Method Article

Perfuzyjna sieć naczyniowa z modelem tkankowym w urządzeniu mikroprzepływowym

DOI:

10.3791/57242

⸱

April 4th, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Micro Engineering, Kyoto University, 2Graduate School of Medical Sciences, Kyushu University, 3International Research Center for Medical Sciences (IRCMS), Kumamoto University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół opisuje, jak zaprojektować perfuzyjną sieć naczyniową w sferoidzie. Mikrośrodowisko otaczające sferoidę jest zaprojektowane tak, aby indukować angiogenezę i łączyć sferoidę z mikrokanałami w urządzeniu mikroprzepływowym. Metoda pozwala na perfuzję sferoidy, co jest długo oczekiwaną techniką w kulturach trójwymiarowych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sferoida (agregat wielokomórkowy) jest uważana za dobry model żywych tkanek w ludzkim ciele. Pomimo znacznego postępu w hodowlach sferoidalnych, przepuszczalna sieć naczyniowa w sferoidach pozostaje krytycznym wyzwaniem dla długoterminowych hodowli wymaganych do utrzymania i rozwoju ich funkcji, takich jak ekspresja białek i morfogeneza. W protokole przedstawiono nowatorską metodę integracji perfuzyjnej sieci naczyniowej w sferoidzie w urządzeniu mikroprzepływowym. Aby indukować perfuzyjną sieć naczyniową w sferoidzie, angiogenne kiełki połączone z mikrokanałami zostały skierowane do sferoidy poprzez wykorzystanie czynników angiogennych z ludzkich fibroblastów płuc hodowanych w sferoidzie. Kiełki angiogenne dotarły do sferoidy, połączyły się z komórkami śródbłonka współhodowanymi w sferoidzie i utworzyły ciągłą sieć naczyniową. Sieć naczyniowa może przenikać do wnętrza sferoidy bez żadnego wycieku. Skonstruowana sieć naczyniowa może być dalej wykorzystywana jako droga dostarczania składników odżywczych i usuwania produktów przemiany materii, naśladując krążenie krwi in vivo. Metoda ta stanowi nową platformę w hodowli sferoidalnej w kierunku lepszej rekapitulacji żywych tkanek.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przejście z kultury jednowarstwowej (dwuwymiarowej) na kulturę trójwymiarową jest motywowane potrzebą pracy z modelami kultur, które naśladują funkcje komórkowe żywych tkanek1,2,3. Płaskie i twarde podłoża z tworzyw sztucznych powszechnie stosowane w hodowlach komórkowych nie przypominają większości środowisk zewnątrzkomórkowych w ludzkim ciele. W rzeczywistości wiele badań pokazuje, że trójwymiarowa hodowla odtwarza specyficzną dla tkanki architekturę, mechaniczne i biochemiczne wskazówki oraz komunikację komórka-komórka, których nie zaobserwowano w konwencjonalnej hodowli dwuwymiarowej4,5,6,7,8.

Wielokomórkowe skupisko lub sferoida, jest jedną z najbardziej obiecujących technik realizacji tej trójwymiarowej kultury9,10. Komórki wydzielają macierz zewnątrzkomórkową (ECM) i mogą wchodzić w interakcje z innymi w sferoidzie. Chociaż niektóre inne podejścia bioinżynieryjne11,12,13,14, takie jak układanie komórek, z powodzeniem odtwarzają złożoność przestrzenną ludzkiego ciała, podejścia te mają tylko dwa lub trzy rodzaje komórek dla ułatwienia analizy i koncentrują się tylko na jednej funkcji docelowych narządów. W przeciwieństwie do tego, komórki w sferoidach są wystawione na różne środowiska hodowlane w zależności od ich pozycji w sferoidzie ze względu na niejednorodne dostarczanie składników odżywczych, tlenu oraz parakrynnych i autokrynnych cząsteczek sygnalizacyjnych w sferoidzie. Ta cecha sferoidów częściowo naśladuje warunki hodowli in vivo i umożliwia komórkom w sferoidach tworzenie znacznie bardziej złożonej, zorganizowanej struktury tkankowej in vitro niż te hodowane w stosach tkankowych9,15,16. Należy zauważyć, że jeśli sferoida składa się z jednego rodzaju komórek, funkcja komórek w sferoidzie nie jest jednolita ze względu na niejednorodne środowisko w sferoidzie. W ciągu ostatnich kilku lat hodowle sferoidalne pozwoliły embrionalnym komórkom macierzystym (ESC), indukowanym pluripotencjalnym komórkom macierzystym (iPSC) lub komórkom macierzystym rezydującym w tkance naśladować sekwencje rozwojowe in vivo i odtwarzać mini-narządy, takie jak brain17, liver18i kidney19,20.

