Metoda badania polimorfizmu C924T genu receptora tromboksanu A2

Summary

W niniejszym badaniu opisujemy metodologię analizy genotypu C924T. Protokół składa się z trzech faz: ekstrakcji DNA, amplifikacji w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) oraz analizy polimorfizmu długości fragmentu restrykcyjnego (RFLP) na żelu agarozowym.

Abstract

Gen receptora tromboksanu A2 (TBXA2R) należy do nadrodziny białkowej G z siedmioma regionami transbłonowymi. Bierze udział w progresji miażdżycy, niedokrwieniu i zawale mięśnia sercowego. W artykule przedstawiono metodologię genotypowania pacjentów w celu zbadania potranskrypcyjnej roli polimorfizmu C924T (rs4523) zlokalizowanego w regionie 3' genu receptora TBXA2. Metoda ta opiera się na ekstrakcji DNA z krwi pełnej, amplifikacji części genu TBXA2 zawierającej mutację C924T za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) oraz identyfikacji genotypów typu dzikiego i/lub zmutowanych za pomocą analizy trawienia restrykcyjnego, w szczególności polimorfizmu długości fragmentu restrykcyjnego (RFLP) w żelu agarozowym. Ponadto wyniki zostały potwierdzone przez sekwencjonowanie genu TBXA2R. Metoda ta ma kilka potencjalnych zalet, takich jak wysoka skuteczność i szybka identyfikacja polimorfizmu C924T za pomocą PCR i analizy enzymów restrykcyjnych. Takie podejście pozwala na badanie predykcyjne tworzenia się blaszek miażdżycowych i progresji miażdżycy poprzez analizę genotypów pacjentów pod kątem polimorfizmu TBXA2R C924T. Zastosowanie tej metody może potencjalnie zidentyfikować osoby, które są bardziej podatne na procesy miażdżycowe, w szczególności osoby w grupie wysokiego ryzyka leczonej aspiryną.

Introduction

TBXA2R należy do nadrodziny białkowej G z siedmioma regionami transbłonowymi, które są szeroko wyrażane i zlokalizowane na błonach komórkowych lub w strukturach wewnątrzkomórkowych^1,2. Szlak sygnałowy TBXA2R bierze udział w zaawansowanych procesach miażdżycowych³. Zwiększoną ekspresję receptora TBXA2 wykazano podczas progresji miażdżycy, a badania kliniczne i eksperymentalne wykazały jego istotną rolę w niedokrwieniu i zawale mięśnia sercowego⁴. C924T, polimorfizm pojedynczego nukleotydu (SNP) genu TBXA2R, został rozpoznany jako funkcjonalny polimorfizm u zdrowych ochotników i został powiązany z zaburzeniami klinicznymi⁵. Co więcej, nasze poprzednie badanie^{6 wykazało,} że polimorfizm C924T genu TBXA2R jest zaangażowany w stabilność transkryptu; w szczególności występuje zwiększona niestabilność transkryptu typu zmutowanego (TT) w stosunku do typu dzikiego (CC). Ponadto kilka bodźców, takich jak difosforan adenozyny (ADP), epinefryna i kolagen w różnych stężeniach, indukowało agregację płytek krwi mniej skuteczną dla typu zmutowanego (TT). Jest to zgodne ze zmniejszonym tworzeniem się skrzeplin i hemostazą. Zatem niestabilność transkryptu TBXA2R i związane z nią zmniejszenie agregacji płytek krwi mogą być związane z ochronną rolą genotypu TBXA2R TT przed zakrzepicą tętnic i jej powikłaniami u pacjentów wysokiego ryzyka leczonych aspiryną⁶.

Tutaj opisujemy metodologię genotypowania pacjentów w celu zbadania potranskrypcyjnej roli polimorfizmu C924T (rs4523) zlokalizowanego w regionie 3' genu receptora TBXA2. Metoda ta opiera się na następujących etapach: (1) ekstrakcja DNA z krwi pełnej, (2) amplifikacja PCR części genu TBXA2R zawierającej mutację C924T oraz (3) identyfikacja dzikich i/lub zmutowanych genotypów za pomocą polimorfizmu długości fragmentu restrykcyjnego (RFLP) na żelu agarozowym. RFLP to technika, która wykorzystuje zmiany w homologicznych sekwencjach DNA⁷. Aplikacja ta została wykorzystana do wykrywania polimorfizmów DNA, zwłaszcza SNP, oraz do znajdowania i kojarzenia znaczenia biologicznego w odmianach genetycznych⁸. Polimorfizm analizowany po raz pierwszy przy użyciu RFLP-PCR u ludzi to ABO blood⁹. Metoda RFLP-PCR pozwala na analizę mutacji genetycznych w homologicznych sekwencjach DNA poprzez ocenę obecności fragmentów o różnej długości po trawieniu DNA przy użyciu wysoce specyficznych endonukleaz restrykcyjnych¹⁰.

