Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Przygotowanie mysiego śliniaka podżuchwowego do pionowej mikroskopii przyżyciowej

8.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57283

⸱

7 maja 2018

 ,  ,  , 
1Theodor-Kocher Institute, University of Bern, 2Center for Infectious Diseases, Integrative Virology, University Clinic of Heidelberg

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy protokół chirurgicznego odsłaniania i stabilizacji mysiego podżuchwowego gruczołu ślinowego do obrazowania przyżyciowego za pomocą pionowej mikroskopii przyżyciowej. Protokół ten można łatwo dostosować do innych gruczołów zewnątrzwydzielniczych okolicy głowy i szyi myszy i innych małych gryzoni.

Streszczenie

Podżuchwowy gruczoł ślinowy (SMG) jest jednym z trzech głównych gruczołów ślinowych i jest przedmiotem zainteresowania wielu różnych dziedzin badań biologicznych, w tym biologii komórki, onkologii, stomatologii i immunologii. SMG to gruczoł zewnątrzwydzielniczy składający się z komórek nabłonka wydzielniczego, miofibroblastów, komórek śródbłonka, nerwów i macierzy zewnątrzkomórkowej. Dynamiczne procesy komórkowe w SMG szczurów i myszy były już wcześniej obrazowane, głównie przy użyciu systemów odwróconego mikroskopu wielofotonowego. W tym miejscu opisujemy prosty protokół chirurgicznego przygotowania i stabilizacji mysiego pistoletu maszynowego u znieczulonych myszy do obrazowania in vivo za pomocą pionowych systemów mikroskopów wielofotonowych. Przedstawiamy reprezentatywne zestawy obrazów przyżyciowych endogennych i adoptywnie przenoszonych komórek fluorescencyjnych, w tym znakowanie naczyń krwionośnych lub przewodów ślinowych oraz generowanie drugiej harmonicznej w celu wizualizacji kolagenu fibrylarnego. Podsumowując, nasz protokół pozwala na chirurgiczne przygotowanie mysich gruczołów ślinowych w pionowych systemach mikroskopowych, które są powszechnie stosowane do obrazowania przyżyciowego w dziedzinie immunologii.

Wprowadzenie

Ślina jest wydzielana przez gruczoły zewnątrzwydzielnicze w celu smarowania żywności, ochrony powierzchni błony śluzowej przewodu pokarmowego oraz dostarczania enzymów trawiennych oraz substancji przeciwdrobnoustrojowych1,2. Oprócz mniejszych gruczołów ślinowych przeplatanych błoną śluzową jamy ustnej, istnieją trzy obustronne zestawy głównych gruczołów zidentyfikowanych jako przyuszne, podjęzykowe i podżuchwowe, w zależności od ich lokalizacji1,2. Komórki nabłonkowe w kształcie piramidy, zorganizowane w worki w kształcie kolby (acini) lub demiluny, które są otoczone komórkami mioepitelialnymi i błoną podstawną, wydzielają surowicze i śluzowe składniki śliny1. Wąska przestrzeń świetlna acini spływa do interkalowanych przewodów, które łączą się w prążkowane przewody, aż w końcu łączą się w jeden przewód wydalniczy1. Główny przewód wydalniczy SMG nazywa się przewodem Whartona (WD) i otwiera się do podjęzykowego karuloku 3,4. Przedział nabłonkowy SMG reprezentuje zatem wysoce arboryczną strukturę z różnorodnymi końcami końcowymi, przypominającymi kiść winogron1,5,6. Śródmiąższ SMG składa się z naczyń krwionośnych i limfatycznych osadzonych w tkance łącznej7 zawierających nerwy przywspółczulne8 i macierz zewnątrzkomórkową5. Normalne gruczoły ślinowe ludzi i gryzoni zawierają również limfocyty T, makrofagi i komórki dendrytyczne9, a także komórki plazmatyczne, które wydzielają immunoglobulinę A (IgA) do śliny9,10. Ze względu na swoje wieloaspektowe funkcje w zdrowiu i chorobie, SMG jest przedmiotem zainteresowania wielu dziedzin badań biologicznych, w tym stomatologii4, immunologii11, onkologii12, fizjologii8 oraz biologii komórki3.

