Artykuł metodologiczny

Izolacja i charakterystyka mezenchymalnych komórek zrębowych serca z próbek bioptycznych endomięśnia sercowego pacjentów z kardiomiopatią arytmogenną

DOI:

10.3791/57263

⸱

28 lutego 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Vascular Biology and Regenerative Medicine Unit, Centro Cardiologico Monzino-IRCCS, 2Department of Clinical Sciences and Community Health, Università degli Studi di Milano, 3Heart Rhythm Center, Centro Cardiologico Monzino-IRCCS

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym artykule przedstawiono metodę izolowania mezenchymalnych komórek zrębu serca z próbek bioptycznych endomiokardiów pacjentów z kardiomiopatią arytmogenną. Opisano ich charakterystykę oraz protokół zwiększający ich różnicowanie adipogenne.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Normalne dorosłe serce składa się z kilku różnych typów komórek, wśród których obfitą populację stanowią mezenchymalne komórki zrębu serca. Izolacja tych komórek daje możliwość zbadania ich udziału w chorobach serca, a ponadto stanowi użyteczny pierwotny model komórkowy do badania mechanizmów biologicznych.

Tutaj opisana jest metoda izolacji C-MSC z próbek bioptycznych pacjentów z kardiomiopatią arytmogenną. Pobieranie próbek z biopsji endomiokardialnej odbywa się w prawych obszarach komorowych przylegających do blizny, które są uwidocznione za pomocą mapowania elektroanatomicznego. Opisano trawienie biopsji w kolagenazie i ich posiewanie na plastikowym naczyniu w pożywce hodowlanej w celu umożliwienia wzrostu C-MSC. Wyizolowane komórki mogą być namnażane w hodowli przez kilka pasaży. Aby potwierdzić ich fenosymalny fenotyp, przedstawiono opis charakterystyki immunofenotypowej. C-MSC są zdolne do różnicowania się w kilka typów komórek, takich jak adipocyty, chondrocyty i osteoblasty: w kontekście ACM, charakteryzującego się złogami adipocytów w sercach pacjentów, opisano protokoły adipogennego różnicowania C-MSC i charakterystykę akumulacji kropelek lipidów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mezenchymalne komórki zrębowe (MSC) to dorosłe komórki pełniące ważną funkcję wspomagającą w wielu tkankach1. Szpik kostny stanowi historyczne źródło MSC, ale można go wyizolować z różnych tkanek, w tym łożyska, tkanki tłuszczowej, krwi pępowinowej, wątroby i serca1,2.

W 2006 roku Międzynarodowe Towarzystwo Terapii Komórkowej (ISCT) po raz pierwszy określiło minimalne kryteria definiowania ludzkiego MSC3. W szczególności MSC musi mieć zdolność przylegania do plastiku. Wyrażają one specyficzne antygeny powierzchniowe: dodatniość dla markerów mezenchymalnych CD44, CD105, CD29 i CD90 oraz ujemność dla markerów hematopoetycznych i śródbłonka CD14, CD45, CD34, CD31 charakteryzuje MSC. Ze względu na brak ekspresji HLA-DR, MSC nie są w stanie wyzwolić alloreaktywności. Co więcej, są to komórki multipotencjalne z potencjałem różnicowania się w kierunku linii adipogennych, chondrocytów i osteoblastów1,3.

Skupiając się na składzie komórkowym serca, mezenchymalne komórki zrębowe serca (C-MSC) występują w obfitości u normalnego dorosłego serca4,5. Odgrywają kluczową rolę zarówno w prawidłowej funkcji serca, jak i stanach patologicznych. Podczas gdy fizjologicznie C-MSC zapewnia mikrośrodowisko, które wspiera strukturalną i funkcjonalną integralność mięśnia sercowego, w chorobach serca są one aktywowane w odpowiedzi na uszkodzenie serca, uczestnicząc w gojeniu się ran i przebudowie zwłóknienia6,7.

Ostatnio wykazano udział C-MSC w substytucji tkanki tłuszczowej w kardiomiopatii arytmogennej (ACM)8. W szczególności ACM jest zaburzeniem genetycznym spowodowanym głównie przez mutacje w genach desmosomalnych, które prowadzą do wymiany włóknisto-tłuszczowej mięśnia sercowego, głównie w prawej komorze 9. Ta substytucja, rozciągająca się od nasierdzia do wsierdzia, tworzy nieprzewodzący substrat, który wywołuje postępującą niewydolność serca i pogarsza arytmie komorowe, co w ciężkich przypadkach może prowadzić do nagłej śmierci. Sommariva i wsp. wykazały mezenchymalne pochodzenie preadipocytów obecnych w eksplantowanych wycinkach serca pacjentów z ACM. Co więcej, C-MSC wyizolowany z biopsji endomięśnia sercowego ACM wykazuje ekspresję genów desmosomalnych i dlatego mogą być dotknięte ich mutacjami. W szczególności w warunkach adipogennych ACM C-MSC gromadzi więcej lipidów niż te z serca kontrolnego. Dowody te prowadzą do wniosku, że C-MSC odgrywają aktywną rolę w patogenezie choroby i stanowią ważny model komórkowy do badania ACM.

Aby ułatwić przyszłe badania w tym kontekście lub w innych chorobach serca, dla których wskazana jest biopsja serca, przedstawiono szczegółowy protokół izolacji C-MSC z małych fragmentów tkanki endomięśnia sercowego, ich ekspansji, charakterystyki immunofenotypowej i różnicowania adipogennego.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To podejście jest zgodne z Deklaracją Helsińską, a pobieranie próbek z prawej komory zostało zatwierdzone (07/06/2012) przez Komitet Etyki "Centro Cardiologico Monzino IRCCS".

