Analizy napływu wapnia w mitochondriach w izolowanych mitochondriach i hodowanych komórkach

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy dwa protokoły pomiaru napływu mitochondrialnego Ca²⁺ w izolowanych mitochondriach i hodowanych komórkach. W przypadku izolowanych mitochondriów szczegółowo opisujemy test importu Ca^{2 +} oparty na czytniku płytek przy użyciu wrażliwego barwnika Ca^{2 +} zieleni wapniowej-5N. W przypadku hodowanych komórek opisujemy metodę mikroskopii konfokalnej z użyciem barwnika Ca²⁺ Rhod-2/AM.

Streszczenie

Ca²⁺ obsługa przez mitochondria jest krytyczną funkcją regulującą zarówno procesy fizjologiczne, jak i patofizjologiczne w szerokim spektrum komórek. Zdolność do dokładnego pomiaru napływu i odpływu Ca²⁺ z mitochondriów jest ważna dla określenia roli mitochondrialnego obchodzenia się z Ca^{2 +} w tych procesach. W niniejszym raporcie przedstawiamy dwie metody pomiaru obchodzenia się z mitochondrialnym Ca²⁺ zarówno w izolowanych mitochondriach, jak i hodowanych komórkach. Najpierw szczegółowo opisujemy platformę opartą na czytniku płytek do pomiaru mitochondrialnego wychwytu Ca^{2 +} przy użyciu wrażliwego barwnika Ca^{2 +} zieleni wapniowej-5N. Format oparty na czytniku płytek pozwala obejść potrzebę stosowania specjalistycznego sprzętu, a barwnik zieleni wapniowej-5N idealnie nadaje się do pomiaru Ca²⁺ z izolowanych mitochondriów tkankowych. W naszej aplikacji opisujemy pomiar mitochondrialnego wychwytu Ca^{2 +} w mitochondriach wyizolowanych z tkanki serca myszy; jednak procedura ta może być stosowana do pomiaru mitochondrialnego wychwytu Ca^{2 +} w mitochondriach wyizolowanych z innych tkanek, takich jak wątroba, mięśnie szkieletowe i mózg. Po drugie, opisujemy test oparty na mikroskopii konfokalnej do pomiaru mitochondrialnego Ca^{2 +} w komórkach przepuszczalnych przy użyciu wrażliwego barwnika Ca^{2 +} Rhod-2 / AM i obrazowania za pomocą 2-wymiarowej laserowej mikroskopii skaningowej. Ten protokół przepuszczalności eliminuje zanieczyszczenie barwnikiem cytozolowym, umożliwiając specyficzne rejestrowanie zmian w mitochondrialnym Ca²⁺. Co więcej, laserowa mikroskopia skaningowa pozwala na uchwycenie szybkich zmian w mitochondrialnym^Ca2+ w odpowiedzi na różne leki lub odczynniki zastosowane w roztworze zewnętrznym. Protokół ten można zastosować do pomiaru mitochondrialnego wychwytu Ca^{2 +} w wielu typach komórek, w tym w komórkach pierwotnych, takich jak miocyty serca i neurony, oraz unieśmiertelnionych liniach komórkowych.

Wprowadzenie

Mitochondria są krytycznymi miejscami wewnątrzkomórkowego przechowywania i sygnalizacji Ca²⁺. Dziesięciolecia badań wykazały, że mitochondria mają zdolność importowania i sekwestrowania Ca^{2+ 1,2}. Mitochondria nie są jednak jedynie pasywnymi miejscami magazynowania Ca²⁺. Ca²⁺ w przedziale mitochondrialnym pełni podstawowe funkcje sygnalizacyjne, w tym regulację produkcji metabolicznej i aktywację szlaków śmierci komórek za pośrednictwem mitochondriów, co zostało omówione wcześniej³. W celu regulacji metabolicznej Ca²⁺ zwiększa aktywność trzech zlokalizowanych w macierzy dehydrogenaz cyklu kwasów trikarboksylowych, a także kompleksów łańcuchów oddechowych, w celu zwiększenia produkcji energii mitochondrialnej^4,5. Przy mitochondrialnym przeciążeniu Ca^{2 +} i rozregulowanym mitochondrialnym Ca^{2 +}, Ca^{2 +} wyzwala otwieranie porów przejściowych przepuszczalności mitochondriów (MPTP), co prowadzi do przepuszczalności wewnętrznej błony mitochondrialnej, utraty potencjału błonowego, dysfunkcji mitochondriów, obrzęku, pęknięcia i ostatecznie śmierci komórki^6,7,8,9. Tak więc mitochondrialna sygnalizacja Ca^{2 +} bezpośrednio wpływa zarówno na szlaki życia i śmierci komórkowej poprzez kontrolę metaboliczną i oś śmierci MPTP.