Obrazowanie dynamicznych procesów i interakcji komórkowych jest potężnym narzędziem w badaniach biologicznych13,14. Rozwój głębokiego obrazowania tkanek i innowacje w mikroskopach opartych na optyce nieliniowej (NLO), które polegają na rozpraszaniu lub absorpcji wielu fotonów przez próbkę, pozwoliły na bezpośrednie badanie procesów komórkowych w złożonych tkankach13,15. Absorpcja wielu fotonów polega na dostarczeniu całkowitej energii wzbudzenia przez fotony o niskiej energii, co ogranicza wzbudzenie fluoroforu do płaszczyzny ogniskowej, a tym samym umożliwia głębszą penetrację tkanek przy zmniejszonych fotouszkodzeniach i szumach spowodowanych wzbudzeniem nieostrym13,15. Zasada ta jest stosowana w mikroskopii dwufotonowej (2PM) i pozwala na obrazowanie próbek fluorescencyjnych na głębokości do 1 mm15,16. Podczas gdy dostępne na rynku konfiguracje 2PM stały się przyjazne dla użytkownika i niezawodne, głównym wyzwaniem dla obrazowania przyżyciowego jest staranne naświetlenie i ustabilizowanie narządu docelowego znieczulonych myszy, szczególnie w przypadku obrazowania serii poklatkowych. Opublikowano kilka metod cyfrowej korekcji dryfu po pozyskaniu danych17,18, a ostatnio opracowaliśmy "VivoFollow", automatyczny system korekcji, który przeciwdziała powolnemu dryfowi tkanek w czasie rzeczywistym za pomocą skomputeryzowanego stage19. Jednak nadal kluczowe znaczenie dla wysokiej jakości obrazowania ma zminimalizowanie ruchów tkanek, zwłaszcza szybkich ruchów spowodowanych oddychaniem lub biciem serca19. Opublikowano procedury przygotowania i stabilizacji dla wielu narządów, w tym rdzenia kręgowego20, wątroba21, skin22, lung23 i węzła chłonnego24. Ponadto opracowano modele do obrazowania gruczołów ślinowych szczurów3,25 i udoskonalono je pod kątem wysokiej rozdzielczości obrazowania przyżyciowego mysiego SMG, dostosowanego do konfiguracji mikroskopu odwróconego26,27,28.

Tutaj prezentujemy praktyczny i adaptowalny protokół do obrazowania przyżyciowego mysiego SMG za pomocą pionowej mikroskopii nieliniowej, która jest powszechnie stosowana do obrazowania przyżyciowego w dziedzinie immunologii. W tym celu zmodyfikowaliśmy szeroko stosowany etap unieruchomienia stosowany do preparacji węzłów chłonnych podkolanowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie prace na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Kantonalny Komitet ds. Eksperymentów na Zwierzętach i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi federalnymi.

1. Znieczulenie myszy

  1. Nosić środki ochrony osobistej, w tym fartuch laboratoryjny i rękawice.
  2. Wymieszaj ketaminę, ksylazynę i sól fizjologiczną do stężenia roboczego odpowiednio 20 mg/ml i 1 mg/ml. Wstrzyknąć materiał roboczy dootrzewnowo (i.p.) w ilości 8-10 μl/g myszy. Umieść mysz z powrotem w klatce.
    UWAGA: Ten protokół został przetestowany na myszach płci męskiej i żeńskiej w wieku od 6 do 40 tygodni z tłem C57BL/6.
  3. Przygotować roztwór acepromazyny w sile 2,5 mg/ml i wstrzyknąć 30 μl i.p., 15 minut po wstrzyknięciu ketaminy-ksylazyny (75 μg/mysz).
  4. Po 5-15 minutach sprawdź, czy jest odpowiednie znieczulenie i analgezja, kontrolując odruchy, np. odruch wycofania łapy lub odruch rogówkowy.
  5. Kontrola odruchów mniej więcej co 30 minut przez cały czas trwania eksperymentu. Podskórnie wstrzyknąć ketaminę/ksylazynę w dawce 1,5 μl/g myszy, co 60 minut lub wcześniej, jeśli odruchy są pozytywne.
    UWAGA: Znieczulenie wziewne, takie jak izofluran, nie może być stosowane w tym protokole, ze względu na utrwalenie myszy.

