Artykuł metodologiczny

Metoda badania polimorfizmu C924T genu receptora tromboksanu A2

11.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57289

⸱

1 kwietnia 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1SS Annunziata University Hospital, Unit of Clinical Molecular Biology and Predictive Medicine, University of Chieti, 2Department of Medical, Oral and Biotechnological Sciences, University of Chieti, 3Department of Biotechnological and Applied Clinical Sciences, University of L'Aquila, 4CNR - Institute of Molecular Genetics, Section of Chieti

W tym artykule

Podsumowanie

W niniejszym badaniu opisujemy metodologię analizy genotypu C924T. Protokół składa się z trzech faz: ekstrakcji DNA, amplifikacji w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) oraz analizy polimorfizmu długości fragmentu restrykcyjnego (RFLP) na żelu agarozowym.

Streszczenie

Gen receptora tromboksanu A2 (TBXA2R) należy do nadrodziny białkowej G z siedmioma regionami transbłonowymi. Bierze udział w progresji miażdżycy, niedokrwieniu i zawale mięśnia sercowego. W artykule przedstawiono metodologię genotypowania pacjentów w celu zbadania potranskrypcyjnej roli polimorfizmu C924T (rs4523) zlokalizowanego w regionie 3' genu receptora TBXA2. Metoda ta opiera się na ekstrakcji DNA z krwi pełnej, amplifikacji części genu TBXA2 zawierającej mutację C924T za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) oraz identyfikacji genotypów typu dzikiego i/lub zmutowanych za pomocą analizy trawienia restrykcyjnego, w szczególności polimorfizmu długości fragmentu restrykcyjnego (RFLP) w żelu agarozowym. Ponadto wyniki zostały potwierdzone przez sekwencjonowanie genu TBXA2R. Metoda ta ma kilka potencjalnych zalet, takich jak wysoka skuteczność i szybka identyfikacja polimorfizmu C924T za pomocą PCR i analizy enzymów restrykcyjnych. Takie podejście pozwala na badanie predykcyjne tworzenia się blaszek miażdżycowych i progresji miażdżycy poprzez analizę genotypów pacjentów pod kątem polimorfizmu TBXA2R C924T. Zastosowanie tej metody może potencjalnie zidentyfikować osoby, które są bardziej podatne na procesy miażdżycowe, w szczególności osoby w grupie wysokiego ryzyka leczonej aspiryną.

Wprowadzenie

TBXA2R należy do nadrodziny białkowej G z siedmioma regionami transbłonowymi, które są szeroko wyrażane i zlokalizowane na błonach komórkowych lub w strukturach wewnątrzkomórkowych1,2. Szlak sygnałowy TBXA2R bierze udział w zaawansowanych procesach miażdżycowych3. Zwiększoną ekspresję receptora TBXA2 wykazano podczas progresji miażdżycy, a badania kliniczne i eksperymentalne wykazały jego istotną rolę w niedokrwieniu i zawale mięśnia sercowego4. C924T, polimorfizm pojedynczego nukleotydu (SNP) genu TBXA2R, został rozpoznany jako funkcjonalny polimorfizm u zdrowych ochotników i został powiązany z zaburzeniami klinicznymi5. Co więcej, nasze poprzednie badanie6 wykazało, że polimorfizm C924T genu TBXA2R jest zaangażowany w stabilność transkryptu; w szczególności występuje zwiększona niestabilność transkryptu typu zmutowanego (TT) w stosunku do typu dzikiego (CC). Ponadto kilka bodźców, takich jak difosforan adenozyny (ADP), epinefryna i kolagen w różnych stężeniach, indukowało agregację płytek krwi mniej skuteczną dla typu zmutowanego (TT). Jest to zgodne ze zmniejszonym tworzeniem się skrzeplin i hemostazą. Zatem niestabilność transkryptu TBXA2R i związane z nią zmniejszenie agregacji płytek krwi mogą być związane z ochronną rolą genotypu TBXA2R TT przed zakrzepicą tętnic i jej powikłaniami u pacjentów wysokiego ryzyka leczonych aspiryną6.

