Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja i hodowla in vitro mysich i ludzkich makrofagów pęcherzykowych

24.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57287

⸱

20 kwietnia 2018

 ,  ,  , 
1Norton Thoracic Institute, St. Joseph's Hospital and Medical Center, 2Flow Cytometry Core, St. Joseph's Hospital and Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

Ta komunikacja opisuje metodologie izolacji i hodowli makrofagów pęcherzykowych od ludzi oraz modeli mysich do celów eksperymentalnych.

Streszczenie

Makrofagi pęcherzykowe to nieuleczalnie zróżnicowane, rezydujące w płucach makrofagi pochodzenia prenatalnego. Makrofagi pęcherzykowe są wyjątkowe ze względu na swoje długie życie i ważną rolę w rozwoju i funkcjonowaniu płuc, a także zlokalizowane w płucach reakcje na infekcje i stany zapalne. Do tej pory nie istnieje ujednolicona metoda identyfikacji, izolacji i obchodzenia się z makrofagami pęcherzykowymi od ludzi i myszy. Taka metoda jest potrzebna do badań nad tymi ważnymi wrodzonymi komórkami odpornościowymi w różnych warunkach eksperymentalnych. Opisana tutaj metoda, która może być łatwo przyjęta przez każde laboratorium, jest uproszczonym podejściem do pobierania makrofagów pęcherzykowych z płynu popłuczyn oskrzelowo-pęcherzykowych lub z tkanki płucnej i utrzymywania ich in vitro. Ponieważ makrofagi pęcherzykowe występują głównie jako komórki przylegające do pęcherzyków płucnych, metoda ta koncentruje się na ich usunięciu przed pobraniem i identyfikacją. Płuco jest silnie unaczynionym narządem, a różne typy komórek pochodzenia szpikowego i limfoidalnego zamieszkują, oddziałują i są pod wpływem mikrośrodowiska płuc. Korzystając z opisanego tutaj zestawu markerów powierzchniowych, naukowcy mogą łatwo i jednoznacznie odróżnić makrofagi pęcherzykowe od innych leukocytów i oczyścić je do dalszych zastosowań. Opracowana w tym celu metoda hodowli wspiera zarówno ludzkie, jak i mysie makrofagi pęcherzykowe do wzrostu in vitro i jest zgodna z badaniami komórkowymi i molekularnymi.

Wprowadzenie

Mikrośrodowisko płuc to wyjątkowo złożony ekosystem z rozbudowanym kanałem powietrznym i układem naczyniowym. Wdychane powietrze przemieszcza się przez tchawicę oraz przez liczne odgałęzienia oskrzeli i oskrzelików, zanim dotrze do pęcherzyków płucnych, gdzie zachodzi wymiana gazowa krew-powietrze. Ze względu na bezpośrednią interakcję z atmosferą, powierzchnia dróg oddechowych wymaga ochrony przed potencjalnie szkodliwym działaniem unoszących się w powietrzu cząstek i zanieczyszczeń. Płuca chronią szereg barier fizycznych, chemicznych i immunologicznych. Warto zauważyć, że rozmieszczenie fagocytów na powierzchni dróg oddechowych służy ważnemu systemowi obrony pierwszej linii. Makrofagi pęcherzykowe (AM) są jednym z rodzajów fagocytów rezydujących w płucach i stanowią zdecydowaną większość puli makrofagów płucnych. Jak sama nazwa wskazuje, AM są przede wszystkim zlokalizowane w świetle pęcherzyków płucnych i występują jako komórki siedzące, które stale pobierają próbki atmosfery otoczenia i komunikują się z nabłonkiem pęcherzyków płucnych1. W płucach w stanie stacjonarnym ponad 95% fagocytów w przestrzeni pęcherzykowej to AMs2, których skład może ulec zmianie z powodu stanu zapalnego, infekcji lub przewlekłego narażenia na zanieczyszczenia.

