu i inkubować próbkę w ciemności w temperaturze pokojowej przez 30 min.
   UWAGA: Ważne jest, aby stężenie jodoacetamidu było nieco większe niż 2x stężenie DTT, aby zapewnić, że wszystkie zredukowane tiole białkowe są alkilowane.
4. Przystąpić do przygotowania bezwodnika octowego-d₆ (etap 1.4.1) lub bezwodnika bursztynowego-d ₄ (etap 1.4.2) potrzebnych do chemicznej (ilościowej) acetylacji lub sukcynylacji próbek.
   1. Oznaczyć molowość (M) 1 g podwielokrotności wodnego roztworu bezwodnika octowego-d₆ na podstawie masy cząsteczkowej (108,13 g/mol) i gęstości (1,143 g/ml w temperaturze 25 °C).
      UWAGA: Opakowanie 1 g zawiera 9,248 μmol bezwodnika octowego-d₆ w objętości 875 μl, co daje 10,57 M roztwór stosowany do peracetylacji próbek.
   2. Przygotować 5 M roztwór bezwodnika bursztynowego _d4, rozpuszczając proszek w bezwodnym DMSO bezpośrednio przed reakcją, aby uniknąć hydrolizy odczynnika. Rozpuścić 0,24 g bezwodnika bursztynowego d₄ w 461 μl bezwodnego DMSO w celu uzyskania 5 M roztworu.
5. Przeprowadzić ilościową chemiczną acetylację lub sukcynylację przez dodanie odpowiednio 60 μmol bezwodnika octowego-d₆ (6 μl roztworu 10,57 M) lub bezwodnika bursztynowego _d4 (12 μl 5 M roztworu) i inkubować próbkę w temperaturze 4 °C przez 20 minut w mieszalniku wirowym.
   UWAGA: Ze względu na kwasowość bezwodników białka mogą się wytrącać. Zanotuj i dostosuj zgodnie z opisem w kroku 1.6.
6. Dodać 10 μl 7,25 M NaOH po inkubacji, aby zwiększyć pH do ~8 w celu wyeliminowania wszelkich produktów ubocznych O-acylacji. Krótko przemieszać i sprawdzić pH próbki, namierzając 1 μl na papierze pH.
   UWAGA: Może być konieczne dodanie więcej niż 10 μl 7,25 M NaOH, aby osiągnąć pH 8. Ponadto potencjalnie wytrącone białka powinny się ponownie rozpuścić.
7. Powtórz kroki peracylacji i regulacji pH 1,5 i 1,6, w sumie trzy razy. Sprawdź wartości pH i zanotuj objętość roztworu podstawowego dodawanego na powtórzenie. Pracuj szybko podczas powyższych etapów acylacji chemicznej, ponieważ bezwodniki ulegną hydrolizie i stracą reaktywność.
8. Po końcowej reakcji znakowania i dostosowaniu pH dodać 10 μl 50% roztworu hydroksyloaminy, aby odwrócić reakcje uboczne O-acylacji.

2. Strawienie przereagowanych próbek białek za pomocą endoproteinazy Glu-C

1. Rozcieńczyć stężenie mocznika do 0,8 M za pomocą 50 mM TEAB, pH 8 i znormalizować objętość próbki.
2. Próbki białek trawić przez dodanie endoproteinazy Glu-C w stosunku proteazy do białka substratu 1:50 (w/w) i inkubować próbki przez noc w temperaturze 37 °C z mieszaniem przy 1 400 obr./min.
3. Zakwasić i schłodzić próbki trawienia białek, dodając kwas mrówkowy do 1% objętości.
4. Odsalać próbki za pomocą wkładów do ekstrakcji fazy stałej z równowagą hydrofilowo-lipofilową. Użyj jednego wkładu z sorbentem 30 mg na próbkę, maksymalnie 5 mg materiału na wkład^4,18.
   UWAGA: Ważne jest, aby sorbent wewnątrz wkładu był mokry przez cały proces odsalania. W razie potrzeby wyłącz pompę próżniową, aby spowolnić przepływ rozpuszczalnika lub próbki przez wkład.
   1. Włóż wkład(y) do portu(ów) w 24-portowym kolektorze próżniowym z pustakami szklanymi i włącz pompę próżniową. Pozostaw nieużywane porty zamknięte. Pozostaw jeden lub dwa porty niezaślepione, aby w razie potrzeby utrzymać niższe ciśnienie na wakuometrze.
   2. Zwilż każdy wkład dwukrotnie 800 μl 80% acetonitrylu (ACN)/0,2% kwasu mrówkowego/19,8% wody. Upewnij się, że poziom rozpuszczalnika utrzymuje się 2–3 mm powyżej poziomu sorbentu. Upewnij się, że wakuometr na kolektorze wskazuje 16.9–67.7 kPa (5–20 in Hg).
   3. Zrównoważyć każdy wkład trzykrotnie z 800 μl 0,2% kwasu mrówkowego w wodzie. Upewnij się, że wakuometr na kolektorze wskazuje 16.9–67.7 kPa (5–20 in Hg).
   4. Załaduj próbki peptydów do wkładu. Upewnij się, że wakuometr na kolektorze wskazuje 6.77–8.47 kPa (2–2.5 cala Hg), a natężenie przepływu nie przekracza 1 ml/min.
   5. Umyj każdy wkład trzykrotnie 800 μl 0,2% kwasu mrówkowego w wodzie. Upewnij się, że wakuometr na kolektorze wskazuje 16.9–67.7 kPa (5–20 in Hg).
   6. Wyjmij wkład z kolektora próżniowego i umieść go w mikroprobówce o pojemności 1,5 ml.
   7. Jednorazowo eluować peptydy za pomocą 800 μl 80% ACN/0,2% kwasu mrówkowego/19,8% wody i pozostawić rozpuszczalnik do inkubacji z sorbentem przez 2-3 minuty.
   8. Za pomocą pipety przepchnąć rozpuszczalnik przez warstwę sorbentu wewnątrz wkładu. Powtórz dla drugiej elucji 400 μl 80% ACN/0,2% kwasu mrówkowego/19,8% wody do tej samej mikroprobówki o pojemności 1,5 ml.
5. Wysuszyć eluat przez odwirowanie próżniowe (stała szybkość wirowania na poziomie 268 x g), zwykle przez 3 godziny
   UWAGA: W razie potrzeby wysuszone próbki eluatu można przechowywać zamrożone w temperaturze -20 °C do momentu przygotowania do przystąpienia do frakcjonowania.

