Method Article

Generowanie roślin transgenicznych z insercją pojedynczej kopii przy użyciu wektora binarnego BIBAC-GW

DOI:

10.3791/57295

⸱

March 28th, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Swammerdam Institute for Life Sciences, University of Amsterdam

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystanie z wektora binarnego pBIBAC-GW sprawia, że generowanie roślin transgenicznych z nienaruszonymi pojedynczymi kopiami jest łatwym procesem. W tym miejscu przedstawiono szereg protokołów, które prowadzą czytelnika przez proces generowania transgenicznych roślin Arabidopsis oraz testowania roślin pod kątem nienaruszalności i liczby kopii wkładek.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podczas generowania roślin transgenicznych, zazwyczaj celem jest uzyskanie stabilnej ekspresji transgenu. Wymaga to pojedynczej, nienaruszonej integracji transgenu, ponieważ integracje wielokopijne są często poddawane wyciszaniu genów. Wektor binarny kompatybilny z Gateway oparty na sztucznych chromosomach bakteryjnych (pBIBAC-GW), podobnie jak inne pochodne pBIBAC, umożliwia insercję transgenów z pojedynczą kopią z wysoką wydajnością. Jako ulepszenie oryginalnego pBIBAC, kaseta Gateway została sklonowana do pBIBAC-GW, dzięki czemu interesujące sekwencje mogą być teraz łatwo włączone do transferu wektorów DNA (T-DNA) przez klonowanie Gateway. Zazwyczaj transformacja za pomocą pBIBAC-GW skutkuje wydajnością 0,2–0,5%, przy czym połowa transgeników ma nienaruszoną integrację T-DNA z jedną kopią. Wektory pBIBAC-GW są dostępne z odpornością na fluorescencję glufosynatu amonowego lub DsRed w okrywie nasiennej do selekcji roślin oraz z odpornością na kanamycynę jako selekcję u bakterii. W tym miejscu przedstawiono szereg protokołów, które prowadzą czytelnika przez proces generowania roślin transgenicznych przy użyciu pBIBAC-GW: począwszy od rekombinacji interesujących sekwencji do wybranego wektora pBIBAC-GW, po transformację roślin za pomocą Agrobacterium, wybór transgeników i testowanie roślin pod kątem nienaruszalności i liczby kopii insertów za pomocą blottingu DNA. Zwrócono uwagę na zaprojektowanie strategii blottingu DNA w celu rozpoznania integracji jedno- i wielokopijnych w jednym i wielu loci.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podczas generowania roślin transgenicznych, zazwyczaj celem jest stabilna ekspresja zintegrowanego transgenu (transgenów). Można to osiągnąć poprzez nienaruszone integracje pojedynczej kopii transgenu. Wielokrotne integracje mogą prowadzić do zwiększonej ekspresji transgenu, ale także do wyciszenia genów. Wyciszenie transgenów jest bardziej prawdopodobne, jeśli wstawione sekwencje są ułożone w tandem lub odwrócone powtórzenia1,2,3,4. Wektory binarne są używane jako czółenka w eksperymentach transformacyjnych za pośrednictwem Agrobacterium w celu dostarczenia interesujących sekwencji do genomów roślin. Liczba integracji z genomem roślinnym zależy od liczby kopii wektora binarnego w Agrobacterium tumefaciens5,6. Wiele powszechnie używanych wektorów binarnych to wektory o wysokiej kopii, a zatem dają wysoką średnią liczbę kopii transgenu: od 3,3 do 4,9 kopii w Arabidopsis5.

Liczba integracji T-DNA może być zmniejszona za pomocą wektorów binarnych o niskiej liczbie kopii w A. tumefaciens, takich jak BIBAC7, lub poprzez uruchomienie T-DNA z chromosomu A. tumefaciens 5. Średnia liczba integracji transgenów w takich przypadkach jest mniejsza niż 25,8,9,10. Ze względu na to, że są jednokopijne u A. tumefaciens, a także u Escherichia coli, pochodne BIBAC mogą utrzymywać i dostarczać konstrukty o wielkości do 150 kb11.

Wektory BIBAC kompatybilne z GW10,12 umożliwiają łatwe wprowadzanie interesujących genów do wektora za pomocą klonowania Gateway. Zastosowanie technologii Gateway znacznie upraszcza procedurę klonowania, ale także pozwala przezwyciężyć typowe problemy związane z dużymi wektorami o niskiej liczbie kopii13,14, takie jak niska wydajność DNA i ograniczony wybór unikalnych miejsc restrykcyjnych dostępnych do klonowania7,11. Pochodne pBIBAC-GW są dostępne z odpornością na glufosynat amonowy (pBIBAC-BAR-GW) lub fluorescencję DsRed w okrywie nasiennej (pBIBAC-RFP-GW) do selekcji w roślinach (Rysunek 1)10,12. W przypadku obu wektorów gen oporności na kanamycynę jest używany jako marker selekcyjny u bakterii.

Wektory pBIBAC-GW łączą: (1) łatwe projektowanie i manipulację genetyczną u E. coli, oraz (2) nienaruszone integracje pojedynczych kopii w planta z wysoką wydajnością. Wektory pBIBAC-GW dają średnio 1,7 integracji u Arabidopsis, przy czym około połowa roślin transgenicznych ma pojedynczą zintegrowaną klasę T-DNA10.

Stabilna ekspresja transgenów jest wymogiem dla większości generowanych transgenów. Stabilną ekspresję transgenu można osiągnąć poprzez nienaruszone integracje z jedną kopią. Praca z roślinami transgenicznymi przenoszącymi nienaruszone, jednokopijne integracje jest jednak jeszcze ważniejsza, jeśli na przykład celem jest zbadanie efektywności procesów opartych na chromatynie, takich jak mutageneza, rekombinacja lub naprawa, oraz zależności tych procesów od lokalizacji genomu i struktury chromatyny w miejscu insercji. Dla naszych zainteresowań, w celu zbadania zależności mutagenezy skierowanej oligonukleotydami (ODM) od lokalnego kontekstu genomowego, wygenerowano zestaw linii reporterowych z nienaruszonymi, jednokopijnymi integracjami genu reporterowego mutagenezy (Rysunek 2)10. Korzystając z tego zestawu linii, wykazano, że wydajność ODM różni się między transgenicznymi loci zintegrowanymi w różnych lokalizacjach genomu, mimo że poziomy ekspresji transgenu są raczej podobne.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Wstawianie interesujących sekwencji do wektora binarnego