Tutaj opisujemy metodologię genotypowania pacjentów w celu zbadania potranskrypcyjnej roli polimorfizmu C924T (rs4523) zlokalizowanego w regionie 3' genu receptora TBXA2. Metoda ta opiera się na następujących etapach: (1) ekstrakcja DNA z krwi pełnej, (2) amplifikacja PCR części genu TBXA2R zawierającej mutację C924T oraz (3) identyfikacja dzikich i/lub zmutowanych genotypów za pomocą polimorfizmu długości fragmentu restrykcyjnego (RFLP) na żelu agarozowym. RFLP to technika, która wykorzystuje zmiany w homologicznych sekwencjach DNA7. Aplikacja ta została wykorzystana do wykrywania polimorfizmów DNA, zwłaszcza SNP, oraz do znajdowania i kojarzenia znaczenia biologicznego w odmianach genetycznych8. Polimorfizm analizowany po raz pierwszy przy użyciu RFLP-PCR u ludzi to ABO blood9. Metoda RFLP-PCR pozwala na analizę mutacji genetycznych w homologicznych sekwencjach DNA poprzez ocenę obecności fragmentów o różnej długości po trawieniu DNA przy użyciu wysoce specyficznych endonukleaz restrykcyjnych10.

W ubiegłych latach następujące metodologie były wykorzystywane do analizy SNP przy użyciu techniki PCR: hybrydyzacja krótkich oligonukleotydów specyficznych dla alleli11, PCR12, rozszerzenie startera na mikromacierze DNA13, test ligacji oligonukleotydów14, Bezpośrednie sekwencjonowanie DNA do identyfikacji specyficznych dla pozycji polimorfizmów pojedynczego nukleotydu15, Taqman method16, spektrometria mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą ekstrakcją (MALDI-TOF) spektrometria masowa17, oraz GeneChips18. Techniki te nie są proste w użyciu i mogą wymagać drogiego sprzętu. I odwrotnie, metoda PCR-RFLP jest niedroga, prosta w użyciu, wygodna, ma wysoką skuteczność i umożliwia szybką identyfikację polimorfizmu C924T. Dodatkowo potwierdziliśmy wyniki poprzez sekwencjonowanie genu TBXA2R przy użyciu metody Sangera15.

To podejście pozwala na predykcyjne badanie powstawania blaszek miażdżycowych i progresji miażdżycy poprzez analizę genotypów pacjentów pod kątem polimorfizmu TBXA2R C924T. Metoda ta może zidentyfikować osoby bardziej podatne na procesy miażdżycowe, w szczególności wśród pacjentów wysokiego ryzyka leczonych aspiryną.

Protokół

Protokół jest zgodny z wytycznymi Komisji Etyki Badań Medycznych Uniwersytetu w Chieti.

1. Konfiguracja odczynnika

  1. Przygotować bufor Tris-EDTA (TE) (pH 8,0). Dodać 200 μl EDTA 0,5 M i 1 ml Tris-Cl 1 M do zlewki i doprowadzić do 100 ml sterylną wodą. Końcowe stężenie buforu TE: 10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA. Przechowywać w temperaturze pokojowej (RT).
  2. Przygotować 1 l 10-krotnego buforu do elektroforezy roztworu podstawowego (TBE). Rozpuścić 108 g zasady Tris, 55 g kwasu borowego i 40 ml EDTA 0,5 M (pH 8) w zlewce i doprowadzić do objętości 1 l sterylną wodą. Sklep w RT.
  3. Przygotuj barwnik ładujący żel. Rozpuścić 0,25 g błękitu bromofenolowego, 0,25 g cyjanolu ksylenowego FF, 50 g glicerolu, 1 mM EDTA (pH 8) w 60 ml wody dejonizowanej lub destylowanej i doprowadzić do objętości 100 ml sterylną wodą. Przechowywać w temperaturze 4 °C (przez kilka miesięcy) lub w temperaturze -20 °C (przez lata)
  4. Przygotuj 200 ml 2% żelu agarozowego. Używaj go świeżego lub alternatywnie przechowuj zestalony w temperaturze pokojowej do kilku tygodni.
    1. Rozpuścić 4 g agarozy w 200 ml 1x buforu TBE w zlewce o pojemności 600 ml. Mieszaj za pomocą miksera magnetycznego przez około 5 minut, aż agaroza całkowicie się zawiesi
      2. .
    2. Podgrzej 2% roztwór agarozy we wrzącej wodzie lub na gorącym talerzu (przez około 10 minut, aż agaroza całkowicie się rozpuści). Należy pamiętać, że zlewka z żelem agarozowym musi być przykryta folią aluminiową. Alternatywnie podgrzej odkrytą zlewkę w kuchence mikrofalowej w wysokiej temperaturze przez około 3–5 minut.
    3. Zamieszaj 2% roztwór agarozy za pomocą mieszadła magnetycznego, sprawdzając, czy agaroza jest całkowicie rozpuszczona.
      UWAGA: Cząstki agarozy pojawiają się jako półprzezroczyste ziarna przed całkowitym rozpuszczeniem. Może być konieczne podgrzewanie cząstek przez kilka minut (około 5–10 minut).
    4. Jeżeli używana jest przechowywana porcja żelu agarozowego, podgrzewać zlewkę pokrytą folią aluminiową w gorącej łaźni wodnej (o temperaturze około 60 °C) aż do rozpuszczenia agarozy. Usunąć pipetą Pasteura wszelkie "ślady" zestalonej agarozy z powierzchni przed nalewaniem.