2. Usuń futro z obszaru operacyjnego

  1. Użyj elektrycznej maszynki do golenia, aby ogolić obszar, który rozciąga się mniej więcej od 5 mm ogona ust w kierunku przednich nóg, rozciągając się nad szczękami w kierunku obu uszu.
  2. Nałóż krem do depilacji na ogolony obszar za pomocą bawełnianego wacika. Ostrożnie i dokładnie usunąć po 3 minutach, np. przecierając wilgotnymi chusteczkami.

3. Napraw mysz na scenie

UWAGA: Ten protokół wykorzystuje niestandardową scenę (Rysunek 1) wyposażoną w dwa swobodnie regulowane uchwyty na szkiełka nakrywkowe (jeden przymocowany do stolika za pomocą, drugi przymocowany na stałe do niego); regulowane stereotaktyczne nauszniki; sznurek, który można napiąć śrubą; swobodnie regulowany metalowy pierścień grzewczy; oraz podniesiony obszar przeznaczony do umieszczenia tułowia myszy. Ten etap jest zmodyfikowany ze stopnia węzła chłonnego podkolanowego, z dodatkowym uchwytem stereotaktycznym i podparciem dla dolnego szkiełka nakrywkowego trzymającego zewnętrzny pistolet maszynowy. Szczegółowe plany lub wyceny etapu są dostępne na życzenie.

  1. Przygotuj scenę, wyjmując uchwyty pierścienia grzewczego i zdejmowany uchwyt szkiełka nakrywkowego. Poluzuj uchwytów nauszników i stałego uchwytu szkiełka nakrywkowego. Przyklej kawałek gazy do środkowej części sceny, służąc jako ściółka dla myszy.
  2. Użyj kleju (patrz Tabela materiałów), aby przymocować szklaną pokrywę o średnicy 20 mm do górnej części cylindrycznego metalowego uchwytu (będzie to dolna szklana osłona). Przyklej szklaną pokrywę o średnicy 25 mm do dolnej części płaskiego metalowego uchwytu (będzie to górna szklana osłona). Upewnij się, że szkła nakrywkowe zachodzą na około 2-3 mm z metalowymi uchwytami, a reszta szkła pozostaje wolna od tłuszczu i kleju.
  3. Połóż mysz na plecach na gazie, prostopadle do rozciągniętego sznurka, z głową wyśrodkowaną między nausznikami.
  4. Przymocuj górne kończyny myszy do sceny za pomocą taśmy chirurgicznej.
  5. Następnie zaczep sznurek o górne przednie siekacze i dokręć, aż szczęka osiągnie pozycję poziomą. Użyj zakrzywionych kleszczy, aby lekko wyciągnąć język z ust, co ułatwia oddychanie.
  6. Mocno, ale nie na siłę, pociągnij ogon i przyklej go taśmą do sceny.
  7. Ustaw nauszniki tak, aby uzyskać kąt około 30° między listwą a krawędzią stage. Aby zapewnić ten kąt, użyj linijki trójkątnej, aby narysować kąt 30° w prawo i w lewo na arkuszu papieru, a następnie umieść przezroczystą stolik na papierze, aby odpowiednio wyrównać uchwyty.
  8. Zamocuj szczękę między nausznikami, jednocześnie przesuwając lewą i prawą belkę do wewnątrz, aż szczęka stanie się nieruchoma, i dokręć. Obserwuj ruchy klatki piersiowej przed, w trakcie i po ustaleniu szczęki. Zmniejszony oddech lub jego brak wskazuje, że pręty są przymocowane do szyi, a nie do kości szczęki; W takim przypadku natychmiast powtórz procedurę mocowania.
  9. Zapewnij ogrzewanie myszy, np. umieszczając w pobliżu lampę grzewczą i/lub poduszkę grzewczą pod stolikiem.

4. Chirurgiczne odsłonięcie gruczołu ślinowego za pomocą mikroskopu stereoskopowego

UWAGA: Poniższe kroki wymagają użycia mikroskopu stereoskopowego, cienkich kleszczyków i nożyczek chirurgicznych. Ponieważ procedura jest nieuleczalna, nie jest konieczne utrzymywanie sterylnych warunków pracy. Wystarczą narzędzia oczyszczone etanolem.