  1. Przygotuj wpis bramy i wektory binarne.
    1. Wyizoluj wektor Gateway Entry zawierający interesujący fragment DNA lub gen za pomocą mini-zestawu przygotowawczego zgodnie z sugestiami dostawcy.
      Uwaga: Wektory BIBAC-GW wymagają użycia kanamycyny (Km) do selekcji u bakterii, dlatego zamiast kanamycyny należy użyć wektora wejściowego z innym markerem oporności. Na przykład, wektor pENTR-gm, niosący gen oporności na gentamycynę, jest dobrym wyborem12.
    2. Propagacja i izolacja interesującego nas wektora BIBAC-GW. Użyj szczepu E. coli, który jest odporny na toksyczność genu ccdB obecnego w kasecie Gateway. Izoluj wektory BIBAC za pomocą protokołów lub zestawów zaprojektowanych specjalnie dla dużych plazmidów, zgodnie z sugestiami dostawcy.
  2. Przeprowadź reakcję bramy.
    1. Przygotować reakcję rekombinacji LR zgodnie z sugestiami dostawcy. Wymieszać następujące składniki w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml w temperaturze pokojowej (RT): 100–300 ng Klon wejściowy (superskręcony), 300 ng wektora BIBAC-GW, bufor reakcyjny LR Clonase (stężenie końcowe: 1x). Dostosować objętość mieszaniny do 16 μl za pomocą TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0). Na koniec dodaj 4 μl mieszanki enzymów LR Clonase i wymieszaj przez wirowanie. Inkubować mieszaninę w temperaturze 25 °C przez 1 godzinę.
    2. Zakończyć reakcję LR przez dodanie 2 μl roztworu proteinazy K (2 μg/μl) do mieszaniny przygotowanej w kroku 1.2.1. Mieszać i inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut.
  3. Przekształć E. coli za pomocą mieszaniny reakcyjnej Gateway przez elektroporację.
    1. Odsolić mieszaninę reakcyjną LR przed elektroporacją.
      UWAGA: Ten krok ma kluczowe znaczenie dla udanej elektroporacji. Poniżej opisano metodę dializy, ale można również zastosować inne metody, takie jak wytrącanie octanem sodu i etanolem.
      1. Przygotować zestaw do dializy filtracyjnej reakcji LR. Wlej 20 ml ultraczystej wody dejonizowanej do sterylnej szalki Petriego. Umieść membranowy dysk filtracyjny (wielkość porów = 0,025 μm) na powierzchni wody.
      2. Ostrożnie odpipetować całą reakcję LR na wierzchu membrany i pozostawić mieszaninę do dializy w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
    2. Dodać 5 μl odsolonej mieszanki LR do elektrokompetentnych ogniw DH10B w kuwecie do elektroporacji (0,1 cm). Elektroporować ogniwa (1,5 V/cm, rezystancja 200 Ω, pojemność 25 μF) i natychmiast dodać 1 ml wstępnie podgrzanego podłoża do represji katabolitu (SOC) do komórek, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C przez 45 min, 180 obr./min. (Pożywka SOC, 1 l: 20 g tryptonu Bacto, 5 g ekstraktu drożdżowego, 0,5 g NaCl, 2,5 ml 1M KCl, 20 ml 1 M glukozy sterylizowanej filtrem).
      UWAGA: Komórki DH10B można zastąpić innymi komórkami E. coli, które stabilnie utrzymują duże plazmidy.
      UWAGA: Optymalne warunki elektroporacji zależą od zastosowanego urządzenia do elektroporacji.
      3. Bakterie osadzać
    3. z maksymalną prędkością przez 30 s za pomocą mikrowirówki, usunąć nadmiar SOC i ponownie zawiesić osad w około 50-100 μl pożywki Luria-Bertani (LB). Rozprowadzić bakterie na płytkach kanamycyny-LB (Km-LB) (stężenie K, 40 μg/ml) i inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez noc. (LB podłoże, 1 l: 10 g tryptonu Bacto, 5 g ekstraktu drożdżowego, 10 g NaCl. Do podłoża stałego dodać agar, 15 g/l).
  4. Zidentyfikuj rekombinowane pochodne BIBAC-GW i wyizoluj plazmidowe DNA.
    1. Aby móc rosnąć na płytkach Km-LB, komórki E. coli powinny zawierać zrekombinowany plazmid BIBAC-GW, w którym sekwencja ccdB jest podstawiona pożądaną wstawką. Użyj reakcji łańcuchowej polimerazy kolonii (PCR)15, aby sprawdzić, czy kolonie bakterii na płytce zawierają prawidłowe plazmidy, posiadające szkielet BIBAC-GW i wkładkę będącą przedmiotem zainteresowania.
      1. Aby zidentyfikować szkielet pBIBAC-BAR-GW, należy przeprowadzić reakcję PCR15 ze starterami DM1969 5'-GCGACGAGCCAGGATAG-3' i DM1970 5'-ATCAGTGCGCAAGACGTGAC-3'. Ten zestaw starterów amplifikuje fragment genu bar o wartości 563 pz.
      2. Aby sprawdzić obecność szkieletu BIBAC-RFP-GW, należy przeprowadzić reakcję PCR15, używając starterów M737 5'-CGTGTAAAAAGCTTAGACTG-3' i M892 5'-AACAGATGGTGGCGTCCC-3'. Ta kombinacja starterów wzmacnia fragment o długości 791 pz nakładający się na promotor crucyferyny i sekwencję RFP.
      3. Wykonaj reakcje PCR15 przy użyciu starterów specyficznych dla genu, aby sprawdzić obecność interesującej nas wstawki.
    2. Zaszczepić pojedynczą dodatnią kolonię w 2–5 ml pożywki LB zawierającej kanamycynę (40 μg/ml) w celu izolacji DNA16. Inkubować w temperaturze 37 °C na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 180 obr./min, przez noc.
    3. Wyizolować plazmidowe DNA (patrz krok 1.1.2).