1. Rozwiązania

  1. Przygotuj pożywkę TMES do hodowli C-MSC z modyfikowaną pożywką Dulbecco firmy Iscove (IMDM), uzupełnioną 20% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 10 ng / ml podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów, 10 000 U/ml penicyliny, 10 000 μg / ml streptomycyny i 0,02 M L-glutaminy. Przefiltrować podłoże TMES za pomocą sterylnego filtra 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  2. Aby przygotować roztwór kolagenazy, należy ponownie zawiesić mieszaninę kolagenazy NB4 w pożywce IMDM, aby uzyskać końcowy roztwór o stężeniu 3 mg/ml. Delikatnie przemieszać, aby rozpuścić proszek, i przefiltrować roztwór kolagenazy za pomocą filtra strzykawkowego 0,2 μm. Porcję objętości 1 ml rozlać do sterylnych probówek o pojemności 2 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
  3. Aby przygotować pożywkę T. ADIPO, należy przygotować pożywkę adipogenną z pożywką IMDM uzupełnioną 10% FBS, 0,5 mM 3-izobutylo-1-metyloksantyny (wstępnie rozcieńczonej dimetylosulfotlenkiem (DMSO) w stężeniu 0,5 M i przechowywanej w temperaturze -20 °C do momentu użycia), 1 μM hydrokortyzonu (wstępnie rozcieńczonego w DMSO w 100 mM i dalej rozcieńczonego do 10 mM w sterylnej wodzie destylowanej i przechowywanego w temperaturze -20 °C do momentu użycia) i 0,1 mM indometacyny (wstępnie rozcieńczonej w DMSO w temperaturze stężenia 0,5 M i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia). Przefiltrować pożywkę T. ADIPO za pomocą sterylnego filtra 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  4. Przygotować bufor do przemywania składający się z buforowanej fosforanem soli fizjologicznej 0,0067 M PO4 (PBS), kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) 5 mM i 5% albuminy surowicy bydlęcej i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  5. Przygotować roztwór roboczy czerwieni olejowej O (ORO), rozpuszczając 1% proszku ORO w 60% izopropanolu, mieszając przez 2 godziny i filtrując za pomocą jednostki filtrującej 0,22 μm w celu usunięcia osadów. Roztwór roboczy należy przechowywać w temperaturze pokojowej (RT).

2. Izolacja mezenchymalnych komórek zrębowych serca

  1. Pobieranie i przetwarzanie biopsji serca
    Uwaga:     Przed rozpoczęciem upewnij się, że masz gotowy roztwór kolagenazy i podłoże TMES.
    1. Umieścić biopsję endomięśnia sercowego ACM (zwykle około 5 mg tkanki) w sterylnej probówce wypełnionej TMES i przetransportować ją do laboratorium.
      nuta: Biopsje ACM są pobierane na sali operacyjnej elektrofizjologii, zgodnie z wcześniejszymi raportami10. Krótko mówiąc, integracja mapowania elektroanatomicznego i echokardiografii wewnątrzsercowej w prawej komorze (patrz Wideo 1) służy do prowadzenia biopsji endomiokardialnej (patrz Wideo 2, fluoroskopia) w odpowiedzi na strefę graniczną chorego mięśnia sercowego. Próbki Healthy Control (HC) są dostarczane z biobanku tkanek, pobierane ze ściany wolnej prawej komory dawcy zwłok w ciągu 24 godzin od zgonu (śmierć przypadkowa, osoby zdrowe). Podczas transportu i przed sekcją należy przechowywać biopsję w TMES w temperaturze 4 °C. Należy ograniczyć czas między pobraniem biopsji a przetworzeniem tkanki (maks. 24 godziny).
    2. Skonfiguruj komorę bezpieczeństwa biologicznego z wymaganymi roztworami, aby przeprowadzić procedurę aż do trawienia enzymatycznego.
    3. Umieść sterylizator pod maską i włącz instrument na 15 minut przed użyciem, aż temperatura wzrośnie o 200 - 250 °C.
    4. Sterylizuj nożyczki i pęsetę przez 10 sekund. Przed użyciem upewnij się, że wysterylizowane narzędzia są zimne. Przygotuj jednorazowe sterylne skalpele.
    5. Umieść probówki z biopsją w sterylnym kapturze. Otwórz probówkę i przenieś biopsję na sterylną płytkę.
    6. Dwukrotnie przemyć biopsję prawej komory 3 ml sterylnego PBS. Jeśli chcesz, zrób zdjęcie biopsji pod mikroskopem.
    7. Przenieś biopsję prawej komory za pomocą sterylnej pęsety do sterylnej probówki o pojemności 2 ml zawierającej 1 ml roztworu kolagenazy.
    8. Pokrój próbkę na0,5 - 1 mm 3 kawałki sterylnymi nożyczkami.
    9. Inkubować przez 1,5 godziny w temperaturze 37 °C przy ciągłym mieszaniu rotacyjnym.
    10. Odwirować przefermentowany roztwór o stężeniu 400 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    11. Usunąć supernatant i dodać 1 ml sterylnego PBS w celu przepłukania osadu.
    12. Wirować przy 400 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    13. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml pożywki TMES.
    14. Otrzymaną zawiesinę należy umieścić na sterylnej 60-milimetrowej płytce poddanej działaniu kultur tkankowych i dodać pożywkę TMES do końcowej objętości 3 ml. Inkubować płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C z 5% CO2,
      nuta: Większa objętość podłoża może uniemożliwić prawidłowe przyleganie strawionych fragmentów biopsji.
    15. Po 24 godzinach wyrzuć pożywkę, aby usunąć nieprzylegające komórki i zanieczyszczenia.
      nuta: Pojedyncze zdysocjowane komórki mezenchymalne mogą przyczepiać się do powierzchni tworzywa sztucznego i dawać początek klonom; Również niestrawione małe fragmenty biopsji mogą przyczepić się do plastikowego naczynia i umożliwić kiełkowanie komórek.
    16. Umyj płytkę dwukrotnie 5 ml sterylnego PBS i dodaj 3 ml świeżej pożywki TMES.
    17. Pożywkę TMES należy wymieniać trzy razy w tygodniu, aż komórki będą zlewane w 80%.
      nuta: Liczba przyłączonych komórek zależy od jakości, ilości tkanki oraz od efektywności trawienia.

3. Ekspansja komórek

Uwaga: Zanim zaczniesz, upewnij się, że masz przygotowane medium TMES.