AMs uczestniczą w szerokim zakresie funkcji, które mogą być lokalne dla płuc i/lub mieć znaczenie ogólnoustrojowe. Na przykład AM są niezbędne do rozwoju i optymalnego funkcjonowania płuc; nadzór immunologiczny; i usuwanie resztek komórkowych, atakujących patogenów i wdychanych cząstek3,4,5,6,7. Wiadomo, że ukierunkowane wyczerpywanie AMs upośledza usuwanie wirusów i bakterii układu oddechowego4,8. Oprócz roli fagocytów i pierwszego rzutu obrońców homeostazy płuc, AM są znane z tego, że działają jako komórki prezentujące antygen w wywoływaniu odporności limfocytów T9, zwiększając skuteczność szczepionki donosowej10 i wpływając na autoimmunizację z ograniczeniami płuc po przeszczepie płuc11,12. Niedobór funkcji AM został powiązany z proteinozą pęcherzyków płucnych (PAP), stanem wynikającym z mutacji genetycznej, nowotworu złośliwego lub infekcji, która upośledza klirens płucnych środków powierzchniowo czynnych13,14. Transplantacja AM jest obecnie badana jako podejście terapeutyczne w leczeniu PAP 15,16.

AMs są znane z tego, że powstają podczas embriogenezy i utrzymują się w płucach przez całe życie, nie będąc zastępowane przez krążące leukocyty2,17. Chociaż rotacja AM jest niewykrywalna w homeostatycznych płucach, różne poziomy rotacji AM odnotowano w niektórych stanach klinicznych, w tym zakażenie wirusem grypy4, napromienianie mieloablacyjne18, narażenie na endotoksynę19 i starość20. Uważa się, że AM samoodnawiają się poprzez proliferację niskiego stopnia17,21, ale niektóre ostatnie badania twierdzą, że monocyty mogą dać początek populacji wewnątrznaczyniowych makrofagów płucnych22,23 w warunkach eksperymentalnych, ale funkcjonalność tych nowo przekształconych makrofagów płucnych nie została jeszcze zdefiniowana w chorobach płuc. Co więcej, zrozumienie progu bodźca w kontekście aktywacji AM jest potencjalnie interesującym obszarem, ponieważ płuca próbują zachować równowagę między sygnałami zapalnymi a maszynerią immunoregulacyjną.

Fizjologiczne lub patologiczne zmiany, które prowadzą do utraty regulacji immunologicznej, są ważne do oceny w różnych warunkach klinicznych (np. infekcje dróg oddechowych, zapalna choroba płuc i zwłóknienie płuc). Niemniej jednak AM są coraz częściej uznawane za wskaźniki, a nawet determinanty zdrowia płuc11,24. Obecnie nie ma dostępnych ujednoliconych protokołów zbierania, charakteryzowania i/lub utrzymywania AM od ludzi i przedklinicznych modeli mysich. Brak konsensusu w sprawie prekursorów i fenotypów AM oraz brak szczegółowej metodologii był główną przeszkodą w rozszyfrowaniu roli AM w zdrowiu i chorobie płuc. Poniższy protokół oferuje ostateczną strategię identyfikacji, izolacji i hodowli in vitro, która znacznie pogłębi zrozumienie zachowania AM i ułatwi badania diagnostyczne i terapeutyczne ukierunkowane na AM.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) oraz Institutional Review Board (IRB) w St Joseph's Hospital and Medical Center.

