Specyficzne i dokładne wykrywanie patogenu zazieleniania cytrusów Candidatus liberibacter spp. za pomocą konwencjonalnego PCR na próbkach tkanek liści cytrusów

Podsumowanie

Zielenienie cytrusów jest szczególnie destrukcyjną chorobą atakującą uprawy cytrusów na całym świecie. Przedstawiono prostą metodę wykorzystującą PCR i ekstrakcję genomowego DNA tkanki liści cytrusów w celu dokładnej i precyzyjnej identyfikacji patogenu zielenienia cytrusów, Candidatus liberibacter spp.

Streszczenie

Zielenienie cytrusów, znane również jako huanglongbing, to destrukcyjna choroba cytrusów pustosząca uprawy cytrusów na całym świecie. Choroba ta powoduje asymetryczne żółte plamienie liści, żółknięcie nerwów, defoliację, gnicie korzeni, a ostatecznie śmierć rośliny cytrusowej. Zainfekowane rośliny cytrusowe mają zahamowany wzrost i wytwarzają kwiaty poza sezonem. Te kwiaty rzadko dają owoce, a te, które dają małe, gorzkie owoce cytrusowe o nieregularnym kształcie, które nie są pożądane. Choroba ta jest przenoszona przez azjatyckiego psyllida cytrusowego, Diaphorina citri, oraz przez przeszczepienie zakażonej tkanki cytrusowej. Patogen ma długi i zmienny okres inkubacji w roślinie cytrusowej - czasami lata, zanim pojawią się objawy. Próby hodowli tego patogenu in vitro nie powiodły się, prawdopodobnie ze względu na niskie i nierównomierne stężenie patogenu w zakażonej tkance cytrusowej lub dlatego, że trudno jest odtworzyć warunki środowiskowe sprzyjające wzrostowi patogenu. Bardzo trudno jest zidentyfikować chorobę przed jej rozprzestrzenieniem się, ze względu na długi okres inkubacji i niezdolność badaczy do wyhodowania patogenu. W rezultacie choroba ujawnia się dopiero po nagłym zniszczeniu całego plonu rolnika uprawiającego cytrusy. Przedstawiono tutaj metodę dokładnego i specyficznego wykrywania patogenu zielenienia cytrusów, Candidatus liberibacter spp., przy użyciu zestawu do ekstrakcji genomowego DNA i PCR. Ta metoda jest prosta, wydajna, opłacalna i można ją dostosować do analizy ilościowej. Ta metoda może być dostosowana do stosowania na dowolnej tkance cytrusowej; Jest jednak potencjalnie ograniczony ilością patogenu obecnego w tkance. Niemniej jednak metoda ta pozwoli rolnikom uprawiającym cytrusy na wcześniejszą identyfikację zakażonych roślin cytrusowych i ograniczenie rozprzestrzeniania się tej destrukcyjnej choroby, zanim będzie mogła się dalej rozprzestrzeniać.

Wprowadzenie

Zazielenienie cytrusów, znane również jako huanglongbing, spowodowało znaczną utratę drzew cytrusowych. Jednym z reprezentatywnych przypadków jest Floryda, gdzie przewiduje się, że choroba spowoduje 70% zmniejszenie produkcji pomarańczowych pudełek z Florydy z 244 milionów skrzynek w sezonie 1997 - 1998 do 70 milionów skrzynek w sezonie 2016-2017¹. Ponad 90% drzew cytrusowych na Florydzie jest zainfekowanych², i szacuje się, że przemysł cytrusowy na Florydzie traci około miliarda dolarów rocznie z powodu chorób cytrusów, w których główną rolę odgrywa zazielenianie cytrusów³. Zielenie cytrusów jest przenoszone głównie przez inwazyjną azjatycką psyllid cytrusową Diaphorina citri, ale może być również przenoszone przez przeszczepienie zakażonej tkanki. Choroba powoduje żółknięcie nerwów, asymetryczne żółte plamienie liści, przedwczesną defoliację, zamieranie gałązek, gnicie korzeni i śmierć rośliny. Co ważne, choroba powoduje, że roślina cytrusowa wytwarza kwiaty poza sezonem, które rzadko dają owoce. Owoce produkowane przez zainfekowane rośliny cytrusowe są niedojrzałe, zielone i gorzkie w smaku⁴.