  1. Gdy komórki są w 80% zlewne, przenieś strawione małe próbki bioptyczne na nową sterylną płytkę 60 mm poddaną działaniu kultur tkankowych i dodaj 3 ml świeżej pożywki TMES.
    nuta: Próbki biooptyczne mogą być ponownie wykorzystane do dalszej izolacji C-MSC. Możliwe jest powtarzanie tej procedury, aż do uzyskania znacznej liczby izolowanych komórek.
  2. Umyj przyczepione komórki dwukrotnie 3 ml sterylnego PBS. Dodać roztwór trypsyny-EDTA (0,5 ml na naczynie o średnicy 60 mm) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 3-5 minut, aby umożliwić oderwanie komórek.
  3. Gdy komórki zostaną oderwane od powierzchni płytki, dodaj 0,5 ml sterylnego FBS, aby dezaktywować trypsynę i zebrać komórki do nowej sterylnej probówki o pojemności 50 ml.
  4. Umyj płytkę dwukrotnie 5 ml sterylnego PBS, aby dodać pozostałe komórki do tej samej probówki.
  5. Odwirować komórki przy 400 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml pożywki TMES.
  7. Załadować 10 μl zawiesiny komórek do komory zliczania komórek.
    nuta: Jeżeli komórki są zbyt skoncentrowane, rozcieńczyć zawiesinę początkową w stosunku 1:10 w PBS i załadować 10 μl rozcieńczonych komórek do komory zliczania komórek.
  8. Pod mikroskopem policz komórki w 3 dużych kwadratach i na liniach dwóch ich boków i oblicz średnią liczbę komórek.
    nuta: Aby uzyskać liczbę komórek/ml, średnią zliczonych komórek mnoży się przez 104, współczynnik rozcieńczenia komory zliczania komórek. Jeżeli komórki zostały jeszcze bardziej rozcieńczone, pomnożyć przez współczynnik rozcieńczenia. Stosunek liczby komórek do zasiewu do stężenia komórek (liczba komórek/ml) odpowiada objętości (w ml) zawiesiny początkowej, która ma być posiana do następnego etapu (ppkt 3.9).
  9. Zawiesinę należy umieścić na sterylnych płytkach poddanych działaniu kultur tkankowych o średnicy 100 mm w końcowym stężeniu 5 000 - 10 000 komórek/cm2 i dodać pożywkę TMES do końcowej objętości 8 ml. Inkubować płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych.
    nuta: Powtórz procedurę ekspansji komórek, gdy komórki zlewają się w 70 - 80%. Przy każdym pasażu (P) zaleca się krioprezerwację części komórek i pokrycie pozostałej ilości. Rozpręż komórki do P3 lub P4 i użyj do analizy sortownika komórek aktywowanego fluorescencyjnie (FACS) (sekcja 4) i różnicowania adipogennego (sekcja 5).
  10. W celu kriokonserwacji po odłączeniu odwirować komórki przy 400 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  11. Policz komórki zgodnie z opisem (kroki 3.7 - 3.8) i ponownie zawieś 1 x 106 komórek w 900 μl sterylnego FBS. Przenieść do sterylnej kriofiolki i dodać 100 μl sterylnego DMSO i wymieszać.
  12. Szybko przechowywać kriofiolki w pojemniku do zamrażania w temperaturze -80 °C przez co najmniej 2 dni, a następnie przenieść fiolki do ciekłego azotu.

4. Charakterystyka mezenchymalnych komórek zrębowych serca za pomocą cytometrii przepływowej

Uwaga: Zanim zaczniesz, upewnij się, że masz przygotowany odczynnik do dysocjacji komórek, bufor do przemywania i specyficzne przeciwciała.

  1. Gdy liczba komórek osiągnie co najmniej 3 x 106 (policzyć komórki zgodnie z opisem w ppkt 3.7 - 3.8), umyć płytkę o średnicy 100 mm dwukrotnie 10 ml sterylnego PBS.
  2. Dodać 5 ml odczynnika do dysocjacji komórek i odczekać 7 - 10 minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić odłączenie komórki.
  3. Po oderwaniu komórek od powierzchni płytki dodać 15 ml sterylnego buforu do przemywania i zebrać zawiesinę do nowej sterylnej probówki o pojemności 50 ml.
  4. Przemyć płytkę dwukrotnie 10 ml buforu do przemywania i dodać pozostałe komórki do tej samej probówki.
  5. Odwirować komórki przy 400 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej i ponownie zawiesić osad w 1 ml buforu do przemłukiwania.
  6. Policz komórki zgodnie z opisem (kroki 3.7 - 3.8) i przenieś 3 x 106 komórek do nowej sterylnej probówki i dodaj bufor do przemywania do końcowej objętości 1,5 ml.
    nuta: Całkowita liczba komórek i całkowita objętość buforu płuczącego zależy od liczby wybranych markerów użytych do analizy (3 x 10,5 komórek po 100 μL na każdą rurkę polistyrenową FACS).
  7. Rozprowadzić 100 μl zawiesiny komórkowej w 12 różnych probówkach polistyrenowych FACS i dodać specyficzne przeciwciało w stężeniu wskazanym w karcie katalogowej produktu.
    nuta: Przeciwciała stosowane do charakterystyki C-MSC to CD34, CD105, CD45, CD29, CD90, CD44, CD31, CD14 i HLA-DR (Tabela 1). Ważne jest, aby przygotować próbkę kontrolną składającą się ze 100 μl zawieszonych komórek wybarwionych kontrolą izotypu w celu sprawdzenia specyficzności sygnału.
  8. Próbki należy inkubować przez 15 minut w ciemności.
  9. Dodaj 1 ml sterylnego buforu do przemywania do każdej probówki, aby zatrzymać reakcję.
  10. Odwirować komórki przy 400 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  11. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 250 μl buforu do mycia.
  12. Przejdź do charakterystyki C-MSC za pomocą cytometrii przepływowej.

5. Adipogenne różnicowanie mezenchymalnych komórek zrębowych serca

Uwaga: Zanim zaczniesz, upewnij się, że przygotowałeś roztwór roboczy T. ADIPO i ORO.

  1. Hodowla w pożywce T. ADIPO
    1. Odłączyć i policzyć komórki zgodnie z opisem w sekcji 3.
    2. Płytka 3 x 105 komórek na każdym dołku sterylnej 6-dołkowej płytki poddanej działaniu kultur tkankowych w 2 ml pożywki T. ADIPO.
    3. Pozwól C-MSC rozróżnić się w pożywce T. ADIPO przez 72 godziny lub 1 tydzień, zmieniając pożywkę co 2 - 3 dni.
  2. Barwienie czerwienią olejową O
    Uwaga:     Użyj barwienia czerwienią olejową O (ORO), aby przetestować akumulację lipidów w C-MSC.
    1. Umieścić 6-dołkową płytkę do hodowli tkankowej pod wyciągiem.
    2. Usunąć podłoże adipogenne i przemyć komórki dwukrotnie 2 ml PBS.
    3. Dodaj wystarczającą ilość 4% paraformaldehydu (PFA), aby pokryć każdą studzienkę. Napraw ogniwa na 5 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Wyrzuć PFA i umyj komórki dwukrotnie 2 ml PBS.
    5. Inkubować stałe komórki z roztworem roboczym ORO przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, używając wystarczającej objętości, aby pokryć każdą studzienkę.
      nuta: Nie należy trzymać 6-dołkowej płytki do hodowli tkankowej pod wyciągiem podczas inkubacji ORO, aby uniknąć odparowania roztworu roboczego ORO.
    6. Usunąć cały roztwór roboczy ORO i przemyć 2 ml PBS 3 - 5 razy, aż płytka zostanie całkowicie oczyszczona; wyrzucić myte płyny. Przerwij płukanie, gdy użyty PBS jest czysty i gdy nie widzisz, pod mikroskopem, niespecyficznego zabarwienia komórek.
    7. Uchwyć 20 obrazów w 20-krotnym powiększeniu dla każdej studzienki za pomocą mikroskopu z odwróconą kulturą tkankową z kontrastem fazowym.
    8. Otwórz zdjęcia za pomocą programu do przetwarzania obrazu, aby określić ilościowo akumulację ORO komórki.
    9. Oddziel różne kanały kolorów za pomocą funkcji "podziel kanały", aby określić ilościowo tylko luminancję w kanale 255-czerwonym.
    10. Policz liczbę komórek na każdym obrazie, licząc jądra. Normalizuj intensywność sygnału ORO na numerze komórki.
    11. Obliczyć średnią wyników uzyskanych dla każdego obrazu tej samej próbki.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Izolacja komórek zrębu serca: Izolacja C-MSC z procedury biopsji endomiokardialnej jest podsumowana w Rysunek 1.