  1. Zlokalizuj przybliżoną pozycję prawego płata SMG, szukając lekkiego wybrzuszenia na skórze około 15 mm ogonowej ust i 5 mm przyśrodkowej linii żuchwy. Podnieś mały fałd skórny pośrodku wybrzuszenia i przytnij go, aby utworzyć otwór o długości około 5 mm.
  2. Natychmiast nałóż pierścień smaru próżniowego o wysokości 4 mm na skórę otaczającą cięcie. (Użyć próżniowej strzykawki wypełnionej smarem z igłą podskórną o sile 25 G).
  3. Napełnij pierścień smarowy solą fizjologiczną, aby upewnić się, że tkanka pozostaje wilgotna podczas operacji.
  4. Pod mikroskopem stereoskopowym rozerwij tkankę łączną, postępując zgodnie z następującą procedurą: Użyj jednego cienkiego kleszczyka, aby mocno przytrzymać kawałek tkanki łącznej bezpośrednio przymocowanej do SMG, a następnie użyj drugich kleszczyków, aby pociągnąć dystalną tkankę łączną, aż pęknie. Upewnij się, że część tkanki łącznej pozostaje przyczepiona do pistoletu maszynowego; Jest to pożądane, ponieważ umożliwia obsługę. Nie dotykaj samego gruczołu kleszczami, ponieważ spowoduje to krwawienie.
  5. Powtórz ten ruch rozrywania tkanki łącznej najpierw na górze gruczołu, a następnie po stronie przyśrodkowej (między prawym a lewym płatem pistoletu oddechowego). Nie należy oddzielać gruczołu podjęzykowego od podżuchwowego.
  6. Kontynuuj usuwanie bocznej tkanki łącznej w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara wokół SMG (przyśrodkowo do ogonowego, do dystalnego, do rostralnego).
  7. Upewnij się, że dopływ krwi, odprowadzające naczynia limfatyczne i przewód ślinowy, które znajdują się w wiązce w miejscu czaszki gruczołu, nie są pęknięte.
  8. Gdy boczna tkanka łączna zostanie przerwana, użyj kleszczy, aby pociągnąć tkankę łączną przyczepioną do ogonowego końca SMG w górę, aby podnieść ogonowy koniec SMG. Zarąb tkankę łączną poniżej płata SMG, zaczynając od ogona i przesuwając się w kierunku końca rostralnego.
  9. Kontynuuj, aż tkanka łączna do wszystkich miejsc SMG zostanie usunięta (z wyjątkiem miejsca rostralnego z głównymi naczyniami krwionośnymi zasilającymi/drenującymi i WD).

5. Naprawianie dławika

  1. Upewnij się, że pierścień smarowy przytrzymujący sól fizjologiczną ma co najmniej 4 mm wysokości i nie przecieka (patrz krok 4.2).
  2. Zamontuj dolną szklaną pokrywę (patrz krok 3.2), mocując metalowy pręt do uchwytu o regulowanej wysokości. Upewnij się, że uchwyt szkiełka nakrywkowego jest ustawiony w najwyższym położeniu i nie dotyka pierścienia smarowego, gdy jest przymocowany do stage. Ustawić uchwyt od kierunku ogonowego pod kątem około 60° do myszy, tak aby szkiełko nakrywkowe zakrywało około dwóch trzecich (część ogonowa i dystalna) odsłoniętego płata. Opuść szklankę nakrywkową, aż zetknie się z dławikiem.
  3. Wypełnij pierścień smarowy na górze szkła nakrywkowego, aby utworzyć nowy zbiornik soli fizjologicznej.
  4. Ostrożnie pociągnij płat SMG na wierzch szkiełka nakrywkowego za pomocą kleszczy, dotykając tylko przyczepionej do niego tkanki łącznej (narząd można odwrócić dolną stroną skierowaną do góry).
  5. Upewnij się, że pierścień smarowy ma równą wysokość co najmniej 4 mm i nie przecieka. W razie potrzeby napełnić zbiornik soli fizjologicznej za pomocą strzykawki 30 G wypełnionej solą fizjologiczną.
  6. Upewnij się, że uchwyt szkła nakrywkowego górnej szklanej pokrywy znajduje się w najwyższym położeniu. Użyj, aby przymocować metalowy uchwyt z górną szkłem pokrywowym 25 mm do uchwytu. Użyj regulowanych uchwytu, aby ustawić szkło nakrywkowe tak, aby pistolet maszynowy był wyśrodkowany pośrodku.
  7. Użyj regulowanego uchwytu, aby opuścić górną szybę pokrywy, aż bezpośrednio zetknie się z pistoletem maszynowym. Na tym etapie obserwuj kształt i kolorystykę gruczołu. Jeśli powierzchnia dławika wydaje się większa lub zmienia się zabarwienie (na przykład z różowego na białe), natychmiast ustaw szkło nakrywkowe w wyższej pozycji, aby zmniejszyć nacisk na pistolet maszynowy.
  8. Sprawdź zbiornik soli fizjologicznej pod kątem wycieków, szukając pęcherzyków powietrza i/lub kropli soli fizjologicznej na zewnątrz zbiornika. W przypadku wykrycia nieszczelności lub pęcherzyków powietrza usuń obie szkiełka nakrywkowe i cały smar, a następnie uruchom ponownie od kroku 2.
  9. Przykręć wszystkie mocujące.