1. Izolacja AMs z mysiego płynu do płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL)

  1. Znieczulij ośmiotygodniową mysz C57BL/6 koktajlem ketaminy (87,5 mg/kg masy ciała) i ksylazyny (12,5 mg/kg masy ciała) poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowe. Kontynuuj, gdy mysz osiągnie znieczulenie chirurgiczne z utratą odruchów i rozluźnieniem mięśni.
  2. Umieść mysz na powierzchni preparacyjnej stroną brzuszną skierowaną do góry. Nałóż maść okulistyczną weterynaryjną na oczy, aby zapobiec odwodnieniu i przetrzyj całą powierzchnię brzuszną myszy sterylnymi wacikami nasączonymi alkoholem nasączonym 70% izopropanolem w celu dezynfekcji.
  3. Zamontuj mysz tak, aby wszystkie cztery nogi były unieruchomione.
  4. Delikatnie otwórz jamę brzuszną za pomocą narzędzi do mikropreparacji. Należy zachować ostrożność, aby otworzyć jak największą powierzchnię, nie uszkadzając żadnych narządów trzewnych ani nie tworząc zwisającej tkanki.
  5. Delikatnie otwórz klatkę piersiową, powoli nacinając klatkę piersiową przez śródpiersie. Idealnie byłoby, gdyby klatkę piersiową można było wyciąć z boku na bok. Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić opłucnej płuc podczas otwierania klatki piersiowej.
  6. Zlokalizuj żyłę główną dolną i wykonaj nacięcie, aby wykrwawić mysz. Użyj chłonnych wacików, aby wchłonąć krew.
  7. Wstrzyknąć 10 ml lodowatej soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do prawej komory (za pomocą strzykawki 10 ml i igły 25G) w celu przepłukania krążących krwinek. Absorbuj przepływ krwi za pomocą chłonnych wacików. Po całkowitym perfuzji płuca będą wyglądały na zbledłe, a następnie będą gotowe do płukania.
  8. Delikatnie rozetnij skórę i mięśnie szyi, aby odsłonić drogi oddechowe. Ostrożnie wytnij sąsiednie mięśnie, chrząstki i tkankę tłuszczową, nie uszkadzając tchawicy.
  9. Wykonaj małe nacięcie (<2 mm) na tchawicy za krtanią. To nacięcie powinno wystarczyć do wprowadzenia cewnika, gdy tchawica jest nadal przymocowana do krtani. Wprowadzić 1-calowy cewnik 22G bez igły do tchawicy w kierunku płuc. Zabezpiecz cewnik jedwabnym plecionym szwem (4-0; niewchłanialny) z kwadratowym węzłem.
    UWAGA: Cewnik należy przyciąć w zależności od rozmiaru myszy. Bardzo krótkie lub długie cewniki mają tendencję do przeciekania i/lub rozrywania dróg oddechowych podczas płukania. Długość cewnika powinna być taka, aby po całkowitym włożeniu końcówka pozostawała dobrze w tchawicy i nie sięgała do oskrzeli pierwotnych.
  10. Podłącz strzykawkę o pojemności 1 ml wypełnioną lodowatym buforem BAL (Ca2+ i Mg2+ wolny PBS + 1 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy, EDTA) do cewnika i powoli wkraplaj bufor do płuc. To napompuje płuca. Trzymaj strzykawkę podłączoną do cewnika przez pięć sekund, a następnie odessaj płyn z płukania, delikatnie pociągając za tłok. Spowoduje to opróżnienie płuc. Zbierz płyn do stożkowej probówki o pojemności 15 ml umieszczonej na lodzie.
  11. Powtórz krok 1.10 jeszcze dziewięć razy i zgromadź płyn z płukania. Nie należy przekraczać 1 ml buforu na płukanie, ponieważ może to spowodować przekroczenie pojemności płuc i doprowadzić do ich pęknięcia.
  12. Eutanazja myszy z powodu przedawkowania CO2 zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez IACUC.
  13. Odwirować 10 ml płynu BAL o stężeniu 250 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut. Osad komórkowy zawiera komórki BAL.
    ostrożność: Osad może być bardzo mały, dlatego należy zachować ostrożność podczas zasysania supernatantu.
  14. Zawiesić komórki BAL w 100 μl buforu przepływowego/sortującego (PBS + 2% inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca (FBS) + 1 mM EDTA + 25 mM kwas N-2-hydroksyetylopiperazyno-N'-2-etanosulfonowy (HEPES)).
  15. Zablokuj niespecyficzne przeciwciało wiążące się z receptorem Fc, dodając mysi blok Fc (klon 2,4G2, 10 μg/ml) i inkubując przez 20 minut na lodzie.
  16. Wykonaj barwienie przeciwciałami wraz z fluorescencją minus jeden (FMO) i kontrolami pojedynczego barwienia11,25. Oceń komórki BAL za pomocą analizatora komórek (patrz Tabela materiałów), a następnie analiza cytometrii przepływowej pojedynczych komórek za pomocą odpowiedniego oprogramowania analitycznego (patrz Tabela materiałów).
  17. Wyizolować AM za pomocą aktywowanego fluorescencją sortera komórek (patrz tabela materiałów) bezpośrednio do 1 ml mysiej pożywki hodowlanej AM, gdy AM są przeznaczone do hodowli in vitro lub transferu komórek in vivo. Alternatywnie, posortuj AM do 1 ml buforu do lizy (patrz tabela materiałów) uzupełnionego 10 μl/ml β-merkaptoetanolu do ekstrakcji RNA.