Charakterystyka mezenchymalna komórek zrębu serca: Zgodnie z ustaleniami Międzynarodowego Towarzystwa Terapii Komórkowej (ISCT), minimalne kryteria definiowania multipotencjalnych mezenchymalnych komórek zrębowych obejmują ich charakterystykę immunofenotypową3. W szczególności, aby potwierdzić ich mezenchymalną linię, komórki są inkubowane z odpowiednimi przeciwciałami sprzężonymi z FITC/PE/APC i analizowane za pomocą cytometrii przepływowej. Wszystkie przeciwciała użyte w charakterystyce C-MSC są wymienione w Tabeli Materiałów.

Jak pokazano w Rysunek 2, C-MSC uzyskane z biopsji są dodatnie dla specyficznych mezenchymalnych antygenów powierzchniowych CD29, CD44 i CD105. Odsetek komórek CD90 dodatnich jest zmienny, jak zgłoszono wcześniej11. Markery śródbłonka (CD31, CD34), monocytów/makrofagów (CD14), hematopoetycznych (CD45) i głównego kompleksu zgodności tkankowej (HLA-DR) nie są wyrażane (Figura 2).

Adipogenne różnicowanie mezenchymalnych komórek zrębu serca: Aby przyspieszyć ich różnicowanie adipogenne, C-MSC uzyskane od pacjentów dotkniętych ACM i HC muszą być hodowane w pożywce T. ADIPO (patrz sekcja Rozwiązania). Komórki utrzymuje się w hodowli przez 72 godziny lub 1 tydzień, wymieniając pożywkę dwa razy w tygodniu.

Nagromadzenie wewnątrzkomórkowych kropelek lipidów jest potwierdzone przez barwienie ORO (Rysunek 3). Różnice w zdolności, a także w stopniu zróżnicowania można zaobserwować pomiędzy komórkami uzyskanymi z ACM i HC. Jak pokazano na reprezentatywnych obrazach, ACM C-MSC gromadzi więcej kropelek lipidów niż HC C-MSC po 72 godzinach hodowli w pożywce adipogenicznej (Rysunek 3). Różnice te utrzymują się również wtedy, gdy komórki są narażone na warunki różnicowania adipogennego przez dłuższy okres (1 tydzień) (Ryc. 3).

figure-results-1
Wideo 1: Integracja mapy elektroanatomicznej i echokardiografii wewnątrzsercowej. Jednobiegunowe mapy elektroanatomiczne wsierdzia prawej komory (lewy przedni skośny i prawy przedni skośny) u pacjenta poddawanego biopsji endomiokardialnej (dolne panele). Ograniczone obszary niskiego napięcia (czerwony/zielony) są widoczne na wierzchołku. Próbki biotoptyczne endomięśnia sercowego (oznaczone jako koło) są pobierane w korespondencji z chorym mięśniem sercowym i przegrodą międzykomorową. Echokardiografia wewnątrzsercowa w czasie rzeczywistym pozwala na sprawdzenie prawidłowego położenia bioptomu w obszarze docelowym (górny panel). Kliknij tutaj, aby obejrzeć ten film. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.)

figure-results-2
Wideo 2: Film fluoroskopii w prawym skośnym przednim. Bioptomium wprowadza się przez długo odchylaną osłonkę i wprowadza do komory. Po dokładnym sprawdzeniu kontaktu bioptomu z mięśniem sercowym, szczęki są otwierane, a następnie mocno zamykane w celu pobrania próbki. Kliknij tutaj, aby obejrzeć ten film. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.)

figure-results-3
Rysunek 1: Projekt procedury. Próbka biopryczna endomiocardialna jest pobierana za pomocą cewnika bioptomowego, małego narzędzia tnącego w kształcie szczypiec. Masa uzyskanej biopsji wynosi około 5 mg (A). Próbkę bitopową endomiokardialną miele się na 0,5 - 1 mm3 fragmenty za pomocą sterylnych nożyczek (B) i dodaje się roztwór kolagenazy. Próbkę umieszcza się w inkubatorze o temperaturze 37 °C na mieszalniku z platformą obrotową na 1,5 godziny mineralizacji (C). Przefermentowany roztwór jest odwirowywany i platerowany w TMES w plastikowym naczyniu (D). C-MSC uzyskuje się dzięki ich właściwościom przylegania do plastyczności zarówno w pojedynczych komórkach, jak i klonach, lub kiełkując z małych, niestrawionych fragmentów bioptycznych (E). C-MSC są następnie charakteryzowane za pomocą cytometrii przepływowej (F). C-MSC są powlekane w pożywce adipogennej, a akumulacja kropelek lipidów jest testowana za pomocą barwienia czerwienią olejową O (G). Podziałka skali wskazuje 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 2: Reprezentatywny profil cytofluorymetryczny C-MSC. Każdy histogram pokazuje liczbę komórek w funkcji intensywności fluorescencji we wskazanym kanale (PE: fikoerytryna; APC: allofikocyjanina; FITC: izotyocyjanian fluoresceiny). Na każdym wykresie pokazana jest kontrolna izotyp (biały) i próbka sprzężona z przeciwciałem przeciwko specyficznemu markerowi powierzchni komórki (czerwony). C-MSC są dodatnie dla mezenchymalnych antygenów powierzchniowych CD29, CD44, CD105 i częściowo dla CD90, podczas gdy nie wykazują ekspresji CD31, CD34, CD14, CD45 i HLA-DR. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 3: Adipogenne różnicowanie C-MSC. Reprezentatywne obrazy ACM i HC C-MSC, hodowane w pożywce adipogennej przez 72 godziny i 1 tydzień, barwione ORO (zdjęcia po lewej; n = 3). Na wykresach po prawej stronie przedstawiono kwantyfikację luminancji barwienia 255-kanałowego koloru czerwonego: intensywność jest wyrażona w dowolnych jednostkach (A.U.). ACM C-MSC gromadzi więcej kropelek lipidów niż kontrole. Zastosowano test T Studenta, *: p < 0,05. Podziałka skali wskazuje 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MSC oraz C-MSC: MSC to komórki multipotencjalne rezydujące we frakcji zrębu różnych tkanek dorosłych, takich jak szpik kostny, tkanka tłuszczowa, chrząstki, mózg, skóra, aneksy płodowe i serce12. Przeprowadzono różne badania w celu wyizolowania i scharakteryzowania ich pod kątem potencjalnych zastosowań w badaniach podstawowych i translacyjnych12,13.