2. Przygotowanie A. tumefaciens do kwiatowego maczania Arabidopsis

  1. Przekształć pochodne BIBAC-GW w A. tumefaciens.
    1. Przygotuj elektrokompetentne komórki szczepu A. tumefaciens C58C1 przenoszące plazmid pomocniczy pCH32 7. Hoduj bakterie w obecności tetracykliny (5 μg/ml) i ryfampicyny (100 μg/ml), aby wybrać pCH32 i zapewnić wzrost tylko komórek Agrobacterium.
    2. Dodać 0,25–0,5 μg DNA pochodnej pBIBAC-GW, wstępnie rozpuszczonego w 10–20 μl sterylnej ultraczystej wody dejonizowanej, do 20 μl kompetentnych ogniw Agrobacterium w kuwetach do elektroporacji (0,1 cm). Utrzymuj komórki na lodzie.
    3. Elektroporuj ogniwa (1,5 V/cm, rezystancja 400 Ω, pojemność 25 μF). Bezpośrednio po elektroporacji dodać do bakterii 1 ml wstępnie podgrzanej (28 °C) pożywki SOC i inkubować komórki w temperaturze 28 °C przez 60–90 minut.
    4. Rozprowadzić 100 μl i resztę bakterii na oddzielnych płytkach LB zawierających ryfampicynę (100 μg/ml), tetracyklinę (5 μg/ml) i kanamycynę (40 μg/ml) i inkubować w ciemności w temperaturze 28 °C przez 1-2 dni.
  2. Przygotować zawiesinę Agrobacterium.
    1. Sprawdzić metodą PCR kilka kolonii A. tumefaciens z płytki przygotowanej w kroku 2.1.4 pod kątem obecności właściwego wektora (patrz krok 1.4.1).
    2. Na pojedynczej kolonii, w której potwierdzono, że zawiera wektor binarny, należy umieścić odpowiednią wkładkę na płytce LB zawierającej antybiotyki (patrz krok 2.1.4). Rosnąć w temperaturze 28 °C przez noc.
    3. Powtórzyć pasmowanie z pojedynczą kolonią uzyskaną w kroku 2.2.2.
    4. Zaszczepić pojedynczą kolonię w 2,5 ml pożywki LC uzupełnionej antybiotykami (patrz krok 2.1.4) w celu hodowli wstępnej. Inkubować w temperaturze 28 °C przez co najmniej 8 godzin lub przez noc, przy prędkości 180 obr./min. (Pożywka LC, 1 l: 10 g tryptonu Bacto, 5 g ekstraktu drożdżowego, 0,5 g NaCl, 2,5 gMgSO4 · 7H2O, 2 g Maltozy).
    5. Dodać kulturę wstępną z kroku 2.2.4 do 250 ml LC uzupełnionej antybiotykami (patrz krok 2.1.4) i rosnąć w temperaturze 28 °C, przy 180 obr./min, przez noc.
    6. Osadzać kulturę, wirując w temperaturze 5 500 x g przez 12 minut. Ponownie zawiesić osad w 100 ml roztworu zawierającego 5% sacharozy, 0,05% Silwet L-77, 0,5 x MS. Wlać zawiesinę do sterylnego pojemnika w celu zanurzenia roślin w kwiatach.

3. Transformacja rzodkiewnika

  1. Przygotuj rośliny Arabidopsis do transformacji.
    1. Uprawiaj rzodkiewnik w szklarni lub komorze wzrostu z kontrolowanym klimatem, aż zakwitną (12 doniczek po 9 roślin każda na zanurzenie).
    2. Przypnij pierwsze, aby umożliwić pojawienie się większej liczby dodatkowych. Rośliny są gotowe do zanurzania 4–6 dni po ścięciu, kiedy rośliny mają wiele niedojrzałych główek kwiatowych i niewiele nawożonych krzemionek.
  2. Zanurzanie kwiatów
    1. Zanurz kwiatostany na 5–10 s w zawiesinie Agrobacterium przygotowanej w kroku 2.2.6. Używaj delikatnego mieszania.
    2. Owiń nadziemne części roślin folią spożywczą, aby utrzymać wysoką wilgotność, i przykryj doniczki pudełkiem, aby rośliny były w ciemności. Inkubuj rośliny przez 2 dni w szklarni/komorze wzrostowej.
    3. Wyjmij pudełko i folię spożywczą i wyhoduj rośliny do dojrzałości w szklarni/komorze wzrostowej.
      UWAGA: Aby zwiększyć efektywność przemiany, te same rośliny można ponownie zanurzyć 7 dni po pierwszym zanurzeniu.
    4. Zbierz nasiona. Zbierz i przeanalizuj nasiona (T1) roślin, przekształcone za pomocą tego samego konstruktu, jako pojedynczy zestaw.
  3. Ekran dla roślin transgenicznych.
    1. Aby przeprowadzić badania przesiewowe pod kątem roślin transgenicznych przekształconych pochodną pBIBAC-RFP-GW, przeanalizuj nasiona za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Aby wykryć ekspresję DsRed w okrywach nasiennych, należy zobrazować nasiona przy wzbudzeniu 560 nm i emisji 600–650 nm. Oddziel nasiona fluorescencyjne od niefluorescencyjnych odpowiedników za pomocą kleszczy.
    2. Aby przesiać rośliny transgeniczne przekształcone pochodną pBIBAC-BAR-GW, wysiewaj nasiona w tacach wypełnionych ziemią (~2,500 nasion/0,1 m2). Aby zapewnić równomierne rozprowadzenie nasion na tacach, zawiesić nasiona w 0,1% agarze w 0,5x pożywce Murashige Skoog (MS) i rozprowadzić nasiona za pomocą pipety 1 ml.
      UWAGA: Aby stymulować nasiona do kiełkowania w sposób synchroniczny, należy inkubować nasiona przez co najmniej 2 dni w temperaturze 4 °C. Można to zrobić przed lub po wysianiu nasion.
      1. Spryskać sadzonki 0,5% roztworem glufosynatu amonowego 2 tygodnie i 3 tygodnie po wysianiu na tacach. Użyj 500 ml roztworu glufosynatu amonowego na 1 m2.
      2. Przenieś ocalałe sadzonki do pojedynczych doniczek. Typowy obraz tacki z sadzonkami przed i po (drugim) zabiegu glufosynatem amonowym pokazano na Rysunek 3.
      3. Przeanalizować rośliny odporne na glufosynat amonu metodą PCR pod kątem obecności interesującego nas konstruktu (patrz krok 1.4.1. dla starterów).
        1. Wyizolować genomowe DNA roślinne do PCR przy użyciu metody opisanej przez Edwardsa i wsp.17

