Artykuł metodologiczny

Obrazowanie PET zapalenia układu nerwowego przy użyciu [11C] DPA-713 w mysim modelu udaru niedokrwiennego

13.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57243

⸱

14 czerwca 2018

 ,  ,  , 
1Department of Radiology, Stanford University, 2Department of Neurology and Neurological Sciences, Stanford University

W tym artykule

Podsumowanie

Obrazowanie pozytonowej tomografii emisyjnej (PET) białka translokatorowego 18 kDa (TSPO) dostarcza nieinwazyjnego sposobu wizualizacji dynamicznej roli zapalenia układu nerwowego w rozwoju i progresji chorób mózgu. Protokół ten opisuje TSPO-PET i autoradiografię ex vivo w celu wykrycia zapalenia nerwów w mysim modelu udaru niedokrwiennego.

Streszczenie

Zapalenie nerwów jest kluczowe dla patologicznej kaskady po udarze niedokrwiennym. Nieinwazyjne metody obrazowania molekularnego mogą dostarczyć krytycznych informacji na temat dynamiki czasowej i roli niektórych interakcji neuroimmunologicznych w udarze. W szczególności obrazowanie pozytonowej tomografii emisyjnej (PET) białka translokatora 18 kDa (TSPO), markera aktywowanego mikrogleju i obwodowych komórek linii szpikowej, zapewnia środki do wykrywania i śledzenia zapalenia nerwów in vivo. W tym miejscu przedstawiamy metodę dokładnego ilościowego określenia zapalenia układu nerwowego za pomocą [11C] N,N-Diethyl-2-[2-(4-methoxyphenyl)-5,7-dimethylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl]acetamidu ([11C]DPA-713), obiecującego radioznacznika TSPO-PET drugiej generacji, w dystalnej niedrożności tętnicy środkowej mózgu (dMCAO) w porównaniu z myszami operowanymi pozorowanymi. Rezonans magnetyczny wykonano 2 dni po operacji dMCAO w celu potwierdzenia udaru oraz określenia lokalizacji i objętości zawału. Obrazowanie PET/tomografii komputerowej (CT) przeprowadzono 6 dni po dMCAO, aby uchwycić szczytowy wzrost poziomu TSPO po udarze. Ilościowe badanie obrazów PET przeprowadzono w celu oceny wychwytu [11C]DPA-713 w mózgu i śledzionie myszy dMCAO oraz myszy pozorowanych w celu oceny centralnych i obwodowych poziomów stanu zapalnego. Wychwyt in vivo [11C]DPA-713 w mózgu potwierdzono za pomocą autoradiografii ex vivo.

Wprowadzenie

Udar mózgu jest piątą najczęstszą przyczyną zgonów i główną przyczyną niepełnosprawności w Stanach Zjednoczonych1. Udar niedokrwienny stanowi zdecydowaną większość tych przypadków (~ 87%), występując, gdy występuje miejscowe zakłócenie przepływu krwi do mózgu (np. przez skrzep krwi lub złogi tłuszczu). Dopływ tlenu i składników odżywczych do obszarów dotkniętych chorobą jest następnie zmniejszany i inicjowana jest złożona kaskada patologiczna, co prowadzi do śmierci neuronów w obrębie rdzenia udaru (zawału), a także w otaczających obszarach. Zapalenie nerwów jest kluczowym elementem szlaku prowadzącego do tego uszkodzenia, przy czym uważa się, że zarówno rezydentne komórki odpornościowe mózgu (mikroglej), jak i naciekające obwodowe komórki odpornościowe (neutrofile, limfocyty T, limfocyty B i monocyty/makrofagi) przyczyniają się do tej destrukcyjnej kaskady2,3. Aktywowany mikroglej i makrofagi odgrywają kluczową rolę w tej odpowiedzi neurozapalnej, z doniesieniami o zarówno szkodliwych, jak i korzystnych skutkach po udarze niedokrwiennym2. Dlatego konieczna jest ocena udziału tych komórek in vivo po udarze.

PET to potężna technika obrazowania molekularnego 3-wymiarowego, która umożliwia wizualizację procesów biologicznych in vivo za pomocą specyficznych cząsteczek znakowanych pozytonem (β+) emitujących radionuklidy, takie jak 11C, 13N, 15O i 18F. Ta nieinwazyjna metoda ma wiele zalet w porównaniu z metodami ex vivo (np. immunohistochemią), ponieważ pozwala na pozyskiwanie informacji molekularnych w czasie rzeczywistym, u żywych, nienaruszonych osób, i pozwala na badania podłużne. Obrazowanie PET TSPO, marker aktywowanego mikrogleju i obwodowych komórek linii mieloidalnej, zapewnia środki do ilościowego określania i śledzenia wrodzonych odpowiedzi komórek odpornościowych w organizmie i może być wykorzystane do oceny stanu zapalnego po udarze i odpowiedzi na interwencje terapeutyczne. TSPO, wcześniej znany jako receptor benzodiazepinowy typu obwodowego, jest białkiem o masie 18 kDa, które, jak się uważa, odgrywa rolę w transporcie cholesterolu i syntezie neurosteroidów4. Co więcej, dowody sugerują, że TSPO jest zaangażowane w zapalenie nerwów i przeżycie neuronów5,6, z doniesieniami o zwiększonej ekspresji w wielu zaburzeniach neurologicznych związanych ze stanem zapalnym, w tym udarze7, dementia8, choroba Parkinsona9 i stwardnienie rozsiane10. TSPO znajduje się na zewnętrznych błonach mitochondrialnych i ulega silnej ekspresji na obrzeżach, szczególnie w tkankach związanych ze steroidami (np. Gruczołach) i z poziomami pośrednimi obserwowanymi w sercu, nerkach i płucach10. Jednak w zdrowym mózgu poziomy TSPO są niskie i ograniczają się głównie do gleju6,11. Po uszkodzeniu neuronów, takim jak obserwowane w udarze, poziom TSPO w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) znacznie wzrasta. Ta zaobserwowana regulacja w górę TSPO może być wykorzystana do zobrazowania zapalenia układu nerwowego in vivo, przy czym poziomy ekspresji zapewniają dokładny wskaźnik nasilenia stanu zapalnego. W związku z tym celem tej metody jest dokładne ilościowe określenieudziału zapalenia układu nerwowego in vivo w mysim modelu udaru niedokrwiennego przy użyciu TSPO-PET.

Wiele znaczników TSPO zostało opracowanych do obrazowania PET zapalenia nerwów. Tutaj obrazowanie TSPO-PET jest opisane przy użyciu [11C]DPA-71312, obiecującego znacznika TSPO drugiej generacji, który wykazał lepszy stosunek sygnału do szumu i niższe niespecyficzne wiązanie niż bardziej historycznie używany [11C]PK11195 13. Jako przykład dla tej metody wybrano mysi model udaru dMCAO14. Model ten obejmuje kraniotomię skroniową i trwałe podwiązanie dystalnej tętnicy środkowej mózgu, co skutkuje ogniskowym niedokrwieniem kory somatosensorycznej. Jest to korzystne w przedklinicznych badaniach nad udarem mózgu ze względu na wysoką odtwarzalność uszkodzeń niedokrwiennych i niską śmiertelność związaną z tym modelem. Do tej pory badania obrazowania TSPO-PET nie zostały jeszcze zgłoszone w modelu gryzoni dMCAO. Jednak poprzednie badania obrazowania PET z wykorzystaniem modelu niedrożności tętnicy środkowej mózgu (MCAO), bardziej ciężkiego i zmiennego modelu udaru, zarówno u myszy, jak i szczurów, wykazały, że ekspresja TSPO wzrasta od 3 dnia i osiąga szczyt około 7 dnia po udarze15,16,17,18. W związku z tym przeprowadziliśmy obrazowanie PET 6 dni po dMCAO, aby zbiegło się to z podwyższoną ekspresją TSPO. [11kategorii]Wychwyt DPA-713 w mózgu oceniano w półkulach ipsilateralnych (zawałowych) i przeciwległych. TSPO-PET połączono ze strukturalnym rezonansem magnetycznym, co pozwoliło na precyzyjne wyznaczenie obszarów zainteresowania zawału i przeciwległych (ROI). W tym miejscu opisujemy zarówno podejście oparte na atlasie, jak i oparte na MRI w celu obliczenia absorpcji [11C]DPA-713. Oceniano również wychwyt radioznacznika w śledzionie w celu zbadania obwodowych poziomów stanu zapalnego między grupami. Metoda ta może dostarczyć krytycznych informacji na temat dynamiki czasoprzestrzennej i roli określonych interakcji neuroimmunologicznych w udarze mózgu i innych chorobach neurologicznych.