W zdrowych warunkach MSC są spokojne, samoodnawiają się w niskich odstępach14. Ponieważ są one narażone na patologiczne zmiany środowiskowe, reagują, sprzyjając przebudowie tkanek poprzez bezpośrednią transdyferencjację, osadzanie się macierzy lub efekt parakrynny14.

MSC SERCA (C-MSC) reprezentują dużą populację komórek serca niebędących miocytami4. Pochodzą z nasierdzia i migrują do mięśnia sercowego, przechodząc proces przejścia nabłonkowego do mezenchymalnego15. Przyczyniają się do mechanicznej i elektrycznej integralności struktury serca, zarówno w stanach fizjologicznych, jak i patologicznych, poprzez interakcje z kardiomiocytami i homeostazą macierzy zewnątrzkomórkowej 7,16. Jednak szeroki zakres funkcji C-MSC nadal nie jest w pełni zrozumiały. Pogłębienie wiedzy na temat ich roli zarówno w stanach fizjologicznych, jak i patologicznych mogą ułatwić badania in vitro przeprowadzone po ich izolacji.

C-MSC uzyskano z różnych obszarów ludzkiego serca, takich jak uszek przedsionkowy 2,17 i prawa komora18.

Ostatnio uzyskano C-MSC z bioptycznych próbek endomięśnia sercowego prawej komory serca człowieka8, co pokazuje, że tkanka źródłowa może mieć zaledwie 3-5 mg.

Możliwe zastosowania: Metoda opisana w tym manuskrypcie pozwala na uzyskanie komórek z kilkoma prostymi pasażkami, takimi jak trawienie i selekcja pod kątem przylegania do plastiku, z bardzo małych próbek serca.

C-MSC można uznać za model komórkowy, ponieważ są one łatwe do amplifikacji i utrzymania in vitro oraz są zdolne do różnicowania się w komórki linii mezenchymalnej (śródbłonek, osteocyty i adipocyty). Co więcej, możliwość pozyskiwania komórek bezpośrednio od pacjentów stanowi doskonałe narzędzie in vitro do badań mechanistycznych w kontekście medycyny spersonalizowanej/precyzyjnej. Rzeczywiście, komórki te przenoszą tło genetyczne i ostatecznie specyficzne mutacje dawców i są pod wpływem specyficznych cech pacjentów, takich jak warunki kliniczne, wiek, płeć, styl życia i leki. Co więcej, możliwość sortowania ich pod kątem różnych markerów może pozwolić na badanie określonych podzbiorów C-MSC19.

C-MSC są znani z tego, że są aktywnymi graczami w różnych chorobach sercowo-naczyniowych, głównie charakteryzujących się niekorzystną przebudową serca. W związku z tym stanowią one potencjalne cele dla nowych strategii terapeutycznych mających na celu przeciwdziałanie chorobom serca 8,20.

Właściwości C-MSC podobne do łodyg i brak ich znaczącej immunogenności sugerują ich potencjalne zastosowanie w terapii komórkowej w medycynie regeneracyjnej serca. Rzeczywiście, podobnie jak MSC ze szpiku kostnego lub innych źródeł, C-MSC może być potencjalnie stosowany zarówno w warunkach autologicznych, jak i allogenicznych, bez konieczności dopasowania między dawcą a biorcą21.

Co więcej, C-MSC, izolowany bezpośrednio z tkanki serca, ma tę zaletę, że jest wstępnie uwarunkowany przez mikrośrodowisko serca i profil epigenetyczny. W kontekście medycyny regeneracyjnej serca może to być szczególnie ważne dla uzyskania pomyślnych wyników.

Dotychczasowe badania przedkliniczne medycyny regeneracyjnej wykazały użyteczny potencjał terapeutyczny C-MSC i jego parakrynną aktywność 18,22,23. Co ważne, badania kliniczne, w których źródłem komórek jest serce, są prowadzone albo na komórkach pochodzących z kardiosfery, albo na subpopulacjach C-MSC 13,24,25. Jednakże, jeśli chodzi o MSC pochodzące ze szpiku kostnego, mogą być konieczne różne protokoły w celu uzyskania stopnia klinicznego C-MSC26.

C-MSC w ACM: Prezentowany protokół nadaje się głównie do badania patologii, dla których wskazana jest biopsja wsierdzia. Pacjenci z ACM poddawani są zabiegom bioptycznym w celach diagnostycznych27. Ich mięsień sercowy jest stopniowo zastępowany przez tkankę bliznowatą, elektrycznie obojętną tkankę złożoną z adipocytów i zwłóknienia. W celu poprowadzenia próbki bioptycznej do obszaru blizny, gdzie wydajność diagnostyczna jest maksymalna, stosuje się mapowanie endomięśnia sercowego 10,28,29. Próbki wykorzystywane w niniejszym protokole pobiera się w strefie granicznej chorego mięśnia sercowego.

Sommariva i wsp. zdefiniowali ostatnio kluczową rolę C-MSC w patogenezie ACM8, wykazując, że C-MSC są aktywnymi uczestnikami adipogenezy serca ACM, ponieważ preadipocyty w tych sercach są pochodzenia mezenchymalnego. Co więcej, C-MSC wyizolowany niniejszym protokołem z biopsji pacjentów z ACM wykazywał większą skłonność zarówno do akumulacji lipidów, jak i adipogenezy niż grupa kontrolna. Z tego powodu komórki te mogą być wykorzystane do potwierdzenia niektórych mechanizmów molekularnych ACM, udowadniając ich przydatność jako modelu komórkowego do badań mechanistycznych9.

Ograniczenia i kroki krytyczne: Pomimo korzyści płynących z uzyskania C-MSC bezpośrednio od pacjentów (patrz paragraf "Możliwe zastosowania"), protokół ten podlega różnym ograniczeniom.