W ostatnich latach gwałtownie wzrosło zainteresowanie badaniem dynamiki mitochondrialnego^Ca2++, w dużej mierze dzięki identyfikacji składników molekularnych mitochondrialnego kompleksu Ca²⁺, mitochondrialnego transportera błony wewnętrznej, który jest podstawowym sposobem importu Ca²⁺ do macierzy mitochondrialnej ^10,11,12. Identyfikacja tych strukturalnych i regulacyjnych podjednostek uniportera ujawniła możliwość genetycznego ukierunkowania na napływ mitochondrialnego Ca²⁺ w celu modulowania funkcji i dysfunkcji mitochondriów oraz ułatwiła badanie wpływu kompleksu uniporter i napływu mitochondrialnego Ca²⁺ na chorobę^13,14,15. Rzeczywiście, mitochondrialna sygnalizacja Ca^{2 +} jest zaangażowana w patologie różnych chorób, od chorób serca po neurodegenerację i raka^{16,17,18,19,20}.

Biorąc pod uwagę fundamentalne znaczenie mitochondrialnej sygnalizacji Ca²⁺ w metabolizmie i śmierci komórki, a także w połączeniu z szerokim zasięgiem systemów biologicznych, które wpływają na sygnalizację mitochondrialnego Ca²⁺, metody oceny napływu mitochondrialnego Ca²⁺ są bardzo interesujące. Nic dziwnego, że opracowano różnorodne techniki i narzędzia do pomiaru mitochondrialnego Ca²⁺. Należą do nich metody, które wykorzystują narzędzia, takie jak fluorescencyjne barwniki wrażliwe na Ca^2+21,22 oraz genetycznie kodowane czujniki Ca²⁺ ukierunkowane na mitochondria, takie jak cameleon i aequorin^23,24. Celem tego artykułu jest zwrócenie uwagi na różne metody i systemy modelowe, w których można mierzyć mitochondrialny wychwyt Ca²⁺. Przedstawiamy dwie eksperymentalne metody oceny zdolności napływu mitochondrialnego^Ca2+. Używając mitochondriów serca jako przykładu, szczegółowo opisujemy platformę opartą na czytniku płytek do pomiaru mitochondrialnego wychwytu Ca^{2 +} przy użyciu wrażliwego barwnika Ca^{2 +} zieleni wapniowej-5N, który idealnie nadaje się do mitochondriów izolowanych tkanek < sup class="xref">14. Korzystając z hodowanych komórek NIH 3T3, opisujemy również test obrazowania oparty na mikroskopii konfokalnej do pomiaru mitochondrialnego Ca^{2 +} w komórkach permeabilizowanych przy użyciu wrażliwego barwnika Ca^{2 +} Rhod-2 / AM²⁵.

Protokół

Wszystkie metody opisane w tym protokole zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Emory.

UWAGA: Pierwsza część to eksperymentalna procedura pomiaru napływu mitochondrialnego Ca²⁺ w izolowanych mitochondriach serca za pomocą czytnika płytek.