Pomimo znacznego postępu w technikach hodowli sferoidów, hodowla dużych sferoidów przez długi czas jest nadal problematyczna. W tkance trójwymiarowej komórki muszą znajdować się w odległości 150-200 μm od naczynia krwionośnego ze względu na ograniczony dopływ tlenu i składników odżywczych21. Sieci naczyniowe w obrębie sferoidy są niezbędne do rekapitulacji wymiany substancji między krwią a tkankami in vivo. Aby to osiągnąć, inne grupy przeprowadziły współhodowlę komórek śródbłonka z komórkami docelowymi22,23,24 lub indukowały różnicowanie komórek pluripotencjalnych w komórki CD31-dodatnie20. Niemniej jednak, opisane struktury przypominające naczynia nie mają otwartych końców światła, które dostarczałyby tlen i składniki odżywcze do środka sferoidy. Aby naśladować rolę naczyń krwionośnych w odżywianiu komórek w trójwymiarowej hodowli, w sferoidzie musi zostać opracowana otwarta i przepuszczalna sieć naczyniowa.

W ciągu ostatnich kilku lat, niektóre grupy badawcze w dziedzinie mikroinżynierii opisały metody budowy perfuzyjnej sieci naczyniowej, spontanicznie tworzonej w urządzeniu mikroprzepływowym przy użyciu czynników angiogennych z hodowanych komórek fibroblastów25,26. Te sieci naczyniowe mają podobną morfologię do swoich odpowiedników in vivo i mogą być przebudowywane przez czynniki środowiskowe, dzięki czemu nadają się do naśladowania funkcji naczyniowych w kulturze sferoidalnej. Celem tego protokołu jest skonstruowanie perfuzyjnej sieci naczyniowej w sferoidzie przy użyciu platformy mikroprzepływowej27. Urządzenie mikroprzepływowe jest modyfikowane w stosunku do wcześniej zgłoszonego device25 tak, aby można było włączyć sferoidę. Kierując angiogenne wydzielanie z komórek fibroblastów w sferoidzie do komórek śródbłonka w mikrokanałach, angiogenne kiełki z mikrokanalików zełączyły się ze sferoidem i utworzyły perfuzyjną sieć naczyniową. Metoda ta pozwala na bezpośrednie dostarczanie szerokiej gamy substancji, takich jak cząsteczki fluorescencyjne i kulki w skali mikrometrycznej, do wnętrza sferoidy, co stanowi ramy dla długotrwałej hodowli tkankowej z sieciami naczyniowymi.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Wykonanie formy urządzenia mikroprzepływowego