W ubiegłych latach następujące metodologie były wykorzystywane do analizy SNP przy użyciu techniki PCR: hybrydyzacja krótkich oligonukleotydów specyficznych dla alleli¹¹, PCR¹², rozszerzenie startera na mikromacierze DNA¹³, test ligacji oligonukleotydów¹⁴, Bezpośrednie sekwencjonowanie DNA do identyfikacji specyficznych dla pozycji polimorfizmów pojedynczego nukleotydu¹⁵, Taqman method¹⁶, spektrometria mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą ekstrakcją (MALDI-TOF) spektrometria masowa¹⁷, oraz GeneChips¹⁸. Techniki te nie są proste w użyciu i mogą wymagać drogiego sprzętu. I odwrotnie, metoda PCR-RFLP jest niedroga, prosta w użyciu, wygodna, ma wysoką skuteczność i umożliwia szybką identyfikację polimorfizmu C924T. Dodatkowo potwierdziliśmy wyniki poprzez sekwencjonowanie genu TBXA2R przy użyciu metody Sangera¹⁵.

To podejście pozwala na predykcyjne badanie powstawania blaszek miażdżycowych i progresji miażdżycy poprzez analizę genotypów pacjentów pod kątem polimorfizmu TBXA2R C924T. Metoda ta może zidentyfikować osoby bardziej podatne na procesy miażdżycowe, w szczególności wśród pacjentów wysokiego ryzyka leczonych aspiryną.

Protocol

Protokół jest zgodny z wytycznymi Komisji Etyki Badań Medycznych Uniwersytetu w Chieti.

1. Konfiguracja odczynnika

1. Przygotować bufor Tris-EDTA (TE) (pH 8,0). Dodać 200 μl EDTA 0,5 M i 1 ml Tris-Cl 1 M do zlewki i doprowadzić do 100 ml sterylną wodą. Końcowe stężenie buforu TE: 10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA. Przechowywać w temperaturze pokojowej (RT).
2. Przygotować 1 l 10-krotnego buforu do elektroforezy roztworu podstawowego (TBE). Rozpuścić 108 g zasady Tris, 55 g kwasu borowego i 40 ml EDTA 0,5 M (pH 8) w zlewce i doprowadzić do objętości 1 l sterylną wodą. Sklep w RT.
3. Przygotuj barwnik ładujący żel. Rozpuścić 0,25 g błękitu bromofenolowego, 0,25 g cyjanolu ksylenowego FF, 50 g glicerolu, 1 mM EDTA (pH 8) w 60 ml wody dejonizowanej lub destylowanej i doprowadzić do objętości 100 ml sterylną wodą. Przechowywać w temperaturze 4 °C (przez kilka miesięcy) lub w temperaturze -20 °C (przez lata)
4. Przygotuj 200 ml 2% żelu agarozowego. Używaj go świeżego lub alternatywnie przechowuj zestalony w temperaturze pokojowej do kilku tygodni.
   1. Rozpuścić 4 g agarozy w 200 ml 1x buforu TBE w zlewce o pojemności 600 ml. Mieszaj za pomocą miksera magnetycznego przez około 5 minut, aż agaroza całkowicie się zawiesi
   .
   2. Podgrzej 2% roztwór agarozy we wrzącej wodzie lub na gorącym talerzu (przez około 10 minut, aż agaroza całkowicie się rozpuści). Należy pamiętać, że zlewka z żelem agarozowym musi być przykryta folią aluminiową. Alternatywnie podgrzej odkrytą zlewkę w kuchence mikrofalowej w wysokiej temperaturze przez około 3–5 minut.
   3. Zamieszaj 2% roztwór agarozy za pomocą mieszadła magnetycznego, sprawdzając, czy agaroza jest całkowicie rozpuszczona.
      UWAGA: Cząstki agarozy pojawiają się jako półprzezroczyste ziarna przed całkowitym rozpuszczeniem. Może być konieczne podgrzewanie cząstek przez kilka minut (około 5–10 minut).
   4. Jeżeli używana jest przechowywana porcja żelu agarozowego, podgrzewać zlewkę pokrytą folią aluminiową w gorącej łaźni wodnej (o temperaturze około 60 °C) aż do rozpuszczenia agarozy. Usunąć pipetą Pasteura wszelkie "ślady" zestalonej agarozy z powierzchni przed nalewaniem.