1. Odczynniki i roztwory

1. Przygotować 500 ml buforu MS-EGTA do izolacji mitochondriów: 225 mM mannitol, 75 mM sacharozy, 5 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES), 1 mM glikolu etylenowo-bis(β-aminoetylowegoeter)-N,N,N',N'-tetraoctowego (EGTA), pH dostosowane do 7,4 za pomocą KOH. Wysterylizuj go przez filtr 0,22 μm i przechowuj w temperaturze 4 °C. Upewnij się, że bufor MS-EGTA jest wstępnie schłodzony do 4 °C przed użyciem.
2. Przygotuj 100 ml buforu KCl: 125 mM KCl, 20 mM HEPES, 1 mM KH₂PO₄, 2 mM MgCl₂, 40 μM EGTA i pH dostosowane do 7,2 za pomocą KOH. Przechowuj go w temperaturze pokojowej.
3. Przygotować 1 mM bulionu zieleni wapniowej-5N w dimetylosulfotlenku (DMSO). Materiał wyjściowy zieleni wapniowej-5N można poddawać i przechowywać w temperaturze -20 °C.
4. Przygotować podłoża do pobierania Ca²⁺.
   1. Przygotować 1 M pirogronian sodu o pH 7,4. Przechowywać w porcjach w temperaturze -20 °C.
   2. Przygotować 500 mM jabłczanu o pH 7,4. Przechowywać w porcjach w temperaturze -20 °C.

2. Izolacja mitochondriów serca

1. Poddaj mysz eutanazji zgodnie ze standardami instytucjonalnymi.
   UWAGA: W przypadku naszej instytucjonalnie zatwierdzonej metody eutanazji, myszy zostały znieczulone przez inhalację izofluoranu i złożone w ofierze przez zwichnięcie szyjki macicy.
2. Zbierz serce, otwierając jamę klatki piersiowej, przecinając po obu stronach żeber, flankując serce, odcinając przeponę i wycinając tkankę serca.
   UWAGA: W tym protokole izolację mitochondriów przeprowadza się z całego serca pobranego od dorosłej myszy (około 120 mg), co powinno wystarczyć na 3-4 eksperymenty. Do izolacji mitochondriów z innych tkanek bogatych w mitochondria, takich jak wątroba, można użyć do 200 mg tkanki zgodnie z opisanym protokołem.
3. Dokładnie wypłucz tkankę w 25 ml lodowatego 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), upewniając się, że cała krew została wyciśnięta z komór.
   UWAGA: Serce zostanie wystarczająco wypłukane, gdy płyn wyciśnięty z serca będzie klarowny.
4. Zmiel serce na małe kawałki w 5 ml lodowatego 1x PBS za pomocą ostrych nożyczek.
5. Wyrzucić PBS i przenieść zmieloną tkankę serca do wstępnie schłodzonego homogenizatora szklano-teflonowego o pojemności 7 ml z odstępem od 0,10 do 0,15 mm.
6. Dodać 5 ml lodowatego buforu MS-EGTA i homogenizować próbkę, aż fragmenty tkanki przestaną być widoczne (około 11 uderzeń).
   UWAGA: Nie należy nadmiernie homogenizować tkanki, ponieważ celem jest uzyskanie nienaruszonych i funkcjonalnych mitochondriów.
7. Przenieść homogenat do probówki o pojemności 15 ml.
8. Odwirować homogenat w temperaturze 600 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut w celu uzyskania osadzaków jąder i nieuszkodzonych komórek.
9. Przenieść supernatant do świeżej probówki o pojemności 15 ml i odwirować go w temperaturze 10 000 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut w celu osadzenia mitochondriów.
10. Odrzucić supernatant i utrzymać osad mitochondrialny na lodzie.
11. Przemyć osad mitochondrialny dwukrotnie za pomocą lodowatego buforu MS-EGTA. Przy każdym przemyciu ponownie zawiesić osad mitochondrialny w 5 ml buforu MS-EGTA, odwirować go przy 10 000 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut i wyrzucić supernatant.
12. Po ostatnim płukaniu wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić mitochondria w 100 μl lodowatego buforu MS-EGTA. Utrzymuj mitochondria na lodzie.
    UWAGA: Mitochondria należy wykorzystać do eksperymentów w ciągu 1 godziny.
13. Zmierz stężenie białka mitochondrialnego za pomocą testu Bradford Protein Assay²⁶.