  1. Zaprojektuj wzór urządzenia mikroprzepływowego za pomocą dostępnego na rynku oprogramowania (Clewin5 lub AutoCAD 2016 itp.). Aby uzyskać informacje na temat funkcji Clewin5, zapoznaj się z instrukcją obsługi (http://manualzz.com/doc/7159150/clewin-user-s-manual).
    UWAGA: Plik projektu jest dostępny w pliku uzupełniającym 1.
  2. Przenieś plik projektowy do generatora mikrowzorów i załaduj do narzędzia maskę chromową pokrytą dodatnim fotorezystem.
  3. Naświetl dodatni fotorezystor w obszarze wzoru za pomocą generatora mikrowzorów.
  4. Rozwiń dodatni fotorezystor za pomocą wywoływacza (tabela materiałów) i spłucz maskę wodą dejonizowaną (DI).
  5. Za pomocą wytrawiacza chromowego (Tabela materiałów) wytrawić chrom w odsłoniętym obszarze, z którego usunięto dodatni fotorezyst. Spłucz maskę wodą DI
    6. .
  6. Usuń pozostały fotorezystor z maski za pomocą acetonu.
    UWAGA: Maska przezroczystości może być alternatywą dla maski Cr.
  7. Przygotuj czystą płytkę krzemową (4 cale, P(100)) i wiruj heksametyldisilazan (HMDS) z prędkością 3,000 obr./min przez 30 s.
  8. Piecz HMDS na miękko przez 5 minut w temperaturze 120 °C i schładzaj wafel przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  9. Powlekaj ujemny fotorezyst (tabela materiałów) przy 500 obr./min przez 10 s i 1,200 obr./min przez 30 s.
    UWAGA: Stan powłoki wirowej powinien dać warstwy fotorezystu o grubości około 100 μm na płytkach po fotolitografii.
  10. Wstępnie piecz negatywowy fotorezystor przez 45 minut w temperaturze 95 °C i schładzaj wafel przez 60 minut w temperaturze pokojowej.
  11. Sprawdź natężenie światła UV w każdym eksperymencie i oblicz czas ekspozycji dla całkowitej dawki energii ekspozycji przy 250 mW/cm2. Umieść fotomaskę (krok 1.1-1.6) na płytce i wystaw je na działanie światła UV.
  12. Piecz ujemny fotorezystor przez 1 minutę w temperaturze 65 °C i 5 minut w temperaturze 95 °C. Pozostaw wafel do ostygnięcia przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.
  13. Rozwijaj ujemną warstwę fotorezystu przez 15 minut w pierwszej kąpieli wywoływacza (tabela materiałów) i 2 minuty w drugiej kąpieli. Płukać wafel w pierwszej kąpieli izopropanolowej (IPA) przez 10 s, a następnie w drugiej kąpieli IPA przez 10 s.
  14. Fotorezystor ujemny należy wypalić na twardo przez 30 minut w temperaturze 200 °C i schłodzić wafel przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  15. Zmierz grubość ujemnej warstwy fotorezystu za pomocą profilera powierzchniowego.
  16. Umieścić wafel w eksykatorze podłączonym do pompy próżniowej i dodać 200 μl silanu (trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooktylo)silanu). Włączyć pompę na 10 minut, następnie wyłączyć ją i trzymać wafel w eksykatorze przez 4 godziny.

2. Etapy produkcji i montaż warstw PDMS

  1. Odlewać prepolimer polidimetylosiloksanu (PDMS) (baza PDMS: utwardzacz = 10:1 (w/w)) i odgazowywać w komorze próżniowej przez 2 godziny.
  2. Utwardzić PDMS w temperaturze 80°C w piekarniku z wentylacją przez noc.
  3. Oderwij PDMS od płytki krzemowej.
  4. Dobrze przebij otwory 1A - 3B (Rysunek 1) i kulturę sferoidalną. Użyj dziurkacza o średnicy 2 mm do otworów 1A - 3B i dziurkacza o średnicy 1 mm do studzienki sferoidalnej.
  5. Wyczyść płytę PDMS i szklane szkiełko nakrywkowe (24 mm × 24 mm) taśmą klejącą, kilkakrotnie przyklejając i odklejając taśmę. Następnie potraktuj płytę PDMS plazmą powietrzną przez 40 s (40 mW, 50 sccm).
  6. Przymocować płytę PDMS do szklanego szkiełka nakrywkowego, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza z powierzchni między płytą PDMS a szkiełkiem nakrywkowym i utwardzić w temperaturze 80 °C przez co najmniej 12 godzin.

3. Przygotowanie sferoidy

UWAGA: W badaniu, czerwone białko fluorescencyjne wyrażające ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (RFP-HUVEC) i zielone fluorescencyjne białko wyrażające HUVEC (GFP-HUVEC) są używane odpowiednio w sferoidach i mikrokanałach, aby odróżnić pochodzenie HUVEC po zbudowaniu perfuzyjnej sieci naczyniowej. Jeśli pochodzenie HUVEC nie jest potrzebne, do eksperymentu wystarczą nieoznakowane HUVEC.