Przede wszystkim zabieg bioptyczny serca jest inwazyjny i często unika się go, jeśli nie jest to absolutnie konieczne. Rzeczywiście, pobieranie próbek tkanki serca jest problematyczne zarówno pod względem etycznym, jak i technicznym. Powodem wykonania biopsji serca może być uzyskanie jednoznacznego rozpoznania w kontekście kardiomiopatii w diagnostyce różnicowej, monitorowanie stanu przeszczepów serca lub stwierdzenie obecności guza serca30. W związku z tym tylko pacjenci, u których biopsja endomięśnia sercowego jest wskazana w stwierdzeniu konsensusu31 , mogą zostać włączeni do badań nad C-MSC. Co więcej, zabieg bioptyczny serca może mieć powikłania kliniczne, przede wszystkim w sercach kardiomiopatycznych. Dlatego próbki elektrofizjologa są zawsze ostrożne, a próbki biotopowe mogą być bardzo małe, co zagraża izolacji komórek. Przyszłe eksperymenty mogą przezwyciężyć ten problem poprzez dostrojenie stężenia kolagenazy lub czasu trawienia.

C-MSC, podobnie jak wszystkie pierwotne komórki ludzkie, wykazują dużą zmienność u różnych osób we wszystkich fenotypach. Rzeczywiście, komórki od różnych osób są nie tylko genetycznie różne, ale także poddawane zmiennym warunkom środowiskowym. W szczególności w tym eksperymencie obserwuje się dużą zmienność w izolacji, wzroście i różnicowaniu adipogennym.

Należy uznać kluczowe etapy niniejszego protokołu. Jeśli próbka biooptyczna zawiera naczynia włosowate, należy je usunąć, aby uniknąć równoległej izolacji komórek śródbłonka, co może zanieczyścić hodowlę C-MSC i może być potwierdzone analizą FACS (dodatni wynik dla CD31). Aby uzyskać skuteczne różnicowanie adipogenne, komórki muszą znajdować się w aktywnej fazie wzrostu. Stopień zbieżności może również wpływać na akumulację lipidów.

Znaczenie metody: W odniesieniu do dotychczasowych metod izolacji mezenchymalnych komórek zrębu po raz pierwszy zaproponowano szczegółowy opis otrzymywania C-MSC bezpośrednio z bioptycznych próbek komorowych człowieka. Chociaż metoda ta jest zalecana do przetwarzania próbek pacjentów z ACM, może mieć potencjalne zastosowanie do wszystkich pacjentów, dla których wskazana jest biopsja serca.

Protokół ten stanowi użyteczną implementację poprzednich metod uzyskiwania komórek, które wymagały większych próbek serca32, które często są trudne do pobrania.

Co więcej, ciekawą innowacją jest źródło próbki. Podczas gdy biopsja komorowa jest zwykle wykonywana na przegrodzie33, protokół ten uwzględnia próbki pobrane z wolnej ściany prawej komory. Komórki pochodzące z chorego okręgu prawej komory mogą być bardziej reprezentatywne dla stanu patologicznego chorób związanych z RV.

Ponadto niektóre z odczynników stosowanych w niniejszym protokole różnią się od innych metod izolacji i różnicowania C-MSC32. Na przykład rodzaj kolagenazy zaproponowany w tym manuskrypcie jest mieszanką kolagenaz klasy I i klasy II o zrównoważonym stosunku aktywności proteolitycznej. Ponadto roztwór wytrawiający składa się z mieszaniny kolagenazy rozpuszczonej w tym samym podłożu podstawowym (IMDM), które jest używane do przygotowania pożywki hodowlanej C-MSC, co pozwala wyizolowanemu C-MSC przystosować się do przyszłych warunków wzrostu.

Ponadto, chociaż procedury sortowania mogłyby ustandaryzować partię komórek, wykorzystanie całej populacji C-MSC, wyizolowanej tylko dzięki właściwości przylegania tych komórek do tworzywa sztucznego, stanowi uproszczenie bez zmiany charakterystyki immunofenotypowej C-MSC. Skład T. ADIPO zaproponowany w tym manuskrypcie jest w stanie prowadzić do różnicowania adipogennego, unikając dysregulacji metabolicznej indukowanej przez inne składniki, takie jak insulina.

Ponadto proponowana metoda kwantyfikacji akumulacji lipidów, która opiera się na ocenie intensywności kolorymetrycznej ORO, dostarcza więcej informacji na temat ilości nagromadzonych lipidów w porównaniu z metodami opartymi wyłącznie na odsetku komórek dodatnich dla barwienia OR. Często akumulację lipidów określa się ilościowo poprzez ekstrakcję ORO wbudowanego przez komórki za pomocą izopropanolu i pomiar jego absorbancji. Jednak ta metoda wymaga większej liczby przejść i jest podatna na zmienność ze względu na parowanie izopropanolu.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została sfinansowana przez włoskie Ministerstwo Zdrowia, Ricerca Corrente dla Centro Cardiologico Monzino-IRCCS.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
IMDMGibco firmy Life Technologies 
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Sigma-AldrichF2442
PENICYLINA STREPTOMYCYNALife Technologies Italia15140122
Kolagenaza NB4Serva17454.02
Podstawowy czynnik wzrostu fibroblastówPeprotech100-18B
L-glutaminaSigma-AldrichG7513
PBSLonza17-516F
Tryple select 1X (odczynnik do dysocjacji komórek)Gibco12563029
EDTASigma-AldrichEDS
Trypsin-EDTA solution Sigma-AldrichT6689
Albumina surowicy bydlęcejSigma-AldrichA2058
3-izobutylo-1-metyloksantynaSigma-AldrichI5879
HydrokortyzonSigma-AldrichH4001
IndometacynaSigma-AldrichI7378
Olej czerwony OSigma-AldrichO0625
IzopropanolSigma-AldrichI9516
Roztwór paraformaldehydu (PFA) 4% w PBSD.b.a. Italia S.r.l.sc-281692
Przeciwciało dimetylosulfotlenku (DMSO)Sigma-Aldrich276855
CD14-FITC (Mφ P9)Becton Dickinson345784
Integryna przeciwciał i beta; 1 (CD29)-PE (klon MAR4)Becton Dickinson561795
Przeciwciało PECAM-1 (CD31)- APC  (klon 9G11)R& Systemy DFAB3567A
Przeciwciało Antygen hematopoetycznych komórek progenitorowych (CD34)-APC (klon 581)Thermo Fisher Scientific CD34-581-05
Przeciwciało H-CAM (CD44)-PE  (klon G44-26)Becton Dickinson561858
Przeciwciało L-CA (CD45)-APC (klon HI30)Thermo Fisher ScientificMHCD4505-4
Przeciwciało THY1 (CD90)-FITC (klon 5E10)BectonDickinson561969
Przeciwciało Endoglin (CD105)-APC (klon 266)Becton Dickinson562408
Przeciwciało HLA-DR-FITC (klon L243)Becton Dickinson
347400
Sterylizator Gima Quick PlusGima 35642
Wirówka stołowa Sigma 3-16KWirówki Sigma10330
Pojemnik do zamrażania Mr. FrostyThermo Fisher Scientific 5100-0001
Mikroskop AxioVert 200M ZeissB 40-080 e 03/01
FACS GalliosBeckman Coulter 773231AF
ImageJ (program do przetwarzania obrazu)NIH
StericupMerck S.P.A. 
Probówki stożkowe, 50 mlEppendorf30122178
Probówki stożkowe, 15 mlEppendorf30122151
Probówki Safe-Lock, 2 mlEppendorf30120094
100 mm Naczynie do hodowli komórkowych z powłoką TCCorning430167
60 mm Naczynie do hodowli komórkowych z powłoką TCCorning430166
6-dołkowe płytki wielodołkowe z powłoką TCProbówki3516
, 5 mlBD Falcon352058
MARKA  komora licząca BLAUBRAND Bü rker-Tü rkSigma-AldrichBR719520
12440053Jednostki filtrujące SCGPU05RE z polistyrenu okrągłodennego Corning