4. Charakterystyka transgenicznych pod kątem liczby i integralności integracji T-DNA

  1. Strategia trawienia restrykcyjnego
    UWAGA: Określ liczbę integracji T-DNA i ich integralność poprzez blotting DNA przy użyciu enzymów restrykcyjnych. Metoda ta pozwala na identyfikację pojedynczych, ale także powtarzających się integracji w tych samych lub różnych loci w genomie.
    1. Użyj serii trawień restrykcji, aby zidentyfikować różne możliwe wzorce integracji:
      1. Wybierz enzym, który tnie raz w środku T-DNA, aby móc niezależnie badać sekwencje przed i za miejscem restrykcji (Figura 4A i Figura 7A-C). Zobacz Rysunek 4A oraz legendę rysunku, aby zapoznać się z oczekiwanymi wynikami i interpretacją.
      2. Wybierz enzym lub kombinację enzymów, wycinając jednocześnie całą sekwencję zainteresowania (Rysunek 4B i Rysunek 7A-D). Każde odchylenie od znanej długości oznacza obcięcie zintegrowanej kasety.
        UWAGA: Należy uważać, aby używać tylko enzymów restrykcyjnych, które nie są wrażliwe na metylację cytozyny.
  2. Przygotuj próbki genomowego DNA.
    1. Wyizoluj genomowe DNA z roślin przenoszących konstrukt będący przedmiotem zainteresowania. Do izolacji DNA można zastosować metodę minipreparacji DNA CTAB18. Do analizy plam DNA Arabidopsis potrzebne jest 2–2,5 μg genomowego DNA. Rozpuść DNA w 50 μl TE.
    2. Sprawdź integralność DNA za pomocą elektroforezy żelowej16. Nienaruszone genomowe DNA migruje jako jedno dyskretne pasmo na górze żelu. Degradację DNA można rozpoznać jako obecność rozmazu. Aby uniknąć uszkodzeń DNA spowodowanych wielokrotnym zamrażaniem i rozmrażaniem, próbki genomowego DNA przechowuje się w temperaturze 4 °C.
    3. Trawić genomowe DNA (2–2,5 μg w przypadku genomowego DNA Arabidopsis) w całkowitej objętości 50 μl, przez noc, stosując warunki buforowe sugerowane przez dostawcę enzymu.
      1. W probówce wymieszaj 2–2,5 μ5 μg genomowego DNA Arabidopsis, 5 μl 10-krotnego buforu restrykcyjnego i enzymu restrykcyjnego 5 U w sumie 50 μl ultraczystej wody dejonizowanej.
    4. Dodać barwnik ładujący (1x stężenie końcowe) do próbek restrykcyjnych przed nałożeniem żelu. Aby uzyskać dobre śledzenie wizualne, użyj jednego z poniższych: komigracja z małymi fragmentami (błękit bromofenolowy, 350–400 pz) lub komigracja z większymi fragmentami (cyjanol cylenowy, 3–4 kbp).
  3. Uruchom żel DNA.
    1. Przygotuj długi (20 cm) żel agarozowy 0,5x TBE19. Procentowa zawartość agarozy w żelu zależy od oczekiwanych rozmiarów fragmentów. 0,8–1% optymalnie oddziela fragmenty o wielkości >1 kb. Użyj 1–1,5% agarozy na fragmenty <1 kb. Nie należy dodawać bromku etydyny do żelu. (5x TBE, 1 l: 54 g zasady Trizma, 27,5 g kwasu borowego, 3,75 g EDTA).
      UWAGA: Aby zapobiec zanieczyszczeniu DNA, należy używać tacek z żelem, które nie są używane do frakcjonowania plazmidu i amplifikowanego DNA metodą PCR.
    2. Załaduj próbki na gel19.
    3. Dodaj do żelu markery DNA, które mieszczą się w zakresie wielkości oczekiwanych fragmentów. Załaduj około 1 μg markera (50-250 ng fragmentu o różnej wielkości) na żel, aby umożliwić wizualizację za pomocą światła UV.
    4. Frakcjonowanie wymiarowe DNA pod niskim napięciem (40–50 V/500 mA) przez noc.
  4. Przygotuj się do przeniesienia DNA z żelu agarozowego na błonę nylonową.
    1. Przenieś żel na osobną tackę i barwij go przez 20–25 minut w 0,5 TBE zawierającym bromek etydyny (5 μg/ml), obracając go z prędkością 40 obr./min na wytrząsarce orbitalnej.
    2. Wizualizuj żel na transiluminatorze UV. Sprawdź separację wielkości genomowego DNA, w tym widoczność dyskretnych pasm satelitarnych (Rysunek 5A). Rozmaz w kierunku mniejszych rozmiarów masy cząsteczkowej wskazuje na degradację DNA.
    3. Na transiluminatorze UV połóż przezroczystość na żelu i zaznacz położenie szczelin i pasm znaczników markerem (Rysunek 5B). Ułatwi to późniejsze określenie wielkości zhybrydyzowanych fragmentów w przypadku, gdy sekwencje markerowe nie hybrydyzują specyficznie z DNA sondy. Wskazując fragmenty znacznika na tym etapie, można śledzić wielkość fragmentów hybrydyzujących.
    4. Umieść żel z powrotem w tacce, spłucz ultraczystą wodą dejonizowaną i zanurz go w 0,25 M HCl na 15 minut, aby rozdrobnić DNA w żelu. Umyć ultraczystą wodą dejonizowaną. Użyj wystarczającej ilości HCl i wody, aby przykryć żel na tacy, a następnie obróć tackę z zanurzonym żelem z prędkością 40 obr./min na wytrząsarce orbitalnej.
    5. Inkubować żel w buforze denaturacyjnym przez 30 minut. Przemyć ultraczystą wodą dejonizowaną. Użyj wystarczającej ilości buforu i wody, aby przykryć żel na tacy, a następnie obróć tackę z zanurzonym żelem z prędkością 40 obr./min na wytrząsarce orbitalnej. (Bufor denaturacyjny: 0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl).
    6. Inkubować żel w buforze neutralizacyjnym przez 30 minut. Przemyć ultraczystą wodą dejonizowaną. Użyj wystarczającej ilości buforu i wody, aby przykryć żel na tacy, obróć tackę z zanurzonym żelem z prędkością 40 obr./min na wytrząsarce orbitalnej. (Bufor neutralizacyjny: 0,5 M Tris, 1,5 M NaCl, 220 mM HCl, pH 7,6).
  5. Przenieś DNA do nylonowej membrany.