3. Peptydy frakcjonowane przy użyciu HPLC z odwróconą fazą offline o zasadowym pH

1. Próbki peracylowane i strawione Glu-C (przygotowane zgodnie z opisem w sekcjach 1 i 2) zawiesić ponownie zawiesić w 200 μl buforu A (10 mM mrówczanu amonu w wodzie, pH 10), mieszać próbkę przez 10 minut w mieszalniku wirowym w temperaturze 4 °C i odwirowywać w temperaturze 17 500 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
   UWAGA: Otrzymana próbka peptydu jest gotowa do frakcjonowania offline przez separację o wysokim pH^19,20.
2. Zaprogramuj metodę frakcjonowania HPLC w trybie offline w zależności od używanego urządzenia i oprogramowania. Poniższa metoda jest specyficzna dla binarnego systemu pomp HPLC, w tym detektora UV o podwójnej długości fali, automatycznego podajnika próbek, kolektora frakcji i kolumny C18 (4,6 mm x 250 mm, wielkość cząstek 5 μm), która toleruje pH 10.
3. Zbierz po 40 frakcji przez 2,1 minuty na frakcję i połącz co czwartą frakcję, co daje cztery końcowe frakcje zbiorcze⁴. Większa liczba połączonych frakcji może być wykorzystana do dalszego zmniejszenia złożoności próbki kosztem czasu zbierania danych ze spektrometrii mas.
4. Wysuszyć zebrane frakcje w liofilizarze, ponownie zawiesić wysuszone próbki peptydów w 1 ml 50% ACN i 1% kwasu mrówkowego w wodzie i przenieść do mniejszego pojemnika na próbki. Przenieść przeniesioną próbkę suszyć przez wirowanie próżniowe (stała szybkość wirowania na poziomie 268 x g), zwykle przez 1 godz
   UWAGA: Niska prężność par mrówczanu amonu może utrudnić całkowite wysuszenie. Jeżeli po wysuszeniu znaczne ilości soli mrówczanu amonu pozostają w postaci osadu soli, należy powtórzyć ekstrakcję do fazy stałej.
5. Ponownie zawiesić próbki w 20 μl 0,2% kwasu mrówkowego w wodzie z mieszaniną wzorców peptydów o indeksowanym czasie retencji (iRT).
   UWAGA: Próbki są teraz gotowe do analizy za pomocą spektrometrii mas.