2. Izolacja AM z płuca myszy, zawiesina jednokomórkowa

  1. Znieczulij ośmiotygodniową mysz C57BL/6 koktajlem ketaminy (87,5 mg/kg masy ciała) i ksylazyny (12,5 mg/kg masy ciała) poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowe. Kontynuuj, gdy mysz osiągnie znieczulenie chirurgiczne z utratą odruchów i rozluźnieniem mięśni.
  2. Umieść mysz na powierzchni preparacyjnej stroną brzuszną skierowaną do góry. Nałóż maść okulistyczną weterynaryjną na oczy, aby zapobiec odwodnieniu i przetrzyj całą powierzchnię brzuszną myszy sterylnymi wacikami nasączonymi alkoholem nasączonymi 70% izopropanolem w celu dezynfekcji.
  3. Zamontuj mysz tak, aby wszystkie cztery nogi były unieruchomione.
  4. Delikatnie otwórz jamę brzuszną za pomocą narzędzi do mikropreparacji. Należy zachować ostrożność, aby otworzyć jak największą powierzchnię, nie uszkadzając żadnych narządów trzewnych ani nie tworząc zwisającej tkanki.
  5. Delikatnie otwórz klatkę piersiową, powoli nacinając klatkę piersiową przez śródpiersie. Idealnie byłoby, gdyby klatkę piersiową można było wyciąć z boku na bok. Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić opłucnej płuc podczas otwierania klatki piersiowej.
  6. Zlokalizuj żyłę główną dolną i wykonaj nacięcie, aby wykrwawić mysz. Użyj chłonnych wacików, aby wchłonąć krew.
  7. Wstrzyknąć 10 ml lodowatego PBS do prawej komory (za pomocą strzykawki 10 ml i igły 25G) w celu przepłukania krążących krwinek. Po całkowitym perfuzji płuca będą wyglądały na zblanszowane i będą gotowe do zbioru.
  8. Wypreparuj płuca, przecinając tchawicę, naczynia krwionośne i więzadła do stożkowej rurki o pojemności 15 ml z 5 ml zimnego zmodyfikowanego podłoża Dulbecco Eagle's (DMEM). Utrzymuj go na lodzie do następnego kroku.
  9. Eutanazja myszy z powodu przedawkowania CO2 zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez IACUC.
  10. Przenieść perfundowane płuca do sterylnego i wolnego od pirogenów naczynia hodowlanego o średnicy 60 mm z 3 ml DMEM. Za pomocą kleszczy preparacyjnych usuń drogi oddechowe i inny twardy materiał tkankowy inny niż płucny, jeśli jest obecny. Tkankę płucną zmielić skalpelem do wielkości <1 mm.
  11. Dodać 300 μg/ml Liberazy TL i 5 U/ml DNazy I, wymieszać pipetując i inkubować w temperaturze 37°C w inkubatorze przez 25 minut. Delikatnie wymieszać raz, pipetując po 10 minutach.
  12. Przepuść zdysocjowane płuca przez sitko o wielkości 100 μm zainstalowane na stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Użyj tylnej części tłoka ze strzykawki o pojemności 1 ml, aby rozgnieść grudki komórek na filtrze. Umyj filtr 20 ml buforem płuczącym (PBS + 2% inaktywowany termicznie FBS + 2 mM EDTA).
  13. Wirować przy 500 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Odrzucić sklarowany osad i ponownie zawiesić osad komórek w 20 ml buforu do przemywania wody.
  14. Powtórz kroki 2.12 i 2.13 dwukrotnie, za każdym razem zmieniając filtr i rurkę. Wstępne namoczenie filtra w buforze płuczącym przez ponad pięć minut zwiększa wydajność AM. Przygotować zawiesinę jednokomórkową, dodając 100 μl buforu przepływowego/sortującego do osadu komórkowego.
  15. Zablokuj niespecyficzne przeciwciało wiążące się z receptorem Fc, dodając mysi blok Fc (klon 2,4G2, 10 μg/ml) i inkubując przez 20 minut na lodzie.
  16. Wykonaj barwienie przeciwciał wraz z FMO i kontrolami pojedynczego barwienia11,25. Oceń komórki płuc za pomocą analizatora komórkowego (patrz tabela materiałów), a następnie przeprowadź analizę cytometrii przepływowej pojedynczych komórek za pomocą oprogramowania analitycznego.
  17. Sortować AM za pomocą sortera komórek (patrz Tabela materiałów) bezpośrednio do 1 ml mysiej pożywki hodowlanej AM, gdy AM są przeznaczone do hodowli in vitro lub transferu komórek in vivo. Alternatywnie, posortuj AM do 1 ml buforu do lizy uzupełnionego 10 μl/ml β-merkaptoetanolu w celu ekstrakcji RNA.