2. Oczyszczanie DNA

  1. Przed rozpoczęciem oczyszczania wykonaj następujące czynności:
    1. Użyć próbek świeżej krwi pełnej ludzkiej lub szybko rozmrozić zamrożone próbki krwi pełnej (przez około 2–3 minuty) w łaźni wodnej (w temperaturze 37 °C), lekko mieszając, a następnie zrównoważyć do RT przed użyciem.
    2. Wymieszaj świeże lub rozmrożone próbki krwi, kilkakrotnie odwracając probówki.
  2. Procedurę oczyszczania należy rozpocząć zgodnie z protokołami dostawcy dla 100 μl objętości elucji.
  3. Określić ilościowo i obliczyć czystość DNA, mierząc absorbancję przy 260, 280 i 320 nm.
    1. Użyć sterylnej wody do rozcieńczenia próbek i skalibrowania spektrofotometru.
    2. Zastosować następujący wzór w celu obliczenia stężenia próbki DNA = 50 μg/ml x (A260 − A320) x współczynnik rozcieńczenia oraz czystości DNA = (A260 − A320)/(A280 − A320), przy dopuszczalnym stosunku między 1,7 a 1,9.

3. Amplifikacja PCR próbek DNA

  1. Przygotować 25 μl mieszaniny reakcyjnej w probówce do mikroamplifikacji o pojemności 0,2 ml, jak pokazano w tabeli 1.
  2. Przeprowadzić amplifikację PCR oczyszczonych próbek DNA za pomocą automatycznego termocyklera, postępując zgodnie z programem amplifikacji przedstawionym w tabeli 2.
  3. Pod koniec amplifikacji PCR należy zatrzymać reakcje PCR, pozostawiając próbki DNA w temperaturze 4 °C.

4. RFLP produktów PCR

  1. Przygotować 22,5 μl roztworu mieszanki głównej dla każdej próbki, tak aby wybrany enzym restrykcyjny roztrawił produkty PCR, jak pokazano w tabeli 3.
  2. Przenieś 2,5 μl produktu PCR do nowej probówki PCR dla każdej próbki, używając pipety i końcówek filtrujących.
  3. Dodać 22,5 μl roztworu głównej mieszanki mineralizacyjnej do probówek zawierających produkt PCR z każdej próbki, używając pipety i końcówek filtrujących.
  4. Mieszaninę reakcyjną inkubować (roztwór mieszaniny wzorcowej i produkt PCR) w temperaturze 37 °C przez 4 godziny.

5. Analiza próbek PCR-RFLP za pomocą elektroforezy żelowej

  1. Wybarwić żel agarozowy, dodając bromek etydyny (EtBr) w stężeniu 0,5 μg/ml do żelu przez 10 minut. EtBr wiąże się z DNA, które można uwidocznić w świetle ultrafioletowym (UV).
    Uwaga: Ważne jest, aby używać rękawic i innych urządzeń ochronnych podczas obchodzenia się, przechowywania i usuwania EtBr, ponieważ jest to mutagen o potencjalnym działaniu rakotwórczym.
  2. Wlej przygotowany żel agarozowy do tacki na żel z założonym grzebieniem studzienki i poczekaj, aż stężeje.
  3. Umieść zestalony żel agarozowy w pudełku żelowym (jednostka do elektroforezy).
  4. Napełnij pojemnik z żelem 1x TBE, aż żel zostanie pokryty.
  5. Za pomocą pipety i końcówek filtrujących załadować 6 μl amplifikowanego DNA do trawienia (w szczególności 5 μl każdej próbki i 1 μl barwnika ładującego żel) do dołków żelu agarozowego. Dodaj marker wielkości DNA w oddzielnym studzience i równolegle z próbkami.
  6. Uruchom żel na 20–30 minut przy napięciu 100 V.
  7. Za pomocą transiluminatora UV zwizualizuj rozszczepione fragmenty DNA lub niestrawione produkty PCR, porównując fragmenty ze znacznikiem wielkości DNA i zarejestruj wyniki za pomocą fotografii zgodnie z instrukcjami producenta.
    Ostrzeżenie: Używaj urządzeń ochronnych (okulary ochronne lub maska na twarz) w pobliżu źródeł światła UV.