4. Analiza DIA próbek frakcjonowanych peptydów

1. Próbki należy analizować przy użyciu metody DIA LC-MS/MS, którą można dostosować do dostępnych przyrządów do spektrometrii mas. Analizę przeprowadzono przy użyciu systemu nano-LC 2D HPLC podłączonego online do ortogonalnego kwadrupolowego spektrometru mas czasu przelotu (QqTOF).
   1. Zaprogramuj oprogramowanie przyrządu tak, aby mieszaniny peptydów były przenoszone na układ wstępny kolumny C18 (200 μm x 6 mm C18-CL chip, 3 μm, 300 A) i myj z prędkością 2 μl/min przez 10 minut rozpuszczalnikiem ładującym (H₂O / 0,1% kwas mrówkowy) w celu odsalania.
   2. Oddzielić peptydy chromatograficznie na chipie C18-CL o wymiarach 75 μm x 15 cm (3 μm, 300 A) przy natężeniu przepływu 300 nL/min z gradientem 2 godzin, używając typowych (i specyficznych dla systemu LC) wodnych rozpuszczalnikowych i rozpuszczalników ACN⁴.
   3. Wygeneruj metodę DIA o zmiennym oknie, w której okna zakresu mas o zmiennej szerokości (od 5 do 90 m/z) są przekazywane z kwadrupola Q1 do komórki zderzeniowej w krokach przyrostowych w pełnym zakresie mas (m/z 400-1,250).
      UWAGA: Czas cyklu wynoszący 3,2 s obejmuje skanowanie jonów prekursorowych przez 250 ms, po którym następuje czas akumulacji 45 ms dla każdego z 64 segmentów SWATH^21,22.
2. Identyfikuj peptydy za pomocą równoległej analizy próbek przez DDA MS i budowania bibliotek spektralnych, lub alternatywnie, peptydy można zidentyfikować bezpośrednio z danych DIA za pomocą oprogramowania PIQED²³, które obsługuje wszystkie techniczne etapy przetwarzania danych, identyfikacji i importu do Skyline w celu późniejszej kwantyfikacji.

5. Przykładowy samouczek analizy danych

1. Pobierz oprogramowanie Skyline (http://proteome.gs.washington.edu/software/skyline) i utwórz konto PanoramaWeb (https://panoramaweb.org).
   UWAGA: Szczegółowe samouczki opisujące korzystanie z Skyline z danymi znajdują się w (https://skyline.ms/wiki/home/software/Skyline/page.view?name=tutorials). Inne algorytmy programowe mogą być używane zamiast tego do wyodrębniania obszarów pików lekkich i ciężkich fragmentów jonów z akwizycji DIA, takich jak Open SWATH²⁴, wtyczka SWATH 2.0 do PeakView²⁵ i Spectronaut²⁶.
   1. Pobierz plik z danymi Skyline, aby uzyskać reprezentatywne wyniki BSA (Rysunek 3) z Panorama Public: https://panoramaweb.org/labkey/JoVEsuccBSA.url. Na stronie Panorama przejdź do tabeli "Targeted MS Runs" i pobierz plik sky.zip, wybierając link POBIERZ po prawej stronie. Rozpakuj pobrany folder .zip i kliknij dwukrotnie plik skyline.sky, aby otworzyć go w Skyline. Sprawdź drzewo docelowe jonów fragmentów peptydów (lewy panel) i cztery chromatogramy z określonych procentów sukcynylacji światła (prawe panele).
   2. Wybierz menu "Widok", przejdź do "Obszary szczytowe | Powtórz porównanie". Po prawej stronie okna pojawi się panel "Peak Areas – Replicate Comparison" zawierający wykresy słupkowe. W panelu Obszary szczytowe kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz polecenie "Przejścia | Pojedynczy", który pokazuje obszar piku jonu fragmentacyjnego dla wybranego jonu fragmentu. Na koniec kliknij prawym przyciskiem myszy panel "Obszary szczytowe" i wybierz "Porządek | Dokument".
   3. W panelu drzewa docelowego po lewej stronie okna kliknij prawym przyciskiem myszy peptyd "E.LCKVASLRE. T | Stosunek do |Oneheavy", który oblicza stosunek sygnału lekkich jonów do sygnału ciężkiego jonu, Light/Heavy.
      UWAGA: To nie to samo, co współczynnik stechiometrii zajętości terenu dla Light/(Heavy+Light).
   4. Zauważ, że drzewo docelowe podaje teraz proporcje L/H na prawo od jonów fragmentów światła.
2. Określić "jony fragmentów różnicowania", które zawierają interesujące nas miejsce acylacji.
   UWAGA: Jak pokazano na rysunku Rysunek 3, przedstawiający dokładnie ten przykład, jony różnicujące zostały określone jako y₇ (najwyżej uszeregowane), y₈, b₃ i b₄. Zauważ, że nieróżnicujące się jony fragmentacyjne wykazują stosunek 1 w drzewie docelowym.
   1. W drzewie docelowym lewego panelu, pod węzłem podrzędnym 588.30++ peptydu E.LCKVASLRE. T, kliknij na y7 różnicujący fragment jon
      K [y₇ ] – 902,49+ (ranga1) [5]
      Zwróć uwagę na zwiększającą się wysokość i powierzchnię szczytu.
   2. W drzewie docelowym lewego panelu, pod węzłem podrzędnym 588.30++ peptydu E.LCKVASLRE. T, kliknij na y₅ nieróżniczkujący się fragment jon A[y₅ ] – 575.31+ (ranga 6) [1]. Zauważyć, że chromatogramy jonów fragmentacyjnych y₅ i powierzchnie pików pozostają w tym samym zakresie dla wszystkich próbek.
   3. W panelu drzewa docelowego przejrzyj inne różniczkujące (stosunek inny niż 1) i nieróżnicujące (stosunek 1) jony fragmentacyjne i zwróć uwagę na zmiany i wzorce na wykresie słupkowym obszaru piku i chromatogramach.
   4. Określ dokładne obszary pików dla lekkich i ciężkich par jonów różnicujących się w celu obliczenia stechiometrii (dodatkowe szczegóły patrz również Meyer i wsp.⁴). Kliknij na "Widok | Siatka dokumentu" i pojawi się siatka dokumentu. W lewym górnym rogu siatki dokumentu kliknij "Widoki | Wyniki przejścia", aby wyświetlić wielokolumnową tabelę z informacjami o jonach fragmentacyjnych, takimi jak sekwencja peptydów, prekursor mz, nazwa repliki itp.
   5. Zmień format raportu na "pivot", klikając ponownie "Widoki" w siatce dokumentu i wybierając "Edytuj widok", aby otworzyć okno Dostosuj widok. W lewym dolnym rogu okna "Dostosuj widok" zaznacz "Nazwa replikacji przestawnej" i wybierz "OK", aby zamknąć okno Dostosuj widok. Zwróć uwagę, że teraz okno tabeli "Siatka dokumentu: Wyniki przejścia" zostało ponownie rozmieszczone w celu pogrupowania kolumn Nazwa replikacji, Czas przechowywania, Obszar, Tło, Ranga szczytowa według replikacji (1%, 10%, 50%, 100% sukcynylacji).
   6. Dla peptydu "E.LCKVASLRE. T" w tabeli "Document Grid: Transition Result" znajdź kolumnę "Precursor Mz", kolumnę "Fragment Ion" oraz kolumnę Obszar 1pct_light_sw1 (sukcynylacja 1%). Zauważ, że istnieją dwa jony prekursorowe dla tego peptydu, lekki (prekursor Mz 588.30 w pierwszych 8 rzędach) i ciężki (prekursor Mz 590.32 w ostatnich 8 rzędach).
   7. W kolumnie "Fragment Ion" znajdź dwa wiersze dla jonu fragmentu y8 odpowiadającego lekkim i ciężkim jonom prekursorowym. W tych samych wierszach w kolumnie Obszar 1pct_light_sw1 zapisz obszary y8 dla lekkich (15 820) i ciężkich (1 426 461).
3. Korzystając z tych wartości powierzchni pików, oblicz stechiometrię sukcynylu lub zmodyfikowaną proporcję, zgodnie z poniższym wzorem i uzyskaj stosunek stechiometrii 0,01 lub 1% sukcynylacji, który odpowiada proporcji sukcynylacji światła w tej zdefiniowanej mieszaninie:
   
