Method Article

Generowanie roślin transgenicznych z insercją pojedynczej kopii przy użyciu wektora binarnego BIBAC-GW

DOI:

10.3791/57295

⸱

March 28th, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Swammerdam Institute for Life Sciences, University of Amsterdam

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystanie z wektora binarnego pBIBAC-GW sprawia, że generowanie roślin transgenicznych z nienaruszonymi pojedynczymi kopiami jest łatwym procesem. W tym miejscu przedstawiono szereg protokołów, które prowadzą czytelnika przez proces generowania transgenicznych roślin Arabidopsis oraz testowania roślin pod kątem nienaruszalności i liczby kopii wkładek.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podczas generowania roślin transgenicznych, zazwyczaj celem jest uzyskanie stabilnej ekspresji transgenu. Wymaga to pojedynczej, nienaruszonej integracji transgenu, ponieważ integracje wielokopijne są często poddawane wyciszaniu genów. Wektor binarny kompatybilny z Gateway oparty na sztucznych chromosomach bakteryjnych (pBIBAC-GW), podobnie jak inne pochodne pBIBAC, umożliwia insercję transgenów z pojedynczą kopią z wysoką wydajnością. Jako ulepszenie oryginalnego pBIBAC, kaseta Gateway została sklonowana do pBIBAC-GW, dzięki czemu interesujące sekwencje mogą być teraz łatwo włączone do transferu wektorów DNA (T-DNA) przez klonowanie Gateway. Zazwyczaj transformacja za pomocą pBIBAC-GW skutkuje wydajnością 0,2–0,5%, przy czym połowa transgeników ma nienaruszoną integrację T-DNA z jedną kopią. Wektory pBIBAC-GW są dostępne z odpornością na fluorescencję glufosynatu amonowego lub DsRed w okrywie nasiennej do selekcji roślin oraz z odpornością na kanamycynę jako selekcję u bakterii. W tym miejscu przedstawiono szereg protokołów, które prowadzą czytelnika przez proces generowania roślin transgenicznych przy użyciu pBIBAC-GW: począwszy od rekombinacji interesujących sekwencji do wybranego wektora pBIBAC-GW, po transformację roślin za pomocą Agrobacterium, wybór transgeników i testowanie roślin pod kątem nienaruszalności i liczby kopii insertów za pomocą blottingu DNA. Zwrócono uwagę na zaprojektowanie strategii blottingu DNA w celu rozpoznania integracji jedno- i wielokopijnych w jednym i wielu loci.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podczas generowania roślin transgenicznych, zazwyczaj celem jest stabilna ekspresja zintegrowanego transgenu (transgenów). Można to osiągnąć poprzez nienaruszone integracje pojedynczej kopii transgenu. Wielokrotne integracje mogą prowadzić do zwiększonej ekspresji transgenu, ale także do wyciszenia genów. Wyciszenie transgenów jest bardziej prawdopodobne, jeśli wstawione sekwencje są ułożone w tandem lub odwrócone powtórzenia1,2,3,4. Wektory binarne są używane jako czółenka w eksperymentach transformacyjnych za pośrednictwem Agrobacteriu....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Wstawianie interesujących sekwencji do wektora binarnego

  1. Przygotuj wpis bramy i wektory binarne.
    1. Wyizoluj wektor Gateway Entry zawierający interesujący fragment DNA lub gen za pomocą mini-zestawu przygotowawczego zgodnie z sugestiami dostawcy.
      Uwaga: Wektory BIBAC-GW wymagają użycia kanamycyny (Km) do selekcji u bakterii, dlatego zamiast kanamycyny należy użyć wektora wejściowego z innym markerem oporności. Na przykład, wektor pENTR-gm, niosący gen oporności na gentamycynę, jest dobrym wyborem12.
    2. Propagacja i izolacja interesującego nas wektora BIBAC-GW. Użyj szczepu E. coli

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z systemu BIBAC-GW, wygenerowano konstrukcje reporterowe do badania ODM w roślinach10. Konstrukty zostały zaprojektowane w wektorze Gateway Entry pENTR-gm12 i wstawione do pBIBAC-BAR-GW (Rysunek 1) przy użyciu reakcji rekombinacji Gateway LR.