3. Izolacja AM od ludzkiego płynu BAL

  1. Zorganizować transfer ludzkiego płynu BAL z kliniki do laboratorium w temperaturze 4 °C.
  2. Odwirować płyn BAL (10 - 50 ml) przy 250 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut. Osad komórkowy zawiera komórki BAL11.
  3. Przepłukać osad 20 ml buforem do przemywania (PBS + 2% inaktywowany termicznie FBS + 2 mM EDTA) i odwirować przy 250 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut.
  4. Ponowne zawieszenie komórek BAL znajduje się w 100 μl buforu przepływowego/sortującego (PBS + 2% Heat inactivated FBS + 1 mM EDTA + 25 mM HEPES).
  5. Zablokuj nieswoiste przeciwciało wiążące się z receptorem Fc, dodając ludzki blok Fc (klon Fc1.3070, 25 μg/ml) i inkubując przez 20 minut na lodzie.
  6. Wykonaj barwienie przeciwciałami wraz z FMO i kontrolą pojedynczego barwienia11,24. Oceń komórki BAL za pomocą analizatora komórek (patrz tabela materiałów), a następnie przeprowadź analizę cytometrii przepływowej pojedynczej komórki za pomocą oprogramowania analitycznego.
  7. Sortować AM za pomocą sortera komórkowego (patrz tabela materiałów) bezpośrednio do 1 ml ludzkiej pożywki hodowlanej AM lub 1 ml buforu do lizy uzupełnionego 10 μl/ml β-merkaptoetanolu.

4. Hodowla in vitro AM

  1. Po posortowaniu komórek zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 250 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut.
  2. Zawiesić ludzkie AM w 1 ml ludzkiej pożywki hodowlanej AM [pożywka Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 uzupełniona 10% FBS, 20% supernatantem hodowli L-929 (jako źródło czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF), 100 U/ml stężenie końcowe), 1 mM pirogronianu sodu, 10 mM kwasu N-2-hydroksyetylopiperazyno-N'-2-etanosulfonowego (HEPES) i 1x penicylina/streptomycyna (opcjonalnie)]. Podobnie, ponownie zawieś mysie AM w 1 ml mysiej pożywki hodowlanej AM [DMEM uzupełniony 10% FBS, 20% supernatantem hodowli L-929 (jako źródło M-CSF, 100 U/ml stężenia końcowego), 1 mM pirogronianu sodu, 10 mM HEPES i 1x penicylina/streptomycyna (opcjonalnie)].
  3. Zliczyć komórki żywotne z wyłączeniem błękitu trypanowego za pomocą licznika komórek i dostosować stężenie komórek żywotnych na poziomie 1 x 106/ml.
    UWAGA: Idealnie, z płynu BAL pobranego od 8-10 tygodniowego samca myszy C57BL/6 można wyizolować do 5 x 105 AMs. Wydajność AM z trawienia płuc myszy jest zmienna i może być nieco mniejsza niż w przypadku płynu BAL myszy. Wydajność AM z ludzkiego płynu BAL zależy od objętości płynu BAL, całkowitej objętości soli fizjologicznej użytej w płukaniu i stanu klinicznego pacjenta.
  4. W zależności od plonu i konieczności doświadczalnej wysiewaj komórki w szkiełkach komorowych, szalkach hodowlanych lub kolbach hodowlanych. Najlepiej wysiać AMs w proporcjach 1 x 105/ml z 10 ml pożywki w kolbie do hodowli tkankowych T25.
  5. Inkubować komórki w inkubatorze nawilżanym o temperaturze 37 °C z 5% atmosferąCO2.
    UWAGA: AM będą rosły jako komórki przylegające i rosną bardzo wolno (czas podwojenia >7 dni).
  6. Po 24 godzinach od wysiewu AM powinny przylegać i nie zostaną oderwane przez delikatną zmianę pożywki hodowlanej. Usunąć pożywkę przez aspirację z jednego końca i uzupełnić świeżą pożywką podgrzaną do temperatury 37 °C.
    UWAGA: Komórki mogą być teraz wykorzystywane do oceny fizjologii AM lub wpływu bodźców. Preparaty AM hodowane na szkiełkach komórkowych mogą być wygodnie barwione odpowiednimi przeciwciałami i idealnie nadają się do wizualizacji mikroskopowej. W celu oceny cytometrii przepływowej AM zbiera się przez inkubację z nieenzymatycznym roztworem dysocjującym komórki.
  7. Odessać pożywkę hodowlaną i dodać roztwór dysocjujący w ilości wystarczającej do pokrycia powierzchni hodowli (około 2 ml na kolbę T25) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5-10 minut. Nie będzie konieczne skrobanie i nie zaleca się mechanicznego skrobania komórek. Delikatnie postukaj w boki, dodaj 1-2 ml buforu przepływowego/sortującego i delikatnie pipetuj w górę i w dół, aby odłączyć większość przylegających komórek.
  8. W przypadku badań RNA należy poddać komórki lizie bezpośrednio na szalce hodowlanej, dodając bufor do lizy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Podejście z wykorzystaniem cytometrii przepływowej w celu identyfikacji makrofagów pęcherzykowych (AM) myszy przedstawiono na Rysunku 1. Obejmuje ono analizę minimalnego zestawu markerów powierzchniowych niezbędnych do odróżnienia AM od innych fagocytów rezydujących w płucach lub naciekających płuca. Niezbędna jest analiza różnicowa, aby jednoznacznie zidentyfikować AM wśród makrofagów śródmiąższowych, komórek dendrytycznych, neutrofili, monocytów oraz płucny...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