4. Obliczyć stosunek stechiometrii dla 10% sukcynylacji, używając różnicujących wartości powierzchni piku jonów fragmentowych y8 z kolumny powierzchni 10pct_light_sw1, 144 953 (lekkie) i 1 188 041 (ciężkie), aby uzyskać stosunek 0,10 lub 10% sukcynylacji.
5. Obliczyć stosunek stechiometrii dla 100% sukcynylacji, używając różnicujących wartości powierzchni piku jonów fragmentacyjnych y8 z kolumny 100pct_light_sw1 Powierzchnia, 954,513 (lekka) i 16,407 (ciężka), aby uzyskać stosunek 0,98 lub 98% sukcynylacji.
6. Podobnie oblicz stosunek stechiometrii dla sukcynylacji 1%, używając różnicujących wartości powierzchni piku jonów fragmentacyjnych b3 z kolumny 1pct_light_sw1 Powierzchnia, 55 697 (lekkie) i 3 149 119 (ciężkie), aby uzyskać stosunek 0,01 lub 1% sukcynylacji.
7. Kontynuować obliczenia współczynnika stechiometrii, stosując wzór dla wszystkich różnicujących jonów fragmentacyjnych, zarówno jonów y, jak i jonów b, w celu uzyskania wartości stechiometrii sukcynylocytacji lizyny dla mieszanin sukcynylacji 1, 10, 50 i 100%.

Wyniki

Po pozyskaniu danych, z proteolitycznych acylowanych peptydów wyznaczono różnicujące jony fragmentów MS2, następnie wyekstrahowane chromatogramy jonowe (XIC) zostały przetworzone w Skyline, a odpowiednie obszary lekkich i ciężkich pików zostały wyeksportowane, które ostatecznie zostały wykorzystane do obliczenia zajętości miejsca. Rysunek 2A pokazuje koncepcyjną ilustrację tego, jak może wyglądać jon prekursorowy XIC z sygnałami peptydowymi zarówno lekkimi, jak i ciężkimi, oraz Rysunek 2B przedstawia przykład odpowiadających im jonów fragmentacyjnych XIC z kodowaniem kolorami (czerwony = jasny; niebieski = ciężki) do różnicowania jonów fragmentacyjnych zawierających modyfikacje acylacji lizyny.