  1. Rozmrozić RFP-HUVEC (3,0 × 105 komórek/fiolkę) i ludzki fibroblast płucny (hLF) (1,0 × 106 komórek/fiolkę) i dodać je do 10 ml pożywki odpowiednio dla komórek śródbłonka i komórek fibroblastów (tabela materiałów). Hoduj je w naczyniu o średnicy 100 mm w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 2-3 dni w przypadku subkonfluentnych RFP-HUVEC i hLF. Ten preparat da ~200 sferoid.
  2. Odłącz RFP-HUVEC i hLF od szalek z 2 ml 0,05% trypsyny-EDTA i zatrzymaj reakcję trypsyny za pomocą 4 ml DMEM zawierającego 10% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% (v/v) penicyliny/streptomycyny.
  3. Po odwirowaniu przy 220 x g przez 3 minuty usunąć supernatant i ponownie zawiesić RFP-HUVEC i hLF w podłożu śródbłonkowym do końcowych stężeń komórek odpowiednio 2,5 × 104 i 1,0 × 105 komórek/ml.
  4. Delikatnie dodaj 200 μl zawiesiny komórek (5 000 komórek dla RFP-HUVEC i 20 000 komórek dla hLF) na dołek do 96-dołkowej płytki o bardzo niskiej powierzchni wiązania.
  5. Inkubować 96-dołkową płytkę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez okres 2-4 dni><. UWAGA: Ponieważ średnica sferoidy zależy od okresu hodowli i początkowej liczby komórek w 96-dołkowej płytce, można ją kontrolować za pomocą tych dwóch parametrów.

4. Inicjowanie komórek w urządzeniu mikroprzepływowym

Uwaga: Konwencja nazewnictwa otworów, kanałów i studni sferoidalnej jest pokazana w Rysunek 1. Dzień 0 definiujemy jako dzień, w którym kończy się pobieranie komórek do urządzenia mikroprzepływowego. Schemat eksperymentalnych osi czasu jest pokazany w Rysunek 2.