Wyniki

Celem tej metody jest ocena genotypu receptora tromboksanu A2 w odniesieniu do polimorfizmu C924T. Ludzki gen TBXA2R znajduje się w locus 19p13.3, obejmuje 15 kbp i składa się z trzech egzonów rozdzielonych dwoma intronami. Polimorfizm C924T genu TBXA2R (o długości 539 bp) został powielony przy użyciu starterów PCR przedstawionych na Rysunku 1, które zostały zaprojektowane w taki sposób, aby powielać specyficzny region DNA, a nie ortologiczny lub paralogiczny region niespecyficzny. Dodatkowo, w celu charakterystyki badanego SNP, przeprowadzono analizę RFLP produktów PCR z wykorzystaniem enzymu restrykcyjnego RsaI (Rysunek 1), a wyniki zwizualizowano na żelu agarozowym.

Na podstawie obecności fragmentów o różnych długościach po trawieniu DNA możliwe jest rozróżnienie genotypu pacjenta w obrębie polimorfizmu C924T. W rzeczywistości, jak pokazano na Rysunku 2, homozygotyczność allelu dominującego (CC) objawia się dwiema prążkami (395 i 144 bp), ponieważ enzym restrykcyjny precyzyjnie przecina fragment genu TBXA2R w obrębie miejsca polimorfizmu C924T. Homozygotyczność allelu rzadszego (TT) przejawia się pojedynczym prążkiem (539 bp), ponieważ cięcie enzymem restrykcyjnym nie zachodzi. Allel heterozygotyczny (CT) wykazuje trzy prążki (539, 395 i 144 bp). Jak pokazano na Rysunku 2, polimorfizm C924T, zdefiniowany przez trawienie produktu PCR enzymem RsaI, został potwierdzony analizą sekwencjonowania.

KomponentObjętość (µL)Stężenie końcowe
10x bufor do PCR Tween-20 (15 mM MgCl2)2)0.251,5 MgCl22 mmol/L
mieszanina dNTP (10 mM)1200 µM
Starter (przedni) (10 pmol/µM)10.4 µM/µL
Starter (odwrócony) (10 pmol/µM)10.4 µM/µL
Taq polimeraza (5 U/µL)0.21 U/µL
Próbka DNA (42 ng/µL)142 ng/µL
woda wolna od DNaz20.55
Suma25

Tabela 1: Konfiguracja amplifikacji PCR. Mieszanina reakcyjna master-mix o objętości 25 µL przygotowana w probówce PCR 0,2 mL w celu amplifikacji pojedynczej próbki DNA.

Standardowa reakcja PCR
Wstępny etap aktywacji5 min95 °C
cykl trójetapowy
Denaturacja30 s94 °C
Wyżarzanie60 s55 °C
Rozszerzenie60 s72 °C
Liczba cykli30 cykli
Końcowe przedłużenie8 min72 °C

Tabela 2: Program amplifikacji PCR. Ustaw automatyczny termocykler w celu przeprowadzenia reakcji PCR i amplifikacji matrycowego DNA. Reakcje PCR zatrzymuje się poprzez schłodzenie do 4 °C.