Protokół

Wszystkie badania na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z Panelem Administracyjnym ds. Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi (APLAC) na Uniwersytecie Stanforda, programem akredytowanym przez Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care. Przed tym zabiegiem trzymiesięczne samice myszy C57BL/6 przeszły operację dMCAO zgodnie ze standardową procedurą i sterylnymi warunkami14.

1. Strukturalny rezonans magnetyczny (2 dni po operacji dMCAO)

  1. Otwórz oprogramowanie operacyjne (patrz Spis materiałów) i skonfiguruj akwizycję, tworząc nowy egzamin. Wybierz lokalizator i sekwencje turborare T2 w eksploratorze palety i przeciągnij do okna egzaminu.
  2. Przymocuj sondy oddechowe i termiczne do łóżka myszy za pomocą miękkiej taśmy i umieść na nich pasek ochronnej wyściółki chłonnej, aby stworzyć sterylne środowisko.
  3. Przymocuj nagrzewnicę powietrza do legowiska dla zwierząt i włącz wentylator, aby ciepłe powietrze było włączone i utrzymywało mysz w cieple. Użyj zautomatyzowanego systemu monitorowania, aby upewnić się, że temperatura ciała i częstość oddechów są utrzymywane na odpowiednim poziomie przez cały czas trwania skanowania.
  4. Znieczulij mysz w komorze indukcyjnej przy użyciu początkowo 3% izofluranu, a następnie utrzymuj na poziomie 1-2% (2 l/min, 100%O2). Upewnij się, że podkładka grzewcza jest włączona pod komorą indukcyjną, aby utrzymać ciepło myszy podczas indukcji. Po znieczuleniu nałóż na mysz lubrykant do oczu, aby uniknąć wysuszenia i powstania owrzodzeń rogówki.
    1. Włącz system znieczulający (izofluran 1-2%, 2 l/min 100% O2) podłączony do skanera MRI i przenieś zwierzę na łóżko myszy.
    2. Umieść głowę myszy leżącą na belce gryzowej i zamocuj nauszniki na miejscu, upewniając się, że nie wystają poza średnicę łóżka.
    3. Nasuń cewkę RF na głowę myszy i wepchnij cewkę i łoże do otworu, umieszczając ją specjalnie dla izocentrum.
    4. Uzyskaj lokalizator, aby wyświetlić pozycję myszy we wszystkich 3 wymiarach i użyj tego obrazu do zdefiniowania objętości dla T2 turborare (TE: 33 ms, TR: 2,500 ms, 2 średnie, 17 warstw, rozdzielczość 0,083 x 0,92 mm, całkowity czas 2 min 40 s). Operacja dMCAO powoduje zawał w korze somatosensorycznej14; w związku z tym, upewnij się, że ten region jest pokryty obrazem T2-zależnym.
    5. Wyjmij myszy ze skanera i odzyskaj myszy w podgrzewanej komorze.

2. Kalibracje PET/CT i konfiguracja przepływu pracy (6 dni po operacji dMCAO)

  1. Utwórz przepływ pracy obrazowania w oprogramowaniu obsługującym skaner, aby uwzględnić akwizycję tłumienia CT, 60-minutową dynamiczną akwizycję PET C-11 (dyskryminacja na poziomie 350 - 650 keV, okno koincydencji 3,438 ns), histogram (20 klatek: 5 x 15 s, 4 x 1 min, 11 x 5 min; z korekcją czasu martwego) oraz rekonstrukcję 3DOSEM-OP (2 iteracje, 18 podzbiorów) w celu stworzenia obrazów 128 x 128 x 159 o rozmiarze woksela 0,776 x 0,776 x 0,96 mm.
  2. Przeprowadź kondycjonowanie źródła promieniowania rentgenowskiego za pomocą panelu kalibracji CT znajdującego się w lewym górnym rogu interfejsu. Kalibracja ta musi być przeprowadzana co tydzień lub przed skanowaniem, jeśli system nie był używany w ciągu ostatnich 48 godzin.
  3. Wykonaj kalibracje ciemnego/jasnego (D/L) i przesunięcia środkowego (C/O).
    1. Naciśnij przycisk kalibracji CT (X) w lewym górnym rogu interfejsu.
    2. Wybierz D/L i C/O dla pliku CT, który będziesz uruchamiać, zdejmij łoże z suwnicy i uruchom kalibrację D/L.
    3. Włóż łoże narzędzia kalibracyjnego do skanera i uruchom kalibrację C/O, upewniając się, że wybór w interfejsie został przełączony na "narzędzie do kalibracji" zamiast "paleta 70 mm".
  4. Wyjmij narzędzie do kalibracji i przywróć standardowe łóżko PET, upewniając się, że wybór w interfejsie został zmieniony z powrotem na "paletę 70 mm".
  5. Przymocuj stół do obrazowania z 4 myszami do platformy skanera za pomocą taśmy i przymocuj rurkę anestezjologiczną (Rysunek 1A). Upewnij się, że izofluran przepływa przez rurki i że nie ma żadnych załamań.
  6. Popchnij łóżko do przodu, tak aby znalazło się w środku pola widzenia (FOV), zamknij drzwi CT i uzyskaj widok zwiadowczy CT, aby upewnić się, że łóżko jest we właściwej pozycji.
  7. Przeprowadzić "standardową" kalibrację skanera PET/CT przy użyciu wyprodukowanego przez siebie fantomu zawierającego znaną dawkę roztworu C-11 jako źródło promieniowania.
    1. Przygotować strzykawkę o pojemności 20 ml wypełnioną dawką znacznika równoważną dawce podanej jednej myszy (~250 - 350 μCi/9 - 13 MBq znacznika C-11 rozcieńczonego w roztworze soli fizjologicznej).
    2. Zapisać aktywność w wzorcu za pomocą kalibratora dawki i zanotować czas pomiaru.
    3. Przeprowadź skan PET/CT standardu przy użyciu dokładnie tych samych parametrów, które zostaną użyte do obrazowania myszy (jak opisano powyżej). Rób to co tydzień, aby utworzyć współczynnik korekcyjny, który skaner PET zostanie zastosowany do danych obrazowania.

3. Konfiguracja przestrzeni roboczej do obrazowania PET/CT

  1. Stwórz sterylne środowisko, używając środka dezynfekującego z wirusobójczym (patrz Tabela materiałów) i umieszczając ochronną wyściółkę chłonną na wszystkich powierzchniach.
  2. Upewnij się, że butle z izofluranem i tlenem są odpowiednio napełnione.
  3. Przygotować cewniki do żył ogonowych, wypełniając strzykawkę o pojemności 1 ml (wyposażoną w końcówkę igły 27,5 g) 0,9% chlorkiem sodu (sterylny roztwór soli fizjologicznej) i przepłukując przez cewnik motylkowy o masie 27,5 g i średnicy 24 cm. Odetnij skrzydełka cewnika przed kaniulacją, aby upewnić się, że nie blokują widoku żyły ogonowej i ułatwić przenoszenie myszy do skanera bez przesuwania cewnika.
  4. Upewnij się, że cały niezbędny sprzęt jest rozłożony na stanowisku pracy, w tym zapasowe strzykawki do "płukania" (wypełnione sterylnym solą fizjologiczną), lubrykant do oczu, waciki etanolowe, lampy grzewcze, przygotowane cewniki (wstępnie napełnione solą fizjologiczną), taśma chirurgiczna, klej do tkanek, strzykawki dozujące 0,5 ml, nożyczki i zapalniczka do uszczelnienia cewnika po pomyślnym umieszczeniu w żyle ogonowej (Rysunek 1B).