    1. Przygotuj zestaw do kapilarnego transferu genomowego DNA. Umieść plastikową płytkę (mniej więcej wielkości żelu lub większą) na tacy wypełnionej 20x solą fizjologiczną i cytrynianem sodu (SSC). Złóż kawałek grubej bibuły filtracyjnej na tacę, tak aby oba jej końce zwisały w SSC. Wytnij kawałek dodatnio naładowanej nylonowej membrany Hybond N+ wielkości żelu i 2 kawałki grubej bibuły filtracyjnej. (20x SSC: 3 M NaCl, 0,3 M cytrynian sodu).
    2. Przygotuj zestaw do bibuły (Rysunek 6), umieszczając żel w szczelinach na górze bibuły filtracyjnej na plastikowej płytce. Na wierzchu umieść membranę Hybond N+, a następnie 2 warstwy bibuły filtracyjnej. Wstępnie zwilż każdą warstwę w 20x SSC przed dodaniem ich do zespołu. Upewnij się, że usunąłeś wszelkie pęcherzyki powietrza między warstwami, ponieważ utrudniają one transfer DNA.
    3. Przykryj zespół grubą warstwą bibuły. Umieść na wierzchu plastikowy talerz z ciężarkiem, takim jak mała butelka. Upewnij się, że nacisk jest równomiernie rozłożony na żel. Zapewni to prawidłowy transfer DNA.
      UWAGA: Waga powinna wynosić około 200–300 g; duże ciężary utrudniają transfer DNA.
    4. Przykryj obszar otaczający zespół, w tym odsłoniętą bibułę filtracyjną, folią spożywczą (Rysunek 6), aby uniknąć parowania 20x bufora SSC i skierować siły kapilarne w kierunku membrany nylonowej. Osusz przez noc.
    5. Zaznacz ołówkiem położenie szczelin, nazwę i/lub datę na górze membrany i wyjmij membranę z zespołu. Zauważ, że dolna strona, która miała kontakt z żelem, przenosi DNA.
    6. Natychmiast przymocuj DNA do błony za pomocą promieniowania UV (2 400 μJ/m2) za pomocą środka sieciującego UV.
      UWAGA: Warunki sieciowania zależą od rodzaju zastosowanej membrany.
      UWAGA: W tym momencie membrana może być przechowywana w temperaturze -20 °C i wykorzystana do późniejszej hybrydyzacji za pomocą sondy. Przepłukać usieciowaną membranę w 2x SSC i uszczelnić ją we wstępnie złożonej rurki polietylenowej zgrzewanej na gorąco przed umieszczeniem jej w temperaturze -20 °C.
  6. Przygotuj sondę do hybrydyzacji.
    1. Amplifikuj sekwencję, która ma być używana jako sonda do blottingu DNA za pomocą PCR20. 50-100 ng fragmentu PCR 250 bp-2 kbp jest używane jako sonda. Dwie oddzielne sondy, jedna hybrydyzująca z prawym obszarem proksymalnym, a druga z lewym regionem proksymalnym granicy T-DNA, mogą być użyte do oceny obecności całego T-DNA (Rysunek 4A i Figura 7).
    2. Rozcieńczyć 50-100 ng produktu PCR w 24 μl ultraczystej wody dejonizowanej w probówce.
    3. Rozcieńczony produkt PCR poddać denaturacji, gotując go przez 5 minut w zlewce z wodą lub bloku grzewczym, a następnie schłodzić bezpośrednio na lodzie.
    4. Rozmrozić gotową mieszankę GCT na lodzie. (GCT-mix: dGTP, dCTP, dTTP (wszystkie 0,5 mM), losowe heksamery 43,2 ng / μL, acetylowane BSA 1,33 mg / ml, 33 mM β-merkaptoenolu, 0,67 M Hepes, 0,17 mM Tris pH 6,8, 17 mM MgCl).
    5. Dodać 21 μl mieszaniny GCT i 2 j. fragmentu Klenowa do produktu PCR.
    6. Dodać 2 μl [32P]ATP do mieszanki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 h.
      UWAGA: Wszystkie kroki związane z [32P]ATP muszą być wykonywane w środowisku przeznaczonym do pracy radioaktywnej, przy użyciu odpowiedniej ochrony.
      UWAGA: Upewnij się, że [32P]ATP jest świeże (nie minęło więcej niż 1 połowa).
    7. Przygotuj Sephadex G-50 (gruboziarnisty lub średni) kolumnowy21 do oczyszczenia znakowanej sondy z nieinkorporowanych (radioaktywnych) nukleotydów. Weź strzykawkę o pojemności 2 ml i przykryj wylot małym kółkiem z grubej bibuły filtracyjnej. Dodać 2 ml leku Sephadex G-50 rozpuszczonego w TE do strzykawki i usunąć cały płyn z kolumny, obracając.
    8. Umieść kolumnę w plastikowej probówce o pojemności 15 ml, załaduj opisaną sondę na kolumnę i wiruj w temperaturze pokojowej (ustaw wirówkę na 750 x g, pozwól, aby prędkość obrotowa wzrosła do osiągnięcia 750 x g, a następnie zatrzymaj wirówkę i pozwól, aby obrót spadł do 0 x g), aby wymyć sondę. Dodać 200 μl TE do kolumny i obrócić, aby wymyć pozostałą sondę; Powtórz raz. W tych warunkach znakowane fragmenty DNA są wykluczane z macierzy Sephadex i eluowane, podczas gdy wolne nukleotydy pozostają w kolumnie.
    9. Użyj 300 μl oznakowanej sondy na probówkę hybrydyzacyjną. Pozostałą oznakowaną sondę należy przechowywać w temperaturze -20 °C do późniejszego użycia. Należy jednak pamiętać o przerwie połowy meczu [32P]ATP.
  7. Hybrydyzuj plamę DNA.
    1. Podgrzać 2x SSC i bufor hybrydyzacyjny (15 ml na probówkę hybrydyzacyjną, maksymalnie 2 bloty na probówkę) do 65 °C. (Bufor hybrydyzacyjny: 10% siarczan dekstranu, 1% SDS, 1 M NaCl, 50 mM Tris pH 7,5, rozpuścić w 65 °C, utrzymać podwielokrotności w temperaturze -20 °C).
    2. Rozgrzej piec do hybrydyzacji do 65 °C.
    3. Umieść nylonową siatkę na tacy z odrobiną podgrzanego (65 °C) 2x SSC, aby przykryć tacę. Umieść plamę DNA na siatce, DNA stroną do góry. Zwiń blot razem z siatką i włóż rolkę do probówki hybrydyzacyjnej. Odlać nadmiar 2x SSC.
    4. W probówce do mikrowirówki gotować 150 μl DNA plemników łososia (stężenie 10 mg/ml) na probówkę hybrydyzacyjną przez 5 minut (patrz również krok 4.6.3). Natychmiast schłodzić na lodzie i dodać do podgrzanego buforu hybrydyzacyjnego.