KomponentObjętość (µL) (n = 1)Objętość (µL) (n = 10)*
bufor enzymatyczny 10x2.527.5
enzym restrykcyjny (5 U/µL)0.55.5
woda wolna od DNaz19.5214.5
Suma22.5247.5

Tabela 3: Trawienie produktów PCR enzymami restrykcyjnymi. Przygotowuje się roztwór master-mix w taki sposób, aby wybrany enzym restrykcyjny strawił produkty PCR. *: Aby przygotować roztwór master-mix dla 10 próbek, należy dodać 10% więcej, przygotowując ostatecznie 11 próbek.

figure-results-1
Rysunek 1: Primery PCR i enzym restrykcyjny RsaI. Primery bezpośrednie i odwrotne zaprojektowane do amplifikacji fragmentu genu TBXA2R o długości 539 bp zawierającego polimorfizm C924T. RsaI to enzym restrykcyjny wybrany do rozpoznawania sekwencji GTAC. ˅: miejsce cięcia enzymu RsaI. C(/T): polimorfizm C924T. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rycina 2: Wzór elektroforetyczny i analiza sekwencji DNA. (A) Genotyp C924T jest rozpoznawany na podstawie wzoru RFLP po trawieniu specyficznym enzymem RsaI. (B) Analiza sekwencji DNA: Wyniki uzyskane metodą RFLP po trawieniu enzymem restrykcyjnym RsaI zostały potwierdzone analizą sekwencji, wykazującą polimorfizm C924T. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy De Iuliis et al., Prostaglandins & Other Lipid Mediators6. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

W niniejszym badaniu opisaliśmy metodologię, która umożliwia genotypowanie pacjentów w celu zbadania potranskrypcyjnej roli polimorfizmu C924T (rs4523) zlokalizowanego w regionie 3' genu TBXA2R. Po pierwsze, metoda ta polega na ekstrakcji DNA z krwi pełnej. W szczególności ten pierwszy proces polega na oczyszczeniu całkowitego ludzkiego DNA, genomowego i mitochondrialnego, z próbek krwi pełnej, świeżych lub mrożonych, poddanych działaniu EDTA (cytrynianu lub heparyny). W przypadku krótkotrwałego przechowywania próbek krwi pełnej należy przechowywać w temperaturze 2-8 °C przez okres do 10 dni. W przypadku przechowywania przez 10 dni próbki należy przechowywać w temperaturze -70 °C. Zautomatyzowany proces oczyszczania składa się z 4 etapów: lizyzacji, wiązania, mycia i elucji. Po drugie, metoda opiera się na amplifikacji PCR części genu TBXA2R zawierającej mutację C924T. Na koniec przeprowadza się identyfikację dzikiego typu i/lub zmutowanego genotypu za pomocą analizy enzymu restrykcyjnego (RFLP) na żelu agarozowym.

Kluczowe etapy protokołu są następujące: (i) W przypadku użycia części żelu agarozowego przechowywanego w temperaturze pokojowej, zestaloną agarozę można ponownie rozpuścić we wrzącej łaźni wodnej (w temperaturze 60 °C przez około 15-20 minut) lub w kuchence mikrofalowej (3-5 minut) przed nalewaniem. Uwaga: poluzuj nakrętkę podczas ponownego topienia agarozy w butelce. (ii), ponadto, przy ponownym podgrzewaniu agarozy, odparowanie spowoduje wzrost jej stężenia. Z tego powodu przydatna może być kompensacja poprzez dodanie niewielkiej ilości wody. (iii) Fragmenty DNA o długości mniejszej niż 1000 pz różnicowano za pomocą żelu agarozowego i zaleca się bufor TBE w celu uzyskania najlepszej możliwej separacji. (iv) Wolimy używać żelu agarozowego niż żelu poliakrylamidowego, ponieważ przygotowanie tego ostatniego jest trudniejsze, a jego przygotowanie zajmuje znacznie więcej czasu. (v) Wybór czasu trwania elektroforezy żelowej zależy od oczekiwanej wielkości produktów amplifikacji. W oparciu o ten protokół wystarczy wykonać elektroforezę przez 20-30 minut przy napięciu 100 V w 2% żelu agarozowym, ponieważ wielkość fragmentów PCR waha się od 100 do 500 pz. (vi) Obowiązkowe jest uzyskanie od 10 do 50 ng dobrej jakości matrycy DNA wyekstrahowanej z próbek ludzkich. Z tego powodu wolimy stosować automatyczne oczyszczanie DNA niż półautomatyczne lub ręczne. (vii) Przygotować reakcję master-mix do amplifikacji PCR i roztwór master-mix do trawienia produktów PCR, dodając 10% więcej (w celu uwzględnienia utraty cieczy podczas pipetowania) do obliczonej objętości pomnożonej przez liczbę próbek na objętość wymaganą dla jednej próbki DNA.