Rysunek 3 pokazuje dane wynikające z eksperymentu dotyczącego obłożenia, takiego jak opisany powyżej, analizujący predefiniowane proporcje lekkiego/ciężkiego sukcynylanego BSA generowanego wewnętrznie na poziomie 1, 10, 50 lub 100%, oraz określenie jego obłożenia sukcynylacją. Importowanie danych o zajętości DIA do Skyline umożliwia łatwą wizualizację drzewa docelowego, wyświetlanie sekwencji peptydów i jonów fragmentacyjnych zarówno dla lekkich, jak i ciężkich jonów prekursorowych (Rysunek 3A). Dane z DIA-MS każdego zdefiniowanego sukcynylowanego stosunku BSA ujawniły immanentnie względne różnice w stosunku lekkiego do ciężkiego jonu_{y 7}, najwyżej sklasyfikowanego jonu różnicującego fragment ze zidentyfikowanego dopasowania widma peptydowego (oznaczonego na czerwono, Rysunek 3B). Rysunek 4 pokazuje przegląd przetworzonych wyników z obliczeń obłożenia MS2, które potwierdziły procentowe obłożenie sukcynylacji białka wejściowego, tutaj składającego się z pre-sukcynylowanego BSA. Zmierzone zajętość sukcynylu lizyny dla 20 proteolitycznych peptydów sukcynylowanych otrzymanych z komercyjnego BSA przed sukcynylacją, sukcynylowanych w określonych procentach (np. w 0, 1, 10, 50 i 100%) przedstawiono w tabeli 2. Dla każdego z 20 proteolitycznych peptydów BSA do obliczenia zajętości sukcynylacji lizyny (Ksucc) użyto najwyżej uszeregowanego, różnicującego jonu fragmentarycznego MS2, wyrażonego jako L/(L+H) w %. Ogólnie rzecz biorąc, kwantyfikacja oparta na MS2 wykazała bardzo dobrą dokładność w określaniu zajętości acylacji nawet przy niskich stechiometriach.

Rysunek 1: Przebieg pracy stechiometrii. (A) Białka inkubuje się trzykrotnie z bezwodnikiem octowym-d6 w celu acetylacji niezmodyfikowanych reszt lizyny. Następnie acetylowane białka są trawione endoproteinazą Glu-C, a następnie frakcjonowane HPLC peptydów proteolitycznych przy użyciu chromatografii odwróconych faz zasadowego. Na koniec peptydy są analizowane przez LC-MS przy użyciu DIA o zmiennych szerokościach okna prekursorowego. (B) Ten sam przebieg pracy jest stosowany do oznaczania stechiometrii sukcynylacji, jak opisano w (A), z wyjątkiem tego, że ciężki odczynnik acylacyjny zmienia się na bezwodnik bursztynowy-d ₄. Rysunek zaczerpnięty z Meyer et al. ⁴ (J. Am. Soc. Mass Spectrom., Otwarty Wybór). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Przykład możliwych uzyskanych danych i obliczeń stechiometrycznych. (A) Lekkie (L) i ciężkie (H) jony prekursorowe MS1 zawierające jedną acetylowaną lizynę różnią się o 3 jednostki masowe. XIC są generowane zarówno dla lekkich, jak i ciężkich otoczek izotopowych oznaczonych odpowiednio na czerwono i niebiesko. (B) Kwantyfikacja na podstawie jonów fragmentacyjnych MS2 XIC z akwizycji DIA może być przeprowadzona przy użyciu "różnicujących" lekkich i ciężkich jonów fragmentowych, które zawierają miejsce acetylacji oznaczone kolorem czerwonym i niebieskim. Wspólne jony fragmentacyjne są wyświetlane w kolorze czarnym kropkowanym i nie zawierają miejsca modyfikacji. Rysunek zaczerpnięty z Meyer et al. ⁴ (J. Am. Soc. Mass Spectrom., Otwarty Wybór). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Wizualizacja na tle nieba sukcynylowanego proteolitycznego peptydu BSA na różnych poziomach obłożenia. (A) Drzewo docelowe Skyline przedstawiające peptyd proteolityczny LCKsuccVASLRE i powstałe w jego wyniku jony fragmentacyjne. (B) Skyline wyekstrahował chromatogramy jonów fragmentacyjnych przy różnych poziomach zajętości sukcynylacji. Najwyżej sklasyfikowany jon różnicujący, y₇, zwiększa się w obszarze pików 1, 10, 50 i 100% korelując z procentem wejściowym wstępnie sukcynylowanego BSA (generowanego we własnym zakresie). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Ocena stechiometrii acylacji BSA wstępnie sukcynylowanego BSA. Pięć różnych próbek BSA przy określonych procentach ciężkiej modyfikacji (np. przy 0, 1, 10, 50 i 100%) poddano określeniu zajętości MS2. Zajętość miejsca dla 20 sukcynylowanych peptydów BSA określono na podstawie najwyżej uszeregowanych różnicujących jonów fragmentacyjnych dla pięciu różnych próbek BSA przy określonych procentach modyfikacji światła (np. przy 0, 1, 10, 50 i 100%). Wykres Box Whisker przedstawia rozkład 20 peptydów sukcynylowych, wartości z 50% peptydów znajdują się w "pudełku" (25% percentyla do 75% percentyla), górny wąs wskazuje wartości od 75% percentyla do maksimum (100%), a dolny wąs wskazuje wartości od 25% percentyla do minimum (0% percentyla). (J. Am. Soc. Spektrom masowy, wybór otwarty). Kwantyfikacja pomiarów znajduje się w tabeli 2. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