4. Przygotowanie zwierząt i kaniulacja

  1. Zważyć myszy, aby określić maksymalną objętość, jaką można wstrzyknąć każdej myszy (tj. objętość znacznika i podawanego roztworu soli fizjologicznej nie może przekraczać 10% masy ciała).
  2. Znieczulij myszy w komorze indukcyjnej za pomocą 3% izofluranu i utrzymuj na poziomie 1-2% (2 l/min 100%O2).
  3. Nałóż smar do oczu na każdą mysz i potwierdź znieczulenie za pomocą odruchu pedałowania (szczypanie palców). W razie potrzeby dostosuj poziom znieczulenia.
  4. Umieść mysz na podgrzewanym łóżku wyposażonym w stożek nosowy, aby dostarczyć izofluran w ilości 1-2% (2 l/min 100% O2).
  5. Podczas gdy mysz jest znieczulona, wykonaj kaniulację żył ogonowych zgodnie z następującym protokołem:
    1. Umieść mysz na boku, aby odsłonić jedną z żył bocznych, podczas gdy głowa pozostaje w stożku nosowym.
    2. Ogrzej ogon za pomocą lampy grzewczej, uważając, aby nie przegrzać ani nie poparzyć ogona, a następnie przetrzyj go wacikiem nasączonym alkoholem, aby rozszerzyć żyłę i wysterylizować miejsce wstrzyknięcia.
    3. Trzymaj igłę skosem do góry i wyrównaj ją z żyłą pod ostrym kątem.
    4. Lekko dociśnij, aby nakłuć skórę i wyrównać igłę tak, aby znalazła się w jednej linii z żyłą.
    5. Delikatnie popchnij do przodu kilka milimetrów za skos, aby igła weszła do żyły.
    6. Upewnij się, że cewnik jest w środku, podając mały (10-20 μl) roztwór soli fizjologicznej. Sól fizjologiczna powinna płynnie opuścić strzykawkę, a żyła powinna się udrożnić. Jeśli zaobserwuje się jakikolwiek opór lub ciśnienie wsteczne, prawdopodobnie cewnik nie znajduje się w żyle i zaleca się ponowną próbę kaniulacji. Jeśli zaobserwuje się krzepnięcie, użyj heparyny (1,000 jednostek heparyny na ml soli fizjologicznej) do konfiguracji kaniulacji i płukania.
      UWAGA: Oceniliśmy kaniulację z heparyną i bez heparyny w badanym szczepie myszy, a ponieważ nie zaobserwowano krzepnięcia, do kaniulacji użyto samej soli fizjologicznej.
    7. Przymocuj cewnik do ogona za pomocą małej kropli kleju tkankowego, a następnie taśmy chirurgicznej, aby upewnić się, że cewnik pozostaje nieruchomy podczas przenoszenia myszy do skanera.
    8. Wyjmij strzykawkę z płukaniem z końca cewnika i uszczelnij koniec zapalniczką, upewniając się, że badacz nie znajduje się w pobliżu izofluranu lub etanolu.
    9. Powtórz tę czynność dla 3 dodatkowych myszy, tak aby wszystkie 4 myszy do skanowania zostały kaniulowane i przygotowane.
  6. Włącz przepływ znieczulający (2,5% izofluranu, 2 l/minutę 100%O2) podłączony do PET/CT i ostrożnie ustaw myszy leżące na łóżku skanera, upewniając się, że cewniki pozostają na miejscu, a głowa każdej myszy jest prosta i bezpieczna w stożku nosowym. Przyklej głowę i ciało każdej myszy do łóżka miękką taśmą chirurgiczną, upewniając się, że oddychanie nie jest ograniczone przez umieszczenie taśmy. Zapisz pozycję każdej myszy, aby umożliwić prawidłowe przypisanie lokalizacji i grupy do analizy obrazu.
  7. Utrzymuj myszy w cieple przez cały czas trwania procedury (np. za pomocą lampy grzewczej lub systemu pompy gorącego powietrza, aby zapewnić myszom ciepło bez przegrzania). Monitoruj częstość oddechów wszystkich myszy, wizualnie, jeśli używasz otwartej suwnicy lub za pomocą systemu zdalnego monitorowania za pomocą podkładek oddechowych, i w razie potrzeby zmieniaj poziomy znieczulenia.

5. Akwizycja CT

  1. Gdy zwierzęta są już bezpieczne w łóżku, a oddychanie jest stabilne, włącz laserowy krzyż nitkowy i przesuń łóżko skanujące tak, aby zrównało się z mózgiem wszystkich czterech myszy. Przesuń łoże skanera do pozycji akwizycji (pozycja 3) tak, aby mózgi myszy znajdowały się jak najbliżej środka pola widzenia.
  2. Uzyskaj obraz myszy w widoku zwiadowczym, aby zweryfikować ich pozycję (użyj pola widzenia 200 mm) i dostosuj pozycję, przeciągając pole FOV na interfejsie, jeśli to konieczne. Kliknij "Rozpocznij przepływ pracy" w oprogramowaniu skanera, aby rozpocząć tomografię komputerową, upewniając się, że wybrałeś opcję "wyświetl interaktywne monity użytkownika", aby skanowanie PET można było rozpocząć ręcznie przed wstrzyknięciem znacznika.

6. [11C]DPA-713 Przygotowanie dawki

  1. Zsyntetyzuj [11C]DPA-713 zgodnie z wcześniejszym opisem12, upewniając się, że nosisz odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE) do pracy z radioaktywnością, w tym fartuch laboratoryjny, rękawice oraz osobiste dozymetry na palce i ciało. Upewnij się, że regularnie zmieniasz rękawice, aby zapobiec skażeniu radioaktywnemu i zwiększaj odległość od źródła promieniowania, jeśli to możliwe.
  2. Za pomocą kleszczy ostrożnie przenieść fiolkę ze znacznikiem radioaktywnym za ołowianą osłonę.
  3. Przygotować strzykawki z dawką 0,5 ml dla każdej myszy, zawierające około 250-350 μCi/9-13 MBq w objętości 100-200 μl, aby zapewnić dawkę odpowiednią do 60-minutowego dynamicznego skanowania PET (podawana dawka powinna być ustalona z uwzględnieniem okresu półtrwania izotopu i osi czasowej projektu badania, przy czym objętość zależy od masy ciała myszy).
  4. Zmierzyć aktywność za pomocą kalibratora dawki ustawionego na C-11, znajdującego się w bliskiej odległości od miejsca kaniulacji, i zapisać czasy pomiaru i wstrzyknięcia, aby umożliwić korekcję zaniku. Przygotuj dawki tuż przed zakończeniem tomografii komputerowej, aby ograniczyć rozpad i upewnić się, że pożądany poziom radioaktywności zostanie wstrzyknięty każdej myszy.
  5. Sprawdzić, czy w strzykawce dozującej nie ma pęcherzyków powietrza przed pomiarem aktywności i wstrzyknięciem do każdej myszy.

7. Pozyskiwanie PET

  1. Gdy myszy automatycznie przejdą z CT do PET, ustaw tylną część skanera do wstrzyknięcia [11C] DPA-713 (Rysunek 1C). Umieść ochronną chłonną wyściółkę na półce i upewnij się, że nożyczki i zapalniczka są pod ręką.
  2. Przeciąć zapieczętowaną rurkę cewnika nożyczkami, sprawdzić, czy linie cewnika są wolne od pęcherzyków i upewnić się, że kaniula nadal znajduje się w żyle, wykonując płukanie solą fizjologiczną w ilości 10-20 μl. Załadować strzykawki z odmierzoną dawką z kroku 6.4 do każdego z 4 cewników, śledząc, jaka dawka została podana każdej myszy.
  3. Kliknij "OK", gdy skanowanie PET jest gotowe do rozpoczęcia, jednocześnie uruchamiając 10-sekundowy timer. Poproś dwóch badaczy z tyłu skanera ze strzykawkami dozującymi w ręku, aby wstrzyknąć wszystkie 4 myszy jednocześnie, gdy zegar osiągnie zero. Przepłukać każdy cewnik 50-100 μl soli fizjologicznej (w zależności od długości rurki cewnika - tj. objętości martwej), aby upewnić się, że pełna dawka dostanie się do żyły ogonowej, a następnie ponownie uszczelnić rurkę za pomocą zapalniczki.
  4. Zmierzyć dawkę strzykawki za pomocą kalibratora dawki, aby uzyskać resztkową wartość radioaktywności (wszelkie substancje śladowe pozostałe w strzykawce). Zwróć uwagę na wartości i czas ich rejestrowania.
  5. Po zakończeniu skanowania ustaw łóżko PET w pierwotnej pozycji za pomocą poziomego przycisku "home" w panelu sterowania ruchem. Wyjmij myszy ze skanera i ostrożnie wyjmij cewnik. Delikatnie uciskaj miejsce kaniulacji, aby zapobiec nadmiernemu krwawieniu.
  6. Zmierzyć pozostałą aktywność w cewniku za pomocą kalibratora dawki, jak opisano wcześniej.
  7. Jeśli myszy mają zostać odzyskane, upewnij się, że odbywa się to w ciepłym otoczeniu (np. w pudełku z podgrzewaną podkładką pod spodem lub zawierającym rękawicę wypełnioną ciepłą wodą), aby ułatwić powrót do zdrowia. Jeśli planujesz eutanazję myszy, umieść je w komorze indukcyjnej zawierającej izofluran, aby pozostały znieczulone przed eutanazją przez perfuzję.
  8. Aby zrekonstruować dane, otwórz oprogramowanie do zarządzania przetwarzaniem końcowym (patrz Spis materiałów), które automatycznie zrekonstruuje każdy skan przy użyciu danych histogramu wygenerowanych z pliku lst.