2. Oczyszczanie DNA

1. Przed rozpoczęciem oczyszczania wykonaj następujące czynności:
   1. Użyć próbek świeżej krwi pełnej ludzkiej lub szybko rozmrozić zamrożone próbki krwi pełnej (przez około 2–3 minuty) w łaźni wodnej (w temperaturze 37 °C), lekko mieszając, a następnie zrównoważyć do RT przed użyciem.
   2. Wymieszaj świeże lub rozmrożone próbki krwi, kilkakrotnie odwracając probówki.
2. Procedurę oczyszczania należy rozpocząć zgodnie z protokołami dostawcy dla 100 μl objętości elucji.
3. Określić ilościowo i obliczyć czystość DNA, mierząc absorbancję przy 260, 280 i 320 nm.
   1. Użyć sterylnej wody do rozcieńczenia próbek i skalibrowania spektrofotometru.
   2. Zastosować następujący wzór w celu obliczenia stężenia próbki DNA = 50 μg/ml x (A₂₆₀ − A₃₂₀) x współczynnik rozcieńczenia oraz czystości DNA = (A₂₆₀ − A₃₂₀)/(A₂₈₀ − A₃₂₀), przy dopuszczalnym stosunku między 1,7 a 1,9.

3. Amplifikacja PCR próbek DNA

1. Przygotować 25 μl mieszaniny reakcyjnej w probówce do mikroamplifikacji o pojemności 0,2 ml, jak pokazano w tabeli 1.
2. Przeprowadzić amplifikację PCR oczyszczonych próbek DNA za pomocą automatycznego termocyklera, postępując zgodnie z programem amplifikacji przedstawionym w tabeli 2.
3. Pod koniec amplifikacji PCR należy zatrzymać reakcje PCR, pozostawiając próbki DNA w temperaturze 4 °C.

4. RFLP produktów PCR

1. Przygotować 22,5 μl roztworu mieszanki głównej dla każdej próbki, tak aby wybrany enzym restrykcyjny roztrawił produkty PCR, jak pokazano w tabeli 3.
2. Przenieś 2,5 μl produktu PCR do nowej probówki PCR dla każdej próbki, używając pipety i końcówek filtrujących.
3. Dodać 22,5 μl roztworu głównej mieszanki mineralizacyjnej do probówek zawierających produkt PCR z każdej próbki, używając pipety i końcówek filtrujących.
4. Mieszaninę reakcyjną inkubować (roztwór mieszaniny wzorcowej i produkt PCR) w temperaturze 37 °C przez 4 godziny.

5. Analiza próbek PCR-RFLP za pomocą elektroforezy żelowej

1. Wybarwić żel agarozowy, dodając bromek etydyny (EtBr) w stężeniu 0,5 μg/ml do żelu przez 10 minut. EtBr wiąże się z DNA, które można uwidocznić w świetle ultrafioletowym (UV).
   Uwaga: Ważne jest, aby używać rękawic i innych urządzeń ochronnych podczas obchodzenia się, przechowywania i usuwania EtBr, ponieważ jest to mutagen o potencjalnym działaniu rakotwórczym.
2. Wlej przygotowany żel agarozowy do tacki na żel z założonym grzebieniem studzienki i poczekaj, aż stężeje.
3. Umieść zestalony żel agarozowy w pudełku żelowym (jednostka do elektroforezy).
4. Napełnij pojemnik z żelem 1x TBE, aż żel zostanie pokryty.
5. Za pomocą pipety i końcówek filtrujących załadować 6 μl amplifikowanego DNA do trawienia (w szczególności 5 μl każdej próbki i 1 μl barwnika ładującego żel) do dołków żelu agarozowego. Dodaj marker wielkości DNA w oddzielnym studzience i równolegle z próbkami.
6. Uruchom żel na 20–30 minut przy napięciu 100 V.
7. Za pomocą transiluminatora UV zwizualizuj rozszczepione fragmenty DNA lub niestrawione produkty PCR, porównując fragmenty ze znacznikiem wielkości DNA i zarejestruj wyniki za pomocą fotografii zgodnie z instrukcjami producenta.
   Ostrzeżenie: Używaj urządzeń ochronnych (okulary ochronne lub maska na twarz) w pobliżu źródeł światła UV.