szt. pkt. czasu pkt. szt. pkt. Rozdział Rozdział Rozdział szt. szt.

Czas (minuta)	% A	% B
0,00	100	0
Godzina 7,27	Rozdział 92	8
Kategoria 45,27	73 Rozdział 73	27 Rozdział 27
Z dnia 49,27	Rozdział 69	Rozdział 31
65,27	61	39 Rozdział 39
72,27	Rozdział 40	60
godz. 80.00	10	90
O godz. 85.00	10	90
Godzina 86,00	100	0
godz. 120.00	100	0
Przepływ: 0,7 mL/min
Bufor A: 10 mM mrówczanu amonu w wodzie, pH 10
Bufor B: 10 mM mrówczanu amonu w 90% ACN i 10% wody, pH 10
Uwaga: pH obu faz ruchomych dostosowane do 10 za pomocą czystego amoniaku

Tabela 1: Gradient dla frakcjonowania HPLC w odwróconej fazie zasadowego pH offline. Długość gradientu: 120 min. Bufor A: 10 mM mrówczanu amonu w wodzie, pH 10. Bufor B: 10 mM mrówczanu amonu w 90% ACN i 10% wodzie, pH 10.

pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. punktu pkt. Rozdział pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt.

L/L+H w %	L/L+H w %	L/L+H w %	L/L+H w %	L/L+H w %
Ksucc 0%	Ksucc 1%	Ksucc 10%	Ksucc 50%	Ksucc 100%
0,2	Pytanie 1.7	Rozdział 11.1	50,9	Nr 99,2
Rozdział 1.2	2.3	Rozdział 12.3	49,4	97,6
2.9	3.8	14	Kategoria 48,6	99,5
0,5	1.8	Pytanie 11,7	50,8	99,5
0,2	Pytanie 1.7	Rozdział 11.1	48,3	Nr 98,2
0,2	Rozdział 1.2	11	47,5	96,1
0,3	1.6	Rozdział 12,8	51 Rozdział 51	Nr 99,2
3.7	5.2	Pytanie 14,7	51,9	89,5
1,5	1.8	Rozdział 12,5	47,2	Nr 91,1
0,8	1,5	Rozdział 11.3	48,4	96,8
0,2	1.6	Pytanie 13,9	49,7	98,9
0,1	1.1	Rozdział 10.7	48,2	98,6
0,2	0,9	Rozdział 10.3	49,4	99,4
0,5	Rozdział 2.5	Rozdział 17,2	52,3	97,5
0,1	3,5	20,8	51 Rozdział 51	99
0,3	Pytanie 1.9	Rozdział 10.7	49,6	Nr 98,2
cyfra arabska	Pytanie 1.7	Rozdział 10,9	47,7	96,3
0,3	Rozdział 1.2	10	53 Rozdział 53	Rozdział 98
1.1	1.8	Pytanie 12,9	57,9	94,1
0,2	1.4	Rozdział 11,6	Kategoria 48,6	98,8

Tabela 2: Kwantyfikacja zmierzonego obłożenia sukcynylacji lizyny BSA dla 20 proteolitycznych peptydów sukcynylowanych. Peptydy sukcynylowane otrzymywane z handlowego uprzednio sukcynylowanego BSA, sukcynylowane w określonych procentach (np. w stężeniach 0, 1, 10, 50 i 100%). Dla każdego z 20 proteolitycznych peptydów BSA do obliczenia zajętości sukcynylacji lizyny (Ksucc) użyto najwyżej uszeregowanego, różnicującego jonu fragmentarycznego MS2, wyrażonego jako L/(L+H) w %.