8. Autoradiografia mózgu

  1. Przed eksperymentem należy usunąć film z autoradiografii cyfrowej, wystawiając go na działanie białego światła przez 10-15 minut i przechowywać w miejscu wolnym od radioaktywności do czasu użycia.
  2. Przygotować strzykawki z dawką 0,5 ml dla każdej myszy, zawierające około 1,0-1,5 mCi/37-56 MBq, aby zapewnić dawkę odpowiednią do przeprowadzenia autoradiodiagnostyki.
  3. Przed wstrzyknięciem należy zmierzyć radioaktywność w strzykawce dozującej za pomocą kalibratora dawki, aby uzyskać dokładny odczyt aktywności.
  4. Kanulokuj zgodnie z wcześniejszym opisem i natychmiast wstrzyknij myszy w obszar odpowiedni dla radioaktywności.
  5. Po wstrzyknięciu należy usunąć cewnik i zmierzyć pozostałą radioaktywność.
  6. Pozostaw myszy w podgrzewanej komorze indukcyjnej, aby pozostały znieczulone przed perfuzją i eutanazją.
  7. Wykonaj eutanazję, gdy myszy są głęboko znieczulone (ciągłe wdychanie 4% izofluranu, 2 l/min 100%O2) poprzez perfuzję PBS i obustronną torakotomię 30 minut po wstrzyknięciu [11C]DPA-713.
    1. Otwórz jamę brzuszną i przetnij przeponę, aby odsłonić serce.
    2. Wprowadzić igłę do infuzji cewnika motylkowego do lewej komory serca i odciąć prawy przedsionek i żyłę główną dolną.
    3. Powoli perfuzjuj z PBS (~20-30 ml) za pomocą strzykawki o pojemności 20 ml.
  8. Ostrożnie usuń mózg z czaszki za pomocą kleszczy i nożyczek.
  9. Umieść mózg w formie do zamrażania wypełnionej płynem o optymalnej temperaturze cięcia (OCT), upewniając się, że mózg jest wypoziomowany i wyśrodkowany w formie, z opuszkami węchowymi skierowanymi w stronę nacięć w formie (aby zapewnić punkty orientacyjne i orientację po wyjęciu mózgu z formy).
  10. Umieść formę na suchym lodzie na 10 -15 minut lub do momentu, gdy OCT stanie się nieprzezroczysty.
  11. Natychmiast umieść każdą formę w mikrotomie kriostatu ustawionym na -18 °C i równoważ przez 10 minut przed montażem.
  12. Oderwij formę do zamrażania i zamontuj mózg na platformie mikrotomu, używając niewielkiej ilości świeżego OCT jako "kleju".
  13. Pozostaw zamontowany mózg w mikrotomie do zamrożenia na 2 minuty.
  14. Przetnij mózg, aż miejsce udaru zostanie odsłonięte (tj. ROI). Użyj obrazu MR, aby zlokalizować zawał w mózgu każdego zwierzęcia. W przypadku dMCAO powinno to konsekwentnie znajdować się w korze somatosensorycznej; Jednak długość skoku może się nieznacznie różnić.
  15. Wytnij obszar mózgu obejmujący zawał, umieszczając skrawki o grubości 20 μm na szklanych szkiełkach mikroskopowych oznaczonych odpowiednim numerem myszy.
  16. Otwórz kasetę z autoradiografią i wyłóż spód kasety jednym arkuszem folii Saran. Ułóż sekcję slajdów stroną do góry na wierzchu owijki saran w kasecie i zwróć uwagę na położenie każdego slajdu. Opcjonalnie zrób zdjęcie rozmieszczenia slajdu, aby pomóc w późniejszej analizie.
  17. Delikatnie połóż kolejną warstwę folii saran wrap na wierzchu (po odczekaniu ~2 minut po pobraniu ostatniego wycinka mózgu - pozwalając mu wyschnąć i przylgnąć do szkiełka) i ostrożnie umieść film do autoradiografii cyfrowej (białą stroną skierowaną w dół) na wierzchu szkiełka.
  18. Zamknij szczelnie kasetę i pozostaw w zamrażarce w temperaturze -20 °C, pozwalając sekcjom na rozpad na filmie przez odpowiedni czas naświetlania (~5-10 okresów półtrwania).
  19. Zeskanuj film po czasie naświetlania za pomocą imagera luminoforowego, aby wygenerować obraz cyfrowy do późniejszej analizy.