Results

Celem tej metody jest ocena genotypu receptora tromboksanu A2 w odniesieniu do polimorfizmu C924T. Ludzki gen TBXA2R znajduje się na 19p13.3, rozciąga się na 15 kpz i składa się z trzech eksonów oddzielonych dwoma intronami. Polimorfizmy C924T genu TBXA2R (539 pz) amplifikowano przy użyciu starterów PCR pokazanych w Rysunek 1, które zostały dobrze zaprojektowane do amplifikacji określonego regionu DNA, ale nie ortologicznego lub paralogicznego regionu niespecyficznego. Ponadto przeprowadzono analizę RFLP przy użyciu enzymu restrykcyjnego RsaI (Rysunek 1) na produktach PCR, a wyniki zwizualizowano na żelu agarozowym, w celu scharakteryzowania konkretnego badanego SNP.

Na podstawie obecności różnych długości fragmentów po trawieniu DNA, możliwe jest rozróżnienie genotypu pacjenta pod kątem polimorfizmu C924T. W rzeczywistości, jak pokazano na Rysunek 2, homozygotyczność głównego allelu (CC) wykazuje dwie prążki (395 i 144 pz), ponieważ enzym restrykcyjny precyzyjnie przecina część genu TBXA2R w miejscu polimorfizmu C924T. O homozygotyczności allelu mniejszego (TT) świadczy pojedyncze prążek (539 pz), ponieważ nie dochodzi do cięcia enzymu restrykcyjnego. Allel heterozygotyczny (CT) ma trzy prążki (539, 395 i 144 pz). Jak pokazano na Rysunek 2, polimorfizm C924T, zdefiniowany przez trawienie RsaI na produkcie PCR, został potwierdzony przez analizę sekwencji.

pkt. pkt.

składnik	Objętość (μL)	Końcowe stężenie
10x bufor do PCR Tween-20 (15 M MgCl2)	0,25	1,5 MgCl2 mmol/L
Mieszanka dNTP (10 mM)	1	200 μM
Podkład (do przodu) (10 pmol/μM)	1	0,4 μM/μL
Podkład (rewers)(10 pmol/μM)	1	0,4 μM/μL
Polimeraza Taq (5 U/μL)	0,2	1 U/μL
Próbka DNA (42 ng/μL)	1	42 ng/μL
Woda wolna od DNaz	Godzina 20,55
łączny	25

Tabela 1: Konfiguracja amplifikacji PCR. Mieszanina reakcyjna o objętości 25 μl master-mix umieszczona w probówce PCR o pojemności 0,2 ml w celu amplifikacji pojedynczej próbki DNA.

Standardowy PCR
Wstępny krok aktywacji	Czas trwania: 5 min		95 °C
Jazda na rowerze w 3 krokach
denaturacja	30 sekund		94 °C
Wyżarzanie	Czas trwania: 60 s		55 °C
rozszerzenie	Czas trwania: 60 s		72 °C
Liczba cykli		30 cykli
Końcowe przedłużenie	8 min		72 °C

Tabela 2: Program amplifikacji PCR. Skonfiguruj automatyczny termocykler w celu wykonania PCR i amplifikacji DNA matrycy. Reakcje PCR zatrzymuje się przez schłodzenie w temperaturze 4 °C.

pkt. pkt. pkt. pkt.

składnik	Objętość (μL) (n = 1)	Objętość (μL) (n = 10)*
10x bufor enzymatyczny	Rozdział 2.5	27,5
Enzym restrykcyjny (5 U/μL)	0,5	Rozdział 5.5
Woda wolna od DNaz	19,5	214,5
łączny	22,5	247,5

Tabela 3: Trawienie enzymatyczne restrykcyjne produktów PCR. Roztwór master-mix przygotowuje się tak, aby wybrany enzym restrykcyjny trawił produkty PCR. *: Aby skonfigurować roztwór master-mix na 10 próbek, dodaj 10% więcej, ostatecznie tworząc 11 próbek.