Arabidopsis zostały przekształcone za pomocą pDM19, plazmidu BIBAC-BAR-GW z reporterem mTurquoise-eYF.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kluczowe znaczenie dla generowania transgeników z pojedynczymi, nienaruszonymi integracjami transgenu ma wybór użytego wektora binarnego. Wektory z rodziny BIBAC zostały wykorzystane do dostarczenia sekwencji interesujących dla wielu gatunków roślin 23,24,25,26,27,28. Wektory BIBAC, w tym BIBAC-GW, dają całkowanie z jedną kop.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych lub innych konfliktów interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Te badania są wspierane przez Holenderską Fundację Technologiczną STW (12385), która jest częścią Holenderskiej Organizacji Badań Naukowych (NWO), a która jest częściowo finansowana przez Ministerstwo Spraw Gospodarczych (OTP Grant 12385 dla MS). Dziękujemy Carol M. Hamilton (Cornell University, Stany Zjednoczone) za dostarczenie pCH20, szkieletu wektorów BIBAC-GW.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Siarczan kanamycyny jednowodnyDuchefaK0126
Siarczan gentamycynyDuchefaG0124
RyfampicynaDuchefaR0146
Chlorowodorek tetracyklinySigmaT-3383
DB3.1 kompetentne komórkiThermo Scientific - Invitrogen11782-018Zamiast tego można użyć One Shot ccdB Survival 2 T1R Competent Cells (A10460) firmy Invitrogen lub innego szczepu odpornego na ccdB E. coli   
Kompetentne komórki DH10BThermo Scientific - Invitrogen18290-015
Gateway LR clonase enzyme mix Thermo Scientific - Invitrogen11791-019
cytrynian trisodu dwuwodnyMerck106432
Baza TrizmaSigma-AldrichT1503
EDTA dwuwodny disodowyDuchefaE0511
Proteinaza KThermo Scientific EO0491
Bacto tryptonBD211705
Ekstrakt drożdżowyBD212750
Chlorek soduHoneywell Fluka13423
Chlorek potasuMerck104936
D(+)-Glukoza monohydratMerck108346
Kuwety do elektroporacji, odstęp 0,1 cmBiorad
Electroporator Gene PulserBioRad
Siarczan magnezu siedmiowodnyCalbiochem442613
D(+)-Maltoza monohydrat 90%Acros Organics32991
SacharozaSigma-Aldrich84100
Silwet L-77Fisher ScientificNC0138454
Murashige Skoog mediumDuchefaM0221
AgarBD214010
Glufosynat amonowy (Basta)Bayer79391781
Enzymy restrykcyjneNEB
Bromek etydynyBio-Rad1610433
System elektroforezyBio-Rad
Wodorotlenek soduMerck106498
Kwas solnyMerck100316
Blotting nylonowa membrana Hybond N+Sigma Aldrich15358lub GE Healthcare Life Sciences (RPN203B)
Bibuła Whatman 3MM ChrGE Healthcare Life Sciences3030-931
dNTPThermo FisherR0181
Acetylowana BSASigma-AldrichB2518
HEPESSigma-AldrichH4034
2-merkaptoetanolMerck805740
Sephadex G-50 CoarseGE Healthcare Life Sciences17004401lub Sephadex G-50 Medium (17004301)
Sól sodowa siarczanu dekstranuSigma-AldrichD8906
Dodecylosiarczan US BiologicalS5010
DNA plemników łososiaSigma-AldrichD7656
Monohydrat diwodorofosforanu soduMerck106346
Przechowywanie Ekran i kaseta fosforowaGE Healthcare Life Sciences28-9564-74
Imager luminoforowyGE Healthcare Life SciencesTyphoon FLA 7000
UV CrossenderStratageneStratalinker 1800
(okład Saran)Omnilabo1090681
AgaroseThermo Scientific - Invitrogen16500
Kwas borowyMerck100165
marker DNA ' Blauw"; Drabina DNA.MRC HollandMCT8070
marker DNA " Rood"; Drabinka DNAMRC Holland MCT8080
Mieszanka heksanukleotydówRoche11277081001
Zestaw do dużych konstrukcjiQiagen12462
Zgrzewalne rurki polietylenowe, przezroczysteróżnych dostawcówSzerokość rurki powinna być szersza niż szerokość membrany bibuły
Zgrzewarka
Filtr membranowy dyskMerckVSWP02500
Chlorek magnezuMerck105833
Siatka hybrydyzacyjnaGE Healthcare Nauki przyrodniczeRPN2519
1652089 Folia spożywcza

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jorgensen, R. A., Cluster, P. D., English, J., Que, Q., Napoli, C. A. Chalcone synthase cosuppression phenotypes in petunia flowers: comparison of sense vs. antisense constructs and single-copy vs. complex T-DNA sequences. Plant Mol Biol. 31 (5), 957-973 (1996).
  2. Stam, M., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

BIBAC GW VectorGateway RecombinationTransgenic PlantsSingle copy InsertionsDNA BlottingAgrobacterium TransformationGlufosinate SelectionDsRed FluorescenceRestriction EnzymesT DNA Integrity

Related Articles