9. Dynamiczna analiza obrazu PET

  1. Otwórz oprogramowanie do analizy obrazu (patrz tabela materiałów) i kliknij ikonę "otwarte dane", aby załadować obraz CT (jako źródło) i ikonę "dołącz dane", aby załadować dynamiczny PET (jako odniesienie).
  2. Przeprowadź wizualną kontrolę jakości danych za pomocą operatora szeregów czasowych w menu rozwijanym: Wybierz odwołanie ("ref") i "globalne", a następnie zastosuj odpowiednie wartości minimalne i maksymalne dla skali kolorów. Wizualizuj dynamiczne dane PET klatka po klatce, weryfikując wychwyt radioaktywności i sprawdzając, czy w skanowaniu nie ma zakłóceń w ruchu.
  3. Utwórz przeciętny obraz PET za pomocą "operatora arytmetycznego".
    1. Wybierz "średnia wybrana", odznacz "ref" i upewnij się, że wejście 1 ("Inp1"), wejście 2 ("Inp2") i gwiazda wejściowa ("Inp*" - obejmuje resztę ramek PET w skanowaniu) są wybrane, aby utworzyć średnią ze wszystkich ramek PET.
    2. Przejdź do zakładki "menedżer danych" (DM) i przeciągnij średni obraz w górę do pozycji "input1" w celach wizualizacji. Rozłóż ponownie skalę kolorów, klikając automatyczne obliczenia w narzędziu "min-max".
  4. Zarejestruj przekładnik prądowy w przeciętnym pliku PET za pomocą funkcji "automatyczne 3D" w menu rozwijanym "zmiana orientacji/rejestracja".
    1. Wybierz "ref" i "Inp1", a następnie wybierz rejestrację "sztywna", "szybka", "Inp1 do Ref". Sprawdź wzrokowo pasowanie we wszystkich 3 wymiarach i w razie potrzeby ręcznie dostosuj w zakładce "ręczne 3D" za pomocą funkcji "przesunięcie" i "obrót".
    2. Jeśli rejestracja jest zadowalająca, wybierz "Inp2" i "Inp*" i zastosuj do wszystkich ramek PET, klikając znacznik wyboru. Kliknij prawym przyciskiem myszy pliki CT i PET w DM i zapisz jako surowe.
  5. Przycinaj mózg jednej myszy na raz w celu analizy mózgu, korzystając z CT jako przewodnika: Wybierz "przycinanie" z menu rozwijanego i przeciągnij granice obrazu, aby przyciąć głowę myszy poniżej pnia mózgu. Zmień orientację obrazów PET i CT za pomocą funkcji "ręcznej reorientacji 3D", jak opisano powyżej, tak aby czaszka była prosta we wszystkich wymiarach.
  6. Załaduj obraz MR dla tej myszy (w formacie DICOM) za pomocą przycisku "dołącz dane" w lewym górnym rogu interfejsu. Przesuń MR za pomocą "ręcznej reorientacji 3D" i dopasuj do czaszki na obrazie CT (upewnij się, że wszystkie modalności są w tej samej orientacji).
  7. Narysuj ROI obrysu na obrazie MR za pomocą narzędzia "3D ROI".
    1. Wyłącz wizualizację PET, odznaczając ją na karcie kontrolera wizualnego (VC) i użyj tylko MR i CT do narysowania ROI.
    2. Kliknij przycisk "dodaj ROI", aby utworzyć nowy ROI i nazwać go "infarct". Wybierz "narzędzie splajnu", kliknij lewym przyciskiem myszy, aby narysować obramowanie ROI i kliknij prawym przyciskiem myszy, aby je zamknąć.
    3. Powtórz wszystkie wycinki obejmujące pociągnięcie, upewniając się, że nie uchwycisz żadnej części czaszki w ROI, a najlepszą praktyką jest pozostawienie luki wokselowej między granicą czaszki a ROI pociągnięcia.
  8. Wygeneruj kontralateralny zwrot z inwestycji przy użyciu objętości zawału.
    1. Utwórz nowy zwrot z inwestycji i oznacz go jako "kontralateralny". Kliknij prawym przyciskiem myszy ROI zawału i wybierz "eksportuj". Przeciągnij ROI do pozycji 2 ("Inp1").
    2. Po wybraniu tylko "Inp1" zastosuj przewrót w lewo i w prawo, korzystając z funkcji "operator" w menu "reorientacja/rejestracja". Zaznacz pole "ROI", wybierz "tylko widok" i ręcznie przenieś nowy ROI do tego samego regionu po stronie przeciwnej. Wybierz operator "arytmetyczny" i zastosuj mnożenie skalarne 2 do nowego ROI, umożliwiając niezależną kwantyfikację ROI.
    3. Wróć do narzędzia ROI 3D. Przejdź do zakładki "eksperckie i eksperymentalne" i kliknij przycisk "importuj ROI". Wybierz Inp1 w oknie dialogowym, aby załadować nowy wolumin jako kontralateralny zwrot z inwestycji.
  9. Kliknij prawym przyciskiem myszy przeciętny obraz PET, rozładuj go i ponownie włącz PET. Wygeneruj ilościowe wyniki absorpcji za pomocą ikony "eksportuj wyniki" w narzędziu 3D ROI.
  10. W razie potrzeby wykonaj dodatkową analizę podzielonego mózgu (tj. automatyczne generowanie ROI regionów prawej i lewej półkuli mózgu przy użyciu modułu wtyczki atlasu mózgu myszy 3D dla oprogramowania Vivoquant).
    1. Ponownie załaduj zarejestrowane obrazy PET/CT.
    2. Zaimportuj atlas mózgu myszy, klikając menu "moduły zaawansowane" i wybierając narzędzie atlasu mózgu 3D. Wybierz "wszystkie regiony lewo/prawo" w "ustawieniach zaawansowanych" i kliknij "uruchom", aby zaimportować atlas 3D.
    3. Ręcznie dopasuj atlas do mózgu, używając czaszki jako obramowania.
    4. Uruchom ponownie atlas, upewniając się, że zaznaczono opcję "importuj ROI 3D", aby wygenerować arkusz kalkulacyjny z wynikami dla wszystkich 14 ROI lewej i prawej półkuli (rdzeń, móżdżek, śródmózgowie, most, kora mózgowiska, hipokamp, wzgórze, podwzgórze, prążkowie, pallidum, opuszki węchowe, ciało modzelowate i istota biała).
  11. Określić ilościowo wychwyt znacznika w śledzionie za pomocą oprogramowania operacyjnego skanera (patrz tabela materiałów).
    1. Załaduj pliki obrazów PET i CT, podświetlając je w bazie danych i klikając "analiza ogólna".
    2. Kliknij zakładkę rejestracji i współrejestruj obrazy PET i CT, klikając ikonę "sztywna rejestracja".
    3. Kliknij zakładkę kwantyfikacji ROI, kliknij ikonę "utwórz ROI" i nazwij ją śledziona.
    4. Wybierz narzędzie "sferyczne", aby narysować ROI śledziony za pomocą pliku CT w celach informacyjnych, upewniając się, że nie nakłada się na wychwyt nerkowy (przy użyciu obrazu i sygnału PET, aby uniknąć rozlania się z nerek).
    5. Edytuj ROI, aby utrzymać stałe wielkości ROI między zwierzętami.
  12. Oblicz standardową wartość korekcji dla normalizacji wychwytu.
    1. Załaduj dane PET/CT ze standardowego skanu i utwórz zwrot z inwestycji w butlę obejmujący strzykawkę o pojemności 20 ml za pomocą narzędzia "ręczny zwrot z inwestycji 3D".
    2. Uzyskaj poziom radioaktywności zawarty w normie za pomocą ikony arkusza kalkulacyjnego.
    3. Wykorzystać ten wynik nCi/cc i oryginalną zarejestrowaną radioaktywność dla wzorca (tj. pomiar wzorca za pomocą kalibratora dawki w nCi/cc) w celu utworzenia współczynnika korygującego dla wartości wychwytu PET. Oznacza to, że należy podzielić radioaktywność wzorca zarejestrowaną przez kalibrator dawki przez radioaktywność obliczoną na podstawie obrazu PET wzorca.
  13. Użyj czynności dawki i czasu pomiarów, aby zaniknąć prawidłowo do czasu akwizycji PET dla wszystkich myszy (tj. obliczyć aktywność dawki na początku skanowania PET).
  14. Powtórzyć te czynności dla wartości resztkowych i odjąć od dawki skorygowanej o rozpad, aby obliczyć dokładną aktywność otrzymaną przez każde zwierzę.
  15. Po zastosowaniu tej korekcji zaniku zastosuj również korekcję standardową, aby upewnić się, że dane są na odpowiednim poziomie aktywności. Upewnij się, że te poprawki są stosowane do ręcznie rysowanych wyników ROI, a dane ROI atlasu mózgu są istotne dla lokalizacji dMCAO (tj. Kora, hipokamp i prążkowie).
  16. Obliczyć %ID/g dla wszystkich ROI, korzystając z następującego równania: %ID/g = (radioaktywność ROI w nCi/cc / dawka skorygowana o rozpad otrzymana w nCi/cc) x 100. Wykreśl %ID/g jako funkcję czasu, używając oprogramowania do tworzenia wykresów, aby wygenerować krzywe aktywności w czasie dla każdego ROI.
  17. Użyj oprogramowania skanera do ostatecznej wizualizacji obrazu i generowania figur. Normalizuj obrazy zgodnie z dawką skorygowaną o zanik otrzymaną przez każdą mysz w momencie skanowania, upewniając się, że wszystkie obrazy są w tej samej skali %ID/g.
    UWAGA: Jest to konieczne, aby umożliwić dokładne porównanie obrazów pochodzących od różnych myszy i/lub obrazów z badań przeprowadzonych w różnych dniach

10. Analiza obrazu autoradiograficznego

  1. Otwórz obraz cyfrowy (plik .gel) w oprogramowaniu ImageJ. Dostosuj jasność i kontrast, aby wizualnie określić próg obrazu i zastosuj odpowiednią "tabelę przeglądową".
    UWAGA: Royal najwierniej odwzorowuje skalę kolorów używaną w PET.
  2. Użyj menedżera ROI, aby ręcznie narysować ROI wokół zawału i odpowiadających mu obszarów przeciwległych.
  3. Użyj funkcji miary, aby określić ilościowo średnią intensywność pikseli każdego zwrotu z inwestycji i wyeksportować wyniki. Wykres za pomocą oprogramowania statystycznego.

Wyniki

Myszy poddano badaniu MRI w celu weryfikacji skuteczności wywołania udaru, a następnie przeprowadzono badanie PET z użyciem [1C]DPA-713, skanując 4 myszy jednocześnie. Obrazy PET, CT i MR zarejestrowano wspólnie przed ręcznym wyznaczeniem obszarów zainteresowania (ROI) w mózgu i przeprowadzeniem półautomatycznej analizy z wykorzystaniem atlasu mózgu w celu zbadania wychwytu znacznika w obszarach ipsilateralnych i kontralateralnych (Rysunek 2).

Obrazy PET/CT oraz krzywe aktywności w czasie (TAC – aktywność radiotraceru jako funkcja czasu) wykazują zwiększony pobór [1C]DPA-713 w półkuli ipsilateralnej w porównaniu do półkuli kontralateralnej (Rycina 3A). Ilościowa analiza dynamicznych obrazów PET mózgu, z wykorzystaniem danych zsumowanych z przedziału 50–60 min, wykazała istotny wzrost poboru znacznika (% ID/g) w półkuli ipsilateralnej (z zawalem) w porównaniu do półkuli kontralateralnej w grupie dMCAO, lecz nie w grupie sham, przy zastosowaniu metody ręcznego wyznaczania ROI (Rycina 3B). Zwiększony pobór zaobserwowano również w półkuli ipsilateralnej w porównaniu między myszami dMCAO a sham. Nie stwierdzono istotnych różnic między półkulami ipsilateralną i kontralateralną przy zastosowaniu metody z wykorzystaniem atlasu, co prawdopodobnie wynika z faktu, że obszary ROI z atlasu są większe niż obszar zawału (zwykle ograniczony do kory somatosensorycznej), co prowadzi do rozcieńczenia sygnału. Jednakże we wszystkich ROI zaobserwowano ogólnie zwiększony pobór w grupie dMCAO w porównaniu do grupy sham, co jest zgodne z wcześniejszymi doniesieniami z wykorzystaniem modelu MCAO u myszy, wykazującymi zwiększoną ekspresję TSPO w obszarach poza miejscem zawału19. Stosunki ipsilateralna/kontralateralna były wyższe u myszy dMCAO w porównaniu do myszy sham w obu zastosowanych metodach; jednakże różnica ta była istotna jedynie w korze przy zastosowaniu metody z atlasem mózgu, ze względu na większą wariancję w metodzie ROI. Można to rozwiązać poprzez zwiększenie liczby myszy w każdej grupie. Ilościowe oznaczenie poboru [11C]DPA-713 w śledzionie nie wykazało istotnych różnic między grupami (Rycina 4).