    5. Dodaj roztwór buforu hybrydyzacyjnego i plemników łososia do probówki z blotem. Wstępnie hybrydyzować w temperaturze 65 °C przez co najmniej 1 godzinę w obracającym się kole, przy 12 obr./min.
    6. Gdy wstępna inkubacja w kroku 4.7.5 jest prawie zakończona, gotować 300 μl znakowanej sondy przez 5 minut (patrz również krok 4.6.3) i dodać natychmiast do blot po inkubacji.
    7. Hybrydyzować przez noc w obracającym się kole w temperaturze 63 °C, 12 obr./min. Nie pipetuj sondy bezpośrednio na plamę, ale do roztworu buforu hybrydyzacyjnego i nasienia łososia.
  8. Umyj plamę.
    1. Podgrzej roztwory myjące (1x SSPE, 0,1% SDS i 0,1x SSPE, 0,1% SDS) do 65 °C. (20x SSPE: 3 M NaCl, 230 mM NaH2PO4, 20 mM EDTA, pH 7,0).
    2. Wyrzuć roztwór hybrydyzacyjny i dodaj około 100-150 ml 1x SSPE, 0,1% roztworu SDS do probówki hybrydyzacyjnej, zamknij probówkę i obróć ręcznie. Wlać roztwór hybrydyzacyjny i myjący do odpowiednich ciekłych odpadów promieniotwórczych.
    3. Dodać około 100–150 ml 1x SSPE, 0,1% roztworu SDS do probówki, zamknąć i inkubować probówkę przez 15 minut w temperaturze 63 °C w obracającym się kole, 12 obr./min. Roztwór myjący należy odpowiednio wyrzucić.
    4. Dodaj około 100–150 ml 0,1x SSPE, 0,1% roztworu SDS do probówki hybrydyzacyjnej, zamknij i obracaj probówkę przez 5 minut w temperaturze 63 °C, 12 obr./min. Roztwór myjący należy odpowiednio wyrzucić.
    5. Wyjmij osusz z probówki i umieść go na tacy zawierającej wystarczającą ilość podgrzanego 0,1x SSPE, 0,1% SDS i wstrząsaj przez 3 minuty w wstrząsającej łaźni wodnej o temperaturze 65 °C. W międzyczasie opłucz siatkę na tacy wypełnionej wodą.
    6. Wyjmij blot, umieść go między wstępnie złożonym plastikiem (rurką polietylenową), ostrożnie zetrzyj nadmiar płynu i pozwól blotowi na chwilę wyschnąć. Należy pamiętać, że płyn zniszczy ekran phosphorimager.
    7. Zamknij plamę w plastiku z trzech stron. Usuń cały nadmiar płynu otaczający kleksa i zamknij plastikową rurkę, uszczelniając czwartą stronę. Odetnij nadmiar plastiku. Upewnij się, że uszczelniona plama nie przecieka i że plastik jest suchy na zewnątrz.
  9. Odświetlić ekran phosphorimager.
    1. Umieść zapieczętowaną plamę w kasecie luminoobrazurów, tak aby ekran luminowizora był skierowany w stronę DNA plamy. Zamknij kasetę i pozostaw na ± 2–4 dni, w zależności od siły znakowania radioaktywnego i czułości luminoobrazurów.
    2. Zeskanuj ekran phosphorimager za pomocą phosphorimager. Uważaj, aby ekran był jak najmniej wystawiony na działanie światła przed skanowaniem. Zapisz obraz. Usuń ekran z sygnału, wystawiając go na działanie jasnego światła.
  10. Przeanalizuj plamę.
    1. Analiza zależy od strategii ograniczeń zastosowanej w kroku 4.1. Analizując blot przygotowany zgodnie ze strategią pokazaną w kroku 4.1.1.1 (Rysunek 4A), policz liczbę wykrytych fragmentów. W tej strategii liczba zhybrydyzowanych fragmentów odnosi się do liczby integracji T-DNA.
      1. Porównaj liczbę fragmentów wykrytych za pomocą sondy dla lewej (Figura 7B) i prawej (Figura 7C) części T-DNA.
        UWAGA: Jeśli zostanie wykryta inna liczba hybrydyzujących fragmentów, oznacza to, że i) występuje wiele kopii T-DNA (w orientacji odwróconej lub bezpośredniej) lub ii) nie w pełni zintegrowane T-DNA.
      2. Oszacuj rozmiary zhybrydyzowanych fragmentów na blot na podstawie wielkości pasm markerowych i porównaj rozmiary zhybrydyzowanych fragmentów z oczekiwanymi rozmiarami fragmentów obliczonymi na podstawie strategii restrykcyjnej insercji tandemowych (Figura 4A) w celu zidentyfikowania możliwego tandemowego układu T-DNA. Użyj klasy Rysunek 4A jako wskazówkę do obliczenia rozmiaru oczekiwanych fragmentów.
        UWAGA: Jeśli rozmiar zhybrydyzowanych fragmentów nie zgadza się z obliczonymi, najprawdopodobniej jedna z obecnych integracji nie jest kompletna.
    2. Analizując blot przygotowany zgodnie ze strategią pokazaną w kroku 4.1.1.2 (Rysunek 4B), oszacuj rozmiar hybrydyzującego fragmentu na plamie na podstawie wielkości pasm znacznikowych i porównaj go z oczekiwanym rozmiarem. Nienaruszona insercja daje pojedynczy fragment o określonej długości. Każde odchylenie oczekiwanej długości wskazuje na niepełną integrację (Rysunek 7D).
  11. Usuń blot do ponownej hybrydyzacji (opcjonalnie).
    UWAGA: Ten sam blot może być hybrydyzowany kolejno z różnymi sondami. Przed kontynuowaniem z nową sondą usuń poprzednią zhybrydyzowaną sondę z plamy.
    1. Aby wyjąć sondę z plamy, umieść ją na tacy stroną DNA skierowaną w dół. Wlej nadwyżkę 0,5% SDS do tacy. Gotuj membranę przez 2–5 minut. Czas trwania zabiegu zależy od wielkości i zawartości GC w użytej sondzie. Dłuższe i bogatsze w GC sondy wymagają dłuższej obróbki.
    2. Po usunięciu należy zhybrydyzować blot z inną sondą lub zapieczętować i przechowywać w temperaturze -20 °C.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z systemu BIBAC-GW, wygenerowano konstrukcje reporterowe do badania ODM w roślinach10. Konstrukty zostały zaprojektowane w wektorze Gateway Entry pENTR-gm12 i wstawione do pBIBAC-BAR-GW (Rysunek 1) przy użyciu reakcji rekombinacji Gateway LR.