AM to długowieczne makrofagi rezydujące w płucach, które zasiedlają płuca począwszy od urodzenia i utrzymują się przez całe życie26. Ich rola w fizjologii płuc7 i patologii12 oraz ich potencjał do przewidywania autoimmunizacji płuc24 zostały rozpoznane. Ponieważ AM są długotrwałe obecne w płucach11,27 i ponieważ biorą udział w aktywacji i progresji odpowiedzi immunolog...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Clare Prendergast za pomoc w redagowaniu manuskryptu. DKN jest wspierany przez grant badawczy (#2095) z Flinn Foundation, a TM jest wspierany przez granty z National Institutes of Health (R01HL056643 i R01HL092514). DKN opracował metody, zaprojektował badanie i napisał manuskrypt; OM pomagał w badaniach na zwierzętach i pobieraniu próbek klinicznych; SB wspomagany analizą cytometryczną przepływową i sortowaniem komórek; TM nadzorował badania i recenzował manuskrypt.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Nieenzymatyczny roztwór dysocjujący komórkiMillipore-SigmaC5789
Puralube Vet MaśćDechra620300
Cewnik 22G Terumo Medical ProductsSR-OX2225CA
4-0 Niewchłanialny jedwabny szew pleciony Kent ScientificSUT-15-2
Dulbecco" s sól fizjologiczna buforowana fosforanami Blok myszy Corning21-031-CM
FC BD Biosciences553142
Bufor do lizy (zestaw PureLink RNA)Thermo Fisher Scientific 12183018A
b-merkaptoetanol Millipore-SigmaM6250 
Sorter komórek FACSAria II BD Biosciences644832
Ketamina  (Ketathesia)Henry Schein56344
Ksylazyna  (AnaSed)Akorn139-236
RPMI 1640Corning10-040-CM
DMEMCorning10-017-CM
Liberase TL Millipore-Sigma5401020001
DNaza IMilipore-SigmaAMPD1-1KT
100μ Filtr siatkowy M Corning352360
Ludzki blok FcBD Biosciences564220
EDTACorning46-034-CI
Hrabina II Automatyczny licznik komórekThermo Fisher Scientific 
Roztwór błękitu trypanowegoThermo Fisher Scientific 
HEPESCorning25-060-CI
Płodowa surowica bydlęca AtlantaBiologicalsS11150H
Linia komórkowa L-929Kolekcja kultur typu amerykańskiegoATCC,  CCL-1
Penicylina/Streptomycyna Corning30-002-CI
Pirogronian soduCorning25-000-CI
T25 Kolba do hodowli tkankowychThermo Fisher Scientific 
Naczynie hodowlane 60 mm Millipore-SigmaCLS3261
15 ml Probówka stożkowa Corning352097
50 ml Rurka stożkowa Analizator
LSRFortessaBD Biosciences657669
FlowJoFlowJov10.4Oprogramowanie analityczne
Anti-CD45 (mysz)Biolegend147709Clone I3/2.3, FITC sprzężony
z anty-CD11b (mysz)Biolegend101228Clone M1/70, PerCP/Cy5.5 sprzężony
anty-CD11c (mysz)BD Biosciences565452Klon N418, BV 421 sprzężony
Anti-I-Ab (mysz)Biolegend116420Klon AF6-120.1, PE/Cy7 sprzężony
anty-Siglec-F (mysz)BD Biosciences562757Klon E50-2440, PE-CF594 sprzężony
Anti-Siglec-H (mysz)Biolegend129605Klon 551, PE sprzężony
Anti-F4/80 (mysz)Biolegend123118Klon BM8, sprzężony APC/Cy7
Anty-Ly-6C (mysz)Biolegend128035Klon HK1.4, BV605 sprzężony
Anty-CD64 (mysz)Biolegend139311Klon X54-5/7.1, BV711 sprzężony
Anti-CD24 (mysz)BD Biosciences563115Klon M1/69, BV510 sprzężony
Anty-CD103 (Mysz)BD Biosciences745305Klon OX-62, BV650 sprzężony
Anty-CD317 (Mysz)Biolegend127015Klon 927, sprzężony APC
Anty-CXCR1 (Mysz)Biolegend149029Klon SA011F11, BV785 sprzężony
Anty-CD45 (Człowiek)Biolegend304017Klon HI30, AF488 sprzężony
Anty-CD11b (Człowiek)Biolegend101216Klon M1/70, PE/Cy7 sprzężony
Anty-HLA-DR (Człowiek)Biolegend307618Klon L243, sprzężony APC/Cy7
Anty-CD169 (Human)Biolegend346008Klon 7-239, APC sprzężony
Anty-CD206 (Human)Biolegend321106Klon 15-2, sprzężony z PE
Anty-CD163 (Human)Biolegend333612Klon GHI/61, BV421 sprzężony
AMQAX100015250061156367 komórek Corning 352098