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Therapeutic applications of mesenchymal stromal cells. Semin Cell Dev Biol. 18 (6), 846-858 (2007).">Brooke, G., et al. Therapeutic applications of mesenchymal stromal cells. Semin Cell Dev Biol. 18 (6), 846-858 (2007).
  2. Human cardiac and bone marrow stromal cells exhibit distinctive properties related to their origin. Cardiovasc Res. 89 (3), 650-660 (2010).">Rossini, A., et al. Human cardiac and bone marrow stromal cells exhibit distinctive properties related to their origin. Cardiovasc Res. 89 (3), 650-660 (2010).
  3. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).">Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  4. Cardiac fibroblasts: more than mechanical support. J Thorac Dis. 9, Suppl 1 36-51 (2017).">Doppler, S. A., et al. Cardiac fibroblasts: more than mechanical support. J Thorac Dis. 9, Suppl 1 36-51 (2017).
  5. Cardiac fibroblasts: from development to heart failure. J Mol Med (Berl). 93 (8), 823-830 (2015).">Moore-Morris, T., Guimaraes-Camboa, N., Yutzey, K. E., Puceat, M., Evans, S. M. Cardiac fibroblasts: from development to heart failure. J Mol Med (Berl). 93 (8), 823-830 (2015).
  6. Ventricular remodeling after infarction and the extracellular collagen matrix: when is enough enough. Circulation. 108 (11), 1395-1403 (2003).">Jugdutt, B. I. Ventricular remodeling after infarction and the extracellular collagen matrix: when is enough enough. Circulation. 108 (11), 1395-1403 (2003).
  7. The cardiac fibroblast: therapeutic target in myocardial remodeling and failure. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 45, 657-687 (2005).">Brown, R. D., Ambler, S. K., Mitchell, M. D., Long, C. S. The cardiac fibroblast: therapeutic target in myocardial remodeling and failure. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 45, 657-687 (2005).
  8. Cardiac mesenchymal stromal cells are a source of adipocytes in arrhythmogenic cardiomyopathy. Eur Heart J. 37 (23), 1835-1846 (2016).">Sommariva, E., et al. Cardiac mesenchymal stromal cells are a source of adipocytes in arrhythmogenic cardiomyopathy. Eur Heart J. 37 (23), 1835-1846 (2016).
  9. Cell models of arrhythmogenic cardiomyopathy: advances and opportunities. Dis Model Mech. 10 (7), 823-835 (2017).">Sommariva, E., Stadiotti, I., Perrucci, G. L., Tondo, C., Pompilio, G. Cell models of arrhythmogenic cardiomyopathy: advances and opportunities. Dis Model Mech. 10 (7), 823-835 (2017).
  10. Electroanatomical mapping systems and intracardiac echo integration for guided endomyocardial biopsy. Expert Rev Med Devices. 14 (8), 609-619 (2017).">Casella, M., et al. Electroanatomical mapping systems and intracardiac echo integration for guided endomyocardial biopsy. Expert Rev Med Devices. 14 (8), 609-619 (2017).
  11. Multipotent cells can be generated in vitro from several adult human organs (heart, liver, and bone marrow). Blood. 110 (9), 3438-3446 (2007).">Beltrami, A. P., et al. Multipotent cells can be generated in vitro from several adult human organs (heart, liver, and bone marrow). Blood. 110 (9), 3438-3446 (2007).
  12. Mesenchymal stem cells reside in virtually all post-natal organs and tissues. J Cell Sci. 119, Pt 11 2204-2213 (2006).">da Silva Meirelles, L., Chagastelles, P. C., Nardi, N. B. Mesenchymal stem cells reside in virtually all post-natal organs and tissues. J Cell Sci. 119, Pt 11 2204-2213 (2006).
  13. The double life of cardiac mesenchymal cells: Epimetabolic sensors and therapeutic assets for heart regeneration. Pharmacol Ther. 171, 43-55 (2017).">Cencioni, C., et al. The double life of cardiac mesenchymal cells: Epimetabolic sensors and therapeutic assets for heart regeneration. Pharmacol Ther. 171, 43-55 (2017).
  14. Mesenchymal stem cells. J Orthop Res. 9 (5), 641-650 (1991).">Caplan, A. I. Mesenchymal stem cells. J Orthop Res. 9 (5), 641-650 (1991).
  15. Generation of cardiac progenitor cells through epicardial to mesenchymal transition. J Mol Med (Berl). 93 (7), 735-748 (2015).">Germani, A., Foglio, E., Capogrossi, M. C., Russo, M. A., Limana, F. Generation of cardiac progenitor cells through epicardial to mesenchymal transition. J Mol Med (Berl). 93 (7), 735-748 (2015).
  16. Cardiac fibroblast: the renaissance cell. Circ Res. 105 (12), 1164-1176 (2009).">Souders, C. A., Bowers, S. L., Baudino, T. A. Cardiac fibroblast: the renaissance cell. Circ Res. 105 (12), 1164-1176 (2009).
  17. Non-oxidizable HMGB1 induces cardiac fibroblasts migration via CXCR4 in a CXCL12-independent manner and worsens tissue remodeling after myocardial infarction. Biochim Biophys Acta. , (2017).">Di Maggio, S., et al. Non-oxidizable HMGB1 induces cardiac fibroblasts migration via CXCR4 in a CXCL12-independent manner and worsens tissue remodeling after myocardial infarction. Biochim Biophys Acta. , (2017).
  18. Human Cardiac Mesenchymal Stromal Cells with CD105+CD34- Phenotype Enhance the Function of Post-Infarction Heart in Mice. PLoS One. 11 (7), 0158745(2016).">Czapla, J., et al. Human Cardiac Mesenchymal Stromal Cells with CD105+CD34- Phenotype Enhance the Function of Post-Infarction Heart in Mice. PLoS One. 11 (7), 0158745(2016).
  19. C-kit+ cardiac progenitors exhibit mesenchymal markers and preferential cardiovascular commitment. Cardiovasc Res. 89 (2), 362-373 (2010).">Gambini, E., et al. C-kit+ cardiac progenitors exhibit mesenchymal markers and preferential cardiovascular commitment. Cardiovasc Res. 89 (2), 362-373 (2010).