3. Pomiar mitochondrialnego wchłaniania wapnia oparty na czytniku płytek

UWAGA: Tutaj jest opisany protokół analizy mitochondrialnego wychwytu Ca²⁺ za pomocą wielomodowego czytnika płytek wyposażonego w wtryskiwacze. Można zastosować dowolny czytnik płytek z możliwością odczytu fluorescencji zieleni wapniowej-5N (wzbudzenie/emisja 506/532 nm) w trybie kinetycznym z automatycznymi wtryskiwaczami odczynników w celu ochrony reakcji przed światłem.

1. Zaprogramuj czytnik płytek tak, aby wykonywał kinetyczny odczyt fluorescencji zieleni wapniowej-5N z pomiarami wykonywanymi co sekundę dla całkowitego czasu oznaczania 1,000 s. Dodatkowo zaprogramuj wtryskiwacze odczynników tak, aby dozowały 5 μl roztworu CaCl₂ w punktach czasowych 30 s, 150 s, 300 s, 480 s i 690 s.
   UWAGA: Czas wstrzyknięć CaCl₂ jest zdefiniowany przez użytkownika i może być dostosowany do potrzeb eksperymentalnych.
2. Zalać wtryskiwacze odczynników roztworem CaCl₂, który ma być użyty.
   UWAGA: Stężenie roztworu CaCl₂ jest definiowane przez użytkownika i może być regulowane w kolejnych seriach w celu miareczkowania ilości Ca²⁺ wymaganej do wyzwolenia otwarcia MPTP.
3. Dodaj 200 μg mitochondriów do pojedynczego dołka na 96-dołkowej płytce.
4. Dodać odpowiednią objętość buforu KCl do studzienki tak, aby całkowita objętość mitochondriów i buforu KCl wyniosła 197 μl.
5. Do mieszaniny mitochondriów dodać 1 μl 1 M pirogronianu i 1 μl 500 mM jabłczanu. Delikatnie odpipetować, aby wymieszać i inkubować mitochondria z substratami przez 2 minuty w temperaturze pokojowej, aby mitochondria mogły się pobudzić.
6. Dodać 1 μl 1 mM bulionu zieleni wapniowej-5N. Delikatnie wymieszać, pipetując.
   UWAGA: Chroń reakcję przed światłem po dodaniu barwnika zieleni wapniowej-5N.
7. Uruchom wstępnie zaprogramowany protokół kinetyczny i monitoruj fluorescencję zieleni wapniowej-5N.

4. Odczynniki i roztwory

UWAGA: Druga część to eksperymentalna procedura obrazowania konfokalnego mitochondrialnego Ca²⁺ w hodowanych komórkach

1. Przygotuj roztwór Tyrode'a (130 mM NaCl, 4 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 10 mM glukozy i 10 mM HEPES, pH 7,2 z KOH). Przechowywać w temperaturze 4 °C. Przed użyciem ogrzać go do temperatury pokojowej.
2. Przygotuj roztwór do przemywania (100 mM octan potasu, 15 mM KCl, 5 mM KH₂PO₄, 5 mM Mg-ATP, 0,35 mM EGTA, 0,12 mM CaCl₂, 0,75 mM MgCl₂, 10 mM fosfokreatyna, 10 mM HEPES, pH 7,2 z KOH). Przechowywać w temperaturze 4 °C. Przed użyciem ogrzać go do temperatury pokojowej.
3. Przygotuj roztwór przepuszczalny, który zawiera 0,005% saponin w roztworze do mycia. Codziennie przygotowuj go na świeżo.
4. Przygotować 0 Ca²⁺ roztwór wewnętrzny (100 mM octanu potasu, 15 mM KCl, 0,35 mM EGTA, 0,75 mM MgCl₂, 10 mM HEPES, pH dostosowane do 7,2 z KOH). Przechowywać w temperaturze 4 °C. Przed użyciem ogrzać go do temperatury pokojowej.
5. Przygotować roztwór wewnętrzny zawierający^Ca2+. Dodaj CaCl₂ do powyższego roztworu wewnętrznego, aby osiągnąć pożądane stężenie wolnego^Ca2+. Ilość CaCl₂ do dodania oblicza się za pomocą programu MaxChelator (maxchelator.stanford.edu).
6. Przygotuj 1 mM materiału Rhod-2/AM w DMSO i przechowuj go w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
7. Przygotuj 1 mM zielonego bulionu MitoTracker w DMSO i przechowuj go w temperaturze -20 °C do czasu użycia.