Bibliografia

  1. Westphalen, K., et al. Sessile alveolar macrophages communicate with alveolar epithelium to modulate immunity. Nature. 506 (7489), 503-506 (2014).
  2. Guilliams, M., et al. Alveolar macrophages develop from fetal monocytes that differentiate into long-lived cells in the first week of life via GM-CSF. J Exp Med. 210 (10), 1977-1992 (2013).
  3. Cardani, A., Boulton, A., Kim, T. S., Braciale, T. J. Alveolar macrophages prevent lethal influenza pneumonia by inhibiting infection of type-1 alveolar epithelial cells. PLoS Pathog. 13 (1), e1006140(2017).
  4. Ghoneim, H. E., Thomas, P. G., McCullers, J. A. Depletion of alveolar macrophages during influenza infection facilitates bacterial superinfections. J Immunol. 191 (3), 1250-1259 (2013).
  5. MacLean, J. A., et al. Sequestration of inhaled particulate antigens by lung phagocytes. A mechanism for the effective inhibition of pulmonary cell-mediated immunity. Am J Pathol. 148 (2), 657-666 (1996).
  6. Nakamura, T., et al. Depletion of alveolar macrophages by clodronate-liposomes aggravates ischemia-reperfusion injury of the lung. J Heart Lung Transplant. 24 (1), 38-45 (2005).
  7. Schneider, C., et al. Alveolar macrophages are essential for protection from respiratory failure and associated morbidity following influenza virus infection. PLoS Pathog. 10 (4), e1004053(2014).
  8. Pribul, P. K., et al. Alveolar macrophages are a major determinant of early responses to viral lung infection but do not influence subsequent disease development. J Virol. 82 (9), 4441-4448 (2008).
  9. Macdonald, D. C., et al. Harnessing alveolar macrophages for sustained mucosal T-cell recall confers long-term protection to mice against lethal influenza challenge without clinical disease. Mucosal Immunol. 7 (1), 89-100 (2014).
  10. Benoit, A., Huang, Y., Proctor, J., Rowden, G., Anderson, R. Effects of alveolar macrophage depletion on liposomal vaccine protection against respiratory syncytial virus (RSV). Clin Exp Immunol. 145 (1), 147-154 (2006).
  11. Nayak, D. K., et al. Long-term persistence of donor alveolar macrophages in human lung transplant recipients that influences donor specific immune responses. Am J Transplant. 16 (8), 2300-2311 (2016).
  12. Sekine, Y., et al. Role of passenger leukocytes in allograft rejection: effect of depletion of donor alveolar macrophages on the local production of TNF-alpha, T helper 1/T helper 2 cytokines, IgG subclasses, and pathology in a rat model of lung transplantation. J Immunol. 159 (8), 4084-4093 (1997).
  13. Borie, R., et al. Pulmonary alveolar proteinosis. Eur Respir Rev. 20 (120), 98-107 (2011).
  14. Greenhill, S. R., Kotton, D. N. Pulmonary alveolar proteinosis: a bench-to-bedside story of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor dysfunction. Chest. 136 (2), 571-577 (2009).