Arabidopsis zostały przekształcone za pomocą pDM19, plazmidu BIBAC-BAR-GW z reporterem mTurquoise-eYF...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kluczowe znaczenie dla generowania transgeników z pojedynczymi, nienaruszonymi integracjami transgenu ma wybór użytego wektora binarnego. Wektory z rodziny BIBAC zostały wykorzystane do dostarczenia sekwencji interesujących dla wielu gatunków roślin 23,24,25,26,27,28. Wektory BIBAC, w tym BIBAC-GW, dają całkowanie z jedną kop...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych lub innych konfliktów interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Te badania są wspierane przez Holenderską Fundację Technologiczną STW (12385), która jest częścią Holenderskiej Organizacji Badań Naukowych (NWO), a która jest częściowo finansowana przez Ministerstwo Spraw Gospodarczych (OTP Grant 12385 dla MS). Dziękujemy Carol M. Hamilton (Cornell University, Stany Zjednoczone) za dostarczenie pCH20, szkieletu wektorów BIBAC-GW.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Siarczan kanamycyny jednowodnyDuchefaK0126
Siarczan gentamycynyDuchefaG0124
RyfampicynaDuchefaR0146
Chlorowodorek tetracyklinySigmaT-3383
DB3.1 kompetentne komórkiThermo Scientific - Invitrogen11782-018Zamiast tego można użyć One Shot ccdB Survival 2 T1R Competent Cells (A10460) firmy Invitrogen lub innego szczepu odpornego na ccdB E. coli   
Kompetentne komórki DH10BThermo Scientific - Invitrogen18290-015
Gateway LR clonase enzyme mix Thermo Scientific - Invitrogen11791-019
cytrynian trisodu dwuwodnyMerck106432
Baza TrizmaSigma-AldrichT1503
EDTA dwuwodny disodowyDuchefaE0511
Proteinaza KThermo Scientific EO0491
Bacto tryptonBD211705
Ekstrakt drożdżowyBD212750
Chlorek soduHoneywell Fluka13423
Chlorek potasuMerck104936
D(+)-Glukoza monohydratMerck108346
Kuwety do elektroporacji, odstęp 0,1 cmBiorad
Electroporator Gene PulserBioRad
Siarczan magnezu siedmiowodnyCalbiochem442613
D(+)-Maltoza monohydrat 90%Acros Organics32991
SacharozaSigma-Aldrich84100
Silwet L-77Fisher ScientificNC0138454
Murashige Skoog mediumDuchefaM0221
AgarBD214010
Glufosynat amonowy (Basta)Bayer79391781
Enzymy restrykcyjneNEB
Bromek etydynyBio-Rad1610433
System elektroforezyBio-Rad
Wodorotlenek soduMerck106498
Kwas solnyMerck100316
Blotting nylonowa membrana Hybond N+Sigma Aldrich15358lub GE Healthcare Life Sciences (RPN203B)
Bibuła Whatman 3MM ChrGE Healthcare Life Sciences3030-931
dNTPThermo FisherR0181
Acetylowana BSASigma-AldrichB2518
HEPESSigma-AldrichH4034
2-merkaptoetanolMerck805740
Sephadex G-50 CoarseGE Healthcare Life Sciences17004401lub Sephadex G-50 Medium (17004301)
Sól sodowa siarczanu dekstranuSigma-AldrichD8906
Dodecylosiarczan US BiologicalS5010
DNA plemników łososiaSigma-AldrichD7656
Monohydrat diwodorofosforanu soduMerck106346
Przechowywanie Ekran i kaseta fosforowaGE Healthcare Life Sciences28-9564-74
Imager luminoforowyGE Healthcare Life SciencesTyphoon FLA 7000
UV CrossenderStratageneStratalinker 1800
(okład Saran)Omnilabo1090681
AgaroseThermo Scientific - Invitrogen16500
Kwas borowyMerck100165
marker DNA ' Blauw"; Drabina DNA.MRC HollandMCT8070
marker DNA " Rood"; Drabinka DNAMRC Holland MCT8080
Mieszanka heksanukleotydówRoche11277081001
Zestaw do dużych konstrukcjiQiagen12462
Zgrzewalne rurki polietylenowe, przezroczysteróżnych dostawcówSzerokość rurki powinna być szersza niż szerokość membrany bibuły
Zgrzewarka
Filtr membranowy dyskMerckVSWP02500
Chlorek magnezuMerck105833
Siatka hybrydyzacyjnaGE Healthcare Nauki przyrodniczeRPN2519
1652089 Folia spożywcza