6. Mocowanie pierścienia grzewczego i sondy temperatury

  1. Włóż sondę temperatury do zbiornika i umieść ją blisko dławika, a następnie przyklej przewód sondy do stage.
  2. Nałóż smarowy pierścień na górne szkiełko nakrywkowe, z SMG pośrodku (średnica pierścienia smarowego powinna odpowiadać średnicy pierścienia grzewczego). Umieść pierścień grzewczy na wierzchu szkiełka nakrywkowego i uszczelnij smarem. Przyklej rurkę pierścienia grzewczego do sceny.

7. Obrazowanie

UWAGA: Używamy pionowego systemu mikroskopu dwufotonowego wyposażonego w przestrajalny laser Ti:Sa i mikroskop fluorescencyjny z obiektywami zanurzonymi w wodzie 20X lub 25X. Korekta dryfu tkanki w czasie rzeczywistym podczas akwizycji może być zrealizowana za pomocą zautomatyzowanego etapu i VivoFollow19. Poprawia to stabilność akwizycji obrazu, ale nie jest wymagane.

  1. Włącz pionowy system mikroskopowy za pomocą odpowiedniego oprogramowania dostarczonego przez producenta mikroskopu. Dostosuj laser Ti:Sa do długości fali wzbudzenia 780-900 nm.
  2. Podłącz rurkę grzewczą do pierścienia grzewczego. Perystaltyczna pompa wodna cyrkuluje gorącą wodę (podgrzaną przez zanurzenie części rurki w łaźni wodnej o temperaturze 80°C) przez pierścień, aby ogrzać pistolet maszynowy.
  3. Podłącz sondę temperatury do termometru cyfrowego. Dostosuj prędkość pompy perystaltycznej, jeśli temperatura nie mieści się w zakresie 35-39 °C. Im szybciej pracuje pompa, tym cieplejszy staje się obiekt i na odwrót.
  4. Przed rozpoczęciem akwizycji obrazu należy przeprowadzić wizualną kontrolę prędkości przepływu krwi. Dokładnie sprawdzić przejście leukocytów przez cienkie naczynia włosowate lub przez wstrzyknięcie fluorescencyjnego dekstranu.
    UWAGA: Dożylnie wstrzyknięty dekstran fluorescencyjny natychmiast wypełni całe naczynia krwionośne SMG, gdy przepływ krwi jest fizjologiczny. W tej procedurze tak jest praktycznie zawsze.
  5. Aby śledzić komórki odpornościowe, głębokość obrazowania wynosi zwykle od 20 do 150 μm poniżej powierzchni SMG identyfikowanego przez sygnał generacji 2. harmonicznej. Rejestruj stosy obrazów o polu widzenia 150-300 μm z rozdzielczością pikseli około 512 x 512 lub większą oraz głębią z 20-60 μm z odstępami 2-4 μm między obrazami. Powtarzaj akwizycję stosu co 20-30 s przez łączny czas 20-60 minut.
  6. Użyj termometru cyfrowego, aby kontrolować minimalny i maksymalny poziom temperatury po uzyskaniu jednej sekwencji obrazu. Odrzucić sekwencję obrazów, jeśli minimum lub maksimum nie mieści się w zakresie 37 ± 2 °C. Uzupełnij wodę w celu zanurzenia obiektywu między sekwencjami obrazów.
  7. Pod koniec sesji obrazowania należy poddać myszy eutanazji przez uduszenie CO2 w znieczuleniu.
    UWAGA: Jest to zgodne ze szwajcarskimi wytycznymi federalnymi dotyczącymi eksperymentów na zwierzętach; Inne wytyczne dotyczące eutanazji mogą mieć zastosowanie w innych miejscach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Niniejszy protokół umożliwia obrazowanie niemal całej strony grzbietowej lub brzusznej SMG. Pole widzenia zazwyczaj obejmuje również śliniankę podjęzykową, która nieco różni się od SMG pod względem składu komórkowego.4Oba gruczoły są otoczone torebką z kolagenu włóknistego i podzielone na płaty. Większość systemów 2PM umożliwia uzyskanie obrazu kolagenu włóknistego bez użycia znaczników poprzez pomiar 2nd sygnał harmoniczny, jednak do wizualizacji strukt...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten oferuje proste podejście do obrazowania in vivo mysich podżuchwowych i podjęzykowych gruczołów ślinowych przy użyciu pionowej mikroskopii nieliniowej, często stosowanej w immunologii. Metoda może być dostosowana do obrazowania innych gruczołów zewnątrzwydzielniczych w okolicy głowy i szyi. Na przykład nasze laboratorium wykonało obrazowanie gruczołu łzowego w analogiczny sposób (nie pokazane).