Wyniki obrazowania PET mózgu myszy po dMCAO zostały potwierdzone za pomocą wysokorozdzielczej cyfrowej autoradiografii ex vivo (Rycina 5). Zaobserwowano zwiększony wychwyt [1C]DPA-713 w tkance zawałowej, przy pomijalnym sygnale w otaczającej zdrowej tkance mózgowej. Ilościowa analiza tych obrazów wykazała stosunki strony ipsilateralnej do kontralateralnej w zakresie od 1,4 do 2,09 u myszy z dMCAO.

Przygotowanie do zabiegu chirurgicznego ze strzykawkami i narzędziami chirurgicznymi, z wykorzystaniem sprzętu obrazującego.
Rycina 1: Konfiguracja skanera PET i stanowiska pracy. Wszystkie obszary robocze wyłożono ochronnymi matami chłonnymi w celu stworzenia sterylnego środowiska. (A) Po kalibracji w skanerze zamocowano wydrukowane w technologii 3D podłoże dla myszy, przystosowane do obrazowania 4 osobników jednocześnie, a stożki nosowe wszystkich 4 myszy podłączono do aparatury do znieczulenia. (B) Z wyprzedzeniem przygotowano niezbędny sprzęt do obrazowania PET, w tym cewniki 27,5 G wypełnione solą fizjologiczną, lubrykant do oczu, gaziki nasączone etanolem, lampy grzewcze, taśmę chirurgiczną, klej tkankowy, strzykawki dozujące o pojemności 0,5 ml, nożyczki oraz zapalniczkę. (C) Do wstrzyknięcia radiotraceru należy przygotować strzykawki z solą fizjologiczną do przepłukania oraz nożyce, umieszczając je z tyłu skanera. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Przebieg procesu korejestracji, PET/CT do MRI, schemat, dopasowanie atlasu mózgu, ręczne wyznaczanie ROI.
Rysunek 2: Proces analizy obrazów PET z atlasu mózgu z podziałem na prawą i lewą półkulę oraz wyznaczeniem jednostronnych i przeciwstawnych obszarów zainteresowania (ROI). Do oznaczenia poboru znacznika w obszarach zainteresowania (ROI) po stronie ipsilateralnej i kontralateralnej wykorzystano oprogramowanie do analizy obrazu, stosując ręcznie wyznaczone ROI oraz półautomatyczne podejście z wykorzystaniem 3D atlasu z podziałem mózgu. Przeprowadzono automatyczną rejestrację obrazów 3D PET/CT, a następnie dokonano ręcznej rejestracji obrazu MRI mózgu w obrębie odpowiadającej mu czaszki myszy zdefiniowanej na obrazie CT. Za pomocą narzędzia 3D ROI ręcznie wyznaczono obszary ipsilateralne (czerwone) i kontralateralne (zielone), przyjmując obszar zawału na obrazie MRI jako punkt odniesienia. W przypadku podejścia z podziałem mózgu, załadowano 3D atlas mózgu myszy z podziałem lewym/prawym i dopasowano go do czaszki zdefiniowanej przez obraz CT. ROI mózgu wykorzystane do kwantyfikacji w tym 3D atlasie mózgu myszy obejmowały: korę lewą (ciemnoszary), hipokamp lewy (bławateczny niebieski), prążkowie lewe (głęboki róż), korę prawą (pomidorowa czerwień), hipokamp prawy (zielony) oraz prążkowie prawe (cyjan). Pobór [11Stężenie [C]DPA-713 w każdym z regionów wyznaczono w nCi/cm³ i następnie przeliczono na %ID/g poprzez normalizację do skorygowanej o rozpad dawki w momencie skanowania dla każdej myszy. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Obrazowanie PET/CT i analiza wykresów dla modelu dMCAO w porównaniu z grupą Sham; obejmuje wyniki dla ROI oraz podejścia z wykorzystaniem atlasu mózgu.
Rycina 3Reprezentatywny In vivo [11Przenikanie C]DPA-713 do mózgu u myszy z modelem DMCAO i myszy pozorowanych. (A) Dynamiczne obrazy PET/CT oraz krzywe aktywności tkankowej (TAC) wykazują zwiększone [11Wchłanianie C]DPA-713 w korze przeciwstawnej u myszy po DMCAO (n = 3) oraz niewielki wzrost u myszy z grupy sham (n = 3), przy czym u myszy po DMCAO stwierdzono istotnie większy kontrast w procentowej dawce wstrzykniętej pomiędzy obszarem zawału a przeciwległą stroną mózgu (%ID/g). (B) Ilościowa analiza PET (sumaryczna dla 50–60 min) wykazała istotnie zwiększone pobranie w obszarze zainteresowania (ROI) po stronie ipsilateralnej przy zastosowaniu metody ROI oraz w korze (Ctx) przy zastosowaniu metody atlasu mózgu z podziałem na półkule. Nie stwierdzono istotnych różnic w hipokampie (HC) ani w prążkowiu (Str). Zwiększone stosunki wartości ipsilateralnych do kontralateralnych zaobserwowano w obu podejściach analitycznych, jednak były one istotne statystycznie jedynie w obrębie Ctx przy zastosowaniu metody atlasu mózgu. *p <0.05), *** (p <0.001) Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Obrazowanie fluorescencyjne dMCAO w porównaniu z grupą Sham; wykres słupkowy porównujący poziomy wychwytu w %ID/g; analiza naukowa.
Rysunek 4: Reprezentatywny In vivo [11C] Wchłanianie C]DPA-713 przez śledzionę u myszy z modelem dMCAO oraz w grupie kontrolnej (Sham). (A) [11Dynamiczne obrazy PET/CT z zastosowaniem [C]DPA-713 przedstawiające obszary zainteresowania (ROI) śledziony u myszy z dMCAO (n = 3) oraz w grupie kontrolnej (sham, n = 3). (B) Wyniki ilościowe nie wykazują istotnych różnic w wychwycie przez śledzionę pomiędzy myszami z grupą dMCAO a grupą sham. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Obrazowanie jądrowe, mapa ciepła radioaktywności, schemat, obszary wysokiej i niskiej aktywności, naukowa wizualizacja danych.
Rysunek 5Reprezentatywne wyniki autoradiografii. Obrazy z cyfrowej autoradiografii wykazują zwiększoną [11Wchłanianie C]DPA-713 w półkuli ipsilateralnej w porównaniu z półkulą kontralateralną. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Prezentowany protokół opisuje metodę ilościowego oznaczania zapalenia układu nerwowego u myszy dMCAO i myszy pozorowanych przy użyciu [11C]DPA-713-PET. TSPO-PET jest najszerzej przebadanym biomarkerem obrazowym do wizualizacji i pomiaru zapalenia nerwów in vivo . Ekspresja TSPO jest regulowana w górę na gleju w mózgu podczas stanu zapalnego, co pozwala na nieinwazyjne wykrywanie i ilościowe określanie zapalenia nerwów. Co więcej, jest to technika wysoce przekładalna, co czyni ją cennym narzędziem zarówno w badaniach klinicznych, jak i przedklinicznych. Protokół ten i reprezentatywne wyniki podkreślają przydatność stosowania [11C]DPA-713 PET do wykrywania i monitorowania zmian neurozapalnych w udarze mózgu i innych zaburzeniach neurologicznych in vivo.