  20. Novel therapeutic strategies targeting fibroblasts and fibrosis in heart disease. Nat Rev Drug Discov. 15 (9), 620-638 (2016).">Gourdie, R. G., Dimmeler, S., Kohl, P. Novel therapeutic strategies targeting fibroblasts and fibrosis in heart disease. Nat Rev Drug Discov. 15 (9), 620-638 (2016).
  21. HLA expression and immunologic properties of differentiated and undifferentiated mesenchymal stem cells. Exp Hematol. 31 (10), 890-896 (2003).">Le Blanc, K., Tammik, C., Rosendahl, K., Zetterberg, E., Ringden, O. HLA expression and immunologic properties of differentiated and undifferentiated mesenchymal stem cells. Exp Hematol. 31 (10), 890-896 (2003).
  22. The Atrial Appendage as a Suitable Source to Generate Cardiac-derived Adherent Proliferating Cells for Regenerative Cell-based Therapies. J Tissue Eng Regen Med. , (2017).">Detert, S., et al. The Atrial Appendage as a Suitable Source to Generate Cardiac-derived Adherent Proliferating Cells for Regenerative Cell-based Therapies. J Tissue Eng Regen Med. , (2017).
  23. Human cardiac-derived adherent proliferating cells reduce murine acute Coxsackievirus B3-induced myocarditis. PLoS One. 6 (12), 28513(2011).">Miteva, K., et al. Human cardiac-derived adherent proliferating cells reduce murine acute Coxsackievirus B3-induced myocarditis. PLoS One. 6 (12), 28513(2011).
  24. Power Is Nothing Without Control: The Enduring Search for the Best Cell in Cardiac Cell Therapy at a Crossroads. Circ Res. 119 (9), 988-991 (2016).">Bassetti, B., Capogrossi, M. C., Pompilio, G. Power Is Nothing Without Control: The Enduring Search for the Best Cell in Cardiac Cell Therapy at a Crossroads. Circ Res. 119 (9), 988-991 (2016).
  25. Cell therapy for heart disease after 15 years: Unmet expectations. Pharmacol Res. , (2017).">Nigro, P., et al. Cell therapy for heart disease after 15 years: Unmet expectations. Pharmacol Res. , (2017).
  26. Mesenchymal stem cells for regenerative therapy: optimization of cell preparation protocols. Biomed Res Int. 2014, 951512(2014).">Ikebe, C., Suzuki, K. Mesenchymal stem cells for regenerative therapy: optimization of cell preparation protocols. Biomed Res Int. 2014, 951512(2014).
  27. Diagnosis of arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy/dysplasia: proposed modification of the task force criteria. Circulation. 121 (13), 1533-1541 (2010).">Marcus, F. I., et al. Diagnosis of arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy/dysplasia: proposed modification of the task force criteria. Circulation. 121 (13), 1533-1541 (2010).
  28. High prevalence of myocarditis mimicking arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy differential diagnosis by electroanatomic mapping-guided endomyocardial biopsy. J Am Coll Cardiol. 53 (8), 681-689 (2009).">Pieroni, M., et al. High prevalence of myocarditis mimicking arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy differential diagnosis by electroanatomic mapping-guided endomyocardial biopsy. J Am Coll Cardiol. 53 (8), 681-689 (2009).
  29. Feasibility of combined unipolar and bipolar voltage maps to improve sensitivity of endomyocardial biopsy. Circ Arrhythm Electrophysiol. 8 (3), 625-632 (2015).">Casella, M., et al. Feasibility of combined unipolar and bipolar voltage maps to improve sensitivity of endomyocardial biopsy. Circ Arrhythm Electrophysiol. 8 (3), 625-632 (2015).
  30. The role of endomyocardial biopsy in the management of cardiovascular disease: a scientific statement from the American Heart Association, the American College of Cardiology, and the European Society of Cardiology Endorsed by the Heart Failure Society of America and the Heart Failure Association of the European Society of Cardiology. Eur Heart J. 28 (24), 3076-3093 (2007).">Cooper, L. T., et al. The role of endomyocardial biopsy in the management of cardiovascular disease: a scientific statement from the American Heart Association, the American College of Cardiology, and the European Society of Cardiology Endorsed by the Heart Failure Society of America and the Heart Failure Association of the European Society of Cardiology. Eur Heart J. 28 (24), 3076-3093 (2007).
  31. 2011 consensus statement on endomyocardial biopsy from the Association for European Cardiovascular Pathology and the Society for Cardiovascular Pathology. Cardiovasc Pathol. 21 (4), 245-274 (2011).">Leone, O., et al. 2011 consensus statement on endomyocardial biopsy from the Association for European Cardiovascular Pathology and the Society for Cardiovascular Pathology. Cardiovasc Pathol. 21 (4), 245-274 (2011).
  32. Concurrent Isolation of 3 Distinct Cardiac Stem Cell Populations From a Single Human Heart Biopsy. Circ Res. 121 (2), 113-124 (2017).">Monsanto, M. M., et al. Concurrent Isolation of 3 Distinct Cardiac Stem Cell Populations From a Single Human Heart Biopsy. Circ Res. 121 (2), 113-124 (2017).
  33. Current status of endomyocardial biopsy. Mayo Clin Proc. 86 (11), 1095-1102 (2011).">From, A. M., Maleszewski, J. J., Rihal, C. S. Current status of endomyocardial biopsy. Mayo Clin Proc. 86 (11), 1095-1102 (2011).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Biopsja endomiokardialnatrawienie kolagenazcytometria przep ywowar nicowanie adypogenicznebarwienie OROCD29 CD44 CD105ekspansja hodowli kom rkowychakumulacja kropli lipidowych

Powiązane artykuły