  1. Dzień −1) Ładowanie sferoidów
    UWAGA: Następujący krok należy wykonać na lodzie, aby zapobiec żelowaniu kolagenu i fibryny.
    1. Rozpuść fibrynogen w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do końcowego stężenia 2,80 mg/ml.
    2. Przygotuj zneutralizowany kolagen (3,0 mg/ml w PBS) zgodnie z protokołem producenta.
    3. Połącz 107,2 μl roztworu fibrynogenu (2,80 mg/ml), 8,0 μl zneutralizowanego kolagenu (3,0 mg/ml) i 3,6 μl aprotyniny (5 U/ml) na reakcję w probówce. Roztwór ten jest oznaczony jako "roztwór mieszanki wzorcowej" (MS).
      UWAGA: Objętość wystarcza na załadowanie jednej sferoidy. Jeśli jest więcej niż jedna sferoida, pomnóż każdą objętość przez liczbę sferoid.
    4. Rozpuścić trombinę w PBS do końcowego stężenia 50 U/mL.
      UWAGA: Podwielokrotności 50 U/ml trombiny (20 μL/probówkę) są przechowywane w temperaturze -30 °C i są rozmrażane przed każdym doświadczeniem.
    5. Umieścić 96-dołkową płytkę zawierającą sferoidy w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
    6. Przygotuj dwie szalki Petriego o średnicy 35 mm w komorze bezpieczeństwa biologicznego, z jedną szalką na lodzie (szalka 1), a drugą na blacie (szalka 2). Odpipetuj 99 μl MS na środek naczynia 1 (Rysunek 3a), aby utworzyć kroplę.
    7. Przyciąć końcówki 2 żółtych (10-100 μl) i 3 przezroczystych końcówek do pipet (1-100 μl) w celu pobrania sferoidów z płytki 96-dołkowej, zmieszania trombiny ze stwardnieniem rozsianym, precyzyjnego pobrania sferoid, wstrzyknięcia sferoid do urządzenia i wstrzyknięcia pożywki do urządzenia. Rozmiar porów końcówki powinien być nieco większy niż średnica otworów 1A - 3B kanałów 1 i 3 lub studzienki sferoidalnej w kanale 2, aby zapewnić dokładne dopasowanie.
      UWAGA: Dalej, o ile nie zaznaczono inaczej, należy używać końcówek do pipet wyciętych na tym etapie. Zdjęcie wyciętych końcówek jest dostępne w Rysunek 4.
    8. Zbierz sferoidę ze 100 μl pożywki z płytki 96-dołkowej i dodaj ją do szalki 2 (Rysunek 3a).
    9. Podnieść sferoidę z minimalną objętością podłoża z naczynia 2. Trzymając pipetor w pozycji pionowej, sferoida powinna przesuwać się grawitacyjnie w kierunku dna końcówki pipety. Wysunąć sferoidę, dotykając końcówką pipety menisku kropelki MS w naczyniu 1 (Rysunek 3a).
      UWAGA: Następujące kroki 4.1.10 i 4.1.11 należy wykonać szybko.
    10. Dodać 1 μl trombiny (50 j./ml) i delikatnie wymieszać z żółtą końcówką pipety.
    11. Mając pipetę ustawioną na 7 μl, podnieś sferoidę i powoli umieść ją w studzience sferoidowej (Rysunek 3b).
    12. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C w celu żelowania fibryny.
    13. Powoli wstrzyknij pożywkę śródbłonkową z otworów 1A i 3A i wypełnij kanały 1 i 3 pożywką (20 ~ 30 μl / kanał).
    14. Umieść urządzenie w naczyniu o średnicy 100 mm z mokrym Kimwiste, aby zapobiec parowaniu mediów z urządzenia (Rysunek 3c).
    15. Umieść urządzenie w temperaturze 37 °C i 5% CO2 na 24 godziny, aby usunąć pęcherzyki na granicy faz między pożywką a fibryną.
  2. Dzień 0) Załadunek HUVEC
    1. Rozmrozić GFP-HUVEC (3,0 x 105 komórek/fiolkę) i dodać je do 10 ml podłoża śródbłonkowego. Hoduj je w naczyniu o średnicy 100 mm w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 2-3 dni, aby osiągnąć subkonfluencję. Jedno naczynie sub-konfluentnych GFP-HUVEC wystarcza na przygotowanie 8-10 urządzeń.
    2. Odłącz GFP-HUVEC od szalek z 2 ml 0,05% trypsyny-EDTA i zatrzymaj reakcję trypsyny za pomocą 4 ml DMEM zawierającego 10% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% (v/v) penicyliny/streptomycyny.
    3. Po odwirowaniu w sile 220 x g przez 3 minuty, ponownie zawiesić GFP-HUVEC w podłożu śródbłonkowym w stężeniu 5,0 x 106 komórek/ml.
    4. Zawiesinę komórkową HUVEC wstrzyknąć do kanału 1 przez otwór 1B (20 μl/kanał).
    5. Przechylić urządzenie mikroprzepływowe o 90°, odłożyć je na bok i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut, aby upewnić się, że HUVEC przylegają do fibryny w kanale 2.
      1. Potwierdź przyczepienie HUVEC do fibryny. Gdy liczba HUVEC przyłączonych na granicy faz między żelem a podłożem jest niewystarczająca, układ krwionośny może zostać odłączony w korzeniu naczyniowym po kilku dniach hodowli urządzenia (Rysunek 5). W protokole wskaźnik powodzenia perfuzji wynosi >50%.
    6. Powtórz kroki 4.2.4 i 4.2.5 dla kanału 3.
    7. Hodować komórki w naczyniu o średnicy 100 mm z wilgotnym Kimwipe w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 7-14 dni.
  3. Dzień 1 ~) Wymiana mediów
    1. Wymieniaj się połową mediów w kanałach 1 i 3 każdego dnia.

5. Barwienie jąder

  1. Przygotować 4% paraformaldehydu (PFA) w PBS.
  2. Usuń media z kanałów 1 i 3 i dodaj 20 μl 4% PFA na kanał. Aby zastąpić roztwór w 4% PFA, powtórz wyjmowanie roztworu z urządzenia i trzykrotne dodawanie 4% PFA.
  3. Inkubować urządzenie w temperaturze 4 °C przez noc.
  4. Usuń 4% PFA z urządzenia i trzykrotnie umyj kanały PBS.
  5. Dodać 20 μl lub 10 μg/ml barwnika fluorescencyjnego (tabela materiałów) na kanał, aby zabarwić jądra komórkowe. Aby wymienić roztwór w urządzeniu, powtórz wyjmowanie roztworu z urządzenia i trzykrotne dodanie 10 μg/ml barwnika fluorescencyjnego.
  6. Przechowuj urządzenie w temperaturze 4 °C przez 24 godziny.