Celem tej metody jest dokładna i precyzyjna identyfikacja ruchliwej bakterii Candidatus liberibacter spp., czynnika wywołującego zazielenienie cytrusów, żyjącego w łyku zakażonych drzew cytrusowych⁵. Genomowe DNA jest ekstrahowane z całej tkanki liścia, która zawiera żywe bakterie. To wyekstrahowane genomowe DNA jest używane jako matryca do konwencjonalnego PCR, w którym oligonukleotydy komplementarne do sekwencji 16S rDNA bakterii są używane do amplifikacji tej sekwencji. Oligonukleotydy komplementarne do cytrusowego genu FBOX są stosowane jako wewnętrzna kontrola amplifikacji. Zdecydowaliśmy się użyć tej metody, ponieważ udowodniono jej skuteczność w poprzednich badaniach⁶.

Ta metoda ma tę wyraźną zaletę, że jest prosta, stosunkowo tania i może być wykonana w każdym normalnie wyposażonym laboratorium biochemicznym. Ponadto PCR pozostaje najdokładniejszą i najbardziej precyzyjną metodą wykrywania tego patogenu, ze względu na trudności w hodowli tego patogenu⁷ oraz zdolność patogenu do przetrwania i rozmnażania się przez lata w obrębie bezobjawowego gospodarza⁸. Do skutecznego wykrycia tego patogenu zastosowano wiele różnych specjalistycznych testów PCR; jednak konwencjonalny PCR pozostaje najprostszym testem do dokładnego i specyficznego wykrywania, zwłaszcza w obrębie bezobjawowych gospodarzy⁸.