Dyskusja

Protokół ten zapewnia nowatorską i dokładną metodę ilościowego określania specyficznego dla miejsca acetylacji lizyny i obłożenia sukcynylacji, którą można zastosować do całego proteomu. Metoda ta opiera się na pomiarze endogennych lekkich peptydów i egzogennych ciężkich peptydów, z których te ostatnie są generowane in vitro przy użyciu ilościowego chemicznego acylowania białek deuterowanym bezwodnikiem octowym-d ₆ lub bezwodnikiem bursztynowym-d ₄ (ryc. 1). W podobnych metodach wykorzystano stabilne znakowanie izotopowe natywnych niezmodyfikowanych reszt lizyny i przeprowadzono kwantyfikację zajętości miejsca w oparciu o jony prekursorowe¹² lub jony fragmentacyjne z akwizycji DDA ^13,14. Protokół ten stosuje kilka etapów podczas przygotowywania próbki w celu poprawy wydajności acylacji i rozszerza etykietowanie chemiczne o sukcynylację. Gromadzenie danych za pomocą akwizycji DIA pozwala uzyskać zarówno intensywność jonów prekursorowych, jak i jonów fragmentacyjnych MS2 w całym wykrywalnym zakresie mas, zmniejszając w ten sposób interferencję jonów fragmentacyjnych. Analiza i kwantyfikacja za pomocą Skyline i niestandardowych skryptów opracowanych we własnym zakresie umożliwiają obliczanie zajętości miejsca dla peptydów zawierających więcej niż jedną resztę lizyny i więcej niż jedną acylację w jednym miejscu.

Na etapie przygotowania próbki w ramach tego protokołu należy wykonać kilka krytycznych kroków, których należy ściśle przestrzegać. Ponieważ cały protokół opiera się na skutecznej modyfikacji chemicznej wszystkich pozostałości lizyny, ten krok ma ogromne znaczenie. Bezwodniki reagują z wolnymi aminami, dlatego należy unikać zawierających aminy lub cząsteczek zanieczyszczeń w lizacie białkowym. Również podczas etapu chemicznej acylacji należy upewnić się, że pH mieszaniny reakcyjnej jest dostosowane z powrotem do pH 8 po każdej z trzech inkubacji z odczynnikiem bezwodnikowym, ponieważ reakcja ta zakwasza mieszaninę i mogą powstawać reakcje uboczne O-acylacji. Ponadto rozcieńczenie mieszaniny reakcyjnej zawierającej 8 M mocznik do około 0,8 M mocznika przed trawieniem i sprawdzenie, czy pH mieści się w optymalnym zakresie, jest ważne dla optymalnej aktywności endoproteinazy Glu-C. Kolejnym kluczowym elementem naszego protokołu jest etap gromadzenia danych i wprowadzenie przepływu pracy DIA, który przezwycięża wszelkie niespójności próbkowania danych DDA i pozwala na kwantyfikację na poziomie jonów fragmentów MS2. Jedną z głównych zalet metodologii DIA jest zmniejszenie zakłóceń, które są zazwyczaj znacznie bardziej podatne i problematyczne podczas ilościowego określania sygnału jonów prekursorowych MS1 (jak sugerowały niektóre z poprzednich publikacji).

Podczas przygotowywania bardzo złożonych próbek można wprowadzić kilka modyfikacji w przepływie pracy. Liczba frakcji połączonych po frakcjonowaniu HPLC w odwróconej fazie zasadowej i pH offline można zmniejszyć, aby obniżyć złożoność połączonych próbek, które zostaną pozyskane przez LC / MS. Ponadto podczas akwizycji można również zastosować dłuższe gradienty chromatograficzne, aby umożliwić lepszą separację peptydów. Alternatywnie, wiele proteaz może być użytych do trawienia próbek w celu wytworzenia większej różnorodności rozszczepionych peptydów i zwiększenia pokrycia reszt białkowych lizyny. Próby i optymalizację można przeprowadzić przy użyciu komercyjnego BSA zawierającego określone wartości procentowe acetylacji lub sukcynylacji.

Jednym z ograniczeń tego protokołu jest potencjalnie niewielkie przeszacowanie zajętości miejsca z powodu nieuwzględnionych innych modyfikacji lizyny, takich jak metylacja lub ubikwitynacja itp., w tym samym miejscu⁴. Obliczone na podstawie obszarów pików lekkich i ciężkich modyfikacji acylowych, L/(L+H), zajętość miejsca opiera się na założeniu, że całkowity poziom modyfikacji w miejscu lizyny składa się tylko z endogennej "lekkiej" acylacji (L) i chemicznie znakowanej "ciężkiej" acylacji (H). Jednakże rzeczywiste całkowite obłożenie acylacji w miejscu in vivo może obejmować inne modyfikacje poza acetylacją i/lub sukcynylacją. Dodatkowo zgłaszana czystość izotopowa zakupionych odczynników bezwodnik octowy-d ₆ (99%) i bezwodnik bursztynowy-d ₄ (>98%) może przyczyniać się do niewielkiego przeszacowania nawet o 2% (sukcynyl) lub 1% (acetyl) endogennego poziomu acylacji⁴. Łącznie te nieznaczne przeszacowania zwiększają trudności w ilościowym określeniu miejsc o obłożeniu poniżej 1%. Duże różnice w liczebności między kompletnymi chemicznie acylowanymi peptydami a natywnymi acylowanymi peptydami również przyczyniają się do potencjalnych błędów ilościowych zajętości miejsca, szczególnie w przypadku nisko endogennych acylowanych peptydów²⁷. Niedawne badanie przeprowadzone przez Weinert i wsp. ²⁷ stwierdziło, że zmniejszone różnice liczebności między kompletnymi peptydami peracetylowanymi mogą zmniejszyć błąd kwantyfikacji²⁷.