Usunięcie tkanki łącznej wokół SMG jest najważniejszym krokiem tego protokołu, ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana przez grant projektu Swiss National Foundation (SNF) 31003A_135649, 31003A_153457 i 31003A_172994 (dla JVS) oraz Leopoldina fellowship LPDS 2011-16 (dla BS). Prace te skorzystały z konfiguracji optycznych "Centrum Obrazowania Mikroskopowego" (MIC) Uniwersytetu w Bernie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Narketan 10 %  (Ketamina) 20ml (100 mg/ml)Vetoquinol3605877535982
Rompun 2% (Ksylazyna) 25 ml (20 mg/ml)Bayer680538150144
Sól fizjologiczna NaCl 0,9%B. Braun3535789
Prequillan 1% (Acepromazyna) 10 ml (10 mg/ml)Fatro6805671900029
Golarka elektrycznaWahl9818Llub podobna
Depilacja kremVeet4002448090656
Durapore Taśma chirurgiczna (2,5 cm x 9,1 m i 1,25 cm x 9,1 m)Durapore (3M)1538-1
Durapore Taśma chirurgiczna (2,5 cm x 9,1 m i 1,25 cm x 9,1 m)Durapore (3M)1538-0
Super glue Ultra żel, klej natychmiastowyPattex, Henkel4015000415040
Szkiełka nakrywkowe mikroskopu 20 mm i 22 mmMenzel-Glä ser631-1343/ 631-1344
Smar do laboratoriów 60 g glisseal NBorer (dostawca VWR)DECO514215.00-CA15
Nożyczki chirurgiczneFine Science Tools (F.S.T)14090-09lub podobne
Cienkie kleszczeFine Science Tools (FST )11252-20lub podobne
Wacik bawełnianyMigros617027988254lub podobne
Gaza Gazin 5 x 5 cmLohmann and Rauscher18500lub podobny
Mikroskop stereoskopowyLeicaMZ16lub podobny
dekstran Texas Red 70kDa  Sondy molekularneD1864
Cascade Blue dekstran 10kDainvitrogenD1976
System dwufotonowyLaVision BiotecTrimScope I i II lubpodobny
obiektyw XLUMPLANFL 20x/0,95 WOlympusn/alub inny cel zanurzenia w wodzie 
Termometr cyfrowyFluke95969077651