W tym badaniu operację dMCAO przeprowadzono przy użyciu 3-miesięcznych samic myszy C57BL/6. Model ten został wybrany, ponieważ powoduje wysoce powtarzalny zawał ograniczony do kory somatosensorycznej, zapewniając model trwałego ogniskowego niedokrwienia o niskiej zmienności w porównaniu z innymi modelami udaru (np . metoda włókien do zamknięcia tętnic środkowych mózgu (MCAO))14. Obrazowanie PET modeli udaru ma tę zaletę, że zawiera wewnętrzny region odniesienia w mózgu dla każdego zwierzęcia za pomocą ROI w półkuli przeciwległej. Ponieważ wystąpi pewien stan zapalny, który wynika z samej operacji, ważne jest, aby uwzględnić myszy, które przeszły pozorowaną operację, w ramach której wykonano kraniotomię i manipulację opon mózgowych bez niedrożności tętnic. Sama kraniotomia może spowodować zakłócenie leżącej poniżej tkanki neuronalnej i wprowadzenie patogenów prowadzących do odpowiedzi immunologicznej niezależnej od udaru20. W związku z tym spodziewany jest pewien stan zapalny po operacji pozorowanej i powinien być oceniany równolegle z dMCAO, aby wykluczyć możliwość sygnału spowodowanego samą operacją. Aby uniknąć uwzględnienia stanu zapalnego wynikającego z operacji bez udaru w analizie kohortowej dMCAO, należy przeprowadzić obrazowanie MR w celu potwierdzenia udanej operacji udaru mózgu i rozwoju zawału. MRI zapewnia również strukturalny układ odniesienia, który jest niezbędny do dokładnego narysowania ROI zawału i kontralateralnego. Ponadto dokładne przetwarzanie obrazu, w tym rejestracja obrazu i określenie zwrotu z inwestycji, jest niezbędne do zapewnienia wiarygodnej kwantyfikacji.

Należy pamiętać o dodatkowych ograniczeniach podczas pracy z radioznacznikami znakowanymi C-11 do badań PET i autoradiograficznych. Konieczne jest uwzględnienie krótkiego okresu półtrwania (20,33 min) C-11, przy czym jego stosowanie jest generalnie ograniczone do instytutów badawczych z dostępem do cyklotronu na miejscu. Odpowiednia trasa transportu radioaktywności, podanie dawki i punkty czasowe akwizycji muszą być określone z wyprzedzeniem wraz z wcześniej przygotowanym szczegółowym planem przebiegu eksperymentu, aby zespół mógł pracować szybko i wydajnie. Projekt i konfiguracja tego badania zostały nakreślone tak, aby umożliwić obrazowanie 4 myszy jednocześnie w celu zwiększenia ilości danych wyjściowych możliwych do uzyskania przy użyciu znacznika C-11. Jeśli to możliwe, zaleca się, aby wszystkie myszy zostały zkaniulowane i znajdowały się w trakcie tomografii komputerowej do czasu, gdy znacznik C-11 dotrze do placówki obrazowania, aby zapewnić minimalny zanik radioznacznika przed wstrzyknięciem. Ten protokół krok po kroku jest również najlepiej przeprowadzony przez zespół składający się z co najmniej 3 badaczy, aby umożliwić szybką kaniulację, pomiar dawki, wstrzyknięcie znacznika, skanowanie PET i sekcję mózgu przed znacznym rozpadem radioaktywnym. Wymaga dwóch osób do przeprowadzenia inicjacji skanowania PET i wstrzyknięcia wszystkim 4 myszom jednocześnie. Powodem rozpoczęcia pobierania PET tuż przed wstrzyknięciem jest zapewnienie dokładnego i pełnego uchwycenia farmakokinetyki i dynamiki dystrybucji znacznika we krwi i obszarach zainteresowania. Wiele kroków może wymagać energicznego treningu i praktyki, aby zapewnić płynny przebieg eksperymentu. W szczególności protokół ten zależy od udanej kaniulacji żył ogonowych myszy C57BL / 6, co może być trudne ze względu na ciemne włosy obecne na ich ogonach i może stać się trudniejsze po wystąpieniu udaru lub w przypadku obrazowania tych samych myszy w wielu punktach czasowych.

Kolejną kwestią związaną z obrazowaniem PET jest staranne rejestrowanie pomiarów dawki radioznacznika i aktywności resztkowej, w tym dokładnego czasu pomiaru. Ma to zasadnicze znaczenie dla dokładnej korekcji zaniku wstrzykniętej dawki w czasie skanowania i służy do uzyskania dokładnego pomiaru wychwytu znacznika (tj. % ID/g) dla każdego ROI. Konieczne jest poznanie dokładnej ilości radioaktywności, która była obecna w każdej myszy w czasie skanowania, aby zapewnić dokładną analizę obrazu. Dlatego zaleca się synchronizację zegarów na komputerze skanera i kalibratorze dawki, aby uniknąć błędów podczas stosowania krótkożyciowych izotopów, takich jak C-11.

Dokładna kwantyfikacja obrazu PET może być również ograniczona przez dokładność skanera i konfiguracji. Dlatego, aby zapewnić dokładną kwantyfikację obrazów PET/CT, ważne jest przeprowadzanie kontroli jakości zarówno dla komponentów CT, jak i PET skanera. Kontrole jakości CT obejmują kondycjonowanie źródła promieniowania rentgenowskiego, kalibrację ciemności/światła i przesunięcia środkowego. Kalibracje te mierzą i korygują szumy systemu i muszą być wykonane przed zakupem zgodnie z zaleceniami producenta skanera. Kalibracje należy również wykonać dla skanera PET. Zazwyczaj wiąże się to ze skanowaniem "standardowego/fantomowego PET", zawierającego znane stężenie radioaktywności. Przy przygotowywaniu wzorca najlepiej jest użyć tego samego radioizotopu, który został użyty w badaniu, dawki porównywalnej do tej podanej pojedynczej myszy w objętości zbliżonej do objętości ciała myszy oraz o tych samych parametrach akwizycji, co w obrazowaniu na zwierzętach. Strzykawka o pojemności 20 ml wypełniona radioznacznikiem rozcieńczonym w wodzie jest używana do wzorca w tym protokole, a późniejsze wyniki obrazowania PET służą do obliczenia współczynnika korekcyjnego na podstawie rzeczywistej dawki zmierzonej przez detektor kalibracyjny. Współczynnik korekcji można zastosować do danych obrazowych uzyskanych w eksperymencie, aby zapewnić dokładną kwantyfikację wychwytu znacznika w obszarach zainteresowania na obrazach PET. Uwzględnia to zakres pozytonów radionuklidu, a także wszelką aktywność tła obecną w dniu skanowania. Ponieważ kalibrator dawki jest integralną częścią generowania tego współczynnika korekcyjnego, konieczne jest, aby to urządzenie było również regularnie kalibrowane zgodnie z wytycznymi producenta.

Podczas przeprowadzania autoradiografii ex vivo ważne jest, aby wybrać optymalny punkt czasowy eutanazji po wstrzyknięciu, aby zapewnić wysoki sygnał do tła w obszarze (regionach) zainteresowania. Trzydzieści minut po wstrzyknięciu wybrano dla autoradiografii [11C]DPA-713 przy użyciu danych uzyskanych podczas dynamicznego obrazowania PET - tj. dynamicznych TAC in vivo jako wskazówki, biorąc pod uwagę również krótki okres półtrwania C-11 i czas potrzebny do przekroju i odsłonięcia tkanki mózgowej po ekstrakcji. Biorąc to pod uwagę, autoradiografia DPA-713 musi być wykonana na oddzielnej kohorcie myszy, aby umożliwić wstrzyknięcie wyższej dawki [11C]DPA-713 i 30-minutowy punkt czasowy na perfuzję i eutanazję w znieczuleniu. Przeprowadzenie małego badania pilotażowego PET in vivo z udziałem 3-4 myszy przed przeprowadzeniem autoradiografii ex vivo będzie pomocne w określeniu optymalnego punktu czasowego dla autoradiografii. Dodatkowym czynnikiem branym pod uwagę w przypadku autoradiografii ex vivo jest to, czy odzyskać myszy po wstrzyknięciu, czy też utrzymać je w znieczuleniu aż do eutanazji. Utrzymywanie ich w stanie znieczulenia naśladuje warunki skanowania i zapewnia, że dystrybucja radioznacznika lub kinetyka wydalania nie zostaną zmienione przez rekonwalescencję. Co więcej, zapobiega to dodatkowemu stresowi myszy, unikając rekonwalescencji i późniejszej indukcji. Wreszcie, użytecznym dodatkiem do protokołu ex vivo byłaby ocena regionalnych uszkodzeń w wycinkach mózgu używanych do autoradiografii za pomocą barwienia immunohistochemicznego (po rozpadzie promieniotwórczym) w celu wygenerowania obrazu o wysokiej rozdzielczości lokalizacji i objętości zawału.