  15. Happle, C., et al. Pulmonary transplantation of macrophage progenitors as effective and long-lasting therapy for hereditary pulmonary alveolar proteinosis. Sci Transl Med. 6 (250), 250ra113(2014).
  16. Suzuki, T., et al. Pulmonary macrophage transplantation therapy. Nature. 514 (7523), 450-454 (2014).
  17. Hashimoto, D., et al. Tissue-resident macrophages self-maintain locally throughout adult life with minimal contribution from circulating monocytes. Immunity. 38 (4), 792-804 (2013).
  18. Murphy, J., Summer, R., Wilson, A. A., Kotton, D. N., Fine, A. The prolonged life-span of alveolar macrophages. Am J Respir Cell Mol Biol. 38 (4), 380-385 (2008).
  19. Maus, U. A., et al. Resident alveolar macrophages are replaced by recruited monocytes in response to endotoxin-induced lung inflammation. Am J Respir Cell Mol Biol. 35 (2), 227-235 (2006).
  20. Perdiguero, G. E., et al. Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).
  21. Bitterman, P. B., Saltzman, L. E., Adelberg, S., Ferrans, V. J., Crystal, R. G. Alveolar macrophage replication. One mechanism for the expansion of the mononuclear phagocyte population in the chronically inflamed lung. J Clin Invest. 74 (2), 460-469 (1984).
  22. Misharin, A. V., et al. Monocyte-derived alveolar macrophages drive lung fibrosis and persist in the lung over the life span. J Exp Med. , (2017).
  23. Zheng, Z., et al. Donor pulmonary intravascular nonclassical monocytes recruit recipient neutrophils and mediate primary lung allograft dysfunction. Sci Transl Med. 9 (394), (2017).
  24. Nayak, D. K., et al. Zbtb7a induction in alveolar macrophages is implicated in anti-HLA-mediated lung allograft rejection. Sci Transl Med. 9 (398), (2017).
  25. Misharin, A. V., Morales-Nebreda, L., Mutlu, G. M., Budinger, G. R., Perlman, H. Flow cytometric analysis of macrophages and dendritic cell subsets in the mouse lung. Am J Respir Cell Mol Biol. 49 (4), 503-510 (2013).
  26. Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells. Nat Immunol. 16 (1), 36-44 (2015).
  27. Eguiluz-Gracia, I., et al. Long-term persistence of human donor alveolar macrophages in lung transplant recipients. Thorax. 71 (11), 1006-1011 (2016).
  28. Yu, Y. A., et al. Flow cytometric analysis of myeloid cells in human blood, bronchoalveolar lavage, and lung tissues. Am J Respir Cell Mol Biol. , (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

p ukanie oskrzelowo p cherzykowecytometria przep ywowaizolacja kom rektrawienie tkanekhodowla kom rkowamarkery powierzchnioweCD45 dodatnieCD11c dodatnieSiglec F dodatnie
Izolacja i hodowla in vitro mysich i ludzkich makrofagów pęcherzykowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.