Kwantyfikacja stechiometryczna zebrana za pomocą tego protokołu może wskazać ważne punkty zapalne acylacji w określonym białku i sformułować hipotezy dla biologicznych eksperymentów uzupełniających, takich jak mutageneza ukierunkowana na miejsce w niektórych miejscach zainteresowania. Protokół ten może również ujawnić połączone efekty miejsc stechiometrii o niskiej acylacji, które mogą wywierać pośredni lub subtelny wpływ na stabilność strukturalną białek i zlokalizowane środowiska komórkowe. Dodatkowo, wdrożenie tego protokołu do pomiaru acetylacji i sukcynylacji oraz innych możliwych modyfikacji acylacji lizyny poza acetylacją w unikalny sposób dostarczyłoby wglądu w dynamiczne efekty acylacji na białka w różnych warunkach biologicznych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
wodny bezwodnik octowy-d6	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	175641-1G	1% czystości izotopowej
bezwodnik bursztynowy-d4	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	293741	2% czystości izotopowej
stopień sekwencjonowania endoproteinaza Glu-C	Roche, Indianapolis, IN, USA (przez Sigma)	10791156001	1:50 stosunek proteazy do białka substratu (wt:wt)
Wkłady do ekstrakcji w fazie stałej (SPE) Oasis HLB	Waters Corp., Milford, MA, USA	094225
HPLC acetonitryl	Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA	BJAH015-4
Woda klasy HPLC	Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA	BJAH365-4
jodoacetamid	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	I1149-25G
ditiotreitol (DTT)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	D9779-5G
Kwas mrówkowy FLUKA (FA) do specyfikacji masy	Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA	C988C27	~ 98%
mocznika	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	PI29700
albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Pierce, Rockford, IL, Stany	Zjednoczone 88341
wodorowęglan trietyloamonu (TEAB)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	T7408-100ML
bezwodny dimetylosulfotlenek (DMSO)	Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA	43998
wodorotlenek sodu (NaOH)	EMDMillipore, Burlington, MA, USA	SX0590
50% roztwór hydroksyloaminy w wodzie	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	438227-50ML
Woda klasy LC-MS	Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA	BJLC365-4
LC-MS acetonitryl	Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA	BJLC015-4
Eppendorf Themomixer Compact	Eppendorf AG, Hamburg, Niemcy	T1317-1EA
Thermo Scientific Savant SPD131DDA Koncentrator SpeedVac	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Stany Zjednoczone	SPD131DDA-115
Podwójny system pomp HPLC Waters 1525	Waters Corp., Milford, MA, Stany	Zjednoczone WAT022939
Detektor UV o podwójnej długości fali Waters 2487	Waters Corp., Milford, MA, Stany Zjednoczone	WAT081110
Waters 717plus Autosampler	Waters Corp., Milford, MA, Stany	Zjednoczone WAT022939
Zbieracz frakcji Waters III	Waters Corp., Milford, MA, Stany Zjednoczone	186001878
Kolumna Agilent Zorbax 300Extend C18	Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, USA	770995-902
Liofilizator Labconco Freeze Dry System Freezone 4.5	Labconco, Kansas City MO, USA	7751000
norma peptydu normalizującego indeksowany czas retencji (iRT)	Biognosys AG, Schlieren, Zurych, Szwajcaria	Ki-3002-2
System HPLC Ultra Plus nano-LC 2D	Sciex LLC, Eksigent Division, Framingham, MA, USA	model # 845
ortogonalny kwadrupolowy spektrometr czasu przelotu (QqTOF) Spektrometr masowy TripleTOF 5600	Sciex LLC, Framingham, MA, USA	za wycenę
ortogonalny kwadrupolowy czas przelotu (QqTOF) Spektrometr masowy TripleTOF 6600	Sciex LLC, Framingham, MA, USA	za wycenę
Układ przedkolumnowy C18 (200 μ m i razy; Układ 6 mm ChromXP C18-CL, 3 i mu; m, 300 & Aring ;)	Sciex LLC, Framingham, MA, USA	804-00006
Wtyczka SWATH 2.0 do PeakView 2.2	Sciex LLC, Framingham, MA, USA	pobieranie oprogramowania Sciex
Spectronaut	Biognosys AG, Schlieren, Zurych, Szwajcaria	Układ Sw-3001
C18-CL (75 µ m x 15 cm ChromXP, 3 i mikro; m, 300 & Aring ;)	Sciex LLC, Framingham, MA, Stany Zjednoczone	804-00001