Bibliografia

  1. Pakurar, A. S., Bigbee, J. W. Digestive System. Digital Histology. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ, USA. 101-121 (2005).
  2. Carpenter, G. Role of Saliva in the Oral Processing of Food. Food Oral Processing. , Wiley-Blackwell. Oxford, UK. 45-60 (2012).
  3. Masedunskas, A., Weigert, R. Intravital two-photon microscopy for studying the uptake and trafficking of fluorescently conjugated molecules in live rodents. Traffic. 9 (10), 1801-1810 (2008).
  4. Amano, O., Mizobe, K., Bando, Y., Sakiyama, K. Anatomy and histology of rodent and human major salivary glands. Acta Histochem Cytochem. 45 (5), 241-250 (2012).
  5. Sequeira, S. J., Larsen, M., DeVine, T. Extracellular matrix and growth factors in salivary gland development. Front Oral Biol. 14, 48-77 (2010).
  6. Takeyama, A., Yoshikawa, Y., Ikeo, T., Morita, S., Hieda, Y. Expression patterns of CD66a and CD117 in the mouse submandibular gland. Acta Histochem. 117 (1), 76-82 (2015).
  7. Hata, M., Ueki, T., Sato, A., Kojima, H., Sawa, Y. Expression of podoplanin in the mouse salivary glands. Arch Oral Biol. 53 (9), 835-841 (2008).
  8. Proctor, G. B., Carpenter, G. H. Regulation of salivary gland function by autonomic nerves. Auton Neurosci. 133 (1), 3-18 (2007).
  9. Le, A., Saverin, M., Hand, A. R. Distribution of Dendritic Cells in Normal Human Salivary Glands. Acta Histochem Cytochem. 44 (4), 165-173 (2011).
  10. Hofmann, M., Pircher, H. E-cadherin promotes accumulation of a unique memory CD8 T-cell population in murine salivary glands. Proc Natl Acad Sci. 108 (40), 16741-16746 (2011).
  11. Bombardieri, M., Barone, F., Lucchesi, D., et al. Inducible tertiary lymphoid structures, autoimmunity, and exocrine dysfunction in a novel model of salivary gland inflammation in C57BL/6 mice. J Immunol. 189 (7), 3767-3776 (2012).
  12. Szwarc, M. M., Kommagani, R., Jacob, A. P., Dougall, W. C., Ittmann, M. M., Lydon, J. P. Aberrant activation of the RANK signaling receptor induces murine salivary gland tumors. PLoS One. 10 (6), e0128467(2015).
  13. Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. Intravital microscopy: A novel tool to study cell biology in living animals. Histochem Cell Biol. 133 (5), 481-491 (2010).
  14. Masedunskas, A., Milberg, O., Porat-Shliom, N., et al. Intravital microscopy. Bioarchitecture. 2 (5), 143-157 (2012).
  15. Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: Multiphoton microscopy in the biosciences. Nat Biotechnol. 21 (11), 1369-1377 (2003).
  16. Theer, P., Hasan, M. T., Denk, W. Two-photon imaging to a depth of 1000 µm in living brains by use of a Ti:Al_2O_3 regenerative amplifier. Opt Lett. 28 (12), 1022(2003).
  17. Gomez-Conde, I., Caetano, S. S., Tadokoro, C. E., Olivieri, D. N. Stabilizing 3D in vivo intravital microscopy images with an iteratively refined soft-tissue model for immunology experiments. Comput Biol Med. 64, 246-260 (2015).
  18. Parslow, A., Cardona, A., Bryson-Richardson, R. J. Sample drift correction following 4D confocal time-lapse imaging. J Vis Exp. (86), (2014).
  19. Vladymyrov, M., Abe, J., Moalli, F., Stein, J. V., Ariga, A. Real-time tissue offset correction system for intravital multiphoton microscopy. J Immunol Methods. 438, 35-41 (2016).
  20. Haghayegh Jahromi, N., Tardent, H., Enzmann, G., et al. A novel cervical spinal cord window preparation allows for two-photon imaging of T-Cell interactions with the cervical spinal cord microvasculature during experimental autoimmune encephalomyelitis. Front Immunol. 8, 406(2017).
  21. Heymann, F., Niemietz, P. M., Peusquens, J., et al. Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice. J Vis Exp. (97), e52607(2015).
  22. Gaylo, A., Overstreet, M. G., Fowell, D. J. Imaging CD4 T cell interstitial migration in the inflamed dermis. J Vis Exp. (109), e53585(2016).