Protokół

1. Wyizoluj genomowe DNA z tkanki roślinnej za pomocą zestawu do ekstrakcji genomu

1. Uzyskaj tkankę liści cytrusów, wycinając cały świeży liść z drzewa cytrusowego za pomocą czystych nożyczek i umieść liść w czystej plastikowej torbie na kanapki.
   UWAGA: Worek zawierający tkankę liściową należy umieścić w lodówce o temperaturze 4 °C lub na lodzie w izolowanym pojemniku tak szybko, jak to możliwe po pobraniu, aby uniknąć zepsucia.
2. Dodaj niewielką ilość ciekłego azotu, aby schłodzić moździerz i tłuczek. Podczas schładzania użyj nożyczek, aby wyciąć mały kawałek tkanki liściowej o wielkości około 1 cala kwadratowego. Umieść przeciętą tkankę w moździerzu, aby natychmiast ją zamrozić. W razie potrzeby dodaj więcej ciekłego azotu.
   UWAGA: Podczas pracy z ciekłym azotem należy zawsze nosić rękawice ocieplane.
3. Szybko zmiel tkankę roślinną na drobny proszek za pomocą moździerza. Kontynuuj mielenie, aż ciekły azot całkowicie wyparuje i pozostanie drobny zielony proszek.
4. Krótko schłodzić metalową szpatułkę w ciekłym azocie przez 10 - 15 s, a następnie zmieloną tkankę wewnątrz moździerza przebrać do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml za pomocą szpatułki.
5. Dodać 600 μl roztworu do lizy jąder (patrz tabela materiałów) za pomocą pipety o pojemności 1000 μl i wirować próbkę przez 1-3 s, a następnie inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 65 °C przez 15 minut.
6. Dodać 3 μl roztworu RNazy do lizatu za pomocą pipety 10 μl, odwrócić probówkę 2 - 5 razy, aby ją wymieszać, i inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze szafkowym przez 15 minut.
   UWAGA: Przed kontynuowaniem poczekaj, aż mieszanina ostygnie do temperatury pokojowej.
7. Dodać 200 μl roztworu do wytrącania białek, wirować z dużą prędkością przez 20 s, a następnie wirować przez 3 minuty przy 13 000 x g, aby uzyskać twardy osad. Podczas wirowania próbki dodaj 600 μl izopropanolu o temperaturze pokojowej do świeżej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
8. Za pomocą pipety o pojemności 1000 μl ostrożnie usunąć supernatant z odwirowanej próbki, przenosząc ją do świeżej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml zawierającej izopropanol. Granulkę można teraz wyrzucić.
   UWAGA: Należy unikać zanieczyszczania supernatantu białkiem poprzez pozostawienie niewielkiej ilości supernatantu nad osadem.
9. Odwróć probówkę, aż DNA stanie się widoczne jako masa nici przypominających nitki, a następnie odwiruj przy 13 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.
10. Zdekantować supernatant, dodać 600 μl 70% etanolu do osadu, kilkakrotnie odwrócić probówkę w celu przepłukania DNA i odwirować przy 13 000 x g przez 1 min.
11. Ostrożnie zassać etanol, pozostawiając luźne osady DNA, a następnie otworzyć i odwrócić rurkę, spoczywającą na bibułie chłonnej. Suszyć na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 15 min.
12. Dodać 100 μl roztworu do nawadniania DNA do wysuszonego osadu DNA, a następnie inkubować DNA w łaźni wodnej o temperaturze 65 °C przez 1 godzinę, mieszając okresowo, stukając w probówkę.
13. Umieścić 1 μl oczyszczonej wody na mikrokuwecie i włożyć ją do spektrofotometru, który ma być użyty jako ślepa próba. Obliczyć stężenie obecnego DNA, umieszczając 1 μl próbki na mikrokuwecie i wkładając do spektrofotometru. Stężenie DNA (ng/μL) można obliczyć jako (A₂₆₀- A₃₂₀) × współczynnik rozcieńczenia × 50 ng/μL.
    UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Próbka może być przechowywana w temperaturze 4 °C.

2. Wykonaj PCR na próbkach genomowego DNA

1. Połączyć 10 μl 2x PCR Master Mix (patrz Tabela Materiałów), 1 μl startera do przodu (10 pM/μL), 1 μl startera odwrotnego (10 pM/μL) (patrz Tabela 2 dla sekwencji startera), 100 ng genomowego DNA wyekstrahowanego z próbki i oczyszczoną wodę (do 20 μL objętości końcowej) w probówce do PCR o pojemności 50 μL, Przesuń, aby wymieszać i krótko odwirować.
2. Włóż probówkę PCR do termocyklera i uruchom odpowiednio (patrz Tabela 1).
   UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać. W razie potrzeby przechowywać próbkę w temperaturze 4 °C po zakończeniu reakcji.

3. Elektroforeza amplifikowanego DNA w żelu agarozowym

1. Odważyć 0,4 g agarozy w proszku i dodać ją wraz z 1x buforem TAE do czystej kolby Erlenmeyera o pojemności 200 ml, wypełniając ją do 50 ml.
2. Kuchenka mikrofalowa na wysokich obrotach przez 1,5 minuty, wstrząsając co 30 s, aż agaroza całkowicie się rozpuści.
   UWAGA: Podczas pracy z płynną agarozą należy nosić rękawice ocieplane, aby zapobiec poparzeniom.
3. Dodaj 2,5 μl 10 mg/ml bromku etydyny do płynnej agarozy i wstrząśnij do wymieszania, a następnie wlej płynny żel agarozowy do równej formy żelowej. Po wylaniu szybko włóż standardowe grzebienie żelowe z 12 zębami.
4. Pozostaw żel do ostygnięcia przez 20 minut w temperaturze pokojowej, następnie usuń grzebienie żelowe i umieść żel w płaskim pudełku z żelem wypełnionym 1x buforem TAE.
5. Za pomocą mikropipety załaduj wszystkie amplifikowane próbki DNA do studzienek. Dodać 5 μl drabinki DNA (patrz tabela materiałów) do oddzielnego dołka od próbek.
6. Próbki należy poddać elektroforezie przez 35 minut przy stałym napięciu 90 V, a następnie usunąć żel i umieścić w transiluminatorze UV.
7. Sfotografuj i przeanalizuj wzór pasma żelowego podczas korzystania z transoświetlenia UV przy długości fali 302 nm.