Rysunek 1: startery PCR i enzym restrykcyjny RsaI. Startery do przodu i do tyłu przeznaczone do amplifikacji części genu TBXA2R o długości 539 pz zawierającej polimorfizm C924T. RsaI jest enzymem restrykcyjnym wybranym do rozpoznawania miejsc GTAC. ˅: miejsce cięcia enzymu RsaI. C(/T): Polimorfizm C924T. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Analiza wzorca elektroforetycznego i sekwencji DNA. (A) Genotyp C924T jest rozpoznawany przez wzorzec RFLP po trawieniu specyficznym enzymem RsaI. (B) Analiza sekwencji DNA: Wyniki uzyskane przez RFLP po trawieniu enzymem restrykcyjnym RsaI potwierdzono za pomocą analizy sekwencji wykazującej polimorfizm C924T. Ten rysunek został zmodyfikowany na podstawie De Iuliis et al., Prostaglandins & Other Lipid Mediators⁶. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

W niniejszym badaniu opisaliśmy metodologię, która umożliwia genotypowanie pacjentów w celu zbadania potranskrypcyjnej roli polimorfizmu C924T (rs4523) zlokalizowanego w regionie 3' genu TBXA2R. Po pierwsze, metoda ta polega na ekstrakcji DNA z krwi pełnej. W szczególności ten pierwszy proces polega na oczyszczeniu całkowitego ludzkiego DNA, genomowego i mitochondrialnego, z próbek krwi pełnej, świeżych lub mrożonych, poddanych działaniu EDTA (cytrynianu lub heparyny). W przypadku krótkotrwałego przechowywania próbek krwi pełnej należy przechowywać w temperaturze 2-8 °C przez okres do 10 dni. W przypadku przechowywania przez 10 dni próbki należy przechowywać w temperaturze -70 °C. Zautomatyzowany proces oczyszczania składa się z 4 etapów: lizyzacji, wiązania, mycia i elucji. Po drugie, metoda opiera się na amplifikacji PCR części genu TBXA2R zawierającej mutację C924T. Na koniec przeprowadza się identyfikację dzikiego typu i/lub zmutowanego genotypu za pomocą analizy enzymu restrykcyjnego (RFLP) na żelu agarozowym.

Kluczowe etapy protokołu są następujące: (i) W przypadku użycia części żelu agarozowego przechowywanego w temperaturze pokojowej, zestaloną agarozę można ponownie rozpuścić we wrzącej łaźni wodnej (w temperaturze 60 °C przez około 15-20 minut) lub w kuchence mikrofalowej (3-5 minut) przed nalewaniem. Uwaga: poluzuj nakrętkę podczas ponownego topienia agarozy w butelce. (ii), ponadto, przy ponownym podgrzewaniu agarozy, odparowanie spowoduje wzrost jej stężenia. Z tego powodu przydatna może być kompensacja poprzez dodanie niewielkiej ilości wody. (iii) Fragmenty DNA o długości mniejszej niż 1000 pz różnicowano za pomocą żelu agarozowego i zaleca się bufor TBE w celu uzyskania najlepszej możliwej separacji. (iv) Wolimy używać żelu agarozowego niż żelu poliakrylamidowego, ponieważ przygotowanie tego ostatniego jest trudniejsze, a jego przygotowanie zajmuje znacznie więcej czasu. (v) Wybór czasu trwania elektroforezy żelowej zależy od oczekiwanej wielkości produktów amplifikacji. W oparciu o ten protokół wystarczy wykonać elektroforezę przez 20-30 minut przy napięciu 100 V w 2% żelu agarozowym, ponieważ wielkość fragmentów PCR waha się od 100 do 500 pz. (vi) Obowiązkowe jest uzyskanie od 10 do 50 ng dobrej jakości matrycy DNA wyekstrahowanej z próbek ludzkich. Z tego powodu wolimy stosować automatyczne oczyszczanie DNA niż półautomatyczne lub ręczne. (vii) Przygotować reakcję master-mix do amplifikacji PCR i roztwór master-mix do trawienia produktów PCR, dodając 10% więcej (w celu uwzględnienia utraty cieczy podczas pipetowania) do obliczonej objętości pomnożonej przez liczbę próbek na objętość wymaganą dla jednej próbki DNA.