Ponieważ istnieją ograniczenia związane z użyciem znacznika opartego na C-11, protokół ten można łatwo zmodyfikować do użytku ze znacznikiem TSPO opartym na F-18 (okres półtrwania 109,77 min), który może być bardziej odpowiedni w miejscach, w których nie ma cyklotronu na miejscu. Dodatkowo protokół ten opisuje użycie zestawu obrazowania z 4 myszami. Chociaż ta metoda o wysokiej przepustowości jest optymalna w przypadku korzystania ze znacznika C-11, protokół ten może być również zmodyfikowany dla osób korzystających z pojedynczych łóżek do obrazowania myszy. Staranne planowanie i konsekwentne szkolenie w technikach opisanych w tym protokole doprowadzi do wygenerowania bogactwa danych przy użyciu [11C]DPA-713, które można łatwo zastosować do badania roli zapalenia układu nerwowego w manifestacji i progresji choroby w innych modelach zaburzeń neurologicznych u gryzoni. Co więcej, technika ta może być wykorzystana do oceny odpowiedzi in vivo na leki immunomodulujące ukierunkowane na mikroglej/makrofagi.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować laboratorium Buckwaltera (szczególnie Dr. Toddowi Petersonowi) za dostarczenie modelu myszy i przeprowadzenie operacji dMCAO i pozorowanych. Dodatkowo chcielibyśmy podziękować Thomasowi Liguori z Invicro za jego pomoc techniczną z oprogramowaniem do analizy obrazu VivoQuant, dr Timowi Doyle'owi, dr Laurze Pisani, dr Frezghi Habte z ośrodka obrazowania małych zwierząt SCi3 w Stanford za ich rady i pomoc w opracowaniu tego protokołu obrazowania oraz ośrodkowi radiochemii (szczególnie dr Jun Park) za pomoc w syntezie [11C]DPA-713.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Skaner PET/CT InveonSiemensWersja 4.2
Skaner MRIVarian7 Oprogramowanie Telsa
ParaVisionBrukerWersja 6.0.1Oprogramowanie operacyjne MRI
Oprogramowanie VivoQuantInVicroWersja 2.5Oprogramowanie do analizy obrazu
Oprogramowanie Inveon Research WorkspaceSiemensWersja 4.2Oprogramowanie operacyjne skanera. Zawiera microQView, oprogramowanie do zarządzania post-processingiem
Kalibrator dawkiCapintechCRC-15
PET Obrazowanie fosforowe Typhoon 9410GE Healthcare8149-30-9410
Cewniki motylkoweSAI Infusion TechnologiesBFL-24Igła 27,5 G
Strzykawki 1 mlBD
Strzykawki insulinoweBD329461Strzykawki insulinowe 0,5 ml z igłą
Strzykawka 20 ml VWRBD302831BD Strzykawka z końcówką poślizgową z podziałką
Klej tkankowySanta Cruz Animal Healthsc-3619313 mL
Lampa grzewczaFluker270025,5-calowa lampa grzewcza dla z zaciskiem i przełącznikiem
0,9% sterylnej soli fizjologicznejPfizer00409-4888-100,9% chlorek sodu do wstrzykiwań, 10 ml
Smar do oczuWatson RugbyPV926977Maść do oczu ze sztucznymi łzami lubrykant, 1/8 uncji
Arkusze chłonne ChuxThermoFisher Scientific1420662Jednorazowa chłonna wyściółka
Nożyczki do irysówWorld Precision Instruments503708-1211,5 cm, Prosta, 12-pak
Taśma chirurgiczna3M Durapore1538-01/2" x 10 jardów rolka, jedwabna, hipoalergiczna
Mysz Łóżko PETW domu4 mysie łóżko PET
ZapalniczkaBicUDP2WMDC
IzofluranHenry ScheinNDC 11695-6776-2Izotezja, znieczulenie wziewne, 250 ml
tlenuPraxiarUN1072Kaseta
autoradiograficznaCole PalmerEW-21700-34Aluminium, 8 "x 10"
Film autoradiograficznyGE Life Sciences28-9564-78Ekran fosforowy do przechowywania BAS-IP SR 2025 E Super Resolution, 20 & razy; 25 cm, tylko ekran
Ostrza mikrotomuThermoFisher Scientific30-508-35MB35 Premier Jednorazowe, kąt cięcia 34&
MikrotomMicromHM 550
Szkiełka mikroskopoweFisher Scientific12-550-15Superfrost™ Szkiełka mikroskopowe
Plus OCT liquidVWR25608-930Preparat rozpuszczalnych w wodzie glikoli i żywic do kriostatu w temperaturach -10° C (14° F) i poniżej
Formy do zamrażaniaPoly sciences18646A-1Jednorazowe formy parafinowe
Saran wrapSaran25700001300
Środek dezynfekującyVirkon S
sprężonego gazu

Bibliografia

  1. Benjamin, E. J., et al. Heart disease and stroke statistics-2017 update: A report from the american heart association. Circulation. 135 (10), 146-603 (2017).
  2. Jin, R., Yang, G., Li, G. Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells. J Leukoc Biol. 87 (5), 779-789 (2010).
  3. Wang, Q., Tang, X. N., Yenari, M. A. The inflammatory response in stroke. J Neuroimmunol. 184 (1-2), 53-68 (2007).
  4. Brown, R. C., Papadopoulos, V. Role of the peripheral-type benzodiazepine receptor in adrenal and brain steroidogenesis. Int Rev Neurobiol. 46, 117-143 (2001).
  5. Papadopoulos, V., Lecanu, L., Brown, R. C., Han, Z., Yao, Z. X. Peripheral-type benzodiazepine receptor in neurosteroid biosynthesis, neuropathology and neurological disorders. Neuroscience. 138 (3), 749-756 (2006).
  6. Scarf, A. M., Kassiou, M. The translocator protein. J Nucl Med. 52 (5), 677-680 (2011).
  7. Cerami, C., Perani, D. Imaging neuroinflammation in ischemic stroke and in the atherosclerotic vascular disease. Curr Vasc Pharmacol. 13 (2), 218-222 (2015).
  8. Stefaniak, J., O'Brien, J. Imaging of neuroinflammation in dementia: a review. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 87 (1), 21-28 (2016).
  9. Gerhard, A. TSPO imaging in parkinsonian disorders. Clin Transl Imaging. 4, 183-190 (2016).
  10. Airas, L., Rissanen, E., Rinne, J. O. Imaging neuroinflammation in multiple sclerosis using TSPO-PET. Clin Transl Imaging. 3, 461-473 (2015).
  11. Fan, J., Lindemann, P., Feuilloley, M. G., Papadopoulos, V. Structural and functional evolution of the translocator protein (18 kDa). Curr Mol Med. 12 (4), 369-386 (2012).
  12. James, M. L., et al. Synthesis and in vivo evaluation of a novel peripheral benzodiazepine receptor PET radioligand. Bioorg Med Chem. 13 (22), 6188-6194 (2005).
  13. Boutin, H., et al. 11C-DPA-713: A novel peripheral benzodiazepine receptor PET ligand for in vivo imaging of neuroinflammation. J Nucl Med. 48 (4), 573-581 (2007).
  14. Doyle, K. P., Buckwalter, M. S. A mouse model of permanent focal ischemia: distal middle cerebral artery occlusion. Methods Mol Biol. 1135, 103-110 (2014).
  15. Wang, Y., et al. [(18)F]DPA-714 PET imaging of AMD3100 treatment in a mouse model of stroke. Mol Pharm. 11 (18), 3463-3470 (2014).
  16. Domercq, M., et al. PET Imaging with [(18)F]FSPG evidences the role of system xc(-) on brain inflammation following cerebral ischemia in rats. Theranostics. 6 (11), 1753-1767 (2016).
  17. Toth, M., et al. Acute neuroinflammation in a clinically relevant focal cortical ischemic stroke model in rat: longitudinal positron emission tomography and immunofluorescent tracking. Brain Struct Funct. 221 (3), 1279-1290 (2016).
  18. Walter, H. L., et al. In vivo analysis of neuroinflammation in the late chronic phase after experimental stroke. Neuroscience. 292, 71-80 (2015).
  19. Rojas, S., et al. Imaging brain inflammation with [(11)C]PK11195 by PET and induction of the peripheral-type benzodiazepine receptor after transient focal ischemia in rats. J Cereb Blood Flow Metab. 27 (12), 1975-1986 (2007).
  20. Glazier, S. S., O'Rourke, D. M., Graham, D. I., Welsh, F. A. Induction of ischemic tolerance following brief focal ischemia in rat brain. J Cereb Blood Flow Metab. 14 (4), 545-553 (1994).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

PET TSPObia ko translokatoroweautoradiografiarodkowa t tnica m zgowaanaliza obrazu
Obrazowanie PET zapalenia układu nerwowego przy użyciu [11C] DPA-713 w mysim modelu udaru niedokrwiennego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.