5. Komórki poszycia do obrazowania

1. Szkiełka nakrywkowe o wymiarach 22 x 22 cm umyć 100% etanolem i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu.
2. Umieść szkiełka nakrywkowe w indywidualnych dołkach 6-dołkowego naczynia do hodowli tkankowych.
   UWAGA: Szkiełka nakrywkowe mogą być pokryte lamininą, poli-L-lizyną lub podobną matrycą, aby ułatwić przyczepianie komórek.
3. Trypsynizuj i ułóż komórki na szkiełkach nakrywkowych, dążąc do około 70% zbiegu w dniu obrazowania.

6. Ładowanie komórek za pomocą Rhod-2/AM i MitoTracker Green

1. Przygotuj zielone rozwiązanie robocze Rhod-2/AM-MitoTracker. Dodać 20 μl rosołu Rhod-2/AM 1 mM, 0,2 μl zielonego materiału MitoTracker 1 mM i 2,5 μl 20% pluronu F-127 do 1 ml roztworu Tyrode'a. Końcowe stężenie Rhod-2 w roztworze roboczym wynosi 20 μM, a końcowe stężenie MitoTracker green wynosi 200 nM.
2. Delikatnie usuń podłoże wzrostowe ze szkiełka nakrywkowego.
   UWAGA: Etap mycia nie jest konieczny przed dodaniem roztworu barwnika.
3. Dodawać zielony roztwór Rhod-2/AM-MitoTracker kroplami na szkiełko nakrywkowe, aż szkiełko nakrywkowe zostanie pokryte (około 3-4 krople na szkiełko nakrywkowe).
4. Inkubuj go przez 30 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem, aby komórki mogły załadować się barwnikami.
5. Deestryfikacja Rhod-2/AM. Delikatnie usuń zielony roztwór Rhod-2/AM-MitoTracker, zastąp go świeżym roztworem Tyrode o temperaturze pokojowej i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.

7. Konfokalne obrazowanie mitochondrialnej Rhod-2/AM i MitoTracker zielonej fluorescencji

1. Przenieść szkiełko nakrywkowe do komory obrazowania mikroskopu i napełnić komorę roztworem do płukania.
2. W ustawieniach obserwacji komórek w kontraście fazowym przy 40-krotnym ustawieniu ostrości dostosuj ostrość, aż komórki będą widoczne i ustawione na ostrości.
3. Przepuszczalność błony komórkowej zielonych komórek Rhod-2/AM-MitoTracker w celu usunięcia Rhod-2 zlokalizowanego w cytozolu, zachowując jednocześnie barwnik zlokalizowany w mitochondriach.
   1. Usuń roztwór do płukania ze szkiełka nakrywkowego.
   2. Zastąp go roztworem do przepuszczalności na około 1 minutę.
   3. Wizualnie monitoruj morfologię błony plazmatycznej w całym procesie przepuszczalności. Przepuszczalne komórki rozwiną szorstką powierzchnię.
   4. Po zakończeniu przepuszczalności natychmiast usuń roztwór do przepuszczalności i zastąp go roztworem wewnętrznym 0 Ca²⁺.
4. Równolegle obrazowana jest fluorescencja Rhod-2 (wzbudzenie za pomocą linii laserowej 559 nm i emisja zbierana na długościach fal w zakresie 575-675 nm) oraz zielona fluorescencja MitoTracker (wzbudzenie za pomocą linii lasera 488nm i emisja zbierana na długościach fal w zakresie 505-525 nm). Skoncentruj się na przepuszczalnych komórkach wykazujących wyraźną kolokalizację Rhod-2 i MitoTracker zielonych.
5. Zmniejsz laser mikroskopu i wzmocnij ustawienia tak, aby mitochondrialna fluorescencja Rhod-2 była przyciemniona i tylko widoczna.
6. Wybierz ustawienia mikroskopu, aby uzyskać skany 2-wymiarowe z odpowiednią liczbą klatek na sekundę i biegiem czasu dla konkretnego zastosowania. Zalecana jest liczba klatek na sekundę wynosząca co najmniej 30 klatek/s, aby dokładnie uchwycić kinetykę zmian w mitochondrialnym Ca²⁺.
7. Usuń roztwór wewnętrzny 0 Ca²⁺ bez zakłócania komórek lub ostrości mikroskopu.
8. Rozpocznij akwizycję obrazu.
9. Dodaj roztwór wewnętrzny wypełniony Ca²⁺ w punkcie czasowym 10 sekund, ręcznie lub za pomocą systemu perfuzyjnego.
10. Wybierz obszary zainteresowania (ROI), aby objąć regiony kolokalizacji między mitochondrialnym Rhod-2 a zielonym sygnałem MitoTracker w oprogramowaniu do akwizycji obrazu.
    UWAGA: Arbitralne wartości fluorescencji (F) dla każdego punktu czasowego nagrania są uzyskiwane dla każdego ROI. Wartości te są odejmowane w tle i normalizowane do początkowej fluorescencji (przed dodaniem Ca²⁺; F₀) i wykreślone jako F/F₀ w czasie w celu prezentacji danych i kwantyfikacji amplitudy zmiany mitochondrialnego Ca²⁺.