Najczęstszą pułapką tej metody jest obecność dodatkowych produktów amplifikacji spowodowanych nieprawidłowym programem termocyklera, niewłaściwym preparatem master-mix amplifikacji lub zanieczyszczeniem matrycą DNA. Co więcej, brak produktów PCR może być spowodowany inaktywowaną polimerazą Taq lub nieprawidłowym uruchomieniem termocyklera. Ponadto obecność nieoczekiwanych fragmentów może być spowodowana zanieczyszczeniem produktu metodą PCR lub niepełnym trawieniem przez inaktywowany enzym, zbyt małą objętością enzymu restrykcyjnego lub zbyt krótkim czasem inkubacji.

W ostatnich latach do analizy SNP przy użyciu techniki PCR wykorzystano następujące metodologie: hybrydyzacja oligonukleotydów specyficznych dla krótkich alleli11, PCR swoista dla alleli12, rozszerzenie starterów na mikromacierzach DNA13, test ligacji oligonukleotydów14, bezpośrednie sekwencjonowanie DNA do identyfikacji polimorfizmów pojedynczego nukleotydu specyficznychdla pozycji 15, metoda Taqmana16, spektrometria mas MALDI-TOF (MALDI-TOF) z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą ekstrakcją17 oraz GeneChips18. Metody te nie są idealne, ponieważ nie są proste w użyciu i/lub wymagają drogiego sprzętu. I odwrotnie, metoda PCR-RFLP opisana w tym badaniu jest niedroga, prosta w użyciu, wygodna, ma wysoką skuteczność i pozwala na szybką identyfikację polimorfizmu C924T. Ograniczeniem obecnej metody jest to, że może być ona stosowana tylko w odniesieniu do niewielkiej liczby SNP i kilku próbek w sesji roboczej.

W przyszłych zastosowaniach metoda ta może być wykorzystana do badań predykcyjnych dotyczących tworzenia się blaszek miażdżycowych i progresji miażdżycy poprzez analizę genotypów pacjentów pod kątem polimorfizmu TBXA2R C924T. Co więcej, metoda ta może zidentyfikować osoby bardziej podatne na procesy miażdżycowe, w szczególności pacjentów wysokiego ryzyka leczonych aspiryną. Wreszcie, metoda ta może być zastosowana do badania innych polimorfizmów związanych z medycyną spersonalizowaną dla określonych leków (na przykład leków przeciwzakrzepowych i przeciwdrgawkowych) w celu zrozumienia odpowiedniej dawki leku oraz indywidualnej odpowiedzi farmakologicznej i klinicznej dla każdego pacjenta przed rozpoczęciem terapii i uniknięcia działań niepożądanych.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ten projekt został częściowo sfinansowany z 60% grantów Ateneo od Ministero dell'Università, Włochy dla S.M. i E.T. Otrzymaliśmy również częściowy wkład w wydatki badawcze ze strony Wydziału Nauk Medycznych, Jamy Ustnej i Biotechnologii Uniwersytetu w Chieti "G. d'Annunzio".

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
QIAsymphony SPQIAGEN
EPPENDORF6131-02222
Oświetlacz UVUVP732-110
Probówki do PCREPPENDORFH0030121589
Termocykler do PCREPPENDORF5331-03721
Pipety i końcówki filtrująceEPPENDORFH4910000018/42/69 I 0030067037/10/02
Horyzontalna aparatura do elektroforezy miniżelowejDIATECH PHORESIS 10RI002-10
Suchy blok grzewczyPODWÓJNY INKUBATORDG210
QIAsymphony DNA Midi KitQIAGEN931255
10x bufor PCR (zwykle dostarczany przez producenta z polimerazą Taq)DIATECH I TAKARAT0100 I R0001DM
PolimerazaTaq TAKARAR0001DM
mieszanina dNTPDIATECH  farmakogenetykaNM001dNTP MIX 10x 100 mikrolitrów, 10 mM
startery PCRDIATECH  farmakogenetyka\\Enzym
restrykcyjny RsaINew England biolabsR0167L
Enzym restrykcyjny 10x buforNew England biolabsR0167L
AgarozaSigmaA9539Fragmenty DNA najlepiej rozdzielać w buforze TBE
Baza Trisbaza SigmaT6066
Kwas borowySigmaB7901
0,5 M EDTA, pH 8,0SigmaE7889
10% (wag./obj.) nadsiarczan amonuSigmaE3678przygotowywany świeży za każdym razem
EtBr ( 0,5 μ g/μ L)SigmaE8751
Błękit bromofenolowySigmaB0126
Ksylenol cyjanol FFSigmaX4126
GlicerolSigmaG5516
Marker wielkości DNADIATECH  farmakogenetykaR1002-10Plazmid pBluescript II SK (+) restrict MSPI
Sterylna woda (autoklawowana)DIATECH  farmakogenetyka\\
Spektrofotometr 937055