Najczęstszą pułapką tej metody jest obecność dodatkowych produktów amplifikacji spowodowanych nieprawidłowym programem termocyklera, niewłaściwym preparatem master-mix amplifikacji lub zanieczyszczeniem matrycą DNA. Co więcej, brak produktów PCR może być spowodowany inaktywowaną polimerazą Taq lub nieprawidłowym uruchomieniem termocyklera. Ponadto obecność nieoczekiwanych fragmentów może być spowodowana zanieczyszczeniem produktu metodą PCR lub niepełnym trawieniem przez inaktywowany enzym, zbyt małą objętością enzymu restrykcyjnego lub zbyt krótkim czasem inkubacji.

W ostatnich latach do analizy SNP przy użyciu techniki PCR wykorzystano następujące metodologie: hybrydyzacja oligonukleotydów specyficznych dla krótkich alleli¹¹, PCR swoista dla alleli¹², rozszerzenie starterów na mikromacierzach DNA¹³, test ligacji oligonukleotydów¹⁴, bezpośrednie sekwencjonowanie DNA do identyfikacji polimorfizmów pojedynczego nukleotydu specyficznych^{dla pozycji 15}, metoda Taqmana¹⁶, spektrometria mas MALDI-TOF (MALDI-TOF) z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą ekstrakcją¹⁷ oraz GeneChips¹⁸. Metody te nie są idealne, ponieważ nie są proste w użyciu i/lub wymagają drogiego sprzętu. I odwrotnie, metoda PCR-RFLP opisana w tym badaniu jest niedroga, prosta w użyciu, wygodna, ma wysoką skuteczność i pozwala na szybką identyfikację polimorfizmu C924T. Ograniczeniem obecnej metody jest to, że może być ona stosowana tylko w odniesieniu do niewielkiej liczby SNP i kilku próbek w sesji roboczej.

W przyszłych zastosowaniach metoda ta może być wykorzystana do badań predykcyjnych dotyczących tworzenia się blaszek miażdżycowych i progresji miażdżycy poprzez analizę genotypów pacjentów pod kątem polimorfizmu TBXA2R C924T. Co więcej, metoda ta może zidentyfikować osoby bardziej podatne na procesy miażdżycowe, w szczególności pacjentów wysokiego ryzyka leczonych aspiryną. Wreszcie, metoda ta może być zastosowana do badania innych polimorfizmów związanych z medycyną spersonalizowaną dla określonych leków (na przykład leków przeciwzakrzepowych i przeciwdrgawkowych) w celu zrozumienia odpowiedniej dawki leku oraz indywidualnej odpowiedzi farmakologicznej i klinicznej dla każdego pacjenta przed rozpoczęciem terapii i uniknięcia działań niepożądanych.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
QIAsymphony SP		QIAGEN
	EPPENDORF	6131-02222
Oświetlacz UV	UVP	732-110
Probówki do PCR	EPPENDORF	H0030121589
Termocykler do PCR	EPPENDORF	5331-03721
Pipety i końcówki filtrujące	EPPENDORF	H4910000018/42/69 I 0030067037/10/02
Horyzontalna aparatura do elektroforezy miniżelowej	DIATECH PHORESIS 10	RI002-10
Suchy blok grzewczy	PODWÓJNY INKUBATOR	DG210
QIAsymphony DNA Midi Kit	QIAGEN	931255
10x bufor PCR (zwykle dostarczany przez producenta z polimerazą Taq)	DIATECH I TAKARA	T0100 I R0001DM
Polimeraza	Taq TAKARA	R0001DM
mieszanina dNTP	DIATECH  farmakogenetyka	NM001	dNTP MIX 10x 100 mikrolitrów, 10 mM
startery PCR	DIATECH  farmakogenetyka	\\Enzym
restrykcyjny RsaI	New England biolabs	R0167L
Enzym restrykcyjny 10x bufor	New England biolabs	R0167L
Agaroza	Sigma	A9539	Fragmenty DNA najlepiej rozdzielać w buforze TBE
Baza Tris	baza Sigma	T6066
Kwas borowy	Sigma	B7901
0,5 M EDTA, pH 8,0	Sigma	E7889
10% (wag./obj.) nadsiarczan amonu	Sigma	E3678	przygotowywany świeży za każdym razem
EtBr ( 0,5 μ g/μ L)	Sigma	E8751
Błękit bromofenolowy	Sigma	B0126
Ksylenol cyjanol FF	Sigma	X4126
Glicerol	Sigma	G5516
Marker wielkości DNA	DIATECH  farmakogenetyka	R1002-10	Plazmid pBluescript II SK (+) restrict MSPI
Sterylna woda (autoklawowana)	DIATECH  farmakogenetyka	\\