  23. Looney, M. R., Thornton, E. E., Sen, D., Lamm, W. J., Glenny, R. W., Krummel, M. F. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat Methods. 8 (8), 91-96 (2011).
  24. Liou, H. L. R., Myers, J. T., Barkauskas, D. S., Huang, A. Y. Intravital imaging of the mouse popliteal lymph node. J Vis Exp. (60), e3720(2012).
  25. Sramkova, M., Masedunskas, A., Parente, L., Molinolo, A., Weigert, R. Expression of plasmid DNA in the salivary gland epithelium: novel approaches to study dynamic cellular processes in live animals. Am J Physiol Cell Physiol. 297 (6), C1347-C1357 (2009).
  26. Masedunskas, A., Porat-shliom, N., Tora, M., Milberg, O., Weigert, R. Intravital microscopy for imaging subcellular structures in live mice expressing fluorescent proteins. J Vis Exp. (79), e50558(2013).
  27. Masedunskas, A., Sramkova, M., Parente, L., et al. Role for the actomyosin complex in regulated exocytosis revealed by intravital microscopy. Proc Natl Acad Sci. 108 (33), 13552-13557 (2011).
  28. Milberg, O., Shitara, A., Ebrahim, S., et al. Concerted actions of distinct nonmuscle myosin II isoforms drive intracellular membrane remodeling in live animals. J Cell Biol. 216 (7), 1925-1936 (2017).
  29. Kuriki, Y., Liu, Y., Xia, D., et al. Cannulation of the mouse submandibular salivary gland via the Wharton's duct. J Vis Exp. (51), e3074(2011).
  30. Chen, G. Y., Nuñez, G. Sterile inflammation: Sensing and reacting to damage. Nat Rev Immunol. 10 (12), 826-837 (2010).
  31. McLaren, A. Some causes of variation of body temperature in mice. Q J Exp Physiol Cogn Med Sci. 46 (1), 38-45 (1961).
  32. Baumgart, K., Wagner, F., Gröger, M., et al. Cardiac and metabolic effects of hypothermia and inhaled hydrogen sulfide in anesthetized and ventilated mice. Crit Care Med. 38 (2), Accessed November 21, 2017 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20095069 588-595 (2010).
  33. Crouch, A. C., Manders, A. B., Cao, A. A., Scheven, U. M., Greve, J. M. Cross-sectional area of the murine aorta linearly increases with increasing core body temperature. Int J Hyperth. , 1-13 (2017).
  34. Smith, C. J., Caldeira-Dantas, S., Turula, H., Snyder, C. M. Murine CMV infection induces the continuous production of mucosal resident T cells. Cell Rep. 13 (6), 1137-1148 (2015).
  35. Lindquist, R. L., Shakhar, G., Dudziak, D., et al. Visualizing dendritic cell networks in vivo. Nat Immunol. 5 (12), 1243-1250 (2004).
  36. Riedl, J., Flynn, K. C., Raducanu, A., et al. Lifeact mice for studying F-actin dynamics. Nat Methods. 7 (3), 168-169 (2010).
  37. Chtanova, T., Hampton, H. R., Waterhouse, L. A., et al. Real-time interactive two-photon photoconversion of recirculating lymphocytes for discontinuous cell tracking in live adult mice. J Biophotonics. 7 (6), 425-433 (2014).
  38. Kyratsous, N. I., Bauer, I. J., Zhang, G., et al. Visualizing context-dependent calcium signaling in encephalitogenic T cells in vivo by two-photon microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (31), E6381-E6389 (2017).
  39. Mank, M., Reiff, D. F., Heim, N., Friedrich, M. W., Borst, A., Griesbeck, O. A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change. Biophys J. 90 (5), 1790-1796 (2006).
  40. Tsyboulski, D., Orlova, N., Saggau, P. Amplitude modulation of femtosecond laser pulses in the megahertz range for frequency-multiplexed two-photon imaging. Opt Express. 25 (8), 9435(2017).
  41. Potma, E. O., Xie, X. S. Detection of single lipid bilayers with coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy. J Raman Spectrosc. 34 (9), 642-650 (2003).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Przygotowanie mysich ślinianek podżuchwowychtechnika stabilizacji chirurgicznejobrazowanie wielofotonoweznakowanie naczyń krwionośnychwizualizacja kolagenuśledzenie limfocytów Tuszczelnianie pierścieniem z wazelinymonitorowanie temperatury
Przygotowanie mysiego śliniaka podżuchwowego do pionowej mikroskopii przyżyciowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.