6. Perfuzja płynu sferoidy

  1. Przygotować sferoidę po hodowli przez ponad 7 dni w urządzeniu w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w celu zakończenia ciągłego szlaku naczyniowego.
  2. Usuń podłoże z otworów 1A, 1B, 3A i 3B.
  3. Wprowadzić 10 μl 10 μM roztworu izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC)-dekstranu w PBS do otworów 1A i 1B.
  4. Monitoruj przepływ mikrogranulek lub barwnika FITC pod mikroskopem odwróconym.

7. Kwantyfikacja długości kiełków

UWAGA: Oprogramowanie ImageJ ver. 1.49 jest używane do wszystkich analiz obrazu w tym badaniu.

  1. Nakładaj na siebie obrazy z dni 0, 1, 3, 5 i 7 GFP-HUVEC.
  2. Odejmij pozycję końcówki układu krwionośnego dnia 0 od tej samej pozycji na zdjęciach wykonanych w dniach 1, 3, 5 i 7.
  3. Określ wzrost końcówki naczynia krwionośnego od pozycji korzenia (Rysunek 6). Odległość między wierzchołkiem naczynia a korzeniem została zdefiniowana jako długość kiełka w tym badaniu (Rysunek 7b).

8. Kwantyfikacja kątów naczyniowych

UWAGA: Kąt naczyniowy został zdefiniowany jako kąt składający się z kąta naczyniowego, korzenia i środka sferoidy (Rysunek 7c).