Wyniki

Pozytywny wynik daje wyraźne pasmo odpowiadające 500 pz dla Candidatus Liberibacter asiaticus Las606/Lss⁶, i/lub odrębne pasmo odpowiadające 700 pz dla Laa2/Laj5, wstawkę w β rybosomalnym 16S operon⁹. Wewnętrzne pasmo kontrolne wzmocnienia musi również pojawić się na poziomie 400 pz. Pasmo to odpowiada amplifikacji cytrusowego genu FBOX ¹⁰ i musi się pojawić, aby wynik zost...

Dyskusja

Bardzo ważne jest, aby wszystkie kroki były dokładnie wykonane, aby osiągnąć optymalne warunki eksperymentalne. Podczas tej demonstracji wykorzystano całą tkankę liścia; Protokół można jednak zmodyfikować tak, aby teoretycznie obejmował każdy rodzaj tkanki roślinnej. Wcześniej naukowcy wyekstrahowali genomowe DNA z tkanki żyły liścia, a nie z całej tkanki liścia, i osiągnęli podobne wyniki¹¹. Jeśli prążek odpowiadający cytrusowemu genowi FBOX nie pojawi się, wynik jest nieważny i może wys...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zestaw do oczyszczania genomowego DNA Wizard	Promega	A1120	Źródło roztworów do lizy jąder, RNazy, wytrącania białek i rehydratacji DNA
Ciekły azot	Air Products	N/A
Mastercycler pro z panelem sterowania	Eppendorf	6321000019
1250 W Mikrofalówka	Panasonic	N/A
5424	Eppendorf	05-403-93
Cyfrowa łaźnia wodna Isotemp 215	Fisher scientific	15-462-15Q
Szpatułka metalowa	Sigma-Aldrich	Z283274
Moździerz i tłuczek	Sigma-Aldrich	Z247464
LSE Mieszalnik wirowy	Corning	6775
2-propanol	Sigma-Aldrich	I9516
Sterylne 10 μ L końcówki	TipOne	1161-3730
Sterylne 200 μ L końcówki	TipOne	1163-1730
Sterylne 1250 μ Końcówki L	TipOne	1161-1750
Zestaw pipet o zmiennej objętości	VWR	75788-460
Bromek etydyny	Sigma-Aldrich	E1510
Agaroza	IBI Scientific	IB70041
EDTA	Thermo Fisher Scientific	17892
Kwas octowy	Fisher Chemical	A38-212
Baza Tris	Sigma-Aldrich	10708976001
μ kuweta	Eppendorf	6138000018
Taca odlewnicza i grzebienie do układania w stosy	Carolina	213655
PowerPac Basic Power Supply	Bio-Rad	1645050
Mini-Sub Cell GT System	Bio-Rad	1704487EDU
Biospektrometr podstawowy	Eppendorf	6135000009
0,2 ml probówki PCR	Fisher scientific	AB-0620
Probówki do mikrowirówek 1,5 ml	Thermo Fisher Scientific	3439
2X Taq Green PCR Master Mix	Promega	M7122
Podkład do przodu	Thermo Fisher Scientific	N/A
Podkład odwrócony	Thermo Fisher Scientific	N/A
Woda, klasa PCR	Sigma-Aldrich	3315953001
Żel Doc XR+	Bio-Rad	1708195
1 KB+ drabinka DNA	Thermo Fisher Scientific	10787018