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jorgensen, R. A., Cluster, P. D., English, J., Que, Q., Napoli, C. A. Chalcone synthase cosuppression phenotypes in petunia flowers: comparison of sense vs. antisense constructs and single-copy vs. complex T-DNA sequences. Plant Mol Biol. 31 (5), 957-973 (1996).
  2. Stam, M., et al. Post-transcriptional silencing of chalcone synthase in Petunia by inverted transgene repeats. Plant J. 12, 63-82 (1997).
  3. Stam, M., Viterbo, A., Mol, J. N., Kooter, J. M. Position-dependent methylation and transcriptional silencing of transgenes in inverted T-DNA repeats: implications for posttranscriptional silencing of homologous host genes in plants. Mol Cell Biol. 18 (11), 6165-6177 (1998).
  4. Jin, Y., Guo, H. S. Transgene-induced gene silencing in plants. Methods Mol Biol. 1287, 105-117 (2015).
  5. Oltmanns, H., et al. Generation of Backbone-Free, Low Transgene Copy Plants by Launching T-DNA from the Agrobacterium Chromosome 1[W][OA]. Plant Physiol. , (2010).
  6. Ye, X., et al. Enhanced production of single copy backbone-free transgenic plants in multiple crop species using binary vectors with a pRi replication origin in Agrobacterium tumefaciens. Transgenic Res. , (2011).
  7. Hamilton, C. M. A binary-BAC system for plant transformation with high-molecular-weight DNA. Gene. 200 (1-2), 107-116 (1997).
  8. Frary, A., Hamilton, C. M. Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: an analysis in tomato. Transgenic Res. 10 (2), 121-132 (2001).
  9. Vega, J. M., et al. Agrobacterium-mediated transformation of maize (Zea mays) with Cre-lox site specific recombination cassettes in BIBAC vectors. Plant Mol Biol. 66 (6), 587-598 (2008).
  10. Anggoro, D. T., Tark-Dame, M., Walmsley, A., Oka, R., de Sain, M., Stam, M. BIBAC-GW-based vectors for generating reporter lines for site-specific genome editing in planta. Plasmid. 89, 27-36 (2017).
  11. Hamilton, C. M., Frary, A., Lewis, C., Tanksley, S. D. Stable transfer of intact high molecular weight DNA into plant chromosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (18), 9975-9979 (1996).
  12. Belele, C. L., Sidorenko, L., Stam, M., Bader, R., Arteaga-Vazquez, M. A., Chandler, V. L. Specific tandem repeats are sufficient for paramutation-induced trans-generational silencing. PLoS Genet. 9 (10), e1003773(2013).
  13. Shizuya, H., et al. Cloning and stable maintenance of 300-kilobase-pair fragments of human DNA in Escherichia coli using an F-factor-based vector. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (18), 8794-8797 (1992).
  14. Shi, X., Zeng, H., Xue, Y., Luo, M. A pair of new BAC and BIBAC vectors that facilitate BAC/BIBAC library construction and intact large genomic DNA insert exchange. Plant Methods. 7, 33(2011).
  15. Woodman, M. E., et al. Direct PCR of Intact Bacteria (Colony PCR). Curr Protoc Microbiol. , A.3D.1-A.3D.7 (2016).
  16. Ausubel, F. M., et al. Mol Biol. Current Protocols in Molecular Biology. 1, (2003).
  17. Edwards, K., Johnstone, C., Thompson, C. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis. Nucleic Acids Res. 19 (6), 1349(1991).
  18. Clarke, J. D. Cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB) DNA miniprep for plant DNA isolation. Cold Spring Harb Protoc. (3), (2009).
  19. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
  20. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning. , CSH Press. (2012).
  21. Sosa, J. M. Chromatography with Sephadex Gels. Anal Chem. 52 (6), 910-912 (1980).
  22. Depicker, A., Stachel, S., Dhaese, P., Zambryski, P., Goodman, H. M. Nopaline synthase: transcript mapping and DNA sequence. J Mol Appl Genet. 1 (6), 561-573 (1982).
  23. Feng, J., Vick, B. A., Lee, M. K., Zhang, H. B., Jan, C. C. Construction of BAC and BIBAC libraries from sunflower and identification of linkage group-specific clones by overgo hybridization. Theor Appl Genet. 113 (1), 23-32 (2006).
  24. Lee, M. K., et al. Construction of a plant-transformation-competent BIBAC library and genome sequence analysis of polyploid Upland cotton (Gossypium hirsutum L). BMC Genomics. 14, 208(2013).
  25. Wang, W., et al. A large insert Thellungiella halophila BIBAC library for genomics and identification of stress tolerance genes. Plant Mol Biol. 72 (1-2), 91-99 (2010).
  26. Wu, C., et al. A BAC- and BIBAC-based physical map of the soybean genome. Genome Res. 14 (2), 319-326 (2004).
  27. Xu, Z., et al. Genome physical mapping from large-insert clones by fingerprint analysis with capillary electrophoresis: a robust physical map of Penicillium chrysogenum. Nucleic Acids Res. 33 (5), e50(2005).
  28. Zhang, M., et al. Genome physical mapping of polyploids: a BIBAC physical map of cultivated tetraploid cotton, Gossypium hirsutum L. PLoS One. 7 (3), e33644(2012).
  29. Frary, A., Hamilton, C. M. Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: An analysis in tomato. Transgenic Res. , (2001).
  30. Stam, M., Viterbo, A., Mol, J. N. M., Kooter, J. M. Position-Dependent Methylation and Transcriptional Silencing of Transgenes in Inverted T-DNA Repeats: Implications for Posttranscriptional Silencing of Homologous Host Genes in Plants. Cell Biol. 18 (11), 6165-6177 (1998).
  31. Głowacka, K., Kromdijk, J., Leonelli, L., Niyogi, K. K., Clemente, T. E., Long, S. P. An evaluation of new and established methods to determine T-DNA copy number and homozygosity in transgenic plants. Plant Cell Environ. 39 (4), 908-917 (2016).
  32. Stefano, B., Patrizia, B., Matteo, C., Massimo, G. Inverse PCR and Quantitative PCR as Alternative Methods to Southern Blotting Analysis to Assess Transgene Copy Number and Characterize the Integration Site in Transgenic Woody Plants. Biochem Genet. 54 (3), 291-305 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

BIBAC GW VectorGateway RecombinationTransgenic PlantsSingle copy InsertionsDNA BlottingAgrobacterium TransformationGlufosinate SelectionDsRed FluorescenceRestriction EnzymesT DNA Integrity

Related Articles