  1. Binaryzuj obrazy fluorescencyjne sferoidy kokultury zawierającej RFP-HUVEC i zmierz pozycję "środka ciężkości" za pomocą funkcji analizy w ImageJ. W tym badaniu zmierzona pozycja "środka ciężkości" jest zdefiniowana jako środek sferoidy (Rysunek 6).
  2. Określ położenie końcówek naczyń krwionośnych i korzeni w ten sam sposób w kroku 7.
  3. Zmierz kąty naczyniowe za pomocą funkcji analizy w oprogramowaniu ImageJ.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 1 przedstawia projekt i zdjęcie urządzenia mikroprzepływowego. Ma trzy równoległe kanały, w których kanał 2 zawiera studnię sferoidalną. Kanały 1 i 3 są używane do hodowli HUVEC, a kanał 2 do sferoidy. Każdy kanał jest oddzielony trapezowymi mikrosłupkami zaprojektowanymi do wzoru PDMS. Mikrosłupki zapobiegają przedostawaniu się hydrożelu w kanale 2 do kanałów 1 i 3 poprzez napięcie powierzchniowe i umożliwiają wymianę substancji między sferoidem a HU...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wcześniejsze doniesienia pokazują, że hLF wydzielają koktajl wielu czynników angiogennych, takich jak angiopoetyna-1, angiogenina, czynnik wzrostu hepatocytów, transformujący czynnik wzrostu-α, czynnik martwicy nowotworu i niektóre białka macierzy zewnątrzkomórkowej29,30. Test ten opiera się na angiogennym wydzielaniu z hLF w sferoidzie kokultury, co jest ograniczeniem tej techniki. Dlatego tak ważne jest, aby dla stabilnej formacji naczyniowej umieścić sferoidę ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autor oświadcza, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez CREST JST (numer grantu JPMJCR14W4), Society for the Promotion of Science (JSPS) KAKENHI (numer grantu 25600060, 16K16386), The Center of Innovation Program z MEXT i JST, Projekt Skoncentrowany na Rozwoju Kluczowej Technologii Oceny z Japan Agency for Medical Research and Development, AMED, Mizuho Foundation for the Promotion of Sciences. Mikroprodukcja była wspierana przez Kyoto University Nano Technology Hub.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AutoCAD 2017AutodeskAutoCAD 2017
Maska chromowa pokryta AZP 1350.TECHNOLOGIA CZYSTEJ POWIERZCHNICBL2506Bu-AZP
Generator mikrowzorówHeidelberguPG101
MF CD-26 WywoływaczRohm i Haasmaterials-Developerw protokole 1.4
S-CleanSasaki ChemicalS-24Wytrawiacz chromu w protokole 1.5
AcetonWako012-00343
Wafel krzemowyCanosisSiJ-4
Spin CoaterMIKASA1H-D7
Hexamethyldisilazan (HMDS)Tokyo Ohka KogyoH0089
SU-8 3050MicroChem-NegativePhotoresist w protokole 1.9
Ekspozycja na promieniowanie UVNanometric Technology IncLA310s
SU-8 DeweloperMicroChemY020100Wywoływacz ujemnego fotorezystu w protokole 1.13
2-propanolWako163-04841
Profilomierz powierzchniVeecoVeeco Dektak XT-S
(Trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooktylo)silanSigma448931
Polidimetylosiloksan (PDMS)Dow Corning Toray184W/C
Dziurkacz do biopsji (1,0mm) Kai IndustriesBP-10F
(2,0 mm) Kai IndustriesBP-20F
System plazmowyFemto ScienceCOVANCE
Szkło osłonoweSZKŁO MATSUNAMI C024241
Naczynia hodowlaneIwaki1000-035
RFP Wyrażające ludzką komórkę śródbłonka żyły pępowinowejAngio ProteomiacAP-0001RFP
Normalne ludzkie fibroblasty płucLonzaCC-2512
Pożywka do wzrostu komórek śródbłonkaLonzaCC-3162
Zestawy pożywek do wzrostu fibroblastówLonzaCC-3132
DMEMThermo Fisher Scientific 11965092
Płodowa surowica bydlęcaThermo Fisher Scientific26140079
Roztwór penicyliny-streptomycynyWako168-23191
0,05 W/v% Trypsyna-0,53 mmol/l EDTA• Roztwór 4Na z fenolem RedWako204-16935
PBS (sole buforowane fosforanem)Takara bioT900
96-dołkowa płytkaBakelit Sumitomo631-21031
1000ul ChipNIPPON GeneticsFG-402
200ul  ChipNIPPON GeneticsFG-301
10ul ChipNIPPON Genetics37650
Inkubator CO2Thermo Fisher ScientificModel 370
GFP Ekspresja ludzkiej komórki śródbłonka żyły pępowinowejAngio ProteomiecAP-0001GFP
Fibrynogen z osocza bydlęcegoSigmaF8630
Aprotynina z płuc bydlęcychSigmaA6279
Kolagen ICorning354236
Trombina z osocza bydlęcegoSigmaT4648
Hoechst 33342InvitrogenH21492Barwnik fluorescencyjny do barwienia jąder w protokole 5.5
Roztwór paraformaldehyduWako163-25983
Odwrócony mikroskop fluorescencyjnyOLYMPUSIX71
Degital Kamera CCDOLYMPUSORCA-R2
Konfokalny skaningowy laserowy mikroskop biologicznyOLYMPUSFV1000
Odwrócony mikroskop fluorescencyjnyOLYMPUSIX-83
Izotiocyjanian fluoresceinySigmaFD70S
electronic Dziurkacz do biopsji