Wyniki

Rycina 1 wykazuje mitochondrialne Ca²⁺ pomiary wychwytu w izolowanych mitochondriach serca z wykorzystaniem platformy opartej na czytniku płytek i Ca²⁺ barwnik calcium green-5N. W warunkach kontrolnych (Rysunek 1A), mitochondria sercowe zawieszono w buforze KCl zawierającym barwnik calcium green-5N, a następnie poddano je sekwencyjnym impulsom CaCl2₂ (5 μL 0,6 mM CaCl2₂ roztwór) dodawan...

Dyskusja

Tutaj opisujemy dwa różne podejścia do pomiaru napływu mitochondrialnego Ca²⁺ . Metoda oparta na czytniku płytek zieleń wapniowa-5N monitoruje pozamitochondrialne poziomy Ca^{2 +} i jest testem wychwytu Ca^{2 +} , który dobrze nadaje się do pomiarów w izolowanych mitochondriach. Chociaż pokazaliśmy reprezentatywne wyniki z izolowanych mitochondriów serca myszy, test ten można łatwo dostosować do mitochondriów wyizolowanych z tkanek o dużej obfitości mitochondriów, w tym wątroby, mięśni szkielet...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Olympus FV1000 Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny	Olympus	FV1000
Synergy Neo2 Wielomodowy czytnik mikropłytek z wtryskiwaczami	tkankowy Biotek
	Kimble	886000-0022
Szkiełka nakrywkowe 22 x 22 mm	Płytka dołkowa Corning	2850-22
96 Corning		3628
6 Talerz studzienkowy	Corning	3506
Calcium Green-5N	Invitrogen	C3737
MitoTracker zielony FM	Invitrogen	M7514
Rhod-2, AM	Invitrogen	R1244
DMSO	Invitrogen	D12345
Pluronic F-127	Invitrogen	P3000MP
D-Mannitol	Sigma	M9546
Sacharoza	EMD Millipore	8510
HEPES	Sigma	H3375
EGTA	Sigma	E8145
Chlorek potasu	Fisher	BP366-500
Fosforan potasu jednozasadowy	Sigma	P0662
Chlorek magnezu	Sigma	M2670
Pirogronian sodu	Sigma	P2256
Kwas L-jabłkowy	Sigma	M1125
Chlorek wapnia	Sigma	C4901
Octan potasu	Fisher	BP364-500
Sól magnezowa adenozyno-5&trifosforanu	Sigma	A9187
Sól disodowa fosfokreatyny	Sigma	P7936
Saponin	Sigma	S7900
Ru360	Calbiochem	557440

Homogenizator