Bibliografia

  1. Shen, R. F., Tai, H. H. Thromboxanes: synthase and receptors. J Biomed Sci. 5 (3), 153-172 (1998).
  2. Nusing, R. M., Hirata, M., Kakizuka, A., Eki, T., Ozawa, K., Narumiya, S. Characterization and chromosomal mapping of the human thromboxane A2 receptor gene. J Biol Chem. 268 (33), 25253-25259 (1993).
  3. Cyrus, T., Ding, T., Praticò, D. Expression of thromboxane synthase, prostacyclin synthase and thromboxane receptor in atherosclerotic lesions: correlation with plaque composition. Atherosclerosis. 208 (2), 376-381 (2010).
  4. Cipollone, F., et al. A Polymorphism in the Cyclooxygenase 2 Gene as an Inherited Protective Factor Against Myocardial Infarction and Stroke. JAMA. 291 (18), 2221-2228 (2004).
  5. Fontana, P., et al. Identification of functional polymorphisms of the thromboxane A2 receptor gene in healthy volunteers. Thromb Haemost. 96 (3), 356-360 (2006).
  6. De Iuliis, V., et al. Differential TBXA2 receptor transcript stability is dependent on the C924T polymorphism. Prostaglandins Other Lipid Mediat. pii. (17), (2017).
  7. Saiki, R. K., et al. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science. 230 (4732), 1350-1354 (1985).
  8. Collins, F. S., Brooks, L. D., Chakravarti, A. A DNA polymorphism discovery resource for research on human genetic variation. Genome Res. 8 (12), 1229-1231 (1998).
  9. Lee, J. C. -I., Chang, J. -G. ABO genotyping by polymerase chain reaction. J. Forensic Sci. 37 (5), 1269-1275 (1992).
  10. Masao, O., Hirofumi, F., Jerzy, K. K., Hidetoshi, I. Single nucleotide polymorphism detection by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism. Nature Protocols. 2 (11), 2857-2864 (2007).
  11. Iwasaki, H., et al. Accuracy of genotyping for single nucleotide polymorphisms by a microarray-based single nucleotide polymorphism typing method involving hybridization of short allele-specific oligonucleotides. DNA Res. 9 (2), 59-62 (2002).
  12. Papp, A. C., Pinsonneault, J. K., Cooke, G., Sadee, W. Single nucleotide polymorphism genotyping using allele-specific PCR and fluorescence melting curves. Biotechniques. 34 (5), 1068-1072 (2003).
  13. O'Meara, D., Ahmadian, A., Odeberg, J., Lundeberg, J. SNP typing by apyrase-mediated allele-specific primer extension on DNA microarrays. Nucleic Acids Res. 30 (15), e75(2002).
  14. Pickering, J. Integration of DNA ligation and rolling circle amplification for the homogeneous, end-point detection of single nucleotide polymorphisms. Nucleic Acids Res. 30 (12), e60(2002).
  15. Chatterjee, P. D. Direct sequencing of bacterial and P1 artificial chromosome-nested deletions for identifying position-specific single-nucleotide polymorphisms. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96 (23), 13276-13281 (1999).
  16. Livak, K. J. Allelic discrimination using fluorogenic probes and the 5' nuclease assay. Genet. Anal. 14 (5-6), 143-149 (1999).
  17. Haff, L. A., Smirnov, I. P. Single-nucleotide polymorphism identification assays using a thermostable DNA polymerase and delayed extraction MALDI-TOF mass spectrometry. Genome Res. 7 (4), 378-388 (1997).
  18. Gunderson, K. L., Steemers, F. L., Lee, G., Mendoza, L. G., Chee, M. A genome-wide scalable SNP genotyping assay using microarray technology. Nat. Genet. 37 (5), 549-554 (2005).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ekstrakcja DNAamplifikacja PCRpolimorfizm d ugo ci fragment w restrykcyjnychelektroforeza w elu agarozowymanaliza RFLPsekwencjonowanie gen wmetoda genotypowaniabadania nad aterotromboz

Powiązane artykuły