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Abbott, A. Cell culture: Biology's new dimension. Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).
  2. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
  3. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
  4. Abu-Absi, S. F., Friend, J. R., Hansen, L. K., Hu, W. S. Structural polarity and functional bile canaliculi in rat hepatocyte spheroids. Experimental Cell Research. 274 (1), 56-67 (2002).
  5. Bissell, M. J., Radisky, D. C., Rizki, A., Weaver, V. M., Petersen, O. W. The organizing principle: microenvironmental influences in the normal and malignant breast. Differentiation. 70 (9-10), 537-546 (2002).
  6. Liu, Y., et al. Novel role for netrins in regulating epithelial behavior during lung branching morphogenesis. Current Biology. 14 (10), 897-905 (2004).
  7. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-U147 (2009).
  8. Torisawa, Y. S., Shiku, H., Kasai, S., Nishizawa, M., Matsue, T. Proliferation assay on a silicon chip applicable for tumors extirpated from mammalians. International Journal of Cancer. 109 (2), 302-308 (2004).
  9. Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
  10. Sutherland, R. M. Cell And Environment Interactions In Tumor Microregions - The Multicell Spheroid Model. Science. 240 (4849), 177-184 (1988).
  11. Rothbauer, M., Zirath, H., Ertl, P. Recent advances in microfluidic technologies for cell-to-cell interaction studies. Lab on a Chip. , (2017).
  12. Matsuura, K., Utoh, R., Nagase, K., Okano, T. Cell sheet approach for tissue engineering and regenerative medicine. Journal of Controlled Release. 190, 228-239 (2014).
  13. Esch, E. W., Bahinski, A., Huh, D. Organs-on-chips at the frontiers of drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (4), 248-260 (2015).
  14. Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
  15. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), (2014).
  16. Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
  17. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373(2013).
  18. Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481(2013).
  19. Taguchi, A., et al. Redefining the In Vivo Origin of Metanephric Nephron Progenitors Enables Generation of Complex Kidney Structures from Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2014).
  20. Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
  21. Auger, F. A., Gibot, L., Lacroix, D. Annual Review of Biomedical Engineering. Yarmush, M. L. 15, 177-200 (2013).
  22. Inamori, M., Mizumoto, H., Kajiwara, T. An Approach for Formation of Vascularized Liver Tissue by Endothelial Cell-Covered Hepatocyte Spheroid Integration. Tissue Engineering Part A. 15 (8), 2029-2037 (2009).
  23. Kunz-Schughart, L. A., et al. Potential of fibroblasts to regulate the formation of three-dimensional vessel-like structures from endothelial cells in vitro. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 290 (5), C1385-C1398 (2006).
  24. Rouwkema, J., De Boer, J., Van Blitterswijk, C. A. Endothelial cells assemble into a 3-dimensional prevascular network in a bone tissue engineering construct. Tissue Engineering. 12 (9), 2685-2693 (2006).
  25. Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip. Lab on a Chip. 13 (8), 1489-1500 (2013).
  26. Moya, M. L., Hsu, Y. H., Lee, A. P., Hughes, C. C. W., George, S. C. In Vitro Perfused Human Capillary Networks. Tissue Engineering Part C-Methods. 19 (9), 730-737 (2013).
  27. Nashimoto, Y., et al. Integrating perfusable vascular networks with a three-dimensional tissue in a microfluidic device. Integrative Biology. 9 (6), 506-518 (2017).
  28. Huang, C. P., et al. Engineering microscale cellular niches for three-dimensional multicellular co-cultures. Lab on a Chip. 9 (12), 1740-1748 (2009).
  29. Newman, A. C., et al. Analysis of Stromal Cell Secretomes Reveals a Critical Role for Stromal Cell-Derived Hepatocyte Growth Factor and Fibronectin in Angiogenesis. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (3), 513(2013).
  30. Newman, A. C., Nakatsu, M. N., Chou, W., Gershon, P. D., Hughes, C. C. W. The requirement for fibroblasts in angiogenesis: fibroblast-derived matrix proteins are essential for endothelial cell lumen formation. Molecular Biology of the Cell. 22 (20), 3791-3800 (2011).
  31. Griffith, C. K., et al. Diffusion limits of an in vitro thick prevascularized tissue. Tissue Engineering. 11 (1-2), 257-266 (2005).
  32. Zheng, Y., et al. Angiogenesis in Liquid Tumors: An In Vitro Assay for Leukemic-Cell-Induced Bone Marrow Angiogenesis. Advanced Healthcare Materials. 5 (9), 1014-1024 (2016).
  33. Osaki, T., Sivathanu, V., Kamm, R. D. Crosstalk between developing vasculature and optogenetically engineered skeletal muscle improves muscle contraction and angiogenesis. Biomaterials. 156, 65-76 (2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Perfusable Vascular NetworkMicrofluidic DeviceSpheroid CultureAngiogenic SproutsEndothelial CellsPDMS SlabFibrin GelHUVEC LoadingVascular AnastomosisFITC Dextran Perfusion

Related Articles